MXPA05012927A - Matriz, implante celular y metodos para su preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a matrices porosas basadas en un polimero o mezcla de polimeros compatibles biologicamente, a un implante celular que esta establecido sobre dichas matrices y a implantes celulares adicionales basados en mezclas de celulas de hepatocitos e isletas de Langerhans. La invencion tambien se refiere a un metodo para producir matrices porosas, a matrices obtenidas de acuerdo a dicho metodo y a un metodo especial para obtener las celulas para la inoculacion de una matriz que se puede implantar.

Description

MATRIZ, IMPLANTE CELULAR Y METODOS PARA SU PREPARACIÓN Y USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a matrices porosas las cuales se basan en un polímero o mezclas de polímeros biológicamente tolerados, a implantes de células las cuales se desarrollan sobre el último, a otros implantes de células los cuales se basan en mezclas de células compuestas de hepatocitos e isletas de Langerhans, a un método para preparar matrices porosas ya las matrices las cuales se pueden obtener usando este método, y a un método especial para obtener las células para inocular una matriz que se puede implantar. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ingeniería de tejidos es un campo interdisciplinario el cual combina las ciencias de ingeniería y de materiales con la medicina. El objetivo es restablecer los tejidos dañados o mej orar su función . El principio de la ingeniería de tej idos es en extremo simple; antes que nada algunas células se remueven del paciente y se propagan in vitro. Las células propagadas se pueden insertar en una substancia de estructura base o armazón, resultando en a formación de un reemplazo de tejido vivo, completo el cual se transplanta otra vez en el paciente. En contraste con el transplante alogénico convencional, el cual presupone un donador adecuado y como regla requiere inmunosupresión medicinal de por vida, este método ofrece la ventaja crucial de ser capaz de usar células endógenas (autologas) . La naturaleza y la construcción de la sustancia de armazón empleada, la cual se conoce también como matriz en lo que sigue, es de particular importancia para que los implantes sean aceptados y sean capaces de funcionar. Aparte de los materiales a ser usados, los cuales son particularmente como una regla polímeros que se pueden degradar biológicamente, el tamaño de poro, la porosidad y la superficie, así como la forma del poro, la morfología de la pared del poro, y la conectividad entre los poros juegan un papel crucial para el desarrollo posterior de las células las cuales se integran en la substancia de armazón y finalmente para la construcción tridimensional del tej ido u órgano a ser regenerado . Los métodos para producir biomatrices de esta naturaleza ya se han descrito. Por lo tanto, las técnicas del campo textil ya se han aplicado para producir biomatrices fibrosas tejidas y no tejidas. Otro método común, en el cual antes que nada se trabajan cristales salinos en el polímero que se puede degradar biológicamente y después se disuelven otra vez, hace posible controlar el tamaño del poro por medio del tamaño de las partículas de sal y para controlar la porosidad por medio de de la relación sal/polímero (WO 98/44027) . En una modificación del método, los polímeros que se pueden degradar biológicamente, los cuales se disuelven en un solvente, se aplican a lo que se llama un material porogénico, el cual se disuelve entonces otra vez fuera del material compuesto, resultado en poros que tienen la forma de la imagen negativa de dicho material dejado tras de si (WO 01/87575 A2) . También ya se han descrito matrices revestidas (véase, por ejemplo, WO 99/09149 Al) . No obstante, las biomatrices las cuales se han producido hasta ahora usando este método no son satisfactorias en todos los casos, en particular con respecto a la aceptación y la capacidad funcional de los implantes los cuales se construyen sobre estas matrices. En particular, no se han logrado hasta ahora reemplazos de órganos aceptables usando implantes de hígado y páncreas . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención logra el objetivo que soporta la presente invención, principalmente el de proporcionar tal implante funcional, por medio de biomatrices particulares y los implantes correspondientes, los cuales se pueden obtener usando un método especial . La presente invención se refiere por lo tanto a la materia-ob eto el cual define en las presentes reivindicaciones . El grado de porosidad es la especificación numérica 5 en % de la fracción del volumen total de la matriz el cual se representa por el volumen del poro. La palabra "poros" se usa para designar las cavidades las cuales están presentes en la matriz de acuerdo con la invención y las cuales, en el presente caso, tienen una forma angular, en particular octagonal, en una sección de dos dimensiones y/o una forma inclinada cuando se observa en tres dimensiones. Al forma se caracteriza además preferiblemente por extensiones de modo tal que la forma de las cavidades se puede comparar con la forma de las células nerviosas. El tamaño de un poro se puede especificar por medio de un diámetro, que es el promedio de los diámetros menor y mayor de los poros los cuales se pueden discernir en una sección bidimensional . La matriz de acuerdo con la invención posee poros de diferentes tamaños, con los tamaños distribuidos (distribución del tamaño de poro) sobre un intervalo particular. De acuerdo con la invención, es importante que una matriz posea una distribución de tamaño de poro amplia. Esta distribución se debe extender desde poros que tiene un tamaño en el rango de aproximadamente 150 m a poros que tienen un tamaño en el rango de aproximadamente 300 um, o son más anchos que esto.

Por consiguiente, una matriz de acuerdo con la invención, de acuerdo a un aspecto, debe poseer poros que tienen un tamaño de 150 pm o menos. Se prefieren las matrices que poseen poros que tienen un tamaño de 140 m o menos. Las matrices que poseen poros que tienen un tamaño de 130 µp? o menos son particularmente ventajosas. De acuerdo con otro aspecto, una matriz de acuerdo a la invención deberla poseer poros que tienen un tamaño de 300 µ??? o más. Las matrices las cuales poseen poros que tienen un tamaño de 350 µ?? o más se prefieren. Las matrices las cuales poseen poros que tienen un tamaño de 370 µp? o más son particularmente ventajosas. La invención incluye las matrices las cuales poseen tanto poros que tienen un tamaño de 150, 140 o 130 µp?, o menos, y poros que tienen un tamaño de 300, 350, o 370 µ??, o más. Estos valores se pueden combinar en cualquier modo arbitrario para dar rangos mínimos sobre los cuales se debe extender la distribución del tamaño de poro, con los intervalos de 150 a 300, 140 a 350 y 130 a 370 µp? que deben ser mencionados, en particular. Se da preferencia particular a la distribución de tamaño de poro dada que poseen la frecuenta máxima fuera del rango de 150 a 300 µp?, es decir, a una frecuencia máxima que se encuentra arriba del tamaño de poro de 300 µp? y a otra frecuencia máxima que se encuentra abajo de un tamaño de poro de 150 µ??.

Una matriz típica de acuerdo con la invención posee la siguiente distribución de tamaño de poro. Aproximadamente 0.5% a 6%, preferiblemente aproximadamente 1% a 5%, aun mas preferiblemente aproximadamente 2% a 4% y, en particular, aproximadamente 3% de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 70 a 100 um; aproximadamente 2% a 8%, preferiblemente aproximadamente de 3% a 7%, aun más preferiblemente aproximadamente 4% a 6%, y, en particular, aproximadamente 5% de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 101 a 115 µp?; aproximadamente 2% a 8%, preferiblemente aproximadamente 3% a 7%, aun más preferiblemente aproximadamente 4% a 6% y, en particular, aproximadamente 5%, de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 116 a 130 µp?; aproximadamente 1% a 7%, preferiblemente aproximadamente 2% a 6%, aun más preferiblemente aproximadamente 3% a 5%, y, en particular, aproximadamente 4%, de poros que tienen un diestro promedio en el rango de desde 131 a 300 µp?; aproximadamente 11% a 23%, preferiblemente aproximadamente 13% a 21%, aun más preferiblemente aproximadamente 15% a 19%, y, en particular, aproximadamente 17%, de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 301 a 330 µ??; aproximadamente 4% a 10%, preferiblemente aproximadamente 5% a 9%, aun más preferiblemente aproximadamente 6% a 8%, y en particular, aproximadamente 7%, de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 331 a 360 um; aproximadamente 5% a 17%, preferiblemente aproximadamente 7% a 15%, aun más preferiblemente aproximadamente 9% a 13%, y en particular, aproximadamente 11% de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 361 a 390 ym; aproximadamente 7% a 19%, preferiblemente aproximadamente 9% a 17%, aun más preferiblemente aproximadamente 11% a 15%, y, en particular, aproximadamente 13%, de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 391 a 420 µt?; aproximadamente 3% a 9%, preferiblemente aproximadamente 4% a 8%, aun más preferiblemente aproximadamente 5% a 7%, y en particular aproximadamente 6% de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 421 a 450 µ??; aproximadamente 12% a 24%, preferiblemente aproximadamente 14% a 22%, aun más preferiblemente aproximadamente 16% a 20%, y en particular, aproximadamente 18% de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 451 a 480 pm; y aproximadamente 5% a 17%, preferiblemente aproximadamente 7% a 15%, aun más preferiblemente aproximadamente 9% a 13%, y en particular, aproximadamente 11% de poros que tienen un diámetro promedio en el rango de desde 481 a 510 µp?. Por regla general, por lo tanto, se obtiene una distribución de tamaño de poro que tiene más de un máximo, con este que corresponde a un agrupamiento de poros en más de un rango de tamaños . Esto es de importancia particular para las propiedades de las matrices de acuerdo con la invención. El volumen de las cavidades, y por lo tanto el grado de porosidad, se debe determinar por porosimetría en una manera conocida per se . Los tamaños de poro, y por lo tanto la distribución del tamaño de poro también, se puede determinar por ejemplo, por medio de microscopio de barrido electrónico. Para esto, se preparan secciones delgadas de la matriz a ser investigada y se revisten con oro. Las fotografías microscópicas de barrido electrónico se evalúan midiendo todos los poros en un área definida, es decir, determinando los diámetros mayores y menores para cada por, determinando la suma de los dos valores y dividiendo la suma entre 2. El término "matriz" se refiere a un soporte tridimensional el cual es adecuado para ser colonizado por células. En este sentido, la matriz sirve como una plantilla tridimensional la cual la cual puede ser colonizada por células o tejidos. Esta colonización puede tomar lugar in vitro o in vivo. Además, la matriz sirve, en conexión con los trasplantes, para situar el transplante y también como un sujetador de lugar para el tejido el cual se forma gradualmente in vivo.

El polímero puede ser en principio cualquier polímero el cual se pueda usar en el campo de la medicina, y, en particular, en la medicina de transplantes. Por consiguiente, los polímeros los cuales son reconocidos por un anfitrión, pero cuyo rechazo se puede suprimir por la inmunosupresión adecuada son todos tolerados de esta manera. Es posible usar polímeros los cuales son esencialmente no que se pueden degradar biológicamente. Sin embargo, se da preferencia a los polímeros los cuales son al menos predominantemente se pueden degradar biológicamente . La expresión "que se puede degradar biológicamente" se refiere a un material al cual los organismos vivientes (o los fluidos corporales o los cultivos celulares los cuales se pueden derivar de los organismos vivientes) pueden convertir en productos que se pueden metabolizar. Los polímeros biológicamente degradables incluyen, por ejemplo, los polímeros los cuales son bioresorbible y/o bioerosionable . "Bioerosionable" denota la habilidad de ser soluble o que se puede suspender en líquidos biológicos . Bioresorbible significa la habilidad de ser absorbidos por las células, tejidos o fluidos de un organismo vivo. En principio, los polímeros que se pueden degradar biológicamente los cuales son adecuados de acuerdo con la invención incluyen cualquiera de los polímeros los cuales se pueden usar en el campo de la medicina, incluyendo también con esto, por ejemplo, además de los polímeros los cuales se encuentran ya establecidos en el campo de la ingeniería de tejidos, los polímeros los cuales han quedado establecidos en los dispositivos de liberación de compuestos activos tales como parches e implantes de compuestos activos. Los polímeros naturales adecuados incluyen, por ejemplo, los polipéptidos tales como albúmina, fibrinogeno, colágeno y gelatina, y también los polisacáridos, tales como quitina, quitosan, alginato y agarosa. Estos polímeros naturales también se pueden modificar, cuando sea apropiado; por ejemplo, se pueden reticular las proteínas tales como el colágeno . Los polímeros sintéticos adecuados incluyen, por ejemplo, polianhídridos particulares, en particular el poli (ácido sebásico-diácido hexadecanoico) , ???(e-caprolactona) , poli (ortoésteres y, en especial poli (OÍ-hidroxi-ésteres) tales como poli (ácido glicólico) , poli (ácido láctico y poli (ácido glicólico-ácido láctico) . Por lo tanto, las matrices e implantes de acuerdo con la invención se basan preferiblemente en polímeros que se pueden degradar biológicamente los cuales contienen unidades repetidas de la fórmula (I) : en la cual R1 es hidrógeno o metilo. Con respecto a las unidades de ácido láctico, se prefiere la forma L (el enantiomero S) . Un polímero particularmente preferido a ser mencionado es el poli (ácido glicólico-ácido láctico) que tiene una relación de ácido glicólico a ácido láctico de desde 99:1 a 1:99, preferiblemente de desde 10:90 a 90:10, por ejemplo 15:85, % mol. Las mezclas compuestas de dos o más polímeros pueden ser del mismo modo convenientes. Además de la naturaleza del polímero, el peso molecular de este también determina las propiedades de la matriz resultante. Se aplica en una manera general, que la porosidad de la matriz disminuye según se incrementa el peso molecular del polímero empleado. Esto aplica en particular, cuando el material se hace espuma cuando se prepara la matriz, es decir, se agrega bajo presión junto con un gas, tal como C02, el cual se disuelve inicialmente en el polímero y forma los poros cuando se reduce la presión. Además, la cristalinidad del polímero empleado afecta las propiedades de la matriz resultante. En este caso, se aplica que la porosidad de la matriz resultante generalmente se incrementa cuando disminuye la cristalinidad, por tal razón se' prefiere un polímero amorfo, en particular para las matrices las cuales son de alta porosidad. Este aspecto también de de importancia particular cuando el material se hace espuma durante la preparación de la matriz. La presente invención se refiere además a matrices porosas las cuales se basan en un polímero que se puede degradar biológicamente y las cuales se caracterizan porque la superficie de la matriz se reviste con al menos una proteína de matriz extracelular. Las proteínas de matriz extracelulares son bien conocidas. Aquellas las cuales se prefieren de acuerdo a la invención son los colágenos, en particular los colágenos del tipo I y IV, laminina y fibronectina . Estas proteínas se pueden preparar en forma purificada en una manera conocida per se o también se obtienen comercialmente . De acuerdo a una modalidad, los revestimientos de matrices de acuerdo a la invención contienen fibronectina como al proteína de matriz extracelular. De acuerdo a otra modalidad, los revestimientos de matrices de acuerdo con la invención contienen una mezcla de colágeno del tipo I, laminina y colágeno del tipo IV como la proteína de matriz extracelular, con preferencia dada en este caso a la mezcla que contiene las proteínas en porcentajes aproximadamente iguales en peso.

De acuerdo a la invención, se da preferencia particular a las matrices las cuales se encuentran revestidas en la manera descrita arriba y las cuales satisfacen al menos uno de los siguientes criterios adicionales: - los poros de las matrices exhiben los tamaños de poro o la distribución de tamaño de poro especificados arriba; - el grado de porosidad es desde 93 a 98%; - los poros exhiben la forma especificada arriba; - el polímero que se puede degradar biológicamente es uno de los polímeros naturales o sintéticos especificados arriba, en particular poli (ácido glicólico-ácido láctico) que tiene un contenido de ácido láctico de aproximadamente 85% mol y un contenido de ácido glicolico de aproximadamente 15% mol.

Las matrices las cuales se encuentran revestidas de este modo se pueden obtener, por ejemplo, por inmersión de la matriz no revestida en una solución la cual contiene la proteína o la mezcla de proteínas la cual se recomienda para el revestimiento y después secando la matriz la cual se ha humedecido con la solución. A este respecto, por regla general es el caso que, dependiendo de las dimensiones del cuerpo de la matriz a ser revestida, la solución humedece las regiones externas del cuerpo de la matriz, en particular, en tanto que comparativamente poza solución penetra al interior del cuerpo de la matriz. Esto puede resultar en que la totalidad de la superficie de la matriz no se encuentra revestida uniformemente sino que en lugar de ello, la densidad del revestimiento disminuye desde la parte externa hacia adentro.

Como una alternativa, o además de un revestimiento, las substancias biológicamente activas se pueden asimilar en el polímero o aun se enlazan al mismo. Estas substancias incluyen, por ejemplo, los compuestos activos sintéticos (moléculas inorgánicas u orgánicas) , proteínas, polisacáridos y otros azucares, lípidos y ácidos nucleicos los cuales, por ejemplo, influencian el crecimiento celular, la migración celular, la división celular, la diferenciación celular y/o el crecimiento del tejido, o poseen efectos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico. Aquellos de los cuales se pueden mencionar a modo de ejemplos son los compuestos activos vasoactivos, los compuestos activos neuroactivos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas, esteroides, anticoagulantes, compuestos activos antiinflamatorios, compuestos activos inmunomoduladores , compuestos activos citotóxicos, antibióticos y compuestos activos antivirales. La presente invención también se refiere a un método para preparar una matriz porosa la cual se basa en un polímero o mezcla de polímeros biológicamente tolerados y las cuales se caracterizan porque una mezcla compuesta de partículas de polímero y partículas de cloruro de sodio que tienen un tamaño de grano definido, se compactan y después se disuelve el cloruro de sodio . Las partículas de polímero que tienen un tamaño de grano en el rango de desde aproximadamente 20 a 950 µp?, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 20 a 760 µp?, y en particular en el rango de desde aproximadamente 108 a 250 µ?a, y partículas de cloruro de sodio que tienen un tamaño de grano en el rango de desde aproximadamente 90 a 670 pm, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 110 a 520 µ?t?, y en particular, en el rango de desde aproximadamente 250 a 425 µp?, han probado ser convenientes para establecer los tamaños de poro o la distribución de tamaño de- poro deseados. Además, una relación en peso de partículas de polímero a partículas de cloruro de sodio en el rango de desde 1:100 a 1:10, ventajosamente en el rango de desde 1:50 a 1:15, y en particular, en el rango de desde aproximadamente 1:20 a 1:18, ha probado ser conveniente para establecer la porosidad deseada . Ha probado además ser conveniente usar sal y poliedros que tienen una distribución de tamaño de grano específica. En lo que concierne al cloruro de sodio el cual se usa para preparar la matriz, es ventajoso que el contenido de sal que tenga un tamaño de grano de desde 250 µp? a 320 pm sea desde aproximadamente 15% a 50%, ventajosamente desde aproximadamente 18% a 42%, y preferiblemente desde aproximadamente 22% a 28%; para el contenido de sal que tenga un tamaño de grano de desde 330 um a 380 µp? sea desde aproximadamente 20% a 65%, ventajosamente desde 30% a 52%, y preferiblemente desde aproximadamente 42% a 46%; y para el contenido de sal que tiene un tamaño de grano de desde 390 µp? a 425 µp? sea desde aproximadamente 15% a 62%, ventajosamente desde aproximadamente 25% a 42%, y preferiblemente desde aproximadamente 29% a 33%, con los valores de porcentaje que se refieren al peso total de sal usado para la preparación. Esto no excluye por lo tanto las fracciones que tienen tamaños de grano superiores o inferiores a los rangos especificados. De acuerdo a una modalidad especifica, ha probado ser ventajoso que el contenido de partículas de cloruro de sodio que tienen un tamaño de grano de desde 108 a 140 µp? sea desde 1 a 15% en peso, preferiblemente desde 4 a 12% en peso, y en particular desde 7 a 9% en peso, que el contenido de sal que tiene un tamaño de grano de desde 145 µ?? a 180 µ?? sea desde 1 a 11% en peso, preferiblemente desde 3 a 9% en peso, y en particular desde 5 a 7% en peso, que el contenido de sal que tiene un tamaño de grano de desde 185 µp? a .220 um, sea desde 3 a 21% en peso, preferiblemente desde 7 a 17% en peso, y en particular desde 10 a 14% en peso, que el contenido de sal que tiene un tamaño de grano de desde 225 µ?? a 250 µp? sea desde 1 a 11% en peso, preferiblemente desde 3 a 9% en peso, y en particular desde 5 a 7% en peso, que el contenido de sal que tiene un tamaño de grano de desde 250 \im a 320 µp? sea desde 15 a 50% en peso, preferiblemente desde 18 a 42% en peso, y en particular desde 22 a 28% en peso, para el contenido de sal que tiene un tamaño de desde 330 µ?? a 380 µp? sea desde 15 a 50% en peso, preferiblemente desde 18 a 42% en peso, y en particular desde 22 a 28% en peso, y para el contenido de sal que tiene un tamaño de grano de desde 390 µp? a 425 µp? sea*-desde 5 a 29% en peso, preferiblemente desde 10 a 24% en peso, y en particular desde 5 a 19% en peso. En lo que concierne al polímero el cual se usa para preparar la matriz, es ventajoso que el contenido de polímero que tiene un tamaño de grano de desde 108 a 140 µp? sea desde aproximadamente 5% a 50%, ventajosamente desde aproximadamente 10% a 30%, y preferiblemente desde aproximadamente 14% a 18%; que el contenido de polímero que tiene un tamaño de grano de desde 145 µ?? a 180 µt? sea desde aproximadamente 10% a 55%, ventajosamente desde aproximadamente 15% a 40%, y preferiblemente desde aproximadamente 20% a 24%, que el contenido de polímero que tiene un tamaño de grano de desde 185 µ?? a 220 µp? sea desde aproximadamente 18% a 88%, ventajosamente desde aproximadamente 32% a 76%, y preferiblemente desde aproximadamente 43% a 49%, y que el contenido de polímero que tiene un tamaño de grano de desde 225 µ?t? a 250 µp\ sea desde aproximadamente 5% a 45%, ventajosamente desde aproximadamente 10% a 28%, y preferiblemente desde aproximadamente 14% a 18%, con los valores de porcentaje que se refieren al peso total del polímero usado para la preparación. Para obtener las partículas de sal y/o polímero con la distribución de tamaño de grano deseada, es una regla general conveniente moler antes que nada el producto disponible comercialíñente . Esto se puede efectuar en dispositivos los cuales se acostumbran para este propósito, por ejemplo, los sistemas de impacto o molinos trituradores. Sin embargo, lo que es determinante para la distribución de tamaño de grano deseada es el tamizado subsecuente usando tamices analíticos acostumbrados . La compactación se efectúa preferiblemente por la acción de una prensa. Para esto, la mezcla de polímero cloruro de sodio se puede prensar en una prensa hidráulica convencional a una presión de ariete en el rango de desde aproximadamente 54.84 kg/cm2 a 101.95 kg/cm2 (780 psi a 1450 psi) , venta osamente en el rango de desde aproximadamente 59.06 kg/cm2 a 86.48 kg/cm2 (840 psi a 1230 psi), y en particular en el rango desde aproximadamente 63.28 kg/cm2 a 77.34 kg/cm2 (900 psi a 1100 psi) . Ha probado ser conveniente permitir que la presión actúe durante aproximadamente 10 s a 360 s, ventajosamente desde aproximadamente 40 s a 180 s, y en particular desde aproximadamente 50 s a 70 s, a temperaturas en el rango desde 18 °C a 25°C. El cloruro de sodio se disuelve, por ejemplo, usando agua o soluciones acuosas, primero, la mezcla compactada (la matriz en blanco) se puede remojar o impregnar durante aproximadamente 1 h a 80 h, ventajosamente desde aproximadamente 12 h a 62 h, y en particular desde aproximadamente 36 h a 60 h. Es ventajoso además que la mezcla compactada sea almacenada inicialmente en una atmósfera de C02 antes de disolver el cloruro de sodio. Así, por ejemplo, la mezcla compactada se puede gasificar a una presión de C02 en el rango de desde aproximadamente 9.84 kg/cm2 a 116.00 kg/cm2 (140 psi a 1650 psi) , ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 18.28 kg/cm2 a 78.74 kg/cm2 (260 psi a 1120 psi) , y en particular en el rango de desde aproximadamente 56.25 kg/cm2 a 63.28 kg/cm2 (800 psi a 900· psi), con tiempos en el rango de desde aproximadamente 1 h a 180 h, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 3 h a 60 h, y en particular en el rango de desde aproximadamente 12 h a 36 h, que han probado ser convenientes en esta conexión. Después de eso, la presión se reduce con la velocidad a la cual se reduce la presión que tiene una influencia en la formación de los poros. Aunque se prefiere el uso de C02, otros gases tales como aire, nitrógeno, helio, neón, criptón, argón, xenón u oxígeno también pueden ser adecuados. Subsecuentemente, el agua o la solución acuosa se remueve, con vistas al secado, en una manera conocida, per se. Para lograr esto, por ejemplo, la matriz se puede colocar sobre papel absorbente . De acuerdo con una modalidad preferida, se agrega una solución de polímero a la mezcla compuesta de partículas de polímero partículas de cloruro de sodio, y el solvente se remueve, antes de efectuar la compactación. En este sentido, las partículas de polímero y la solución se polímero pueden tener la base del mismo polímero. Sin embargo, los polímeros también pueden ser diferentes polímeros, en particular polímeros que tienen diferentes degradabilidades biológicas. El uso de la solución de polímero tiene la ventaja de que cuando en efecto los pilares de soporte se encuentran erguidos en la matriz, haciendo posible con esto mejorar las propiedades mecánicas de la matriz. En particular, una matriz de esta naturaleza exhibe menos tendencia al colapso. El solvente el cual se usa debe disolver el polímero pero no la sal . Esto asegura que las propiedades porogénicas de la sal, no se ven afectadas o sólo de manera insignificante. Acetona, acetato de etilo, cloruro de metileno, cloroformo, hexafluoroisopropanol , hidrocarburos alifáticos y aromáticos, clorados o fluorados, tetrahidrofurano, etil metil cetona, dietil cetona, y mezclas de los mismos, por ejemplo, son adecuados para disolver los polímeros mencionados arriba. El cloroformo es en particular adecuado para disolver el poli (ácido glicólico) , poli (ácido láctico) o poli (ácido glicólico-ácido láctico) , y también adecuado con vista al uso medico. Mezclar la solución de polímero y la mezcla de partículas de polímero partículas de sal resulta inicialmente en una pasta que se puede agitar la cual después se vuelve sólida rápidamente según se remueve el solvente . La concentración del polímero en el solución se debe elegir de manera conveniente de modo tal que el polímero se disuelva completamente, por un lado, y por otro lado, el solvente se pueda remover rápidamente sin que las partículas de polímero comiencen a disolverse en alguna extensión significativa. Una relación de pesos de partículas de polímero a polímero disuelto de desde 10:1 a 1:100 ventajosamente de desde 2:1 a 1:25, y en particular de desde 1:1: a 1:10, han probado ser benéficas. En lo que concierne a la relación de pesos de partículas de polímero a partículas de cloruro de sodio, es posible, dentro del contexto de esta modalidad, seleccionar una relación de pesos la cual es mayor con respecto al cloruro de sodio, es decir, de hasta 1:200, 1:500 o 1:1000, con la relación de pesos de polímero total a cloruro de sodio que es aun mayor de 1:100. De esta manera es posible obtener porosidades mayores que el 98%. En el método descrito arriba, el cloruro de sodio sirve como un material porogenico el cual, por definición, se entiende que es un material sólido, o al menos semisólido el cual inicialmente se une con el polímero que forma la matriz para dar una mezcla y el cual se remueve después de la mezcla, resultando en la formación de las cavidades (poros) . Para esto, es conveniente que el material porogenico sea soluble en al menos un solvente y sea esencialmente insoluble en al menos otros solvente más . Un material es esencialmente insoluble cuando, en particular, es menos que 30% en peso, preferiblemente menos del 20% en peso, en particular menos del 10% en peso, por ejemplo, menos del 5, 4, 3, 2, y 1% en peso, soluble bajo las condiciones de procesamiento, es decir, como regla general a temperaturas en el rango desde 18°C a 25°C y a presión atmosférica. La estructura y propiedades de las matrices resultantes se determinan esencialmente por el material porogénico el cual se usa para prepararlas. En este sentido, no es sólo la naturaleza del material porogénico la cual es importante sino también, en especial, la distribución del tamaño de grano de las partículas porogénicas . Por lo tanto, aplica en general, que no sólo el tamaño de poro sino también la conectividad, es decir, la red e cavidades las cuales se comunican unas con otras, se incrementa cuando se incrementa el tamaño del grano. Esta red, la cual se denomina macroestructura o estructura macroporosa, se debe distinguir de los poros que se pueden obtener por espumacion y los cuales, como regla general, están cerrados y por lo tanto forman una estructura la cual se denomina una microestructura o estructura microporosa. La presente invención, por lo tanto, también se refiere al método para preparar una matriz porosa con base en un polímero biológicamente tolerado o mezclas de polímeros, se caracteriza porque una mezcla compuesta de partículas de polímero, partículas de un material porogénico y una solución de polímero se compactan y el material porogénico se disuelve después . Este método en principio no está restringido a las características descritas previamente. Por lo tanto, el polímero se puede seleccionar a partir de polianhídridos , (poli (ortoésteres) , poli (a-hidroxiésteres) , poli (éster amidas), poliamidas, poli (éster éteres), policarbonatos , polialquilenos , polialquilen glicoles, polialquilen óxidos, polialquilen tereftalatos , polivinil alcoholes, polivinil éteres, polivinil esteres, haluros de polivinilo, polivinil pirrolidonas, polisiloxanos, poliestirenos , poli-uretanos , celulosas derivadas y polímeros y copolímeros de ácido (met) acrílico . En tanto que el material porogénico se selecciona preferiblemente a partir de sales solubles en agua, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, fluoruro de sodio, fluoruro de potasio, yoduro de sodio, yoduro de potasio, nitrato de sodio, sulfato de sodio, citrato de sodio, tartrato de sodio, azucares (por ejemplo, sacarosa, fructosa, y glucosa) y mezclas de los mismos, el material también se puede seleccionar a partir de substancias cerosas tales como parafinas, cera de abeja y los similares. En principio, el polímero, el material porogénico y el solvente usado para formar la solución se deben acoplar unos con otros de modo tal que la solución contiene el polímero en forma disuelta y partículas de polímero en forma sólida y el material porogénico permanece esencialmente sin disolver. Las matrices las cuales se obtienen usando los métodos descritos arriba, son del mismo modo parte de la materia objeto de la presente invención. La presente invención también se refiere a implantes los cuales comprenden al menos una de las matrices descritas arriba y al menos un tipo de células. En este sentido, las células se pueden seleccionar en particular, a partir de células del hígado, células del páncreas, células de grasa, células intestinales, células de la piel, células de vasos sanguíneos, células nerviosas, células musculares, células de la glándula tiroides y células de raíces dentales, de acuerdo con el propósito del implante. Las modalidades especiales de implantes de acuerdo a la invención se refieren a las células del hígado y las células del páncreas . La presente invención se refiere además a implantes los cuales comprenden al menos una matriz basada en un polímero tolerado biológicamente y células de al menos dos tipos de células, con las células del primer tipo que son hepatocitos y las células del segundo tipo que son isletas de Langerhans . Esta materia objeto no se restringe a las matrices descritas arriba, es decir, los implantes con base en las matrices de acuerdo a la invención. Las relaciones particulares de hepatocitos a isletas de las células de Langerhans son ventajosas de acuerdo al propósito del implante, es decir, en particular la función a ser satisfecha. Por lo tanto, una modalidad de la invención se refiere a implantes los cuales, después del implante, exhiben las propiedades endocrinas de un órgano pancreático equivalente. Una relación de hepatocitos a isletas de Langerhans de aproximadamente 10s .-3000 ha probado ser ventajosa para este propósito. Otra modalidad de la invención se refiere a implantes los cuales después del implante, llevan a cabo las funciones metabólicas de un hígado. Una relación de epatocitos a isletas de Langerhans de aproximadamente 105:3-200, ventajosamente de 106:10-100, en particular de 106:20-80 y, en particular preferiblemente de aproximadamente 106-35-45, ha probado ser conveniente para este propósito. Se puede notar que tales implantes contienen como regla general otras células además de los hepatocitos y las isletas de Langerhans, principalmente y en particular, otras células hepáticas y células pancreáticas las cuales actúan concomít ntemente e conexión con el aislamiento de las células . Las células o mezclas de células que se deben usar para colonizar las matrices de acuerdo con la invención se pueden obtener en una manera conocida per se. Para el propósito de producir un implante autólogo, las células se derivan preferiblemente del individuo dentro de quien se debe insertar el implante. Por lo tanto, el tejido adecuado, por ejemplo una porción del hígado o el páncreas, se remueve como regla general del individuo y se prepara en un modo adecuado para la inoculación y cultivo de la matriz in vitro. En este sentido, es importante que las células exhiban una velocidad de vitalidad la cual es tan alta como sea posible.

Si se obtienen células del hígado del tejido hepático, se debe tomar en cuenta el hecho de que las células del hígado están rodeadas por una capa de tejido conectivo, en particular en el caso de una cirrosis hepática. De acuerdo a la invención, se usan soluciones de composición definida para que sean capaces de aislar las células del hígado que contienen una proporción de células vitales la cual es tan alta como sea posible . La presente invención se refiere por lo tanto a una composición acuosa la cual contiene NaCl, KC1, y HEPES y tiene un pH de aproximadamente 7.4, y a su uso para la perfusión de una porción del hígado o el páncreas. En particular, 1000 mL de esta solución contienen aproximadamente 8.3 g de NaCl, 0.5 g de C1 y 2.38 g de HEPES. La perfusión se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37°C y una velocidad de flujo de aproximadamente 30 mL/min. Unos cuantos minutos, en particular desde aproximadamente 5 a 120 minutos, por ejemplo, aproximadamente 7 minutos, son suficientes para perfusión de la porción de tejido adecuadamente a la velocidad de flujo mencionada arriba. Alternativamente, es posible también usar una composición acuosa A' la cual contiene ácido etilenglicoltetraacetico (EGTA) para la perfusión una porción del hígado o el páncreas .

La presente invención se refiere además a una composición acuosa B la cual tiene un pH de desde aproximadamente 7.3 a 7.4, preferiblemente aproximadamente 7.35, y la cual contiene NaCl , KC1, HEPES, CaCl2, colagenaza e inhibidor de tripsina, así como a su uso para la reperfusión de una porción del hígado o el páncreas. 1000 mL de la solución contienen preferiblemente 8.3 g de NaCl, 0.5 g de KC1, 2.38 g de HEPES, 0.7 g de CaCl2 x 2H20, 500 mg de colagenaza H y 7.5 mg de inhibidor de tripsina. En este caso, también la perfusión a aproximadamente 37°C y una velocidad de flujo de aproximadamente 30 mL/min ha probado ser conveniente. Unos cuantos minutos, en particular desde aproximadamente 5 a 10 minutos, por ejemplo, aproximadamente 6 a 7 minutos, son suficientes para la perfusión adecuadamente de la porción de tejido. Alternativamente, es posible también usar una composición acuosa B' , la cual contiene colagenaza e hialuronidasa, para la perfusión de una porción del hígado o el páncreas. 1000 mL de la solución contienen preferiblemente desde 5 a 10 U de colagenaza/mL y desde 5 a 10 ü de hialuronidasa/mL . Es ventajoso para la viabilidad de las células a ser aisladas, si la porción de tejido se trata inicialmente con la composición A y después se trata con la composición B. alternativamente, es posible usar una composición A' inicialmente y después usar una composición B' . Enseguida de la perfusión, la porción de tejido se puede diseccionar después y se agita cuidadosamente en un medio adecuado, por ejemplo medio E de Williams. Si la suspensión de células resultante aun contiene relativamente residuos celulares gruesos, estos se pueden remover en una manera conocida per se, por ejemplo, filtrando la suspensión de células a través de una red de nylon (200 µp?) . Las células del filtrado se pueden comprimir cuidadosamente, en conexión con lo cual una centrifugación de tres minutos a 50 g y 4°C ha probado ser ventajoso. Las células las cuales han sido aisladas se cargan en las matrices en una manera conocida per se. Como regla general, las células se cargan a la matriz como una solución que contiene las células y las células y la matriz se incuban entonces, usualmente bajo condiciones de cultivo de células, hasta que las células se adhieren a la matriz. Si se carga más de un tipo de células a una matriz, por ejemplo, hepatocitos e isletas de Langerhans, los diferentes tipos de células se pueden cargar en principio conjuntamente o aun consecutivamente. De acuerdo a una modalidad especial, las isletas de Langerhans se cargan inicialmente, seguido por los hepatocitos, con una incubación en cada caso que se lleva a cabo después de la carga hasta que al menos una parte de las células se adhiere a la matriz. Las matrices e implantes de acuerdo a la invención exhiben ventajas cruciales. Así pues, las dimensiones internas permiten que las matrices sean colonizadas efectivamente con las células. Las matrices son por un lado, moldeables libremente, y por otro lado proporcionan estabilidad y rigidez adecuadas para soportar el procedimiento de implante quirúrgico y resistir las fuerzas mecánicas que actúan en el sitio del implante. La destrucción inicial de células, las cuales se fijan después del implante, es limitado, y después de un corto tiempo, el tejido implantado puede asumir la función pretendida. Poco después del implante o la implantación, los vasos sanguíneos y el tejido de granulación rico en vasos sanguíneos, y también el tejido nervioso, comienza a proliferar dentro del implante. Las matrices de acuerdo a la invención se pueden preparar sin tener que usar solventes fisiológicamente dañinos, por ejemplo, formaldehído, lo cual significa que no se requiere un método especial para eliminar los solventes y no existe peligro de que persistan cantidades residuales de estos solventes. Las matrices e implantes de acuerdo a la invención tienen muchos diferente usos posibles. Aquellos que se pueden mencionar en particular, son los usos en el campo medico. La presente invención por lo tanto también se refiere a las matrices e implantes de acuerdo a la invención para uso terapéutico . Un uso especial en este campo es el de sintetizar tejido (ingeniería de tejidos) . En este caso, las marices de acuerdo a la invención sirven más o menos como andamios dentro de los cuales migran las células y/o sobre los cuales se adhieren las células . Para esto, las matrices pueden, por ejemplo, ser inoculadas con las células deseadas in vitro, es decir, tratadas con una solución que contiene las células e incubadas hasta que las células se han adherido a la matriz. Tal matriz junto con las células que se adhieren a ella (designadas aquí como un implante) se puede someter después a otros pasos de procedimiento, por ejemplo, cultivo posterior, cuando sea apropiado bajo la influencia de compuestos activos, por ejemplo, para el propósito de expandir adicionalmente las células o modificar sus propiedades, y/o ser almacenadas hasta el implante en una manera adecuada, por ejemplo, sobre hielo o en un reactor de bioflujo bajo condiciones estándar. En el contexto de este uso, es ventajoso ser capaces de aislar inicialmente y cuando sea apropiado, también expandir in vitro las células las cuales se pretenden para el implante. En particular, esto hace posible en consecuencia aplicar diferentes tipos de células, tales como los hepatocitos mencionados arriba con las isletas de Langerhans, a una matriz . En lugar de una inoculación in vitro, otra posibilidad es implantar la matriz (sin ninguna adhesión celular previa) con el objetivo de inducir células precursoras, las cuales son capaces de regenerar el tejido, que migran dentro del tejido dañado y ahí regeneran el tejido que se ha perdido. Para esto. La matriz debe ser configurada de modo tal que las células deseadas, pero no las células no deseadas, puedan migrar dentro de la matriz. Tal uso se describe en general como regeneración de tej ido guiada (GTR) . Una matriz de acuerdo con la invención o un implante de acuerdo con la invención se puede usar por lo tanto para tratar el cuerpo humano o animal. Para esto, una o más marices o uno o más implantes, se introducen dentro del cuerpo a ser tratado por medio de una intervención quirúrgica. Si el implante contiene células que tienen una función orgánica, o si las células que tienen una función orgánica deben migrar dentro de la matriz, como es el caso, por ejemplo, con los hepatocitos o las Isletas de Langerhans, las matrices o implantes, por ejemplo, se pueden implantar dentro del mesenterio, el tejido subcutáneo, el retroperitoneo, el espacio properitoneal o el espacio intramuscular del individuo a ser tratado. En principio, cualquier individuo quien requiera un reemplazo de tejido apropiado se puede tratar con las matrices o implantes de acuerdo con la invención, estos individuos como regla general son individuos quienes están sufriendo de un trastorno o enfermedad específica cuyo curso involucra la pérdida de tejido funcional. Esto puede afectar potencialmente órganos completos, por ejemplo, el hígado o el páncreas. Por lo tanto, la presente invención se dirige en particular, a tratar enfermedades las cuales llevan a la falla crónica del hígado o el páncreas. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, hepatitis crónica y cirrosis biliar en adultos así como atresia biliar y defectos metabólicos congénitos en niños . Un transplante de hígado también puede estar indicado en el caso de carcinomas hepáticos. Por otro lado, un transplante de páncreas se indica en particular, en el caso de todas las formas de diabetes mellitus, en particular diabetes mellitus del tipo I o el tipo II . La presente invención también se refiere por lo tanto al uso de una matriz de acuerdo a la invención o de un implante de acuerdo a la invención para hacer disponible un agente terapéutico para llevar a cabo u transplante en un individuo, y en este sentido, en particular para tratar un individuo quien sufre de al menos la pérdida parcial de tejido funcional el cual debe ser reemplazado por el transplante. Los siguientes ejemplos se destinan a ilustrar la invención sin restringir su ámbito . Ejemplo 1 Preparación de la matriz a) Sin solución de polímero Pelotillas de Polímero (Reomer® RG 858, que se pueden obtener de Boehringer, Ingelheim) se congelan en nitrógeno liquido y se muelen en el estado de congelación (sistema de impacto Dáschle; 1200 rpm, 2 min) . Las partículas de polímero molidas se tamizan. Las partículas que tienen un tamaño de desde 108 µ?? a 250 µ?? se usan para preparar la matriz. En este sentido, 165 en peso del polímero empleado tiene un tamaño de partícula de entre 108 µp? y 140 µ?t?, en tanto que 22% en peso del polímero empleado tiene un tamaño de partícula de entre 145 µ?? y 180 µ?t?, 46% en peso del polímero empleado tiene un tamaño de partícula de entre 185 µp? y 200 µp? y 16% en peso del polímero empleado tiene un tamaño de partícula de entre 225 µt? y 250 µp?. Se tamiza cloruro de sodio (sal común) y las partículas de cloruro de sodio que tienen un tamaño de grano de desde 250 µp? a 425 µ?? se usan para preparar la matriz. En este sentido, 25% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 250 µp? y 320 µp?, 44% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 330 µp? y 380 µp? y 31% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 390 µ? y 425 pm. 760 mg de las partículas de cloruro de sodio y 40 mg de partículas de polímero se mezclan unas con otras. La mezcla se introduce en un dado de troquelado y se prensa con una prensa hidráulica por 1 minutos a una presión de ariete de 70.31 kg/cm2 (1000 psi) . Después de lo cual, la matriz en blanco se coloca cobre una placa de teflón y se gasifica por 24 horas en una atmósfera de C02 59.76 kg/cm2 (850 psi) . Las piezas en blanco se remojan después por 24 horas para disolver los granos de sal atrapados. Finalmente, las matrices se secan por 12 horas sobre papel absorbente. La matriz polimérica resultante tiene una porosidad de 95-12% y un tamaño de poro definido, el cual se determina por medio de microscopio electrónico de barrido, de 250 µta ± 120 µp?. b) Con solución de polímero Cloruro de sodio (analíticamente puro) se tritura (sistema de impacto Daschler; 12000 rpm, 2 min) y después se tamiza y las partículas de cloruro de sodio que tienen un tamaño de grano de 108 a 425 pm se usan para preparar la matriz. En este sentido, 8% de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 108 µp? y 140 µp?, en tanto que 6% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 145 µp? y 180 m, 12% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 185 µp? y 220 µ??, 6% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 225 µ?? y 250 um, 25% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 250 µp? y 320 µp?, 26% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 330 µp? y 380 µp? y 17% en peso de la sal empleada tiene un tamaño de partícula de entre 390 µ?? y 425 µ??. 96 g de partículas de cloruro de sodio se mezclan con 1 g de las partículas de polímero descritas en el ejemplo la) y después se tratan con 100 mL de una solución de cloroformo la cual contiene 4 g del polímero en forma disuelta. La mezcla que se obtiene de este modo se calienta a desde 45°C a 65°C, resultando en la evaporación del cloroformo en aproximadamente 25 minutos. La mezcla de sal/polímero resultante se prensa entonces con una prensa hidráulica por un minuto a una presión de ariete de 70.31 kg/cm2 (1000 psi) y se subsecuentemente se remoja por 24 horas para disolver los granos de sal atrapados. La matriz se gasifica después, como se describe arriba, y finalmente se seca por 12 horas sobre papel absorbente. La matriz polimérica resultante tiene una porosidad de 96%. Si se mezclan 98.5 g de partículas de sal con 0.5 g de partículas de polímero y la mezcla se trata con 100 mL de una solución de cloroformo la cual contiene 1 g de polímero, se obtiene una matriz que tiene una porosidad del 99%. Si se mezclan 99.2 g de partículas de sal con 0.1 g de partículas de polímero y esta mezcla se trata con 100 mi de una solución de cloroformo que contiene aproximadamente 0.9 g de polímero, se obtiene una matriz polimérica que tiene una porosidad del 99%. E emplo 2 a) Revestimiento de la matriz con fibronectina La matriz del ejemplo 1 se sumerge en una solución de amortiguador de carbonato la cual contiene 3 de fibronectina derivada de plasma humano (Sigma) /mL y la cual tiene un pH de 9.4. Después de aproximadamente 60 s, la matriz se recupera de la solución se somete a liofilización y ?-esterilizada . Ej emplo 3 Aislamiento de células Una porción de hígado se retira del individuo a ser transplantado, en una manera conocida per se. La porción de hígado que se ha removido se infiltra o perfunde antes que nada por 7 minutos, a una velocidad de flujo de 30 mL/min y a 37°C, con una solución (8.3 g de NaCl ; 0.5 g de KC1; 2.38 g de HEPES; aforada a 1000 mL con agua destilada; pH 7.4). la porción de hígado se infiltra después por otros 6 a 7 min, a una velocidad de flujo de 30 mL/min y a 37°C, con una solución inhibidora de colagenaza/tripsina (8.3 g de NaCl; 0.5 g de KC1; 2.38 g de HEPES; 0.7 g de CaCl2 x 2¾0; 500 mg de colagenaza (Colagenaza H, Boehringer Mannheira, Mannheim, Alemania); 7.5 mg , de inhibidor de tripsina (ICN, Eschwege, Alemania); elevada a 1000 mL con agua destilada; pH 7.35). Después de que la perfusión hay llegado a su fin, la porción de hígado se disecciona y se agita cuidadosamente en medio E de Williams. La suspensión de células se filtra (red de nylon; 200 pm) y después se lava con medio E de Williams. Después de eso, las células se someten a centrifugación a 50 g a 4°C por 3 min. La vitalidad de las células, la cual se determina usando Azul de Triptan, es de 95%. Las isletas de Langerhans se aislan del mismo modo a partir de una porción de páncreas. Ejemplo 4 Colonización de células En el primer paso, las matrices las cuales se revistieron en el Ejemplo 2 se incuban con las isletas de Langerhans las cuales se aislaron como se describe en el ejemplo 3. Para esto, 3000 isletas se suspendieron, por mL, en una mezcla de solución compuesta de MI19 y FCS (relación de volumen de 19:1) . El número de células se determinó contabilizándolas en un tubo de conteo de 0.25 mm bajo un microscopio Olympus invertido. De 8 mL a 10 mL de esta solución se aplicaron después a la matriz usando una pipeta. Se desecha la solución de exceso la cual no permanece en la matriz. La matriz, la cual se ha tratado de este modo se coloca después, por 4 horas, en un incubador de cultivos celulares para permitir que la células se adhieran. Una solución que consiste de medio E de Williams, la cual contiene por mL, una suspensión de células hepáticas no purificada que contiene aproximadamente 5.0 x 107 hepatocitos vitales y aproximadamente 1.0 x 106 células hepáticas no parenquimatosas , se aplica después a la matriz. Desde 8 mL a 12 mL de la solución se cargan usando una pipeta; se desecha la solución de exceso la cual no es asimilada por la matriz. La matriz se puede mantener durante aproximadamente 1.5 horas en hielo antes del implante. Si se planea un implante para un momento posterior, la matriz se puede almacenar bajo condiciones estándar en un reactor de bioflujo hasta por 5 días . Ejemplo 5 Actividad secretoria y velocidad de proliferación de los hepatocitos Ratas de Lewis se transplantaron con matrices colonizadas por células como se describe en el ejemplo 4. Los transplantes se retiraron otra vez de los animales a varios tiempos y se examinaron morfometricamente . El número de células en los transplantes, los cuales exhibían la forma de un disco circular que tenía un diámetro de 15 mm y un espesor de 2 mm, fue de 94 x 103, 140 x 103 y, respectivamente, 146 x 103 a 1, 6, y 12 meses después del transplante. Los hepatocitos del transplante los cuales se removieron un mes después del transplante exhibieron expresión normal de albúmina. Los hepatocitos proliferantes se encuentran en todas las preparaciones sin que exista ningún incremento patológico en la velocidad de proliferación. Los hepatocitos los cuales se han transplantado de acuerdo con la invención, exhiben una incorporación de BrdU la cual se incrementa en un factor de 3 en comparación con el de las preparaciones hepáticas estándar. Ej emplo 6 Vascularización La investigación posterior de las matrices descritas en el ejemplo 4 muestra que estas matrices se encuentran notablemente bien vascularizadas sólo un mes después del implante. Los vasos sanguíneos se extiende microscópicamente a la matriz y los hepatocitos transplantados y las isletas de-Langerhans logran el contacto como resultado de una capilarización adecuada, con el sistema cardiovascular del transplante receptor. Se puede observar además que las isletas co- transplantadas de células de Langerhans no provocan hipoglucemia en el receptor. El desempeño de la secreción endocrina de estas células, y también de las isletas propias del receptor, se regula presumiblemente por un mecanismo de retroalimentación . Ejemplo 7 Adopción de la función hepática Las Ratas de Gunn se conocen como un modelo animal para el síndrome de Crigler-Na ar humano puesto que, como resultado de un defecto enzimático congénito, sus hígados son incapaces de conjugar adecuadamente la bilirrubina. Como consecuencia, los niveles de plasma sanguíneo tóxicos de bilirrubina no conjugada llevan a la muerte como resultado del daño crítico substancial . Tres ratas de Gunn se transplantaron con una matriz colonizada por células como se describe en el ejemplo 4. La matriz tuvo un área externa en total de 10 cm2. El nivel de bilirrubina en los animales experimentales se redujo sólo cuatro semanas después del transplante. La bilirrubina es desde ahora en adelante conjugada. En todos los tres casos, se puede detectar la bilirrubina conjugada usando una sonda de cuto biliar, en los ductos biliares del hígado que se encuentran aun presentes. Consecuentemente, la bilirrubina la cual se conjuga en la matriz alcanza el hígado hematogénicamente y se puede eliminar del hígado por medio del sistema de ductos biliares. E emplo 8 Pacientes humanos Matrices colonizadas con células como se describe en el ejemplo 4 se transplantan en la cavidad abdominal de un paciente que sufre de una cirrosis hepática pronunciada. La tabla 1 de abajo resumen los descubrimientos de laboratorio del paciente antes del transplante. Tabla 1 Al paciente 1 (cirrosis hepática etílica, previamente se descompensó varias veces, ahora no activo) se le dieron 4 matrices (en cada caso 124 mm x 45 mm x 5 mm) . La Tabla 2 de abajo resume los valores del hígado 3, 10 y respectivamente 20 semanas después del transplante.

Tabla 2 Paciente 1 3 10 20 GOT 22 10 11 GPT 28 9 28 GGt 71 10 9 Albúmina de suero 28.6 42 44 CHE 2652 4400 4600

Claims (45)

1. REIVINDICACIONES 1. Una matriz porosa con base de polímero o mezcla de polímeros tolerados biológicamente, caracterizada porque, la matriz posee poros que tiene un tamaño de 150 µ?a o menos y poros que tienen un tamaño de 300 \im o más y el grado de porosidad es desde 93 a 98%.
2. 2. La matriz como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizada porque, la matriz posee poros que tienen un tamaño de 130 µp? o menos.
3. 3. La matriz como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque, la matriz posee poros que tienen un tamaño de 370 ]i o más.
4. 4. La matriz como se reivindica en una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque, el polímero tolerado biológicamente es un polímero que se puede degradar biológicamente .
5. 5. La matriz como se reivindica en una de las reivindicaciones, precedentes, caracterizada porque, el polímero que se puede degradar biológicamente se selecciona a partir de polímeros naturales tales como albúmina, fibrinogeno, colágeno, gelatina, quitina, quitosan, agarosa, alginato y polímeros sintéticos tales como polianhídridos , poli ( -caprolactona) y poli (a-hidroxiésteres) .
6. 6. La matriz como se reivindica en la reivindicación 5, caracterizada porque, el polímero que se puede degradar biológicamente es poli (ácido glicolico-ácido láctico) que tiene un contenido de ácido láctico de aproximadamente 85 % mol y un contenido de ácido glicólico de aproximadamente 15 % mol .
7. 7. La matriz porosa como se reivindica en una de las reivindicación 1 a 6, caracterizada porque, la superficie de la matriz se reviste con al menos una proteína de matriz extracelular .
8. 8. La matriz como se reivindica en la reivindicación 7, caracterizada porque, la proteína de matriz extracelular se selecciona a partir de colágenos, laminina y fibronectina .
9. 9. La matriz como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizada porque, el revestimiento contiene fibronectina .
10. 10. La matriz como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizada porque, el revestimiento contiene una mezcla de colágeno del I, laminina y colágeno del tipo IV.
11. 11. La matriz como se reivindica en la reivindicación 10, caracterizada porque, la mezcla contiene las proteínas en contenidos en peso aproximadamente iguales .
12. 12. Un método para preparar una matriz porosa con base de polímero o mezclas de polímeros que se pueden degradar biológicamente, caracterizado porque, la mezcla de partículas de polímero, que tiene un tamaño de grano en el rango de desde aproximadamente 20 a 950 µp?, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 50 a 760 µ?? y en particular, en el rango de desde aproximadamente 108 a 250 µp?, y partículas de cloruro de sodio que tienen un tamaño de grano en el rango de desde aproximadamente 90 a 670 µp?, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 110 a 520 µp?, y en particular en el rango de desde aproximadamente 250 a 425 µp?, se compacta y después se disuelve el cloruro de sodio.
13. 13. El método como se reivindica en la reivindicación 12, caracterizado porque, la mezcla de partículas de cloruro de sodio comprende desde 15 a 50% en peso, preferiblemente desde 18 a 42% en peso, y en particular desde 22 a 28% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 250 µ?a a 320 µp? desde 20 a 65% en peso, preferiblemente desde 30 a 52% en peso, y en particular desde 42 a 46% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 330 a 380 µp?, y desde 15 a 62% en peso, preferiblemente desde 25 a 42% en peso y en particular desde 29 a 33% en peso de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 390 µp? a 425 um.
14. 14. El método como se reivindica en la reivindicación 12, caracterizado porque, la mezcla de partículas de cloruro de sodio comprende desde 1 a 15% en peso, preferiblemente desde 4 a 12% en peso, y en particular desde 7 a 9% en peso de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 108 µ?? a 140 µ?? desde 1 a 11% en peso, preferiblemente desde 3 a 9% en peso, y en particular desde 5 a 7% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 145 µ?t? a 180 um, desde 3 a 21% en peso, preferiblemente desde 7 a 17% en peso, y en particular, desde 10 a 14% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 185 µp? a 220 µ??, desde 1 a 11% en peso, preferiblemente desde 3 a 9% en peso, y en particular desde 5 a 7% en peso de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 225 µp? a 250 µ?a, desde 15 a 50% en peso, preferiblemente desde 18 a 42% en peso, y en particular desde 22 a 28% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 250 µpa a 320 µ?a, desde 15 a 50% en peso, preferiblemente desde 18 a 42% en peso, y en particular desde 22 a 28% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 330 µp? a 380 µ??, y desde 5 a 29% en peso, preferiblemente desde 10 a 24% en peso, y en particular desde 15 a 19% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 390 um a 425 µp?.
15. 15. El método como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque, la mezcla de partículas de polímero comprende desde 5 a 50% en peso, preferiblemente desde 10 a 30% en peso, y en particular desde 14 a 18% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 108 pm a 140 pm, desde 10 a 55% en peso, preferiblemente desde 15 a 40% en peso, y en particular desde 20 a 24% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 145 µp? a 180 µp?, desde 18 a 88% en peso, preferiblemente desde 32 a 76% en peso, y en particular desde 43 a 49% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 185 µp? a 220 µp?, y desde 5 a 45% en peso, preferiblemente desde 10 a 28% en peso, y en particular desde 14 a 18% en peso, de partículas que tienen un tamaño de grano de desde 225 µ?a a 250 µp?.
16. 16. El método como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque, la relación en pesos de partículas de polímero a partículas de cloruro de sodio es desde 1:100 a 1:10, ventajosamente desde 1:50 a 1:15 y, en particular desde 1:20 a 1:18.
17. 17. El método como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque, se agrega una solución de polímero a la mezcla compuesta de partículas de polímero y partículas de cloruro de sodio, y el solvente se remueve antes de la compactacion.
18. 18. El método como se reivindica en la reivindicación 17, caracterizado porque, el solvente disuelve el polímero pero no la sal .
19. 19. El método como se reivindica en la reivindicación 18, caracterizado porque, el solvente se selecciona a partir de acetona, acetato de etilo, cloruro de metileno, cloroformo, hexafluoroisopropanol , hidrocarburos alifáticos y aromáticos, clorados y florados, tetrahidrof rano, etil metil cetona, dietil cetona y mezclas de los mismos.
20. 20. El método como se reivindica en la reivindicación 19, caracterizado porque, el polímero es (poli (ácido glicólico) , poli (ácido láctico) o poli (ácido glicólico-ácido láctico) y el solvente es cloroformo.
21. 21. El método como se reivindica en una de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque, la relación de pesos de partículas de polímero a polímero disuelto es desde 10:1 a 1:100, ventajosamente desde 2:1 a 1:25 y, en particular, desde 1:1 a 1:10.
22. 22. El método como se reivindica en la reivindicación 12, caracterizado porque, la compactación se efectúa por la acción de la presión.
23. 23. El método como se reivindica en la reivindicación 22, caracterizado porque, la presión está en el rango de desde aproximadamente 54.84 kg/cm2 a 101.95 kg/cm2 (780 psi a 1450 psi) , ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 59.06 kg/cm2 a 86.48 kg/cm2 (840 psi a 1230 psi), y en particular en el rango desde aproximadamente 63.28 kg/cm2 a 77.34 kg/cm2 (900 psi a 1100 psi).
24. 24. El método como se reivindica en la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque, la duración de la acción está en el rango de desde aproximadamente 10 s a 360 s, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 40 s a 180 s, y en particular en el rango de desde aproximadamente 50 s a 70 s.
25. 25. El método como se reivindica en una de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque, la temperatura a la cual se efectúa la acción está en el rango de desde aproximadamente -76°C a 42°C, ventajosamente en el rango de desde 0°C a 32°C, y en particular en el rango de desde 18°C a 25°C.
26. 26. El método como se reivindica en la reivindicación 12, caracterizado porque, se permite que el agua actué sobre la mezcla compactada para el propósito de disolver el cloruro de sodio.
27. 27. El método como se reivindica en la reivindicación 26, caracterizado porque, la duración de la acción está en el rango de desde aproximadamente 1 h a 80 h, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 12 h a 62 h, y en particular en el rango de desde 36 h a 60 h.
28. 28. El método como se reivindica en la reivindicación 26 o 27, caracterizado porque, el agua se remueve otra vez.
29. 29. El método como se reivindica en la reivindicación 12, caracterizado porque, la mezcla compactada se almacena antes que nada en una atmósfera de CO2 y el cloruro de sodio se disuelve subsecuentemente.
30. 30. El método como se reivindica en la reivindicación 29, caracterizado porque, la presión de C02 está en el rango de desde aproximadamente 9.84 kg/cm2 a 116.00 kg/cm2 (140 psi a 1650 psi) , venta osamente en el rango de desde aproximadamente 18.28 kg/cm2 a 78.74 kg/cm2 (360 psi a 1120 psi) , y en particular en el rango de desde aproximadamente 56.25 kg/cm2 a 63.28 kg/cm2 (800 psi a 900 psi).
31. 31. El método como se reivindica en la reivindicación 29 o 30, caracterizado porque, el tiempo de almacenamiento está en el rango de desde aproximadamente 1 h a 180 h, ventajosamente en el rango de desde aproximadamente 3 h a 60 h, y, en particular en el rango de desde aproximadamente 12 h a 36 h.
32. 32. Un método para preparar una matriz porosa con base de polímero o mezcla de polímeros tolerada biológicamente, caracterizado porque, una mezcla compuesta de partículas de polímero, partículas de un material porogénico y una solución de polímero se compactan y se disuelve el material porogénico.
33. 33. El método como se reivindica en la reivindicación 32, caracterizado porque, el polímero se selecciona a partir de polianhídridos , poli (ortoésteres) , poli (a-hidroxiésterés) , poli (éster amidas), poliamidas, poli (éster esteres), policarbonatos, polialquilenos , polialquilen glicoles, polialquilen óxidos, polialquilen tereftalatos, polivinil alcoholes, polivinil éteres, polivinil esteres, haluros de polivinilo, polivinilpirrolidonas , polisiloxanos , poliestirenos , poliuretanos , celulosa derivadas y polímeros y copolímeros de ácido (met ) acrílico .
34. 34. El método como se reivindica en la reivindicación 32, caracterizado porque, el material porogénico se selecciona a partir de las sales solubles en agua.
35. 35. El método como se reivindica en la reivindicación 34, caracterizado porque, la sal soluble en agua se selecciona partir de cloruro de sodio, cloruro de potasio, fluoruro de sodio, fluoruro de potasio, yoduro de sodio, yoduro de potasio, nitrato de sodio, sulfato de sodio, citrato de sodio, tartrato de sodio, azucares y mezclas de los mismos.
36. 36. El método como se reivindica en la reivindicación 32, caracterizado porque, la solución contiene polímero en forma disuelta y partículas de polímero en forma sólida.
37. 37. El método como se reivindica en la reivindicación 32, caracterizado porque, la solución no disuelve el material porogénico.
38. 38. Una matriz la cual se caracteriza porque, se puede obtener usando un método de las reivindicaciones 11 a 37.
39. 39. Un implante el cual se caracteriza porque, comprende una matriz como se reivindica en una de las reivindicaciones 1 a 11 o 38 y al menos un tipo de células.
40. 40. Un implante el cual comprende una matriz con base de un polímero biológicamente tolerado y células de la menos dos tipos de células, caracterizado porque, las células del primer tipo de células son hepatocitos y las células del segundo tipo de células son células de isletas de Langerhans .
41. 41. El implante como se reivindica en la reivindicación 40, caracterizado porque, la relación de hepatocitos a isletas de Langerhans es de aproximadamente 106:3000
42. 42. El implante como se reivindica en la reivindicación 40, caracterizado porque, la relación de hepatocitos a isletas de células de Langerhans es de aproximadamente 106:3-200, ventajosamente de aproximadamente 106:10-100, en particular aproximadamente 10s: 20-800 y en particular preferiblemente de aproximadamente 106:35-45.
43. 43. Un método para obtener células para inocular una matriz que se puede implantar, caracterizado porque, (i) se remueve una porción de tejido de un individuo; (ii) la porción de tejido se trata con una composición la cual contiene, NaCl, KC1, HEPES, CaCl2, colagenasa e inhibidor de tripsina y tiene un pH de desde aproximadamente 7.3 a 7.4; (iii) la porción de tejido tratada se disecciona, si es necesario; (iv) la porción de tejido se agita en un medio adecuado; (v) y al menos una parte de la suspensión de células resultante se aisla.
44. 44. El método como se reivindica en la reivindicación 43, caracterizado porque, la porción de tejido se trata inicialmente, después de la remoción, con otra composición la cual contiene NaCl, KCl y HEPES y tiene un pH de aproximadamente 7.4.
45. 45. El método como se reivindica en la reivindicación 43, caracterizado porque, la suspensión de células resultante se somete a centrifugación a aproximadamente 50 g y 4°C y se aisla la pelotilla de células.