MXPA05000552A - Metodos y medios para controlar la sialilacion de proteinas producidas por celulas de mamifero. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona medios y metodos para cultivar celulas de mamifero por los cuales se incrementa la sialilacion de una proteina producida por las celulas. El medio puede contener N-acetilmanosamina y, opcionalmente, galactosa. El medio tambien puede comprender fructosa y manosa. De manera alternativa, el medio puede contener galactosa y fructosa y, opcionalmente, tambien puede comprender manosa y/o N-acetilmanosamina. Los metodos pueden ser practicados junto con otros metodos para cultivar celulas para incrementar la cantidad o calidad de una proteina producida por las celulas, incluyendo cultivar las celulas a una temperatura inferior a 37 degree C.

Description

METODOS Y MEDIOS PARA CONTROLAR LA SIALILACION DE PROTEINAS PRODUCIDAS POR CELULAS DE MAMIFERO CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con métodos y medios para controlar la sialilación de una proteína producida por células cultivadas. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las proteínas son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico, farmacológicas, agrícolas, nutricionales y de investigación. Dado el alto costo de producir proteínas, especialmente proteínas terapéuticas, aún en pequeños incrementos en la eficiencia de producción o en la función y estabilidad de una proteína pueden ser valiosos . La función y estabilidad, y en consecuencia, la utilidad, de una proteína puede ser afectada por la adición postraslacional de residuos de azúcar a la proteína para formar una glicoproteína . Por ejemplo, la adición de residuos de ácido siálico terminales a polisacáridos unidos a una glicoproteína generalmente incrementa el tiempo de vida de la proteína en la corriente sanguínea y puede, en casos particulares también afectar la solubilidad, estabilidad térmica, resistencia al ataque por proteasa, antigenicidad y actividad específica de algunas glicoproteínas . Véase por ejemplo Gu and Wang (1998), Biotechnol . y Bioeng. 58 (6) :642- Ref: 161202 48; Morell et al. (1968), J. Biol . Chem. 243(1): 155-59. Por lo tanto es deseable incrementar el contenido de ácido siálico de una glicoproteina, especialmente una glicoproteína a ser usada para aplicaciones farmacológicas. SUMARIO DE LA INVENCION La invención proporciona medios y métodos para cultivar células de "mamífero para producir una proteina, opcionalmente una proteina recombinante secretada, y para controlar u, opcionalmente, para incrementar, el contenido de ácido siálico de la proteina. La invención proporciona un método para incrementar la producción y/o sialilación de una proteína por células de mamífero, que comprende cultivar las células en un medio que comprende galactosa y fructosa. El medio puede estar libre de suero y también puede comprender N-acetilmanosamina y/o mañosa. Las concentraciones de galactosa, mañosa y fructosa que pueden ser cada una de aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 40 m , de aproximadamente 0.5 mM hasta aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 mM. La concentración de N-acetilmanosamina puede ser de al menos aproximadamente 0.8 mM, opcionalmente de al menos aproximadamente 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, o 20 mM. La proteína puede ser una proteína secretada, recombinante, y las células de mamífero pueden ser células CHO. Las células pueden ser cultivadas a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 35°C. En otra modalidad, la invención proporciona un medio, opcionalmente un medio libre de suero, para cultivar células de mamífero que comprenden galactosa y fructosa y, opcionalmente, N-acetilmanosamina y/o mañosa. La galactosa, mañosa y fructosa pueden estar en concentraciones de aproximadamente 0.1 m hasta aproximadamente 40 mM cada una, de aproximadamente 0.5 mM hasta aproximadamente 20 mM cada una, de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 10 mM cada una, o de aproximadamente 1 m hasta aproximadamente 5 mM cada una. La M-acetilmanosamina puede estar a una concentración de al menos aproximadamente 0.8 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, o 20 mM. En una modalidad, la invención abarca un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína, que comprende cultivar una célula de mamífero que produce la proteína en un medio que comprende N-acetilmanosamina y galactosa. El medio puede comprender además fructosa y mañosa. Opcionalmente, la fructosa y mañosa pueden estar presentes cada una a una concentración de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM. La fructosa y mañosa pueden estar a la misma o diferentes concentraciones. La célula puede ser cultivada a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 37°C, opcionalmente, a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 36°C, o de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 35°C. La concentración de N-acetilmanosamina en el medio puede ser de al menos aproximadamente 0.8 mM, y la concentración de galactosa en el medio puede ser de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM. La proteína puede ser una proteína secretada y/o recombinante y puede ser producida en una célula CHO . En una modalidad adicional, la invención comprende una combinación con un medio para cultivar células de mamífero en el cual la galactosa y N-acetilmanosamina y, opcionalmente, también la fructosa y mañosa son combinadas con el medio. La fructosa puede estar a una concentración de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM, y la mañosa puede estar a una concentración de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM. La N-acetilmanosamina puede estar a una concentración de al menos aproximadamente 0.8 mM, y la galactosa puede estar a una concentración de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM. Las células de mamífero pueden ser células CHO, y el medio puede estar libre de suero. Además, la invención proporciona un método mejorado para producir una proteína cultivando células de mamífero que expresan la proteína que comprende cultivar las células de mamífero a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 35°C en un medio que · comprende N-acetilmanosamina . El medio también puede comprender galactosa y, opcionalmente , también fructosa y mañosa. La concentración de galactosa, mañosa y fructosa puede ser de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 m cada una. Las concentraciones de galactosa, mañosa y fructosa pueden ser las mismas o diferentes entre sí . La concentración de N-acetilmanosamina puede ser de aproximadamente al menos 0.8 mM, y el medio puede estar libre de suero. Las células de mamífero pueden ser células CHO, y la proteína puede ser una proteína secretada, recombinante . Finalmente, la invención proporciona un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína recombinante que comprende cultivar células de mamífero que expresan la proteína recombinante a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 35°C en el medio que comprende fructosa, galactosa, mañosa y N-acetilmanosamina, donde las concentraciones de fructosa, galactosa y mañosa en el medio son de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM cada una y donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos 0.8 mM. Las concentraciones de fructosa, mañosa y galactosa pueden ser las mismas o diferentes entre sí . BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una red de vías metabolicas que conducen a la sialilación de glicoproteínas .- Corfield and Schauer (1979), Biol . Cellulaire 35:213-26; Gu and Wang (1998), Biotechnol . and Bioeng. 58(6): 642-48. Las moléculas usadas en la invención están encasilladas. La retroalimentación negativa se muestra por un signo menos adyacente a una flecha que contiene una línea punteada. La Figura 2 compara la fracción que eluye con un alto contenido de sal de la región extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral fusionado a la región Fe de un anticuerpo (TNFR:Fc, el cual se describe en la Patente Estadounidense No. 5,395,760) sobre una columna de intercambio aniónico cuando el 'TNFR: Fe es producido por cultivos que crecen en medios con los aditivos indicados . Todas las muestras, incluyendo las producidas por un cultivo sin aditivos ("Control" marcado), son comparados con un solo lote de TNFR : Fe producido en un experimento separado por cultivos que crecen sin aditivos en el medio. La Figura 3 es una gráfica de contorno hecha usando el programa de computadora JMP (descrito más adelante) , que muestra las moles de ácido N-acetilneuramínico (NANA) por mol de TNFR: Fe (impresas en negrillas y encasilladas después de cada uno de los puntos de los datos mostrados en este experimento y marcados como parte de cada línea del contorno) producidos por células cultivadas crecidas en medios con las concentraciones indicadas de N-acetilmanosamina y azúcares (fructosa, galactosa y mañosa) .

DEFINICIONES Un anticuerpo, como se usa aquí, es una proteína o complejo de proteínas, cada uno de los cuales comprende al menos uno, u opcionalrnente al menos dos, dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos diméricos, o un complejo de orden superior de proteínas incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos heterodiméricos y anticuerpos tetraméricos . Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico a o sustancialmente similar a un dominio CL, CH1, CH2 , CH3 o CH4, de origen humano o animal. Véase por ejemplo Hasemann and Capra, Immunoglobulins : Structure and Function, en William E. Paul, ed. , Fundamental Immunology, Segunda Edición, 209, 210-218 (1989). Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo es de al menos 10 aminoácidos de longitud, opcionalrnente de al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 aminoácidos de longitud. Una porción Fc de un anticuerpo incluye dominios de inmunoglobulina humanos o animales CH2 o CH3 o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a esos. Para una discusión, véase Hasemann and Capra, supra, a 212-213. Una glicoproteína como se usa aquí, es una proteína que ha sido modificada mediante la adición de uno o más carbohidratos, incluyendo, especialmente, la adición de uno o más residuos de azúcar. · · Un oligosacárido o polisacárido es una cadena de dos o más residuos de azúcar ligados por enlaces químicos covalentes . Sialilación, como se usa aquí es la adición de un residuo de ácido siálico a una proteina, la cual puede ser una glicoproteina . El término ácido siálico, como se usa aquí, abarca una familia de azúcares que contiene 9 o más átomos de carbono, incluyendo un grupo carboxilo. Una estructura genérica que abarca todas las formas naturales conocidas del ácido siálico se muestra más adelante.

Los grupos Rl en varias posiciones o una sola molécula pueden ser los mismos o diferentes entre sí. Rl puede ser un hidrógeno o un grupo acetilo, lactilo, metilo, sulfato, fosfato, anhidro, ácido siálico, fucosa, glucosa o galactosa. R2 puede ser un grupo N-acetilo, N-glicolilo, amino, hidroxilo, N-glicolil-O-acetilo, o- N-glicolil-O-metilo. R3 representa el residuo de azúcar precedente a un oligosacárido al cual está unido al ácido siálico en el contexto de una glicoproteína . R3 puede ser galactosa (conectada en su posición 3, 4 ó 5), N-acetil-galactosa (conectada en su posición 6) , N-acetil-glucosa (conectada en su posición 4 ó 6) , ácido siálico (conectado en su posición 8 ó 9), o ácido 5-N-glicolil-neuramínico . Essentials of Glycobiology, Ch. 15, Varki et al., eds., cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999). Han sido encontradas más de 40 formas de ácido siálico en la naturaleza. Essentials of Glycobiology, Ch. Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999) . Una forma común del ácido siálico es el ácido N-acetilneuramínico (NANA) , en el cual Rl es un hidrógeno en todas las posiciones y R2 es un grupo n-acetilo. Las proteínas sustancialmente similares son al menos 80%, opcionalmente al menos 90%, idénticas entre sí en una secuencia de aminoácidos y mantienen o alteran en una forma deseable la actividad biológica de la proteína no alterada. El por ciento de identidad de dos aminoácidos o dos secuencias de ácido nucleico puede ser determinado por inspección visual y cálculo matemático, o de manera más preferible, la comparación se efectúa comparando la información de la secuencia usando un programa de computadora. Un programa de computadora ejemplar es la versión 10.0 del programa del paquete Wisconsin del Genetics Computer Group (GCG; Madison, I) , "GAP" (Devereux et al. (1984), Nucí. Acids Res. 12:387). Los parámetros predeterminados preferidos por el programa "GAP" incluyen: (1) la implementación GCG de una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para la ausencia) para nucleótidos, y la matriz de comparación de aminoácidos ponderada de Gribskov y Burgess (1986), Nucí. Acids Res. 14:6745, de acuerdo a lo descrito por Schwartz and Dayhoff, eds . , Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalidad de 30 por cada hueco o espacio y una penalidad adicional de 1 por cada símbolo en cada hueco o espacio de las secuencias de aminoácidos, o penalidad de 50 por cada hueco o espacio y una penalidad adicional de 3 por cada símbolo en cada hueco o espacio para secuencias nucleotídicas ; (3) sin penalidad por huecos o espacios finales; y (4) sin penalidad máxima por huecos o espacios grandes. Las regiones de las dos proteínas que son alineadas por GAP para su comparación son de al menos 10 aminoácidos de longitud, opcionalmente de al menos 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250 ó 300 aminoácidos de longitud. También pueden ser usados otros programas usados por aquellos expertos en la técnica de la comparación de secuencias. Un experto en la técnica reconocerá que los parámetros elegidos pueden afectar el por ciento de identidad y para la mayoría de las veces si las secuencias son diferentes. Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o sustancialmente similar al dominio VL o VH de origen humano o animal . Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable es de al menos 10 aminoácidos de longitud, opcionalmente, de al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 aminoácidos de longitud. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La adición de carbohidratos a proteínas (aquí el término glicosilación de proteínas) y el procesamiento posterior de esos carbohidratos puede afectar el pliegue o doblez, estabilidad, y propiedades funcionales de una proteína. Lodish et al. Molecular Cell Biology, Capítulo 17, W.H. Freeman, New York (2000) . Por ejemplo, la proteína precursora de hemaglutinina no se pliega apropiadamente en presencia de tunicamicina, un antibiótico que interfiere con la producción de un precursor oligosacárido necesario para la glicosilación ligada a N (descrita más adelante) . Id. Además, una forma no glicosilada de la fibronectina es secretada normalmente por los fibroblastos, pero es degradada más rápidamente que la fibronectina glicosilada. Lodish et al., supra. - ¦ La mayoría de las proteínas secretadas y proteínas de la superficie celular contienen al menos una cadena de carbohidrato; además, en numerosas proteínas citoplásmicas y nucleares están también glicosiladas . Lodish et al., supra; Essentials of Glycobiology, Ch. 13, Varki et al., eds . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999) . Un conjunto de enzimas capaces de proteínas glicosilantes se localizan dentro del retículo endopl smico y del aparato de Golgi, organelos que la secretan y proteínas de la superficie celular que pasan a través de su trayectoria hacia la membrana celular y mas allá. La identificación de enzimas nucleares y/o citoplásmicas que pueden ejecutar funciones similares sigue siendo incierta. Essentials of Glycobiology, Ch. 13, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999) . Aunque la glicosilacion de proteínas es un proceso complejo y variable, las modificaciones con carbohidratos de proteínas pueden ser divididas, aproximadamente, en dos clases, glicosilacion ligada a O y glicosilacion ligada a N. ambas de ellas implican la adición de oligosacáridos a aminoácidos específicos dentro de una proteína. Los polisacáridos ligados a 0 son ligados a un grupo hidroxilo, usualmente al grupo hidroxilo de un residuo de serina o treonina. Los O-glicanos no son agregados a residuos de serina y treonina, y el criterio para determinar- cuales serinas y treoninas serán glicosiladas no han sido determinados completamente. Los O-glicanos usualmente comprenden una o dos ramificaciones y comprenden de uno a cuatro tipos diferentes de residuos de azúcar, los cuales son agregados uno por uno. Con frecuencia, el residuo terminal es un ácido siálico. En contraste, los polisacáridos ligados en N son unidos al nitrógeno amida de una asparagxna. Unicamente las asparaginas que son parte de una de dos secuencias tripeptidicas , asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina (donde X es cualquier aminoácido excepto prolina) , es un blanco de la glicosilación. El primer paso en la glicosilación ligada a N implica la adición de un oligosacárido complejo, preformado, ramificado que consiste de tres residuos de glucosa, nueve de mañosa, y dos de N-acetilglucosamina. Este oligosacárido es procesado adicionalmente por un complejo y series variables de pasos, dando como resultado la adición y remoción de varios residuos de azúcar. En el producto final, el residuo terminal sobre cada ramificación del polisacarido puede ser, pero no siempre un ácido siálico. Lodish et al., supra. Los N-glicanos pueden tener de una a cinco ramificaciones. Varki et al. supra. El trabajo anterior ha determinado una red de vías biosintéticas que conduce a la adición de ácido siálico a proteínas, como se ilustra en la Figura 1. Gu and Wang, supra; Corfield and Schauer, supra. Una gran variedad de moléculas están implicadas en varias etapas en la síntesis de ácido siálico y su unión a glicoproteínas, incluyendo azúcares como la glucosa, mañosa, fructosa, y galactosa, nucleótidos como el ATP y CTP, y un anfitrión de enzimas necesarias para catalizar los numerosos pasos biosintéticos implicados, por nombrar solo unas cuantas de las numerosas moléculas implicadas. La Figura 1 también ilustra dos puntos en esta red de vías donde se sabe que ocurre una inhibición por retroalimentacion negativa (líneas punteadas con cabezas de flechas) . Además, Gu and Wang {supra) han reportado que la adición de N-acetilmanosamina al medio de cultivo da como resultado un incremento de la sialilación de una proteína producida por las células cultivadas. Sin embargo, la utilidad comercial de la N-acetilmanosamina es actualmente limitada por su costo, y por lo tanto son necesarias condiciones de cultivo u otros aditivos para el medio con efectos similares o mejores. En consecuencia, la invención proporciona un método para incrementar la sialilación de una glicoproteína producida por un cultivo celular, que comprende agregar al cultivo celular N-acetilmanosamina y galactosa. En una modalidad más, la invención proporciona un método para incrementar la sialilación de una glicoproteína producida por un cultivo celular, que comprende cultivar células en un medio que comprende N-acetilmanosamina, galactosa, fructosa y mañosa. De manera alternativa, la sialilación puede ser incrementada cultivando las células en un medio que comprende galactosa y fructosa y, opcionalmente, también N-acetilmanosamina y/o mañosa. En otra modalidad más, la invención abarca una mejora de un método para producir una proteina, que comprende cultivar células de mamífero que expresan la proteína a una temperatura inferior a 37°C, opcionalmente de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 36°C o de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 35°C, o de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 33 °C, en un medio que comprende N-acetilmanosamina. En otro aspecto, la invención proporciona un medio de cultivo para células de mamífero que comprende N-acetilmanosamina, galactosa, y opcionalmente, también fructosa y/o mañosa. La concentración de N-acetilmanosamina puede ser de al menos aproximadamente 0.8 milimolar (mM) , opcionalmente de al menos aproximadamente 2 mM, al menos de aproximadamente 3 mM, al menos de aproximadamente 4 mM, al menos de aproximadamente 5 mM, al menos de aproximadamente 10 mM, o al menos aproximadamente de 20 mM, y la concentración de galactosa puede ser de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 mM, opcionalmente de aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 4 mM, o de aproximadamente 2.5 mM hasta aproximadamente 3.5 mM. Las concentraciones de fructosa y mañosa, cuando están presentes, pueden ser las mismas o diferentes -de aquéllas de cada una y aquéllas de la galactosa y N-acetilraanosamina . Las concentraciones de fructosa y mañosa pueden ser de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 m cada una, opcionalmente de aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 4 mM cada una, o de aproximadamente 2.5 mM hasta aproximadamente 3.5 mM cada una . De manera alternativa, la invención proporciona un medio de cultivo para células de mamífero que comprende fructosa y galactosa, y opcionalmente, también mañosa y/o N-acetilmanosamina . La fructosa, galactosa y mañosa pueden estar presentes cada una en concentraciones de aproximadamente 0.1 mM cada una hasta aproximadamente 40 mM, cada una, opcionalmente de aproximadamente 0.5 mM cada una hasta aproximadamente 20 mM cada una, de aproximadamente 1.0 mM cada una hasta aproximadamente 10 mM cada una, o de aproximadamente 1 mM cada una hasta aproximadamente 5 mM cada una. La fructosa, galactosa y mañosa pueden estar presentes a la misma o diferentes concentraciones. La N-acetilmanosamina puede estar presente en una concentración de al menos aproximadamente 0.8 milimolar (mM) , opcionalmente de al menos aproximadamente 2 mM, al menos aproximadamente 3 mM, al menos aproximadamente 4 mM, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 10 mM, o al menos aproximadamente 20 mM. Además, la invención abarca un medio de cultivo para células de mamífero que comprende fructosa, galactosa, y opcionalmente, mañosa, las cuales pueden estar presentes a concentraciones de aproximadamente 0.1 mM cada una hasta aproximadamente 40 mM cada una, opcionalmente de aproximadamente 0.5 mM cada una hasta aproximadamente 20 mM cada una, de aproximadamente 1.0 mM cada una hasta aproximadamente 10 mM cada una, o de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 mM cada una. La fructosa, galactosa y ma osa pueden estar presentes a las mismas o concentraciones diferentes . En un aspecto, la invención proporciona un método para cultivar células de mamífero que comprende hacer crecer en cultivo una célula de mamífero que ha sido modificada genéticamente para producir una proteína y agregar al cultivo N-acetilmanosamina, galactosa, y, opcionalmente, también fructosa y/o mañosa. En otro aspecto, la invención proporciona un método para cultivar una célula de mamífero que ha sido modificada genéticamente para producir una proteína en un medio que comprende N-acetilmanosamina a una temperatura inferior a 37°C. Un tipo de célula modificada genéticamente es una célula que ha sido transformada con un vector recombinante que codifica para la proteína. La proteína puede ser expresada bajo el control de un promotor viral fuerte (por ejemplo un promotor de citomegalovirus (CMV) o un promotor de virus de simio 40 (SV40) ) o un promotor inducible (por ejemplo un. promotor de metalotionina o un promotor sensible a la tetraciclina como se describe en, por ejemplo, Gossen and Bujard (1992) Proc . Nati. Acad. Sci, 89:5547-51). Típicamente, la célula no expresa naturalmente la proteína o expresa la proteína únicamente a niveles muy bajos (en ausencia de modificación genética) . Debe comprenderse, de manera general, que una proteína es un polipéptido de al menos 10 aminoácidos de longitud, opcionalmente, de al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 ó 200 aminoácidos de longitud. Las proteínas producidas usando los métodos y medios de la invención pueden ser proteínas secretadas. Los métodos y medios de la invención pueden ser usados para incrementar la sialilacion de cualquier proteína, y es particularmente ventajoso para polipéptidos cuya expresión está bajo el control de un promotor fuerte, como por ejemplo, un promotor viral y/o polipéptidos que son codificados en un mensaje que tiene un elemento líder tripartita adenoviral . Los ejemplos de vectores de expresión útiles que pueden ser usados para producir proteínas son descritos en la Solicitud Internacional WO 01/27299 y en McMahan et al., (1991), EMBO J. 10:2821, el cual describe el vector pDC409. Generalmente, los métodos de la invención son útiles para inducir la producción de polipéptidos recombinantes . Las proteínas que .pueden ser - producidas con los métodos y medios de la invención incluyen aquéllas que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a o sustancialmente similares a toda o parte de una de las siguientes proteínas: un ligando de Flt3 (como se describe en la WO 94/28391) , un ligando de CD40 (como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,087,329), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, leptina, IL-2, angiopoyetina-2-(de acuerdo a lo descrito por Maisonpierre et al. (1997), Science 277 (5322 ): 55-60 , incorporada aquí como referencia), ligando de Fas, ligando para el activador del receptor de NF-kappa B (RANKL, de acuerdo a lo descrito en la WO 01/36637) , ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de la necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, como se describe en la WO 97/01633), linfopoyetina derivada de estroma tímico, factor estimulante de la colonia granulocítica, factor estimulante de la colonia granulocítica-macrofagocítica (GM-CSF, como se describe en la Patente Australiana No. 588819), factor de crecimiento de los mastocitos, factor de crecimiento de las células no diferenciadas (descrito por ejemplo en la Patente Estadounidense No. 6,204,363, incorporada aquí como referencia) , factor del crecimiento epidérmico, factor del crecimiento queratinocítico, factor del crecimiento y desarrollo de los megacariocitos, ANTES, hormona del crecimiento, insulina, insulinotropina, factores del crecimiento similares a la insulina, hormona- paratiroidea, interferones , incluyendo los interferones a, interferón ? e interferones de consenso (como aquéllos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,695,623 y 4,897471, ambas de las cuales se incorporan aguí como referencia) , factor del crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas similares a la sinaptotagmina (SLP 1-5) , neurotrofina-3 , glucagon, interleucinas 1 hasta 18, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-ß , factor de la necrosis tumoral (TNF) , factor inhibidor de la leucemia, oncostatina-M, y varios ligandos de moléculas de la superficie celular ELK y Hek (como los ligandos para cinasas relacionadas con eph o LERKS) . Las descripciones de las proteínas que pueden ser producidas de acuerdo a los métodos de la invención pueden encontrarse en, por ejemplo, Human Cytokines : Handbook for Basic and Clinical Research, Vol . II (Aggarwal and Gutterman, eds . Blackwell Sciences, Cambridge, ??, 1998) ; Growth Factors : ? Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); and The Cytokine Handbook (A. W. Thompson, ed. , Academic Press, San Diego, CA, 1991) , todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Las proteínas adicionales que pueden ser producidas usando los métodos y medios de la invención incluyen proteínas que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un receptor para cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, un antagonista para un receptor de cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, y/o proteínas sustancialmente similares a esos receptores o antagonistas. Esos receptores y antagonistas incluyen: arabas formas del receptor del factor de la necrosis tumoral (TNFR, referidas como p55 y p75, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,395,760 y la Patente Estadounidense No. 5,610,279), receptores de Interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; descritos en la Patente Estadounidense NO. 0 460 846, Patente Estadounidense No. 4,968,607 y Patente Estadounidense No. 5,767,064, todas las cuales se incorporan aquí como referencia) , antagonistas del receptor de IL-1 (como aquéllos descritos en la Patente Estadounidense No. 6,337,072, incorporada aquí como referencia) , antagonistas o inhibidores de IL-1 (como aquéllos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,981,713, 6,096,728 y 5,075,222, todas las cuales se incorporan aquí como referencia) , receptores de IL-2, receptores de IL-4 (como se describe en la Patente EP No. 0 367 566 y la Patente Estadounidense No. 5,856,296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptor del factor estimulante de la colonia granulocítica-macrofagocítica, receptor del factor estimulante de la . colonia granulocítica, receptores de oncostatina-M y factor inhibidor de la leucemia, activador del receptor de NF-kappa B (RANK, descrito en la WO 01/36637 y la Patente Estadounidense No. 6,271,349), osteoprotegerina (descrita por ejemplo en la Patente Estadounidense No. 6,015,938, incorporada aquí como referencia), receptores para TRAIL (incluyendo los receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4) , y receptores que comprenden dominios de muerte, como Fas o Receptor Inductor de Apoptosis (AIR, por sus siglas en inglés) . La mayoría de las proteínas que pueden ser producidas usando los métodos y medios de la invención incluyen proteínas que comprenden todas o partes de las secuencias de aminoácidos de antígenos de diferenciación (referidas como proteínas CD) o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares entre esas. Esos antígenos son descritos en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds . , Kobe, Japón, 1996). Proteínas CD similares son descritas en trabajos posteriores. Ejemplos de esos antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos de éstos (ligando de CD27, ligando de CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia del receptor de TNF, la cual también incluye al 41BB y OX 40. Los ligandos son con frecuencia miembros de la familia del TNF, como el ligando de 41BB y el ligando de OX40. En consecuencia, los miembros de la familia del TNF y el TNFR también pueden ser producidos usando la presente invención. · ¦ También pueden ser producidas proteínas enzimáticamente activas o sus ligandos usando los métodos y medios de la invención. Los ejemplos incluyen proteínas que comprenden toda o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares a una de esas: miembros de la familia de la metaloproteinasa-desintegrina, varias cinasas, glucocerebrosidasa, superoxido dismutasa, activador del plasminógeno tisular, factor VIII, factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteínas A-I , globinas, antagonista de IL-2, ct-1 antitripsina, Enzima Convertidora de T F-a, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y numerosas otras enzimas y sus ligandos. Los métodos y medios de la invención también pueden ser usados para producir proteínas quiméricas seleccionadas in vitro para unirse a una proteína blanco específica y modificar su actividad como aquéllas descritas en las Solicitudes Internacionales WO 01/83525 y WO 00/24782 y anticuerpos o porciones de los mismos y anticuerpos quiméricos, es decir anticuerpos que tengan dominios de inmunoglobulina de anticuerpos constantes humanos acoplados a uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variables murinos, fragmentos de los mismos, o proteínas sustancialmente similares. El método de la invención también puede ser usado para producir conjugados que- comprendan un anticuerpo y una sustancia citotóxica o luminiscente. Esas sustancias incluyen: derivados de maitansina (como el DM1) ; enterotoxinas (como una enterotoxina Estafilocóccica) ; isótopos de yodo (como el yodo 125) ; isótopos de tecnesio (como el Tc-99m) ; cianin fluorocromos (como el Cy5.5.18); y proteínas inactivadoras de los ribosomas (como la bouganina, gelonina, o saporina S6) . Los ejemplos de anticuerpos, proteínas quiméricas seleccionadas in vitro, o conjugados de anticuerpo/citotoxina o an icuerpo/luminóforo que pueden ser producidos usando los métodos y medios de la invención incluyen aquéllos que reconocen cualquiera de o una combinación de proteínas incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente y/o los siguientes antígenos : CD2 , CD3, CD4 , CD8, CDlla, CD14 , CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52 , CD80, (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-lCC, IL-?ß, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, subunidades de receptor IL-2, receptor IL-4, receptor IL-6, receptor IL-13, receptor IL-18, PDGF-ß y análogos de los mismos (como aquéllos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,272,064 y 5,149,792), VEGF, TGF, TGF- 2, TGF-ß?, receptor de EGF (incluyendo aquéllos descritos en la Patente Estadounidense No. 6,235,883 Bl) receptor de VEGF, factor de crecimiento hepatocítico, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, ?????, TALL-1, y zTNF4; véase Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1) :19-25), complemento de C5 ; IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral UC1, antígeno PEM, LCG (el cual es un producto genético que es expresado en asociación con cáncer de pulmón), HER-2, una glicoproteína asociada con tumores TAG-72, el antígeno SK-1, epítopes asociados con tumores que están presentes en niveles elevados en sueros de pacientes con cáncer de colon y/o pancreátio; epítopes asociados con el cáncer o proteínas expresadas en células de cáncer de mama, colon, células escamosas, próstata, pancreático, pulmón y/o riñon y/o sobre células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, las integrinas B2, receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4 RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) , la molécula de adhesión intercelular 3 (ICAM-3) , adhesión de leucointegrina, la glicoproteína plaquetaria gp Ilb/lIIa, cadena pesada de la miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (el cual es un inhibidor del factor Vlla-factor tisular) , MHCI, antígeno carcinoembriónico (CEA) , alfa-fetoproteína (AFP) , factor de la necrosis tumoral (TNF) , CTLA-4 (el cual es un antígeno asociado con los linfocitos T citotóxicos) , receptor de Fc-?-1, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, L-selectina, IFN-?, Virus Sincitial Respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de la hepatitis B (VHB) , Sreptococcus mutans, y Staphlycoccus aureus. Los métodos y medios de la invención también pueden ser usados para producir toda o una parte de una proteina que sea un anticuerpo antiidiotípico o una proteína sustancialmente similar, incluyendo anticuerpos antiidiotípicos contra: un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral gp72; un anticuerpo contra el gangliósido GD3 ; un anticuerpo contra el gangliósido GD2 ; o anticuerpos sustancialmente similares a esos. Los métodos y medios de la invención también pueden ser usados para producir proteínas de fusión recombinantes que comprenden cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente o proteínas sustancialmente similares. Por ejemplo, proteínas de fusión recombinantes que comprenden una de las proteínas mencionadas anteriormente más un dominio de muítimerización, como una cremallera de leucina, una espiral enrollada, una porción de Fe de un anticuerpo, o una proteína sustancialmente similar, pueden ser producidos usando los métodos y medios de la invención. Véase por ejemplo WO 94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259: 1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262: 1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hákansson et al. (1999), Structure 7:255-64. Específicamente incluidas entre esas proteínas de fusión recombinantes se encuentran..proteínas en las cuales al menos una porción del TNFR o RANK se encuentran fusionada a una porción de Fe de un anticuerpo (TNFR: Fe o RANK: Fe) . El TNFR: Fe 'comprende la porción de Fe de un anticuerpo fusionado a un dominio extracelular de TNFR, el cual incluye secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a los aminoácidos 1-163, 1-185 o 1-235 de la Figura 2A de la Patente Estadounidense No. 5,395,760. RANK: Fe se describe en la O 01/36637. Las células adecuadas para practicar la presente invención incluyen cualquier linea celular que pueda glicosilar proteínas, preferiblemente una línea de célula de mamífero que haya sido modificada genéticamente para expresar una proteína, aunque la invención también puede ser usada para producir proteínas no recombinantes . Preferiblemente, las células son líneas celulares homogéneas. Son conocidas en la técnica numerosas líneas celulares adecuadas. Por ejemplo, pueden ser usadas células de ovario de hámster Chino (CHO) , HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, mieloma (por ejemplo NSO, NSI) , o WI38. También pueden ser usadas líneas celulares de hibridoma que produzcan un anticuerpo para practicar la invención. Las líneas celulares derivadas de las células mencionadas anteriores también son adecuadas para practicar la invención. Las células particularmente preferidas son células CHO, las cuales son ampliamente usadas para la producción de proteínas recombinantes, por ejemplo citocinas, factores de coagulación y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88: 2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; Mc innon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol 145:3011-3016). Una línea celular mutante deficiente es dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub et al. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 7:4216-4220), como DXB11 o DG-44, es útil debido que el sistema de expresión genética seleccionable y amplificable de DHFR eficiente permite una expresión de proteína recombinante de alto nivel en esas células (Kaufman (1990). Meth. Enzymol . 185:527-566). Además, esas células son fáciles de manipular como cultivos adherentes o en suspensión y exhiben una estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y las proteínas recombinantes expresadas en ellas han sido caracterizadas ampliamente y han sido aprobadas para usarse a nivel de elaboración clínica comercial por agencias reguladoras. De acuerdo a la presente invención, una célula anfitriona de mamífero es cultivada bajo condiciones que promueven la producción de la proteína de interés, la cual puede ser un anticuerpo o una proteína recombinante. Las formulaciones de medios de cultivo celular basal para cultivar células de mamífero son bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, p. ..69-84, Wiiey-Liss (1987) .

Para esas formulaciones de medio de cultivo basal el experto en la técnica . agregará componentes como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas como factores del crecimiento, amortiguadores, antibióticos, lipidos, elementos en trazas y similares, dependiendo de los requerimientos de la célula anfitriona a ser cultivada. El experto también puede elegir usar una de muchas formulaciones de medios individualizados que hayan sido desarrolladas para maximizar el crecimiento celular, viabilidad celular y/o producción de proteína recombinante en una célula cultivada particular. Los métodos de acuerdo a la presente invención pueden ser usados en combinación con medios de cultivo celular comercialmente disponibles o con un medio de cultivo celular que haya sido formulado individualmente para usarse con una línea celular particular. El medio de cultivo puede o no contener suero y/o proteína. Los medios comerciales adecuados incluyen Medio PMI 1641, Medio de Eagle Modificado de Dulbecco, Medio Esencial Mínimo de Eagle, Medios F-12 y F12, Medio de McCoy 5A, Medio de Leibovitz L-15, y medio libre de suero como EXCELLMR 300 Series (disponible de JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, EUA) , entre otros, los cuales pueden ser obtenidos del American Type Culture Collection o JRH Biosciences, así como otros vendedores . El experto en la técnica también puede elegir usar una de las muchas formulaciones de medios individualizados que hayan sido desarrollados para maximizar el crecimiento celular, viabilidad celular, y/o producción de polipéptido recombinante en una célula anfitriona cultivada particular. Los métodos de acuerdo a la presente invención pueden ser usados en combinación con medios de cultivo celular comercialmente disponibles o con medio de cultivo celular que haya sido formulado individualmente para usarse con una línea celular particular. Por ejemplo, un medio enriquecido que podría soportar una producción de polipéptido incrementada puede comprender una mezcla de dos o más medios comerciales, como, por ejemplo, DMEM y medio de Ham F12 combinados en relaciones, por ejemplo, como 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8 aún hasta 1:15 o mayores. De manera alternativa o además, un medio puede ser enriquecido mediante la adición de nutrientes, como aminoácidos o peptona, y/o puede ser usado un medio (o la mayoría de sus componentes con las excepciones señaladas más adelante) a concentraciones mayores que las usuales recomendadas, por ejemplo a 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, o aún concentraciones mayores. Como se usa aquí, "IX" significa la concentración estándar, "2X" significa dos veces la concentración estándar, etc. En cualquiera de esas modalidades, los componentes del medio que pueden afectar sustancialmente la osmolaridad, como las sales, no pueden incrementarse en concentración, de modo que la osmolaridad del medio caiga fuera de un intervalo aceptable. De este modo, un medio puede, por ejemplo, ser 8X con respecto a todos los componentes excepto las sales, las cuales pueden estar presentes solo en IX. Un medio enriquecido puede estar libre de suero y/o libre de proteína. En este contexto, "libre de proteína" significa libre de proteínas 'de al menos 15 aminoácidos, como la insulina o factor del crecimiento similar a la insulina. El medio "libre de proteína" puede contener proteínas hidrolizadas, como las encontradas en las peptonas (de levadura, soya u otras fuentes) , las cuales son aditivos de medio comúnmente usados. Además, un medio puede ser suplementado periódicamente durante el tiempo en que se mantenga un cultivo para reabastecer los componentes del medio que pudieran haberse agotado, por ejemplo, vitaminas, aminoácidos y precursores metabólicos . Como es sabido en la técnica, los diferentes medios y temperaturas pueden tener efectos un tanto diferentes sobre diferentes líneas celulares, y el mismo medio y temperatura pueden no ser adecuados para todas las líneas celulares. Los métodos de la invención son útiles para inducir la producción de proteínas recombinantes . Las proteínas recombinantes son proteínas producidas por el proceso de ingeniería genética. El término "ingeniería genética" se refiere a infectar, transfectar, transformar o transducir una célula con una molécula polinuleotídica recombinante para hacer que la célula altere la expresión de una proteína deseada. En algunas modalidades, esa molécula polinucleotidica recombinante comprende ácidos nucleicos que codifican para la proteína de interés ligada operativamente a secuencias reguladoras adecuadas, las cuales son parte de un "vector de expresión" en el cual están insertados los ácidos nucleicos que codifican para la proteina de interés. Los métodos y vectores para modificar genéticamente células y/o líneas celulares para expresar una proteína de interés son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica; por ejemplo, varias técnicas son ilustradas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al . , eds . (Wiley & Sons, New York, 1988, y actualizaciones trimestrales) Sambrook et al., Molecular Cloning: ? Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989) ; y Kaufmanm R.J. Largre Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Adicionalmente pueden ser usados protocolos que usan reactivos comercialmente disponibles, como los reactivos lipidíeos catiónicos LIPOFECTAMINEMR, LIPOFECTAMINEMR-2000 , 0 LIPOFECTAMINEMR-PLUS (los cuales pueden ser comprados de Invitrogen) , para transfectar células. Felgner et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 84: 7413-7417. Además, puede ser usada la eletroporación o bombardeo con microproyectiles recubiertos con ácidos nucleicos para transfectar células usando procedimientos, como aquéllos de Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 2da ed. Vol . 1-3, cold Spring Harbor Laboratory Press, y Fitzpatrick-McElligott (1992), Biotechnology (NY) 10 (9) : 1036-40. Las técnicas de ingeniería genética incluyen, pero no se limitan a, transformación de células con vectores de expresión, recombinación homologa dirigida y activación genética (véase por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,272,071 de Chappel) , y transactivación por factores de transcripción modificados (véase por ejemplo Segal et al. (1999), Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 96 (6) :2758-63) . Con frecuencia se usa un gen que codifica para un marcador seleccionado para facilitar la identificación de células recombinantes y por lo tanto con frecuencia se incluye a los vectores de expresión. La selección de transformantes puede ser efectuada usando métodos, por ejemplo, el esquema de selección de dihidrofolato reductasa (DHFR) o resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al. (1990), Meth. In Enzymology 185:487-511. Uña cepa anfitriona adecuada para la selección de DHFR puede ser, por ejemplo, CHO cepa de DX-B11, la cual es deficiente en DHFR. Urlaub and Chasin (1980), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220.. Otros ejemplos de marcadores seleccionables incluyen aquéllos que confieren resistencia a antibióticos, como G418 e higromicina B. Las secuencias reguladoras se derivan típicamente de genes de mamífero, microbios, virus y/o insectos. Los ejemplos ' de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores y raejoradores transcripcionales , sitios de unión ribosomal (véase por ejemplo Kozak (1991), J. Biol . Chem. 266: 19867-19870), secuencias que pueden controlar la terminación transcripcional y traslacional , señales de poliadenilación (véase por ejemplo cLauchlan et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:5323-33), y sitios de unión y construcción de matriz (véase Phi-Van et al (1988), Mol. Cell. Biol. 10:2302-07; Stief et al. (1989), Nature 341:342-35; Bonifer et al. (1990), EMBO J. 9 :2843-38). Las secuencias de nucleótido son ligadas operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia que codifica para la proteína. Esas secuencias pueden estar presentes en posición cis o trans en tanto se relacionen funcionalmente con la secuencia que codifique para la proteína. De este modo, una secuencia nucleotídica promotora es ligada operativamente a una secuencia que codifica para una proteína si la secuencia nucleotídica promotora controla la transcripción de la secuencia codificadora. Aunque muchas secuencias capaces de regular la expresión, como promotores, ejercen sus efectos cuando están presentes en la posición cis, este no necesariamente es el caso siempre. Por ejemplo, ARNs no codificadores presentes en posición trans pueden desregular o mejorar la expresión del gen. Véase por ejemplo Storz (2002) , Science 296:1260-63. - - Las secuencias promotoras y mej oradoras comúnmente usadas son derivadas de polioma virus, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) , y citomegalovirus (CMV) humano. Por ejemplo, puede ser usado el promotor/me orador del CMV humano del gen 1 inicial inmediato. Véase por ejemplo Patterson et al. (1994), Applied Microbiol . Biotechnol . 40;691-98. Pueden ser usadas secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo pueden usarse sitios de origen de SV40, del promotor inicial y final, mejorador, empalme y poliadenilación para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia genética estructural en una célula anfitriona de mamífero. Los promotores virales inicial y final son particularmente útiles debido a que ambos son fácilmente obtenidos de un genoma viral, un fragmento, el cual también puede contener un origen de replicación viral (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol . 185:487-511). También pueden ser usados fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio Bgl I localizado en el origen de replicación viral de SV 40. Una secuencia que codifica para un péptido señal nativo o heterólogo apropiado (secuencia líder) puede ser incorporada en un vector de expresión, para promover la secreción extracelular de la proteína recombinante . La elección del péptido señal o líder depende del tipo de células anfitrionas en las cuales la proteína recombinante vaya a ser producida. Ejemplos de péptido señal que son funcionales en células anfitrionas de mamífero incluyen la secuencia señal para la interleucina 7 (IL-7) descrita en la Patente Estadounidense No. 4,965,195, la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 descrita en Cosman et al., Nature 312:768, 1984; el péptido señal receptor de interleucina-4 descrita en la Patente EP No. 367,566; el péptido señal del receptor de interleucina-1 tipo I descrito en la Patente Estadounidense No. 4,968,607; y el péptido señal del receptor de interleucina-1 tipo II descrito en la Patente EP No. 460,846. Las secuencias de control adicionales que muestran mejorar la expresión de genes heterólogos de vectores de expresión de mamífero incluyen elementos como el elemento de la secuencia que aumenta la expresión (EASE, por sus siglas en inglés) derivado de células CHO (Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997) ; Patente Estadounidense No. 6,312,951 Bl; Patente Estadounidense No. 6,027,915; Patente Estadounidense NO. 6,309,841 Bl) y el líder tripartita (TPL) y ARN del gen VA de Adenovirus 2 (Gingeras et al. (1982). J. Biol . Chem. 257:13475-13491). Las secuencias del sitio de entrada ribosomal internas (IRES) de origen viral permiten que los ARNm dicistrónicos sean traducidos eficientemente (Oh and Sarnow (1993) , Current Opinión in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996) , Nucleic Acids Research 24:2697-2700). La expresión de un ADNc heterólogo como parte de un ARNm dicistrónico seguida por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo DHFR) ha mostrado mejorar la transfectabilidad del anfitrión y la expresión del ADN heterólogo (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol . 185:487-511). Los vectores de expresión ejemplares que emplean ARNm dicistrónicos son pTR-DC/GFP descritos por Mosser et al., Biotechniques 222:150-161 (1997) , y p2A5I descrito por Morris et al., in Animal Cell Technology, pp . 529-534 (1997) . Los ejemplos de vectores de expresión útiles que pueden ser usados para producir proteínas son aquéllos descritos en la WO 01/27299 y el vector pDC409 descrito en McMahan et al. (1991), EMBO J. 10:2821. Otro vector de expresión altamente útil, el pCAVNOT, ha sido descrito por Mosley et al. (1989), Cell 59:335-348. Otros vectores de expresión para usarse en células anfitrionas de mamífero pueden ser construidos de acuerdo a lo descrito por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol . 3:280 (1983)). Un sistema útil para la expresión de alto nivel estable de ADNc de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 puede ser construido sustancialmente de acuerdo a lo descrito por Cosman et al. (Mol. Imm nol. 23:935 (1986)).- · Un vector de expresión altamente útil, P LSV N1/N4, descrito por Cosman et al. (1984), Nature 312:768, ha sido depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamíferos útiles son descritos en la Patente EP No. A 0 367 566 y la WO 01/27299. Los vectores pueden ser derivados de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa, puede ser agregada una secuencia señal heteróloga, como la secuencia señal para IL-7 descrita en la Patente Estadounidense No. 4,965,195; la secuencia señal para el receptor de IL-2 descrito en Cosman et al. (Nature 312:768 (1984)); el péptido señal de IL-4 descrito en la Patente EP No. 367,566; el péptido señal del receptor de IL-1 del tipo I descrito en la Patente Estadounidense No. 4,968,607; y el péptido señal IL-1 del tipo II descrito en la Patente EP No. 460,846. Las condiciones de cultivo adecuadas para células de mamífero son conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed. , Oxford University Press, New York (1992) . Las células de mamífero pueden ser cultivadas en suspensión o mientras estén unidas a un sustrato sólido. Además, las células de mamífero pueden ser cultivadas, por ejemplo, en biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, biorreactores de lecho empaquetado, biorreactores de lecho fibroso, botellas giratorias, matraces con agitación, o biorreactores de tanque con agitación, con o sin microsoportes , y operados en un modo por lotes, lote alimentado, continuo, semicontinuo o perfusión. Los métodos y medios de la invención pueden ser combinados con otros métodos o aditivos de medio, especialmente aquéllos que incrementan la producción o sialilación de una proteína. Por ejemplo, las células pueden hacerse crecer a temperaturas de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 40 °C, opcionalmente de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 37°C, de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 36° C, de aproximadamente 29 °C hasta aproximadamente 35 °C, o de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 33 °C. Además, pueden ser agregadas sustancias además de la N-acetilmanosamina, galactosa, fructosa y mañosa al medio. Esas sustancias incluyen, pero no se limitan a inhibidores de la histona desacetilasa, butirato, tricostatina, cafeína y hexametilen bisacetamida. Los métodos de acuerdo a la presente invención pueden ser usados para incrementar el título y/o sialilación de proteínas en procesos de cultivo de una sola fase o fases múltiples. En un proceso de una sola fase, las células son inoculadas en un ambiente de cultivo, y los métodos y medios descritos son empleados durante la única fase de producción. En un proceso de etapas múltiples, las células son cultivadas en dos o más fases distintas. Por ejemplo las células pueden ser cultivadas primero en una fase de crecimiento, bajo condiciones ambientales para maximizar la proliferación y viabilidad celular, entonces transferidas a una fase de producción, bajo condiciones que incrementen la producción y/o sialilación de una proteína. En los procesos de fases múltiples los métodos y medios de acuerdo a la presente invención son empleados al menos durante la fase de producción. Los ejemplos presentados a continuación no pretenden ser exhaustivos o limitar el alcance de la invención. El experto comprenderá que son posibles modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores, y esas modificaciones y variaciones pretenden estar dentro del alcance de la invención. Todas las referencias citadas aquí, tanto supra como Infra, son incorporadas aquí en su totalidad. EJEMPLO 1 COMPARACION DE LA CAPACIDAD DE VARIOS AZUCARES Y COMBINACIONES DE LOS MISMOS PARA INDUCIR LA SIALILACION DE TNFR: Fc El siguiente experimento se efectuó para determinar cual carbohidrato o combinación de carbohidratos agregada a medios de cultivo celulares es capaz de inducir la mayor sialilación del TNFR : Fc producido por las células. El grado relativo de sialilación fue determinado midiendo la fracción de TNFR:Fc producido por un cultivo celular -que eluye desde una columna de intercambio aniónico únicamente a una alta concentración de sal. Esto proporciona una medida aproximada del grado de sialilación debido a que las proteínas con más ácido siálico requieren una concentración de sal mayor para eluir desde una columna de intercambio aniónico. Se inocularon aproximadamente 2.0 x 10s células de una linea celular CHO que había sido modificada genéticamente para producir TNFR:Fc en cada uno de 12 matraces que contenían 30 mi de medio libre de suero con INTRALIPIDS14 (una emulsión estéril de aceite de soya fraccionado y fosfolípidos de huevo fraccionados en agua) , factor del crecimiento similar a la insulina I, y butirato sin ningún carbohidrato adicionado (marcado como "control) o con los aditivos de carbohidrato indicados en la Figura 2 a una concentración de 4 mM cada uno . Los cultivos fueron incubados durante 7 días a 30°C con agitación a 150 revoluciones por minuto. El TNFR:Fc cosechado del medio después de siete días de crecimiento y prepurificado por cromatografía de afinidad con proteína A. Posteriormente, la concentración de proteína TNFR:Fc purificada fue determinada midiendo la absorbancia a 280 nanómetros . La concentración de la proteína TNFR:Fc fue ajustada a aproximadamente 0.25 mg/ml por dilución en imidazol 20 mM, pH 6.2.

Se corrió una columna de intercambio aniónico (4.6 mm de diámetro y 50 mm de alto) como sigue. La columna fue calibrada antes y después de correr las muestras experimentales usando una mezcla de dos proteínas control que contenían 0.25 mg/ml de inhibidor de tripsina de soya y 0.5 mg/ml de lactoalbúmina (ambas obtenidas de Sigma-Aldrich Corporation, St . Louis, Missouri, EUA) . Se aplicó una muestra de hasta 200 µ? de esta mezcla a la columna, y se corrió un gradiente lineal de entre 20 mM de imidazol, pH 6.2 (Amortiguador A) y 20 mM de imidazol, NaCl 0.7 M, pH 6.2 (Amortiguador B) a través de la columna a una velocidad de 0.8 ml/min. A los 22.1 minutos, se contempló el gradiente, y la columna contenía 100% de Amortiguador B. La elución de la proteína fue determinada verificando la absorbancia a 280 nanómetros, y se registró automáticamente una gráfica de esas mediciones contra el tiempo (en relación al tiempo de carga) a medida que la proteína eluyó de la columna. La lactoalbúmina eluyó antes que el inhibidor de tripsina de soya (aproximadamente 11.2 minutos en comparación con 15.4 minutos) . Entre los ensayos, la columna fue limpiada inyectando 0.2 mi de NaCl 2M, seguidos por dos conjuntos de lavados alternativos con amortiguadores A y B seguidos por un lavado final con amortiguador A. Se cargó un volumen de hasta 200 µ? (a aproximadamente 0.25 mg/ml) de TN.FR : Fe sobre la columna de intercambio aniónico, y se corrió un gradiente lineal a través de la columna como se explicó anteriormente. Se consideró que la porción del pico de TNFR:Fc se eluyó después del inhibidor de tripsina de soya eluyó a una alta concentración de sal. La fracción de TNFR :Fe que eluyó a una alta concentración de sal se determinó comparando el área bajo la curva que eluyó después del inhibidor de tripsina de soya con el área total bajo la curva. El número fue comparado en cada caso con una fracción similar de un lote de TNFR: Fe producido en un experimento separado por un cultivo celular que creció sin mañosa, fructosa, galactosa o N-acetilmanosamina . Los resultados se muestran en la Figura 2, el hecho de que el cultivo de control del presente experimento sin azúcares agregados esté solo muy ligeramente por encima del 100% indica que la sialilación de TNFR: Fe puede ser casi constante de lote a lote. Esos datos también indican que los cultivos que crecieron en N-acetilmanosamina, fructosa, mañosa y galactosa (a concentraciones de 4 m cada una) produjeron los niveles más altos de sialilación de TNFR: Fe de cualquiera de las combinaciones probadas. Además, el TNFR: Fe de los cultivos que crecieron en las siguientes combinaciones de azúcares también mostraron incrementos en la sialilación: (1) galactosa sola; (2) fructosa y galactosa; (3) fructosa, galactosa y mañosa; y (4) N-acetilmanosamina y galactosa.

EJEMPLO 2 MUESTREO DE UNA SUPERFICIE DE RESPUESTA PARA DETERMINAR CONCENTRACIONES OPTIMAS DE N-ACETILMANOSAMINA Y AZUCARES Este experimento se efectuó para determinar las concentraciones óptimas para la N-acetilmanosamina y fructosa, mañosa, y galactosa en medio de crecimiento para incrementar la sialilación de TNFRrFc. El experimento también busca determinar una combinación que logre la mayoría de la sialilación de TNFRrFc con la concentración más baja de N-acetilmanosamina . Aproximadamente 2.0 x 106 células de la misma linea celular CHO usada en el ejemplo 1 fueron inoculadas en cada uno de 13 matraces que contenían 30 mi de medio libre de suero con INTRALIPIDSMR (una emulsión estéril de aceite de soya fraccionado y fosfolípidos de huevo fraccionados en agua), factor del crecimiento similar a la insulina I, y butirato con los aditivos de medio indicados en la Figura 3, es decir, concentraciones variables de N-acetilmanosamina y/o un cóctel de azúcar que contenía cantidades equimolares de fructosa, galactosa y mañosa. Las combinaciones de concentraciones de aditivos de medios fueron elegidas para tomar una muestra de una superficie de respuesta. Véase por ejemplo Óberg and Deming, Chemical Eng. Process, Abril, 2000: 53-59. Se usaron cinco cultivos por duplicado para producir los datos para el punto central de la Figura 3, y otros ocho cultivos, cada uno de los cuales produjeron los datos para uno de los ocho puntos axiales de la Figura 3. El TNFR:Fc cosechado en el medio después de 7 días de crecimiento a 30°C con agitación a 150 revoluciones por minuto y prepurificado por cromatografía de afinidad con Proteína A. El número de moles de ácido N-acetilneuramínico (NANA) por mol de proteína recombinante fue determinado como sigue . Después de la cromatografía de afinidad con proteína A, se determinó la concentración de TNFR:Fc leyendo la absorbancia a 280 nanómetros, y la concentración de proteína se ajustó a 1 mg/ml por dilución en solución salina amortiguada con fosfato. Se diluyó sialidasa (obtenida de Glyko, Inc. de Novato, California, EUA) a 1 mU/µ? (donde 1 unidad es la cantidad de enzima necesaria para escindir 1 µp??? de NANA por minuto a pH 5 y 37°C) en Amortiguador de Incubación 2X (acetato de sodio 200 mM, pH 5.0). Se mezclaron el TNFR:Fc y la sialidasa (10 µ? de cada uno) y se incubaron durante 4 horas a 37°C. Posteriormente, la mezcla fue diluida a 0.2 mg/ml de TNFR:Fc agregando 30 µ? de agua. El ácido siálico liberado fue detectado y cuantificado usando cromatografía de intercambio iónico de alto desempeño, en la cual el efluyente fue verificado usando detección amperométrica pulsátil. La detección amperométrica pulsátil utiliza electrodos que intercala impulsos de limpieza (para remover los analitos que ensucian al electrodo y eviten lecturas exactas) con impulsos de detección a un potencial -apropiado para detectar NANA. El sistema fue calibrado antes y después de correr las muestras experimentales usando cantidades conocidas de NANA comprado de un distribuidor comercial como, por ejemplo, Sigma-Aldrich Corporation de St . Louis, Missouri, EUA. El sistema para efectuar la cromatografía de intercambio aniónico de alto desempeño y la detección amperométrica pulsátil fue obtenido de Dionex Corporation of Sunnyvale, California, EUA. Los resultados, los cuales se muestran en la Figura 3, fueron graficados usando un programa de computadora para análisis estadístico y presentación gráfica de datos (JMP®, disponible de SAS Institute, Cary, North Carolina, EUA) . Los niveles más altos de sialilación de TNFR:Fc se observaron a 3 mM de cada una de las fructosa, galactosa y mañosa y ligeramente por encima de 5 rrM de N-acetilmanosamina. Sin embargo, cuando se agregaron fructosa, galactosa y mañosa 3 mM a los cultivos que contenían ligeramente menos de 3 mM N-acetilmanosamina, los niveles de sialilación son casi iguales a los observados usando aproximadamente 5 mM de N-acetilmanosamina. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (41)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína producida por células de mamífero, caracterizado porque comprende cultivar las células en un medio que comprende galactosa y fructosa .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1,. caracterizado porque el medio comprende además mañosa.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el medio comprende además N- acetilmanosamina .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio está libre de suero.

5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el medio está libre de suero.

6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las concentraciones de galactosa, mañosa y fructosa son cada una de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 10 mM .

7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración de N- acetilmanosamina en el medio es de al menos aproximadamente 0.8 mM .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina es una proteína recombinante , secretada.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de mamífero son células CHO .

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células son cultivadas a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 36°C.

11. Un medio para cultivar células de mamífero, caracterizado porque comprende galactosa y fructosa.

12. El medio de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además mañosa.

13. El medio de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende además N- acetilmanosamina .

14. El medio de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las concentraciones de galactosa, mañosa y fructosa son cada una de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 10 mM .

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la concentración de N- acetilmanosamina en el medio es de al menos aproximadamente 0.8 mM .

16. El medio de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el medio está libre de suero.

17. El medio de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el medio está libre de suero.

18. El medio de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el medio está libre de suero.

19. Un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína, caracterizado porque comprende cultivar una célula de mamífero que produce la proteína en un medio que comprende N-acet ilmanosamina y galactosa.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el medio comprende además fructosa y mañosa.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la concentración de fructosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM y donde la concentración de mañosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM.

22. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula es cultivada a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 35°c.

23. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos aproximadamente 0.8 mM y donde la concentración de galactosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM .

24. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteína es una proteína secretada.

25. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteína es una proteína recombinante .

26. El método de .. conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula es una célula CHO .

27. Medio para cultivar células de mamífero, caracterizado porque se combina el medio de galactosa y N- acetilmanosamina .

28. El medio de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el medio comprende además fructosa y ma osa.

29. El medio de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la concentración de fructosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM y donde la concentración de mañosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM .

30. El medio de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la concentración de N- acetilmanosamina en el medio es de al menos aproximadamente 0.8 mM y donde la concentración de galactosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5. mM .

31. El medio de conformidad con la reivindicación 27, caracter zado porque las células de mamífero son células CHO.

32. El medio de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque -el medio está libre de suero.

33. Método para producir una proteína cultivando células de mamífero que expresan la proteína, caracterizado porque comprende cultivar las células de mamífero a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 36°C en un medio que comprende N-acetilmanosamina .

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el medio comprende además galactosa.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el medio comprende además fructosa y mañosa .

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la concentración de galactosa en el medio es de aproximadamente 1.5 m hasta aproximadamente 4.5 mM, donde la concentración de mañosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM, y donde la concentración de fructosa en el medio es de aproximadamente 1.5 mM hasta aproximadamente 4.5 mM.

37. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos aproximadamente 0.8 mM.

38. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el medio está libre de- suero.

39. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque las células de mamífero son células CHO.

40. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porgue la proteína es una proteína recombinante, secretada.

41. Un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína recombinante, caracterizado porque comprende cultivar células de mamífero que expresan la proteína recombinante a una temperatura de aproximadamente 29°C hasta aproximadamente 36°C en un medio que comprende fructosa, galactosa, mañosa, y N-acetilmanosamina, donde la concentración de fructosa en el medio es de aproximadamente 1.0 mM hasta aproximadamente 5.0 mM, donde la concentración de galactosa en el medio es de aproximadamente 1.0 mM hasta aproximadamente 5.0 mM, donde la concentración de mañosa en el medio es de aproximadamente 1.0 mM hasta aproximadamente 5.0 mM, y donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos 0.8 mM.