MXPA97005572A

MXPA97005572A - Complejos estables para el suministro de farmacosque contienen lipidos y metodos para su produccion

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Publication number: MXPA97005572A
Application number: MXPA/A/1997/005572A
Authority: MX
Inventors: Gao Xiang; Huang Leaf
Original assignee: University Of Pittsburgh
Priority date: 1995-01-23
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 1998-10-30

Abstract

Se describen novedosos complejos estables para la entrega de drogas, concentrados, biológicamente activos, listos para ser utilizados y que contienen lípidos, métodos para su utilización. La actividad biológica de los complejos producidos, es comparable a la de las formulaciones preparadas de acuerdo con el método del arte anterior basado en el mezclado conjunto;y, al ser purificados, los complejos producidos mediante el método de la presente invención, tienen una concentración de 50 a 500 veces la de los componentes de los complejos formados mediante el mezclado conjunto. El método descrito en la presente, permite la producción en gran escala de sistemas entregadores de drogas y que contienen lípidos,útiles para la terapia basada en los genes, y para otras aplicaciones.

Description

" COMPLEJOS ESTABLES PARA EL SUMINISTRO DE FÁRMACOS QUE CONTIENEN LIPIDOS Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN " Campo de la Invención La presente invención se refiere a lípidos catiónicos y a su utilización como vehículos para la transferencia de ácidos nucleicos o de otras macromoléculas tales como las proteínas, el interior de las células. Mas específicamente, la presente invención se refiere a complejos para la entrega de drogas y que contienen lípidos, los cuales complejos son estables, biológicamente activos, capaces de ser concentrados; y también se refiere a los métodos para la producción de dichos complejos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El desarrollo de nuevas formas terapéuticas que recurren a las macromoléculas tales como las proteínas o los ácidos nucleicos en calidad de agentes terapéuticos, ha creado la necesidad de desarrollar medios nuevos y efectivos para entregar o hacer llegar dichas macromoléculas a sus adecuados objetivos celulares. La terapéutica basada en la utilización sea de factores de crecimiento polipéptidos específicos, sea de genes específicos para reemplazar los genes ausentes o defectuosos, son ejemplos de la terapéutica que pueden requerir dichos nuevos sistemas de entrega. La aplicación clínica de dichas terapias depende no solamente de la eficacia de los nuevos sistemas de entrega sino también de su seguridad y de la facilidad con la cual las tecnologías en las cuales se basan dichos sistemas, pueden ser adaptadas para la producción farmacéutica en gran escala, en su capacidad para ser almacenados, y en la distribución comercial de las formulaciones terapéuticas. La terapia basada en genes, se ha transformada en una modalidad de REF : 25321 creciente importancia para tratar varias condiciones patológicas de tipo genético. La capacidad potencial para proveer tratamientos efectivos, y aun curaciones, ha servido como estímulo para realizar un intensivo esfuerzo para aplicar esta tecnología a algunas enfermedades para las cuales no había un tratamiento efectivo. Los progresos recientes en este campo han indicado que la terapia basada en los genes, puede tener un significativo impacto no solamente en el tratamiento de las condiciones patológicas relacionadas con un sólo gen, sino también en las enfermedades mas complejas, tales como el cáncer. Sin embargo, uno de los obstáculos significativos en el logro de una terapia eficiente basada en los genes, ha sido la dificultad de diseñar medios nuevos y efectivos para entregar (hacer llegar) los ácidos nucleicos terapéuticos a las células-objetivo. Por lo tanto, un vehículo ideal para la entrega de los genes exógenos a las células y tejidos, debería ser altamente eficiente en la entrega del ácido nucleico, de una utilización segura, fácil de producir en grandes cantidades, y tener una suficiente estabilidad para ser práctico como producto químico.

Los vehículos no-virósicos, que están principalmente representados por las lípidos catiónicas, sßn-un tipo de vehículo que por las siguientes razones han sids tenidos en cuenta para ser utilizados en la terapia basada en los genes. Primero, el DNA de plásmido requerido para la terapia basada en los genes y mediada mediante lípidos, puede ser preparado de manera amplia y rutinaria en gran escala, y su utilización es mas sencilla y menos riesgosa que la utilización de los vectores virósicos tales como los retrovirus.

Segundo, la entrega de los genes, mediada por retrovirus, puede entregar sea RNA sea DNA. Por lo tanto, el DNA, RNA o un oligonucleótido pueden ser introducidos directamente en una célula. Por otra parte, los liposmas catiónicos no son tóxicos, no son inmunogénicos, por lo que pueden ser utilizadas repetidas veces in vivo, tal como se evidencia por la exitosa entrega in vivo de genes a vasos sanguíneos cateterizados (Nabel, E.G. y Otro(s) (1990) Science 249: 1285 - 1288), células pulmonares epiteliales (Brigham, . L. y Otros), ( 1989) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.. 195-200, Stribling, R. y Otro(s) (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A.. 89: 1 1277 - 1 1281), y otras utilizacio-nes sistémicas (Zhu, N., y Otro(s) (1993) Science. 261 :209-21 1, Philip, R., y Otro(s), (1993), Science. 261 : 209-211) de liposomas catiónicos. Si bien una variedad de formulaciones de liposomas catiónicos, inclusive el reactivo liposoma catiónico disponible en el comercio, el DOTMA/DOPE (cloruro de N-l-(2,3-dioleoíloxi)propil-N,N,N-trimetil amonio / dioleoíl fosfatidiletanolamina), son conocidos en el arte (Felgner, P.L. y Otro(s) (1997) Proc. Nati. Acad. Scie. U.S.A. 84: 7413 - 7417), una formulación de liposoma catiónico, designada como DC-Chol/DOPE (3BN-(N'.N'-dimetilaminoetano) carbamoíl colesterol) / (dioleoíl fosfatidi-letanolamina) ha demostrado ser relativamente no tóxica y mas eficiente que el DOTMA/ DOPE, en unos ensayos efectuados in vitro (Gao, X. y Huang, L. (1991) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 179:280-285). Por otra parte, después de unos amplios estudios in vivo (Plautz, G.E. y Otro(s) (1993), Proc. Natl.Acad. Scie. U.S.A.. 90: 4645 - 4649, Stewart, M.J. y Otro(s) (1992) Hum. Gene Ther.. 3: 267-275) en los cuales se demostró que el DC-Chol/DOPE era tanto seguro como eficaz en calidad de sistema para la entrega de un ácido nucleico, dicha formulación ha sido aprobada por la U.S. Food and Drug Administration (FDA) y por la U.K. Medicines Control Agency (MCA), y ha sido utilizada en dos ensayos clínicos de terapia mediante genes, por separado (Nabel, G.J. y Otro(s), (1993), Proc. Nati. Acad. Scie. U.S.A.. 90: 11307-13311, Caplen, N.J. EE.UU., y Otro(s) (1995), Nature Medici ne. 1 : 39-46. Sin embargo, la utilización del DC-Chol/DOPE y de otros liposomas catiónicos actualmente existentes, en calidad de vehículos para entregar ácidos nucleicos a objetivos celulares, son inconvenientes para las aplicaciones terapéuticas en gran escala, por una variedad de razones. Primero, las relaciones: liposomao/ácido nucleico, utilizadas para formar los complejos ácido nucleico/liposoma en el método del anterior, basado en el mezclado conjunto, resulta en la formación de complejos que presentan un gran diámetro por lo que su estabilidad es relativamente baja.

Por lo tanto, ninguna de las formulaciones de liposomas catiónicos actualmente utilizadas, inclusive el DC-Chol/DOPE, está diseñada como formulación farmacéutica estable lista para ser utilizada, de un complejo ácido nucleico/liposoma. Esta limitación del método del mezclado conjunto, requiere que el usuario prepare el complejo antes de cada utilización, lo cual es un inconveniente que requiere un personal especialmente capacitado. Además, la preparación del complejo mediante el mezclado conjunto antes de cada utilización, crea la posibilidad de una posible fuente de variaciones en las dosis, que impide la evaluación de los tratamientos hechos con estos complejos, debido a una posible sub- o super-dosificación dada al receptor. Segundo, el método del mezclado conjunto, del arte anterior, para preparar los complejos ácido nucleico / liposoma catiónico antes de cada utilización, requiere utilizar una solución diluida de ácido nucleico (inferior a 4 µg/ml) y una dispersión diluida de liposoma (inferior a 50 µM), para preparar el complejo ácido nucleico/liposoma, a efectos de reducir la posibilidad de la formación de agregados grandes y menos activos. Esta limitación hace que sea difícil preparar complejos pequeños biológicamente activos, a menos que se recurra a condiciones prácticamente óptimas, tales como la reducción de la cantidad de liposomas (lo cual es causa de una menor actividad en la transferencia del ácido nucleico) o incrementar la cantidad de liposoma (lo cual acrecienta la toxicidad). Por otra parte, el hecho de que el complejo deba ser preparado en concentraciones diluidas, es un significativo inconveniente para sus aplicaciones clínicas, particularmente en el caso de la inyección intratumoral del complejo, por cuanto solamente un pequeño volumen del complejo puede ser inyectado en cada uno de los sitios (Nabel, G.J., y Otro(s), (1993), Proc.Natl.Acad.Scie. U.S.A.. 90: 11307 - 11311). Por lo tanto, el objeto de la presente invención es el de proveer complejos estables, biológicamente activos, que comprenden lípidos, para la entrega de drogas, los cuales complejos deben ser capaces de ser concentrados; y también es el de proveer métodos para producir dichos comolejos. Breve descripción de la Invención La presente invención provee métodos para producir complejos que contienen lípidos, para la entrega de drogas, los cuales complejos tienen una carga positiva neta y/o una superficie cargada positivamente. Mediante la expresión "droga" tal como se la utiliza en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, se hace alusión a cualquier entidad molecular, que sea monomérica u oligomérica, y que, al ser unida en forma de complejo con un lípido o con un lípido y un policatión, es administrado a un individuo con el objeto de proveer un efecto terapéutico en el receptor. Por lo tanto, cabria esperar que las macromoléculas que tienen una carga global neta negativa, o regiones de negatividad, serían capaces de formar los complejos entregadores, de la presente invención. Las macromoléculas que son particularmente adecuadas para ser utilizadas junto con los complejos de la presente invención, son, por ejemplo, el DNA, RNA, los oligo-nucleótidos o las proteínas cargadas negativamente. Sin embargo, cabria también esperar que las macromoléculas que tienen una carga positiva ((por ejemplo, una gran proteína catiónica), serían capaces de formar los complejos de la presente invención mediante la unión de la macromolécula catiónica con el lípido o polímero aniónico, y seguidamente con el lípido catiónico, de modo de formar un complejo. Los complejos de la presente invención abarcan un complejo droga/lípido formado mezclando la droga a ser entregada, con liposomas catiónicos, en una relación: droga/lípido, tal que el complejo droga/lípido formado tenga una carga positiva neta y un complejo: droga / lípido / policatión formado mezclando la droga con liposomas catiónicos y policatión en una relación lípido/policatión, tal que el complejo droga/lípido/policatión formado tenga una carga neta positiva. La expresión "carga neta positiva", aplicada al complejo droga/lípido, se refiere a un exceso de carga positiva, del lípido con respecto a la droga.

La expresión "carga neta positiva", aplicada al complejo droga/lípido/policatión, indica que las cargas positivas del lípido catiónico y del policatión, sobrepasan la car ga negativa de la droga. Sin embargo, debe entenderse que la presente invención también abarca los complejos droga lípido y droga / lípido / policatión que tienen una superficie positivamente car gada, independientemente de si la carga neta del comple jo es positiva, neutra o aun negativa. Es posible medir una superficie positivamente cargada de un complejo, mediante la migración del complejo en un campo eléctrico, conocido por los que tienen pericia en el arte, como la "Medición del Potencial Zeta". (Martion, A., Swarick, J., y Cammarata, A., Physical Pharmacy & Physical Chemical Principies in the Pharmaceutical Sciences, 3a edición, Lea and Febinger, Philadelphia, EE.UU. 1°83), o mediante la afinidad vinculadora del complejo con todas las superficies. Los complejos que presentan una superficie celular cargada positivamente, tienen una mayor afinidad a las superficies celulares que aquellos complejos que tienen una superficie neutra o cargada negativamente. Por ello, la presente invención se refiere a métodos para producir aquellos complejos droga/lípido y droga/lípido/policatión, que comprenden el mezclar la droga a ser entregada, con liposomas catiónicos, y opcionalmente policatión, ello, en una relación tal que el complejo formado tiene una carga neta positiva y/o una superficie cargada positivamente.

En otra forma de realización de la presente invención, los métodos para producir complejos droga/lípido o droga/lípido/policatión, pueden además comprender el oaso de la purificación de dichos complejos a partir de componentes libres ¿n exceso (droga, lípido, policatión), después de su producción. Los complejos droga/lípido y droga/lípido/policatión de la presente invención, son generalmente estables, capaces de ser producidos con una concentración relativamente elevada, y retienen su actividad biológica a lo largo del tiempo, bajo condiciones de almacenamiento. Dichos complejos son de utilización en la entrega (hacer llegar) los ácidos nucleicos, las proteínas y otras macromoléculas, a las células y tejidos. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En la Figura 1 se muestra una distribución típica de los tamaños (diámetro medio) de complejos de ácido nucleico / liposomas preparados en forma de un mezclado conjunto a partir de liposomas DC-Chol/DOPE (3:2) y DNA de plásmido pRSVL (2 µg), con las relaciones lípido/DNA, indicadas. Las Figuras 2A y 2B muestran la distribución del marcador de los liposomas, el 3H-colesteril hexadecil éter (o) y del marcador del 2P-DNA (•), elegido entre las fracciones de los gradientes de la sucrosa. Las localizaciones de cada una de las fracciones en los gradientes de la sucrosa, de ambas Figuras 2A y 2B, se indica en la parte superior de la Figura 2 A. En la Figura 2A se muestra la distribución de los marcadores H y después de la centrifugación de los liposomas libres (10 µmoles de DC- Chol DOPE (2:3) en 2 ml de volumen) o de DNA libre (50 µg de DNA de pRSVL en un volumen de 2 ml) a través de un gradiente de densidades de sucrosa. En la Figura 2B se muestra la distribución de los marcadores H y P después de la ultra centrifugación del complejo DNA-liposoma (formado a través del mezclado de 20 µmoles de lípidos DC-Chol/DOPE (2:3) y 0,4 mg de DNA de pRSVL en un volumen de 2 ml) a través de un gradiente de densidades de sucrosa. En la Figura 3 se muestran las actividades de transfección en las células de CHO, del complejo del mezclado conjunto DNA/liposoma (o), del complejo de mezclado conjunto DNA/liposoma poli-L-lisina (PLL), del complejo (D) del complejo DNA/lípido (•), y del complejo DNA/lípido PLL (B). Los liposomas DC -Chol/DOPE utilizados para formar los complejos mencionados, contenían una cantidad variable de % de mol de DC-Chol, tal como se indica en el fondo de la Figura 3. Los complejos DNA/lípido (•) y DNA lípido/PLL (B), fueron purificados en un gradiente de densidades de sucrosa antes de ser sometidos a ensayo para establecer la actividad de la transfección. La actividad de la transfección se indica en el eje vertical, en forma de unidades luminosas de actividad de luciferasa. En la Figura 4 se muestran las actividades de trans fección del complejo mezclado conjunto de DNA liposoma (o) y del complejo de mezclado conjunto DNA/liposoma/PLL (D) comparadas con las actividades de transfección de los complejos DNA/lípido (•) y DNA/lípido/PLL almacenados a una temperatura de 4 °C durante 130 días después de su purificación en un gradiente de densidades de sucrosa. Los liposomas DC-Chol/DOPE utilizados para formar los complejo recién mencionados, contenían cantidades % en mol variables de DC-Chol, tal como se indica en la parte inferior de la Figura 4. La actividad de la transfección se indica en el eje vertical, en forma de unidades luminosas de actividad de luciferasa. En la Figura 5 se muestra la concentración de la proteína que puede ser extraída de las células de CHO, 36 horas después de que las células fueran tratadas con un complejo de mezclado conjunto DNA/liposoma (o); complejo de mezclado conjunto DNA liposoma/PLL (D); complejo DNA/lípido ( • ); o complejo DNA/lípido/PLL (B). Los complejos DNA lípido y DNA/lípido/PLL, fueron purificados en un gradiente de densidades de sucrosa, antes de ser sometidos a ensayo para evaluar la actividad de la transfección. Las liposomas DC-Chol/DOPE utilizadas para formar los complejos recién mencionados, contenían cantidades variables, expresadas en % de mol, de DC-Chol, tal como se indica en el fondo de la Figura 5. En la Figura 6 se muestran los resultados de los ensayos de CAT de extractos tumorales preparados a partir de ratones que tenían tumores ovarianos. Una cantidad (2 x 10E6) de células de carcinoma ovariano humano, fue inyectada por vía subcutánea en ratones SCID, en el día 0.

En el día 14, unas soluciones de 100 µl que contenían DNA de pUCCMVCAT (contiene el gen de cloramfenicol acetil transferasa del ]_ coü) (30 µg), que formaban un complejo con liposomas DC-Chol (30 nmoles) en la forma de un mezclado conjunto (avenidas (lañes) 1 y 2; muestras por duplicado), o la misma cantidad de DNA en la forma de complejo purificado (preparado a partir de liposoma DNA:DC-Chol en una relación 1 µg/25 nmoles, avenidas 3 y 4; muestras por duplicado), fueron directamente inyectados en unos tumores. A las cuarenta y ocho horas después de la transfección, los ratones fueron sacrificados, y los extractos tumorales que contenían 100 µg de proteína, fueron sometidos a ensayo para establecer la actividad de CAT.

La avenida 5 muestra una actividad de CAT de control, positiva, para el CAT standard de E. coli. En las Figuras 7A-7C se muestra las actividades de transfección del compiejo de mezclado conjunto DNA/lípido y de los complejos, purificados y sin purificar, de DNA/lípido/PLL, en células "293" (Figura 7A), células C3 (Figura 7B) y células BL6 (Figura 7C). La actividad de la transfección se indica en el eje vertical de las Figuras 7A-7C, en forma de unidades luminosas de actividad de luciferasa. Descrip?iQn «je la Invención La presente invención se refiere a los complejos para entregar drogas y que contienen lípidos, los cuales complejos tienen una carga neta positiva y/o una superficie cargada positivamente con un pH 6.0 - 8.0. Estos complejos comprenden liposomas catiónicos, drogas, y opcionalmente también comprenden policationes. La presente invención se refiere además a un método para producir estos complejos, pudiendo el método además opcionalmente incluir el paso de la purificación de estas formulaciones mediante la elimninacón de los componentes individuales presentes en exceso. Para la producción de los complejos droga/lípido de la presente invención, la inclusión del paso de la purificación, es una forma de realización preferida. Debe entenderse que cuando se aplique el paso de la purificación a los complejos droga/lípido/policatión, la recuperación de dichos complejos en un estado puro libre de componentes en exceso, después de la purificación, es inferior a la recuperación de los complejos droga/lípido después de su purificación, por cuanto el pico que contiene el complejo droga/-lípido/policatión después de la purificación de la sucrosa después de la centrifugación por densidad, es mas amplio que el pico que contiene los complejos droga/lípido, por lo que se superpone con los picos de los componentes libres. Los complejos para la entrega de drogas y que contienen lípidos, de la presente invención, son estables, capaces de ser producidas con concentraciones relativamente elevadas, y retienen la actividad biológica del componente droga a lo largo del tiempo bajo condiciones de almacenamiento. El método para producir estos complejos, se basa en un modelo de vinculación entre dos polímeros de cargas opuestas (es decir, ácido nucleico cargado negativamente y lípidos cargados positivamente) en los cuales la formación de grandes agregados inestables se evita mediante la neutralización de la carga negativa de la droga mediante la utilización de una cantidad en exceso de carga positiva en la forma de liposomas catiónicos y policatión.

Se ha observado que los complejos de la presente invención retienen su diámetro y bioactividad inicial durante 4 meses en condiciones de almacenamiento en un tampón de sucrosa al 10 %. Las "drogas" que están contenidas en los complejos que entregan droga y que contienen lípido, de la presente invención, pueden ser ácidos nucleicos, proteínas polianiónicas, polisacáridos y otras macromoléculas que pueden formar complejos directamente con lípidos catiónicos. Sin embargo, las drogas catiónicas (por ejemplo, proteínas canónicas grandes), pueden formar directamente complejos con un lípido aniónico o formar secuencialmente complejos primero con un lípido o polímero aniónicos seguido por un lípido catiónico. La utilización de este proceso, permite la entrega de la droga, cargada positivamente o neutra, a las células, mediante los complejos de la presente invención. Para producir los complejos droga lípido y droga/lípido/policatión con una carga neta positiva, el exceso de carga positiva del lípido con respecto a la droga, o del lípido y policatión con respecto a la droga, puede ser un exceso de aproximadamente 30 veces de la carga positiva en el complejo de lípidos totales/droga, o de lípido y policatión y droga, preferentemente un exceso de carga de 2 a 10 veces, y mas preferentemente, un exceso de la carga, de 2 a 6 veces la carga. Los complejos que poseen una carga positiva en sus superficies, pueden tener rangos preferidos similares de exceso de carga superficial con respecto a la droga. Para producir un complejo ácido nucleico/lípido que tiene un exceso de carga positiva de lípido con respecto al ácido nucleico, las cantidades molares de lípido liposomal catiónico a ser mezclado con 1 µg de ácido nucleico para producir un complejo ácido nucleico/lípido que tiene una carga positiva en exceso de lípido a ácido nucleico a pH 6,0 - 8,0, pueden variar de aproximadamente 0, 1 nmol a aproximadamente 200 nmol de lípido, preferentemente de aproximadamente 5 nmol a aproximadamente 100 nmol de lípido, dependiendo ello del contenido de la carga positiva del liposoma catiónico. Por supuesto, si la droga fuera una proteína, la cantidad de lípido a ser mezclada con 1 µg de proteína cargada negativamente, sería de por lo menos diez veces menor que la cantidad de lípido a ser mezclado con 1 µg de DNA, tal como se muestra en lo que precede, por cuanto las proteínas presentan una carga de menor densidad que los ácidos nucleicos. Las personas con la pericia habitual en el arte, comprenderán fácilmente que, en función del contenido positivo de la carga de los liposomas catiónicos, sería necesario mezclar diferentes cantidades molares de liposomas catiónicos con una cantidad equivalente de droga, a efectos de producir un exceso de carga positiva del lípido con respecto a la droga. Cuando haya de producirse un complejo droga/lípido/policatión que tiene una carga positiva neta y/o una superficie positivamente cargada, la inclusión del policatión reduce la cantidad de lípido que ha de ser mezclada con la droga, siempre y cuando la carga positiva debida al lípido, pueda ser inferior que la carga negativa debida a la droga. Esta reducción en la cantidad de lípido, reduce la toxicidad de las formulaciones que contienen policatión. Las cantidades molares de liposomas catiónicos a ser utilizadas en la formulación de complejos ácido nucleico/lípido/policatión, puede variar en el rango de aproximadamente 0,1 nmol a aproximadamente 200 nmol de lípido por 1 µg de ácido nucleico, mas preferentemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 nmoles de lípido por 1 µg de ácido nucleico, dependiendo ello del contenido de carga positiva de los liposomas catiónicos. En términos generales, debe entenderse que en la producción de los complejos de ácido nucleico/lípido y ácido nucleico/lípido/policatión de la presente invención, la cantidad molar de lípidos requerida para producir estos complejos, se incrementará a medida que aumenta la concentración del ácido nucleico mezclado con los liposomas. Los que tienen la pericia habitual en el arte, comprenderán fácilmente que cuando los complejos de la presente invención son purificados, el exceso de carga positiva de los liposomas catiónicos con respecto a la droga o de los liposomas catiónicos y del policatión con respecto a la droga inmediatamente antes del mezclado, será mayor que el exceso de carga positiva en los complejos purificados de los lípidos con respecto a la droga, o del lípido y policatión, por cuanto el paso de la purificación, resulta en la remoción de los lípidos libres en exceso y/o del policatión libre. A efectos de ilustrar cómo las cargas atribuidas al liposoma catiónico, droga y policatión, pueden ser determinados a pH 6,0 - 8,0 se provee el siguiente ejemplo. Suponiendo que la droga a ser entregada sea DNA, se procede a determinar la carga negativa del DNA a ser entregado, para lo cual se divide la cantidad de DNA a ser entregada, o la cantidad de DNA en el complejo, por 330, que es el peso molecular de un nucleótido aislado; un nucleótido es igual a una carga negativa. Por lo tanto, la carga negativa para 1 µg de DNA, es de 3,3 nmols. Para 10 nmol de lípidos DC-Chol/DOPE, uno calcula la carga efectiva del lípido, para lo cual se multiplica la cantidad de lípido liposomal (10 nmol) por 0,4 (40 % del lípido liposomal es el liposoma catiónico DC-Chol), obteniéndose 4 nmol de lípido DC-Chol en los liposomas. Dado que a pH 6-8, una molécula de DC-Chol tiene una carga positiva, la carga positiva efectiva de lípido liposomal en el momento del mezclado, o en el complejo, es de 4,0 nmol. Por supuesto, los que tienen la pericia habitual en el arte, entenderían rápidamente que hay otros liposomas catiónicos que podrían tener una cantidad mayor o menor de carga positiva por molécula de liposoma catiónico a pH 6,0 -8,0, que el DC-Chol. Suponiendo que el policatión a ser mezclado para formar el complejo, sea una sal de bromo de poli-L-lisina (PLL), la carga positiva de PLL en el momento del mezclado, se obtiene dividiendo la cantidad de PLL a ser mezclada, por 2QZ, que es el peso molecular de un residuo lisilo; un residuo lisilo, equivale a un carga positiva. Por lo tanto, la carga positiva para 1 µg de PLL, es de aproximadamente 5,0 nmols. Para calcular la carga positiva aportada por los residuos lisilo en un complejo formado, la cantidad de lisina presente en el complejo, es dividida por el peso molecular de un residuo lisilo, tomándose en cuenta el peso de un contra-ión, caso de estar presente. La aplicación de los cálculos recién explicados, a los datos presentados en la Tabla 1 incluida en la presente (ver Ejemplo 3), ilustra cómo puede calcularse una relación de cargas positiva/negativa, tanto en el momento del mezclado del DNA y del liposoma y, después de la purificación del complejo producido por el mezclado del DNA con el liposoma. En la Tabla 1 del Ejemplo 3, 0,4 mg de DNA son mezclados con 20 µmols de liposomas catiónicos DC-Chol/DOPE, obteniéndose un complejo DNA/lípido. Para los liposomas catiónicos que tienen una relación DC-Chol/DOPE, de 4:6, el contenido de carga positiva del lípido liposomal, tomado igual a 8000 nmol y el contenido de carga negativa de los 0,4 mg de DNA, a ser mezclados con los liposomas, se toma como 1320 nmols, en base a los cálculos con las muestras, presentados en los párrafos anteriores.

Por ello, la relación entre la carga positiva y la negativa en el momento del mezclado, es de 6,06 (8000 dividido por 1320). Sin embargo, una vez que el complejo haya sido purificado, la relación entre el liposoma y el DNA de este complejo purificado, era de 12,7 nmol de liposoma µg de DNA, tal como se muestra en la Tabla 1 (ver la "fila 4:6"). Esta relación de 12,7, se traduce a una relación de cargas positiva a negativa, de 1,5, con lo cual se muestra que la purificación retiró el exceso de carga positiva de los liposomas libres. También en la Tabla 1, en la cual el complejo DNA/lípido/PLL fue preparado mezclando 4 µmol de liposomas (DC-Chol/DOPE 4:6) y 1 mg de PLL con 0,4 mg de DNA, es posible calcular la relación entre la carga positiva y la negativa en el momento del mezclado, como sigue.

En base a los cálculos en las muestras, presentados en los párrafos precedentes, el lípido liposomal (4 µmol) aporta 1600 nmol de carga positiva, el PLL (1 mg) aporta 5000 nmol de carga positiva, y el DNA (0,4 mg) aportan 1,320 nmol de carga negativa. Por lo tanto, la relación entre la carga positiva y la negativa, en el momento del mezclado de las liposomas, PLL y FDNA, es de 5 (1600 + 5000) / 1320 Además, los que tienen pericia en el arte, deben comprender que la carga neta del complejo puede ser determinada midiendo la cantidad de DNA, lípido y, caso de haberlo, policatión, en el complejo, mediante la utilización de una adecuada técnica analítica tal como la utilización de un rotulado radio-isotópico de cada uno de los componentes o mediante análisis elemental. Una vez que las cantidades de cada uno de los componentes (DNA, lípido, y, caso de haberlo presente, policatión) en un complejo con un pH dado, son conocidas, se podría entonces calcular la carga neta aproximada de dicho complejo con el pH dado, tomando en cuent los pK's de los componentes que puedan ser conocidos o determinados analíticamente. En una forma de realización preferida, la droga es una secuencia de ácidos nucleicos, preferentemente una secuencia de ácidos nucleicos que codifique un producto gen que tiene una utilidad terapéutica. En una forma de realización de la invención, un método para producir complejos de ácido nucleico/lípido que tiene una carga positiva neta y/o una superficie cargada positivamente a pH 6,0 - 8,0, comprende el combinar ácidos nucleicos con liposomas catiónicos en una relación: ácido 10 nucleico/lípido, tal que el complejo ácido nucleico/lípido formado, tiene un exceso de carga positiva de lípido a ácido nucleico. En una forma de realización alternativa, el ácido nucleico y el liposoma catiónico pueden ser mezclados con el policatión en una relación: ácido nucleico/policatión, tal que los complejos de ácido nucleico/policatión formados tienen una carga positiva en exceso del lípido y policatión con respecto al ácido nucleico, con un pH = 6 - 8. En una forma de realización preferida, los complejos ácido nucleico/lípido y ácido nucleico/lípido/policatión, son producidos mediante la lenta adición de ácido nucleico a la solución de liposoma o de liposoma mas policatión, y mezclando con una barra de agitación cuando se permite que el mezclado tenga lugar en segundo término. Como alternativa, el liposoma, o la mezcla de liposoma / policatión, pueden ser adicionados en una única cámara, a partir de una primera entrada, al mismo tiempo que el ácido nucleico es adicionado a la cámara a través de una segunda entrada.

Los componentes son seguidamente mezclados simultáneamente mediante medios mecánicos, en una cámara en común. Los liposomas catiónicos mezclados con la droga, o con droga y policatión, para formar los complejos de la presente invención, pueden contener un liposoma catiónico sólo o un liposoma catiónico y combinado con un fosfolípido neutro. Las especies de liposomas catiónicos adecuadas, incluyen a título no limitativo, los siguientes: el 1 ,2-bis(oleoíloxi)-3-(trimetil amonio) propano (DOTAP); el cloruro de N-l,(2,3-dioleoíloxi) propil-N,N,N-trimetil amonio (DOTMA), u otros surfactantes N-(N,N-dialcoxi) alquil-N,N,N-amonio tri sustituido; el l,2-dioleoíl-3-(4'-trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol (DOBT) o el colesteril (4'-.rimetilamonio)butanoato (ChOTB) en el cual el grupo trimetilamonio está conectado mediante un brazo separador de butanoílo, a sea la doble cadena (para DOTB) sea el grupo colesteril (para ChOTB); el DORI(DL- 1 ,2-dioleoíl-3-dimetilamino?ropil-B-hidroxietilamonio) ÓDORIE (DL-1, 2-0-dioleoíl-3-dimetilaminopro?il-ß-hidroxietilamonio) (DORIE), o análogos de los mismos, tales como se revela en el documento WO 93/03709; 1, 2-dioleoíl-3-succinil-sn-glicerol colina éster (DOSC); colesteril hemisuccinato éster (ChOSC); las Upo poliaminas tales como la doctadeci-lamido glicil espermina (DOGS) y la dipalmitoíl fosfatidi etanolamido espermina (DPPES) o los lípidos catiónicos revelados en la Patente Estadounidense No. 5,283,185, el ioduro de colesteril-3ß-carboxil-amido-etilentrimetilamino, el ioduro de l-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesteril carboxilato, la colesteril- 36 -carboxiamido etilen amina, el ioduro de colesteril-3ß-oxisuccinamido-etilentrimetilamonio, el ioduro de 1-dimetilamino-3-tri metil amonio-DL-2-propil-colesteril-3ß-oxisuccinato, el ioduro de 2-(2-trimetilamonio)etilmetilamino etilcol esteril-3ß-oxisuccinato, el 3ßN-(N',N'-dimetil amino etano) carbamoíl colesterol (DC-Chol), y el 3ß-N-(polietilenimina) -carbamoilcolesterol. Los ejemplos de lípidos catiónicos preferidos, incluyen: el ioduro de colesteril-3ß-carboxiamidoetilentrimetilamonio, el ioduro de 1-dimetila-mino-3-trimetilamino-DL-2-propil-colesteril carboxilato, el ioduro de coles teril-3ß-carboxiamido etilen amina, el ioduro de coles teril-3ß-oxisuccina-midoetilen metilamonio, el ioduro de l-dimetilamino-3-trimc .tamino-DL-2-propil-colesteril-3ß-oxisuccinato, el ioduro de 2-(2-tri metilamonio) etilmetil amino etil-colesteril-3ß-oxisuccinato, el 3ßN-(N',N'-di metil aminoetano)-carbamoíl-colesterol (DC-Chol), y el 3ßN-(polietilenimina)-carbamoíl colesterol. Dado que uno de los atributos de los complejos de la invención, es su estabilidad durante el almacenamiento (es iecir, su capacidad de conservar un diámetro pequeño y de retener una actividad biológica a lo largo del tiempo después de su formación), los que tienen la pericia habitual en el arte, comprenderán que los lípidos catiónicos preferidos son aquellos lípidos en los cuales los enlaces entre el grupo lipófilo y los grupos amino son estables en la solución acuosa. Si bien dichos enlaces hallados en los lípidos catiónicos incluyen los enlaces amídicos, los enlaces éster, los enlaces éter y los enlaces carbamoílo, los lípidos catiónicos preferidos son aquellos que tienen un enlace carbamoílo. Un ejemplo de lípido catiónico preferido que tiene un enlace carbamoílo, es el DC-Chol. Los que tienen la pericia habitual en el arte, comprenderán fácilmente que los liposomas que contienen mas de una especie de lípidos catiónico, pueden ser utilizados para producir los complejos de la presente invención. Por ejemplo, se han descubierto liposomas que comprende dos especies de lípidos catiónicos, la lisil-fosfatidiietanolamina y el ß-alanil colesterol éster (Brunette, E. y Otro(s), (1992), Nucí. Acids. Res.. 20:1151).

Además, debe entenderse que en la selección de los liposomas catiónicos adecuados para ser utilizados en el mezclado conjunto con la droga y opcionalmente con el policatión, para formar los complejos de la presente invención, los métodos de la presente invención no se restringen solamente a la utilización de los lípidos ya mencionados en la presente; al contrario, puede utilizarse cualquier composición de lípidos, siempre y cuando se produzca un liposoma catiónico. Por lo tanto, además de los lípidos catiónicos, los liposomas catiónicos utilizados para formar los complejos de la invención, pueden contener otros lípidos además de los lípidos catiónicos. Dichos lípidos incluyen a título no limitativo, los siguientes: los liso lípidos de entre las cuales la lisofosfatidilcolina (1-oleoíllisofosfatidilcolina) es un ejemplo, el colesterol, o los fosfolípidos neutros que abarcan la dioleíl fosfatidil etanolamina (DOPE) o la dioleíl fosfatidilcolina (DOPC). Los complejos de lípidos de la presente invención, también pueden contener lípidos cargados negativamente como también lípidos catiónicos, siempre y cuando la carga neta de los complejos formados sea positiva y/o la superficie del complejo esté cargada positivamente. Los lípidos cargados negativamente de la presente invención, son aquellos que comprenden por lo menos una especie de lípido que tiene una carga negativa neta en o cerca del pH fisiológico, o combinaciones de las mismas. Las especies de lípidos negativamente cargados adecuados, comprenden el fosfatidil glicerol y el ácido fosfatídico o un análogo fosfolípido similar. Por otra parte, se considera que en los liposomas catiónicos utilizados para formar los complejos de la invención, la relación de los lípidos puede ser variada de modo de incluir una mayoría de lípidos catiónicos en combi nación con colesterol o con mezclas de liso lípidos o lípidos neutros. Cuando el lípido catiónico elegido ha de ser combinado con lípido, un lípido preferido es un fosfolípido neutro, mas preferentemente, el DOPE.

Los métodos para producir los liposomas a ser utiliza dos en la producción de los complejos que comprenden lípido y que sirven para entregar las drogas, de la presen te invención, son conocidos por los que tienen pericia en el arte. Una revisión de las metodologías para la preparación de los liposomas, puede ser hallada en: Liposome Technology (CFC Press NY 1984); Liposomes. por Ortro (Marcel Schher, 1987); Methods Biochem Anol.. 33:337-462 (1988) y Patente Estadounidense No. 5,283,185, Dichos métodos incluyen la extrusión y sonicación de congelar-descongelar. Pueden utilizarse tanto liposomas unilaminares (diámetro promedio, inferior a aproximadamente 200 nm) como liposomas multilaminares (diámetro promedio, superior a aproximadamente 200 nm), como componentes de partida para producir los complejos de esta invención. En los liposomas catiónicos utilizados para producir los complejos: droga/lípido de la presente invención, el lípido catiónico se halla presente en el liposoma en de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 % mol de lípido liposimal completo, preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 % mol, y preferentemente aun, de aproxima damen te 20 a aproximadamente 60 % mol. El lípido neutral, cuando está incluido en el liposoma, puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 90 % mol del lípido liposomal completo, preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 % mol, mas preferentemente aun, de apro ximadamente 40 a 80 % mol. El lípido cargado negativamente, cuando está incluido en el liposoma, puede estar presente en una concentración que varía entre de aproximadamente 0 % mol y aproximada mente 49 % mol del lípido liposomal completo, preferente mente de aproximadamente 0 % mol a aproxima damente 40 % mol. En una forma de realización preferida, los liposomas contienen un lípido catiónico y un lípido neutro, mas preferentemente, DC-Chol y DOPE, en relaciones de entre aproximadamente 2:8 a aproximadamente 6:4. Debe además entenderse que los complejos de la presente invención pueden contener lípidos modificados, proteínas, polica tiones o ligantes de los receptores que funcionan como un factor de puntería que dirige el complejo hacia un tipo de células o tejidos en particular. Los ejemplos de factores de puntería incluyen, pero no se limitan a, la asialglicoproteína. la insulina, la lipoproteína de baja densidad (LDL), el folato y los anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra las moléculas de la superficie de las células. Los blancos potenciales incluyen de manera no limitativa: el hígado, las células sanguíneas, las células endoteliales y las células tumorosas. Además, debe entenderse que la carga positiva de los complejos de la presente invención, puede ser afectada no solamente por la composición lípido del complejo sino también por el pH de la solución en la cual se forman los complejos: droga/lípido. Por ejemplo, si se incrementa el pH (se lo hace mas básico), se neutraliza gradualmente la carga positiva de la amina terciaria del lípido catiónico DC-Chol. En una forma de realización preferida, los complejos de la presente invención son producidos, y almacenados, con un pH tal que los complejos tienen una carga positiva neta y/o una superficie cargada positivamente. Un rango preferido para los pH, es el pH 6,0 - 8,0, mas preferentemente, de 7,0 a 7,8. Cuando haya de mezclarse un policatión con ácido nucleico y liposomas catiónicos, el policatión puede ser seleccionado de entre los 0 policationes orgánicos que tienen un peso molecular de entre aproximadamente 300 y aproximada mente 200.000. Dichos policationes tienen preferentemente también una valencia de entre aproximada mente 3 y aproximadamente 1000, a pH = 7,0. Los policationes pueden ser aminoácidos, péptidos, proteínas, 5 poliaminas, carbohidratos, naturales y sinté ticos, y cualesquiera polímeros catiónicos sintéticos. Los ejemplos no limitativos de policationes, incluyen: la poliarginina, la poliomitina, las protaminas y la polilisina, el polibreno (bromuro de hexadimetrina), la histona, los dendrímeros catiónicos, la espermina, la espermi dina y los polipéptidos derivados de antígeno-T SV40 o grande que tiene un exceso de cargas positivas y representa una señal de localización nuclear. Un policatión preferido, es la poli-L-lisina (PLL). En la producción de los complejos: ácido nucleico / lípido / policatión, de la presente invención, la relación entre el policatión y el ácido nucleico, es mantenida -. fija, mientras se varía la cantidad de liposoma.

Sin embargo, los que tienen pericia en el arte, reconocerán que la •-elación entre el policatión y el ácido nucleico, será afectado por la densidad de la carga del lipoí na a ser mezclado junto con el ácido nucleico y el policatión. Por ejemplo, si la densidad de la carga de los liposomas disminuye como resultado de cambios en la composición del lípido del liposoma (por ejemplo, si se disminuye la relación entre el lípido catiónico y el lípido neutro en el liposoma), la cantidad de policatión a ser mezclada junto con el ácido nucleico y el liposoma, será incrementada para compensar la disminución de carga positiva aportada por los liposomas. Sin embargo, si se utiliza policatión, es de preferir la utilización de cantidades sub-saturantes de policatión (es decir, cantidades que no saturen la totalidad de la carga negativa del ácido nucleico) a efectos de permitir que los liposomas catiónicos formen complejos con el ácido nucleico. Por lo tanto, en una forma de realización preferida de la presente invención, se utiliza un exceso de carga positiva de lípido con respecto al ácido nucleico, aun cuando haya un policatión mezclado con el lípido y el ácido nucleico. Las cantidades de policatión que pueden ser mezclados con 1 µg de ácido nucleico y cantidades variables de liposomas catiónicos en la presente invención, varían entre aproximadamente 0,01 µg y aproximadamente 100 µg de policatión por µg de ácido nucleico, preferentemente de aproximadamente 0,1 µg a aproximadamente 10 µg de policatión por µg de ácido nucleico. Cuando se desee la purificación de los complejos ácido nucleico/lípido y ácido nucleico/lípido/policatión, mediante la eliminación del DNA libre en exceso, de los liposomas libres en exceso y del policatión libre en exceso, la purificación puede ser llevada a cabo mediante la centrifugación a través de un gradiente de densidades de sucrosa, o de otros medios que sean adecuados para formar un gradiente de densidades. Sin embargo, se entiende que también podrían utilizar se otros métodos de purificación tales como la cromatogra fía, filtración, partición de fases, precipita ción o absorción. En una forma de realización preferida, se utiliza la purificación a través de la centrifugación por un gradiente de densidades de sucrosa. El gradiente de sucrosa puede variar de aproximadamente 0 % de sucrosa a aproximadamente 60 % de sucrosa, preferentemente de aproximadamente 5 % de sucrosa a aproximadamente 30 % de sucrosa. El tampón en el cual se efectúa el gradiente de sucrosa, puede ser cualquier tampón acuoso que sea adecuado para el almacenamiento de la fracción que contiene los complejos y es preferible que se trate de un tampón adecuado para la administración del complejo a las células y tejidos. Un tampón preferido, es el pH 7,0-8,0 Hepes. Se entiende que en la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos preferidas son aquellas que son capaces de dirigir la expresión de las proteínas. Dichas secuencias pueden ser insertadas mediante tecnolo gías rutinarias, en vectores de expresión de plás mido, conocidos por los que tienen pericia en arte, con anterioridad al mezclado con los liposomas catiónicos o lípidos catiónicos y policatión, de modo de formar los complejos que comprenden lípidos y que entregan las drogas, de la presente invención. La cantidad de ácido nucleico mezclada junto con los liposomas catiónicos o con los liposomas catiónicos y el policatión, puede variar entre aproximadamente 0,01 µg y aproximadamente 1 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1 µg a aproximadamente 1,0 mg. Se entiende que cuando el ácido nucleico de interés está contenido en los vectores de expresión de plásmido, la cantidad de ácido nucleico anteriormente mencionada, se refiere al plásmido que contiene el ácido nucleico de interés. La purificación de los complejos de ácido nucleico / lípido y de ácido nucleico/lípido/policatión, de la presente invención, sirve para concentrar los ácidos nucleicos y los lípidos contenidos en los complejos resultantes, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces, de modo tal que el contenido de lípido contenido en los complejos, puede llegar a ser de hasta aproximadamente 40 µmol/ml y el contenido de ácido nucleico puede llegar a ser de hasta aproximadamente 2 mg/ml. El diámetro de los complejos producidos por los métodos de la presente invención, es inferior a aproximada mente 400 nm, preferentemente inferior a aproximada mente 200 nm, y mas preferentemente aun, inferior a 150 nm. Los complejos formados mediante los métodos de la presente invención, son estables durante hasta aproximada mente un año cuando son almacenados a una temperatura de 4 °C. Los complejos pueden ser almacenados en una solución de sucrosa al 10 % al ser recuperados del gradiente de sucrosa, o pueden ser liofilizados y seguidamente reconstituidos 2Q en una solución de sucrosa al 10 %, con anterioridad a la utilización. En una forma de realización preferida, los complejos son almacenados en solución. La estabilidad de los comple jos de la presente invención, se mide mediante ensayos específicos a efectos de determinar la estabilidad física y la actividad biológica a lo largo del tiempo, bajo condiciones de almacenamiento. La estabilidad física de los complejos se mide determinando el diámetro de los complejos, para lo cual se recurre a métodos bien conocidos por las personas que tienen la pericia habitual en el arte, los cual incluye por ejemplo la microscopía electrónica, la cromatografía de filtración de gel, o mediante la dispersión luminosa casi-elástica, para lo cual se utiliza un dimensionador de partículas Coulter N4SD, tal como se describe en los ejemplos. La estabilidad física del complejo queda "sustancial mente sin cambiar" durante el almacenamiento cuando el diámetro de los complejos almacenados no es incrementada en mas del 100 %, preferentemente en no mas del 50 %, y mas preferentemente en no mas del 30 %, con respecto al diámetro de los complejos tal como los mismos se determinan en el momento en que los complejos han sido purificados. Los ensayos utilizados en la determinación de la actividad biológica de los complejos, varían en función de cuál es la droga contenida en los complejos. Por ejemplo, si la droga es un ácido nucleico que codifica un producto-gen, es posible determinar la actividad biológica tratando las células in vitro bajo condiciones de transfección utilizadas por los que tienen la pericia habitual en el arte para la transfección de complejos de mezclado conjunto, de DNA y liposomas catiónicos. Las células que pueden ser transfectadas por los complejos, incluyen aquellas células que pueden ser transfec ta das mediante complejos de mezclado conjunto de DNA/liposoma. La actividad de los complejos almacenados, es seguidamen te comparada con la actividad de transfección de los complejos preparados por mezclado conjunto. Si la droga es una proteína, entonces es posible determinar la actividad mediante un bio-ensayo apropiado para dicha proteína. Cabe además entender por los que tienen pericia en el arte, que los complejos de la presente invención, pueden ser utilizados in vivo como vectores en la terapia basada en los genes. Las formulaciones terapéuticas en las cuales se utilizan los complejos de la presente invención, preferente men te comprenden los complejos en una tampón fisiológica mente compatible tal como por ejemplo suero fisiológico tamponado con fosfato, suero salino isotónico o tampón de baja intensidad iónica tal como sucrosa al 10 % en agua (pH 7,4 - 7,6) o en Hepes (pH 7-8, siendo un pH mas preferido, 7,4-7,6). Los complejos pueden ser administrados en forma de aerosoles o con soluciones líquidas para su administración intratumoral, intravenosa, intratraqueal, intraperitoneal e intramuscular. Todos los artículos o patentes a las cuales se hace alusión en la presente, se incorporan a título de referen ia. Los siguientes ejemplos ilustran varios aspee tos de la presente invención, pero de ninguna manera tienen el objeto de limitar los alípido catióniconces de la misma. EJEMPLOS Materiales El DOPE fue comprado a Avanti Polar Lipid, Inc. (Alabaster, AL, EE.UU.). El pRSVL, que es un plásmido que codifica el gen de la luciferasa bajo el control de la repetición de la terminal larga del virus del sarcoma de Rous (De Wet, J.R. y Otro(s), Mol.Cell.Bio 7: 725 - 737), fue ampliado en E.coli y purificado mediante la utilización del método de ultracentrifugación standard CsCl-ErtBr (Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laborato ry Manual (2a edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, EE.UU. (1989). Todos los medios para el cultivo de tejidos, fueron provistos por Gibco BRL (Gaithersburg, MD). Las lípidos 293 de riñon embriónico humano, las células CHO (Células ovarianas de Hámster Chino), las células BL6 y BHK (células de riñon de cría de hámster), fueron provistos por la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células pulmonares de ratones (MLC), son células de cultivo primarias originalmente derivadas del pulmón de un ratón Balb/c por el Dr.

S. Kenned (Oak Ridge National Laboratory, TN). Las células 293, BL6, BHK y MLC, frieron cultivadas con medio DMEM, las células de CHO fueron cultivadas con medio F12, y las células C3 Hela fueron cultivadas en un medio RPMI-1640. Todos los medios fueron complementados con su ro bovino fetal al 10 % (Hyclone Laboratories, Inc., UT), y 100 unidades de penicilina / ml y 100 µg de estreptomicina por ml. El bromhidrato de poli-L-lisina (MW 3000 y MW 25.600), y otros productos químicos, fueron provistos por Sigma (St. Louis, MI). El DC-Chol fue sintetizado de acuerdo con el método de Gao y Huang (1991) (Gao, X., y Huang, L. (1991) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 179, 280- 285), con modificaciones en los pasos de la purificación, como sigue: después de la reacción frieron adicionados 10 ml de hexano, y la mezcla fue extraída tres veces con 10 ml de agua. La fase orgánica fue reunida y secada al vacío, a una temperatura de 4 °C. El sólido resultante fue disuelto en una cantidad mínima de etanol absoluto bajo calor, y «cristalizado en acetonitrilo a una temperatura de 0 °C. La pureza del DC-Chol era por lo menos superior al 95 %, tal como se analizó mediante el método del TLC y el H-NMR, y el rendimiento era de aproximadamente el 70 %, lo cual es una significativa mejora con respecto al rendimien to del método anteriormente mencionado de Gao, X., y Huang, L. (1991), Biochem. Biophvs. Commun.. 179: 280 - 285). Métodos Preparación v Purificación del los Complejos Fueron preparados unos liposomas catiónicos con un complejo total de lípidos, de 20 nM, a partir de DC-Chol y DOPE, con varias relaciones, mediante un método de sónica ción, de acuerdo con un procedimiento publicado (Gao, X., y Huang., L. (1991) Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 179 : 280 - 285.

Una cantidad vestigial de 3H colesteril hexadecil éter (Amersham, Arlington Heights, IL) fue incluida para fines de cuantificación. El tamaño de los liposomas era de entre 100 y 150 nm de diámetro, tal como se determinó mediante la dispersión casi-elástica de la luz, para lo cual se utilizó un dimensiona dor de partículas Coulter N4SD (Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL). A menos que se indique otra cosa en los siguientes ejemplos, los complejos de DNA lípido fueron preparados en una típica escala de laboratorio mediante la adición de cantidades de liposomas libres DC-Chol/DOPE, tal como se indica en cada uno de los ejemplos en un volumen de 1 ml de tampón Hepes 2 nM (pH 7,6) a un sistema de cultivo de poliestireno 15 x 7,5 (Baxtere, McGraw Pare, IL); una agitadora micro-magnética fue colocada en el tubo, y la solución fue bien mezclada. Unas cantidades de DNA de pRSVL, tal como se indica en cada uno de los ejemplos, fue seguidamente colocadas gota a gota a partir de una solución de reservas (0,2 mg/ml, en tampón Hepes 2 mM, pH 7,6) a la solución de liposoma durante un período de 3 min. Unas cantidades vestigiales de pRSVL rotulados con p mediante un equipo transportarle nick (Promega, Madison, Wl) y el p dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) fueron incluidas para fines de cuantificación. Para preparar los complejos purificados de lípido / PLL / DNA, una cantidad de la solución anterior de 0,2 mg/ml de DNA, tal como se indica en cada uno de los ejemplos, fue adicionada a 1 ml de mezcla PLL/liposoma que contenía cantidades de liposomas y PLL, tal como se indica en cada uno de los ejemplos. Los complejos DNA lípido fueron colocados en la parte superior de un gradiente de pasos de sucrosa, compuesto de 0,5 ml cada uno de los siguientes: sucrosa al 5 %, al 7,5 %, al 10 % y 15 % (peso/peso), los complejos DNA lípido/PLL frieron colocados en la parte superior de un gradiente de pasos de sucrosa compuesto de 0,5 ml de cada uno de los siguientes: sucrosa al 5 %, i0 %, 15 %, 20 % y 30 % ([peso/peso). Los complejos de DNA lípido y de DNA/lípido/PLL, fue ron seguidamente purificados removiendo el lípido libre y el PLL libre, mediante ultra-centrifugación a 100.000 g durante 30 minutos a una temperatura de 4 °C. Después de la centrifugación, de la parte superior del tubo a su fondo, fueron extraídas unas fracciones de 200 µl. Unas alícuotas de cada una de las fracciones, fueron evaluadas para establecer la radioactividad H y p, para lo cual se utilizó un contador de escintilaciones. Las fracciones que contenían valores pico del p, frieron recuperadas y reunidas. Dichas fracciones reunidas, fueron seguidamente sometidas a ensayo para verificar el tamaño de sus partículas y la actividad de la transfección. Evaluación In Vitro de la Transfección La actividad biológica de los complejos anteriormente mencionados, fue evaluada mediante la transfección in vitro de lípidos en los Ejemplos, como sigue. En pocas palabras, unas células cultivadas en una placas de 48 cavidades, fueron incubadas con un complejo de DNA/lípido diluido en 0,5 ml de CHO-S-SFM (Gibco BRL) o con un complejo de mezclado conjunto de DNA/liposoma preparado de acuerdo con Gao y Huang (1991) (Gao, X., y Huang, L. ( 1991), Biochem. Biophvs. Res. Commun . 179: 280- 285). Para la transfección del DNA de pRSVL utilizándose liposomas de DC-Chol en la presencia de PLL, los liposomas fueron primero mezclados con PLL, y seguidamente unidas con DNA, formando complejos con el mismo. Todas las trans fecciones fueron efectuadas durante 4 horas a una temperatura de 37 °C. Después de la transfección, los lípidos frieron objeto de un mayor cultivo durante 36 horas en el medio adecuado que contenía suero bovino fetal al 10 %. Las células fueron seguidamente lavadas con PBS y Usadas con 100 µl de tampón lisis 1 X provisto mediante un equipo de evaluaciones portátil (Promega, Madison, Wl). Una muestra de 4 µl del lisato, fue sometida a ensayo para verificar la actividad de la transferasa, para lo cual se utilizó 100 µl de solución de 15 substrato tomada del equipo portátil de evaluación de la luciferasa reconsti tuida y un luminómetro AutoLumat LB953 (Berthold, Alemania). La concentración de las proteínas de cada uno de los lisatos, fue evaluada mediante un método de teñido de azul de Coomassie, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Pierce, Rockford, IL). 2o EJEMPLO 1 Determinación del Tamaño del Complejo DNA/Lípido. Mediante la Relación: DNA/Lípido. Este experimento fue llevado a cabo para demostrar que el tamaño del complejo DNA/lípido formado mediante el mez ciado conjunto, cambiaba _ a medida que variaba la reía ción del DNA mezclado con el liposoma. En pocas palabras, el DNA del plásmido pRSVL (2 µg), fue mezclado con variadas cantidades de liposomas DC-CHOL/DOPE (3:2) en tampón Hepes 2 nM a pH 7,6 en un volumen final de 500 µL y al cabo de 7 minutos, se determinó el tamaño del complejo mediante un dimensionador de partículas por luz láser dispersa Coulter N4SD, que operaba den el modo unimodelo.

Tal como se muestra en la Figura 1, no se formaron agregados grandes cuando el DNA se hallaba en exceso (relaciones: liposoma/DNA, inferiores a 7); pero con relaciones lípido/DNA que presentaban cargas neutrales (aproximadamente 10), el tamaño del complejo llegó a un máximo. En adición, cuando la relación de liposoma/DNA era mantenida constante a 10 nmoles/µg, el tamaño del complejo aumentaba a medida que aumentaba tanto la concentración del DNA como de liposoma, y finalmente se formaron precipita dos. Sin embargo, cuando la relación de liposoma/DNA era incrementada, el tamaño del complejo se redujo progresiva mente hasta que el tamaño del complejo se hizo constante (250 0 300 nm) cuando la relación de liposoma/DNA sobrepasó los 25 nmoles de lípido/ µg de DNA. Este resultado puede deberse al hecho de que el DNA era tal vez recubierto por los liposomas en exceso y por ello no se presentaba la agregación entre los complejos. En base a los datos presentados en la Figura 1, los complejos lípido/DNA fueron preparados utilizándose para ello una relación liposoma/DNA de 50 nmoles/g mediante la lenta adición de una solución de DNA a 200 µg/ml a una cantidad en exceso (10 µmols) de liposoma. El tamaño del complejo formado, era de aproximadamente 250 nm.

Cuando la relación del liposoma DNA era cambiado a 25 nmoles/µg, el tamaño del complejo aumentaba a aproximadamen te 350 nm. Los complejos formados utilizando sea la reía ción 25 nmol/µg sea la relación 50 nmol/g, pareció ser físicamente estable dado que no se formaron precipitados durante el almacenamiento durante 4 semanas a una temperatura de 4 °C. EJEMPLO 2 Purificación de los Complejos DNA/Lípido Cuando el DNA fue mezclado con liposomas en una relación de 1 µg/50 nmoles, se observó que existía un exceso de lípidos liposomales libres junto con el complejo DNA/lípido. Dado que los lípidos libres en exceso son tóxicas para las células, se llevó a cabo un experimento para determinar si los lípidos liposomales podían ser separados del complejo DNA/lípido mediante un método de ultra-centrifugación de gradiente de densidades. Brevemente, los liposomas libres (10 µmoles de DC-Chol/DOPE (2:3) en un volumen de 2 m); DNA libre (50 µg de pRSVL en un volumen de 2 ml) y complejo DNA lípido formado mezclando 20 µmoles de DEC-Chol/DOPE ((2:3) y 0,4 mg de DNA de plásmido de pRSVL (50 nmoles/µg), fueron, cada uno de ellos, sometido a centrifugación durante 30 minutos a una temperatura de 4 °C en un gradiente consistente en 0,5 ml de sucrosa con cada una de las siguientes concentraciones: 5 %, 7,5 %, 10 % y 15 % (peso/peso). Unas fracciones de 200 µl frieron seguidamente reunidas desde la porción superior al fondo del tubo, y sometidos a ensayo para establecer la distribución -¿1 marcador del DNA ( p, B) y el marcador de los lípidos (3H o). Las Figuras 2A y 2B muestran los resultados de separaciones típicas de lípido liposomal libre, DNA libre (Figura 2A) y complejo DNA/lípido (Figura 2B), en el gradiente de la sucrosa. Los resultados presentados en la Figura 2B, muestran que después de la centrifugación, el complejo formaba una banda mayor en la capa de sucrosa al 10 %. Por comparación, la Figura 2A muestra que la mayor parte de la radioactividad del DNA libre o de los lípidos liposomales libres se distribuían en la mitad superior del tubo, y que no ingresaban en el gradiente de la sucrosa. Además, si bien el pico de H y el pico de p en la Figura 2B coexistían en la fracción No. 16, hubo una significativa cantidad de H distribuida en las fracciones 1 a 10, lo cual indica que los lípidos liposomales en exceso estaban bien separados del complejo DNA/lípido. EJE PLO 3 Estabilidad Física de los Complejos Lípido/DNA v Lípido / PLL / DNA. Purific dos Fueron formados complejos DNA/lípido mezclando 20 µmoles de liposomas de varias composiciones DC-Chol/DOPE (ver Tabla 1) con 0,4 mg de DNA de plásmido pRSVL, en una relación de 1 µg de DNA por 50 nmoles de lípido. Los complejos lípido/PLL/DNA fueron formados mezclando 4 µmoles de liposomas de diversas composiciones DC-Chol / DOPE, con 1 mg de PLL (MW = 3000) y 0,4 mg de DNA de plásmido pK VL.

Ambos complejos fueron seguidamente purificados retirándoseles los lípidos libres, el DNA libre y el PLL libre, mediante centrifugación de gradiente de sucrosa, tal como se describió anteriormente en el Capítulo: Métodos. Las fracciones de pico fueron recuperas y reunidas. Las muestras reunidas fueron seguidamente evaluadas en cuanto a sus diámetros, inmediatamente después de la recuperación (día O) o después de su almacenamiento en sucrosa al 10 % a una temperatura de 4 °C durante 120 días. En la siguiente Tabla 1 se muestran los resultados de estas evaluaciones.

TABLA 1.- ESTABILIDAD FÍSICA DE LOS COMPLEJOS LIPIDO DNA Y LIPIDO PLL/DNA. PURIFICADOS Los datos mostrados en la Tabla 1, muestran que los complejos lípido/DNA y lípido/PLL/DNA, purificados, presentaban un pequeño tamaño (inferior a 200 nm) al día 0 y que su tamaño no aumentó drásticamente con el almacenamiento. Por otra parte, las relaciones DNA/lípido en los complejos purificados, se hallaba entre 10 y 23 nmoles de lípido/µg de DNA, dependiendo ello de la composición de los liposomas utilizados, y esta relación no cambió después de un almacenamiento de 120 días. También se observó una relación inversa entre la concentración del DC-Chol en los liposomas y la cantidad del lípido presente en el complejo, lo cual es una indicación de que los liposomas enriquecidos con DC-Chol, muestran una vinculación mas fuerte del DNA o una actividad neutralizadora de la carga, mas enérgica que los liposomas menos enriquecidos con DC-Chol. Las columnas de la extrema derecha muestran la recupera ción del DNA rotulados con 32p en los complejos DNA / lípido y DNA/lípido/PLL después de su purificación en el gradiente de densidades de sucrosa. Los resultados muestran que la recuperación del DNA en los complejos que no contienen PLL, era superior a la observada para los complejos que contienen PLL. EJEMPLO 4 Actividad biológica de los Complejos Purificados, en Varias Células Dado que los complejos DNA/lípido formados mediante una mezcla de lípidos al DNA que presentan una elevada relación lípido/DNA, eran tanto pequeñas como estables en el tiempo, fueron realizados unos experimentos para llevar a cabo la actividad de transfección de dichos complejos con la actividad del complejo DNA/lípido preparado mediante el método del mezclado conjunto. En uno de los experimentos, las células CHO cultivadas en placas de 48 cavidades, fueron tratados durante 4 horas con una mezclado conjunto de sea 1 µg pRSVL y 10 nmoles de liposomas de DC-Chol/DOPE de diferentes composiciones de lípidos solamente (o) o junto con 1 µg de PLL (MW = 3,000) (D), o, las células fueron tratadas con un complejo DNA / lípido purificado ( • ) o con un complejo DNA/lípido/PLL (fl) formado mezclando 1 µg de DNA con 50 nmoles de liposomas DC-Chol/DOPE (complejo DNA/lípido) o con 19 nmoles de liposomas DC-Chol/DOPE y 1 µg de PLL (complejo DNA/lípido/PLL) seguido por centrifugación a través de un gradiente de densidades de sucrosa, tal como se describió en el Capítulo: Métodos. 36 horas después del tratamiento, las células fueron Usadas en 100 µl de tampón de lisis, y fueron evaluados 4 µl del lisato para establecer la actividad de la luciferasa, para lo cual se utilizó 100 µl de una solución de substrato de luciferasa. La actividad de la luciferasa fue seguidamente some tida a conteo durante un período de 20 segundos. Los resul ta dos presentados en la Figura 3, muestran que la composi ción de liposomas mas preferida para transfectar las célu las CHO, era 40 % de DC-Chol y 60 % de DOPE. Además, en la presencia de 1 µg adicional de poli-L-lisina (PLL, MW = 3.000), en la mayoría de los casos se observó un refuerzo de 2 a 6 veces, de la actividad de transfección. Es particularmente interesante que la actividad del complejo DNA/lípido purificado, era similar a la del complejo de mezclado conjunto DNA/complejo cuando se adicionó la misma cantidad de DNA a las células.

Sin embargo, la actividad de transfección del complejo purificado DNA/lípido/LPL, era de aproximadamente 30 % a 50 % inferior a la del complejo DNA/liposoma/PLL preparado mediante el procedimiento del mezclado conjunto. A efectos de establecer que los resultados obtenidos en las células de CHO no eran específicas para ciertas células, las actividades de transfección de los complejos de DNA/lípido y de DNA/lípido/PLL, purificados, en dos otras células, células BHK y de pulmón de ratón (MLC), fueron comparadas con las de los complejos DNA/liposoma formados por mezclado conjunto. En breve, las células (sea BHK sea MLC) cultivadas en placas de 48 cavidades con una confluencia del 60 %, frieron transfectadas con 1 µg de pRSVL que formaba un complejo con 10 nmoles de liposomas DC-Chol 10 (complejo de mezclado conjunto), con la misma cantidad de DNA mezclada con liposomas con una relación DNA/liposoma de 1 µg/50 nmoles a efectos de producir complejo DNA/lípido purificado o con complejo DNA/lípido/PLL purificado preparado con una relación DNA/liposoma/PLL de 1 µg/10 nmoles/2 µg. 15 Seguidamente fueron cosechadas las células a 36 horas después de la transfección, y la actividad de la luciferasa de los lisatos de las células transfectadas fue determinada tal como se describe en el Capítulo: Métodos. Los resultados de estos experimentos se muestran en las Tablas 2 y 3. - ' TABLA I EXPRESIÓN PEL GEN PE LVCIFERASA EN CÉLULAS PH TRANSFECTAPAS CON pRSVL Actividad de la Luciferasa (unidades relativas de lus ?o'3) Composición Mezclado Conjunto Complejo Purifi- Complejo Purifide Liposoma de Complejo ficado DNA/lí- cado DNA/lípido/ (DC-Chol/DOPE) DNA/liposoma pido PLL 2:8 91.8 ±9,5 110,1 ±5,2 214.6 ±41,1 3:7 61,2 ± 19,9 1886,8 ±266,7 151.7 ± 62,9 4:6 438,2 ± 14,4 1638,8 ± 63,9 446,3 ± 16,9 5:5 837,8 ± 8 1015,0 ±41,2 234,2 ± 46,4 TABLA 3.- EXPRESIÓN DEL GEN DE LUCIFERASA EN CÉLULAS PULMONARES DE RATÓN TRANSFECTADAS CON pRSVL Actividad de la Luciferasa (unidades relativas de luz x 10'3> Composición Mezclado ConComplejo Puri- Complejo Puride Liposoma junto de Com- ficado DNA/ ficado DNA/ (DC-Chol/DOPE) piejo lípido lípido/PLL DNA/liposoma 2:8 1,1 ± 0,7 0,4 ± 0,2 0,3 ± 0,1 3:7 1,5 ± 1,0 0,3 ± 0,0 4,1 ± 1,3 4:6 3,1 ± 0,2 2,0 ± 0,3 14,6 ± 3,1 :5 0,1 ± 0,0 1,5 ± 1,2 10,1 ± 2,3 Es interesante observar que para la cepa de células BHK, la actividad de la transfección del complejo DNA / lípido purificado era sustancialmente mas elevada que la del complejo DNA/liposoma formado por mezclado conjunto. Para las células tales como las MLC, que son difíciles de transfectar, los complejos purificados hechos a partir de mezclas DNA/liposoma/PLL, eran aparentemente superiores a los complejos de mezclado conjunto y a los complejos DNA lípido purificados hechos sin PLL. A efectos de determinar si los complejos lípido / PLL / DNA podrían ser hechos mediante diferentes relaciones: lípido/ácido nucleico y con un PLL de peso molecular diferente que el utilizado en los ejemplos anteriores, se llevó a cabo el siguiente experimento. Un complejo lípido/poli-L-lisina/DNA, fue preparado a partir de 20 µg de DNA de plásmido de pRSVL, 10 µg de poli-L-lisina (MW 25,600), y liposomas DC-Chol/DOPE (relación molar: 4,5/5,5), con las relaciones lípido DNAS mostradas en la Tabla 4. Los complejos resultantes fueron seguidamente purificados mediante ultra-centrifugación de gradiente de sucrosa, tal como se describe en el Capítulo: Métodos. Una alícuota del complejo purificado que contiene 0,5 µg de DNA, fue utilizada para transfectar las células CHO, y seguidamente se procedió a medir la actividad de la luciferasa. Los resultados de este experimento, se muestran en la siguiente Tabla 4. TABLA 4- EFECTO DE LA RELACIÓN; LIPIDO/DNA EN EL COMPLEJO PURIFICADO OUE CONTIENE POLI-L-LISINA (M .600? Relación Composición del Tamaño del Actividad (nmoles Complejo Purificomplejo de trans-de lípido/ cado (nmoles de purificado feccidn µg DNA) lípido/ µg (nm) (conteos \ SO) xl?° 3,3 1,1 89 108 (5) 6,6 2,5 98 6.065 (604) 12,5 4,3 101 5.846 (668) 20, 0 9,6 35 7.633 (977) Los resultados muestran que en la presencia de mayores cantidades de policatión, es posible utilizar relaciones: lípido/DNA, menores para producir complejos DNA / lípido / policatión que tienen una apreciable actividad de transfección. EJEMPLO 5 Actividad de Transfección de Complejos Almacenados Unas células CHO cultivadas en placas de 48 cavidades, frieron tratados durante 4 horas con una mezclado conjunto de 1 µg pRSVL y 10 nmoles de liposomas de DC-Chol / DOPE de composiciones de lípidos solamente (o) o junto con 1 µg de PLL (MW = 3,000) (D), o, las células fueron tratadas con un complejo DNA/lípido purificado (•) o con un complejo DNA/lípido/PLL (I) almacenados a una temperatura de 4 °C durante 130 días en sucrosa al 10 %. Los complejos purificados habían sido formados mezclando 1 µg de pRSVL y 50 nmoles de liposomas DC-Chol / DOPE de diferentes composiciones de DC-Chol/DOPE solo (DNA / lípido) o con 1 nmol de liposomas DC-Chol DOPE y 1 µg de PLL (complejo DNA/lípido/PLL) seguido por centrifugación a través de un gradiente de densidades de sucrosa, tal como se describió en el Capítulo: Métodos. Los resultados muestran que la actividad de la luciferasa en los lisatos de células preparados a partir de células transfectadas con los complejos DNA lípido y DNA / lípido/PLL, almacenados, era comparable con la actividad de la luciferasa observada en los lisatos de células trans fectadas con los correspondientes complejos preparados mediante mezclado conjunto. EJEMPLO 6 1° Comparación de la Citotoxicidad de los Complejos DNA / Lipo soma Preparados Mediante Mezclado conjunto, con la de los Complejos DNA/Lípido purificados La toxicidad de los diferentes complejos sobre las células, fue estudiada en células CHO, como sigue. Las células CHO fueron tratadas con 5 complejo de mezclado conjunto DNA/liposoma (o), complejo de mezclado conjunto liposoma/PLL (3); complejo DNA/lípido purificado (•); o complejo DNA/lípido/PLL purificado (B). Los complejos de mezclado conjunto fueron formados mezclando 1 µg de DNA de pRSVL con 10 nmoles de liposomas DC-Chol/DOPE de o diferentes composiciones DC-Chol/DOPE, solos o junto con 1 g de PLL (mw = 3.000). Los complejos purificados fueron formados mezclando 1 µg de DNA de pRSVL con 50 nmoles de liposomas DC-Chol/DOPE solamente (complejo DNA/lípido) o con 10 nmoles de liposomas DC-Chol/DOPE y 1 µg de (complejo DNA lípido PLL) seguido por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sucrosa, tal como se describe en el Capítulo de Métodos. 36 horas después del tratamiento, las células fueron Usadas, se extrajo la proteína y seguidamente se la cuantificó mediante un método de teñido de azul de Coomassie. La Figura 5 muestra los resultados de este experimento en el cual la cantidad de proteína extraíble recuperada al final de experimento, sirve como un indicador de la porción de las células que han sobrevivido después del tratamiento indicado. Los datos presentados muestran que si bien el complejo purificado parecía ser ligeramente mas tóxico para las células que el complejo de mezclado conjunto DNA liposoma, morfológicamente, la transfección no causó ningún efecto toxicológico serio en las células tratadas con sea los complejos de mezclado conjunto sea los complejos purificados, con la salvedad de que las células tratadas con complejos purificados que contienen un elevado % en mol de DC-Chol, eran menos confluentes al final del experimento. EJEMPLO 7 Transfección In Vivo de Tumores Mediante Complejos DNA / Lípido purificados Una cantidad (3 x 10 ) células de carcinoma ovariano humano fueron inyectadas simultáneamente en ratones SCID en el día 0. Catorce días después, 100 µl de soluciones que contenían pUCCMVCAT DNA (30 µg) que formaban un complejo con liposomas DC-Chol (DC-Chol/DOPE = 3:2)en la forma de un mezclado conjunto (avenidas 1 y 2), o la misma cantidad de DNA en la forma de complejo DNA lípido purificado 40 (preparado a partir de DNA y liposomas DC-Chol con relaciones de 1 µg de DNA/25 nmoles de lípido, frieron directamente inyectados en los tumores. Los animales frieron sacrificados dos días después, y los extractos de los tumores que contenían 100 µg de proteína, frieron sometidos a ensayo para establecer la actividad CAT a una temperatura de 37 °C de acuerdo con Ausubel y Otro(s) (Wiley, Boston, EE.UU.), Vol. 1, pp. 9.6.2-9.6.5). Los resultados muestran que el complejo purificado, sin bien había sido preparado bajo condiciones no óptimas, presentaba una actividad de transfección in vivo. EJEMPLO 9 Comparación de la Actividad de Transfección de los Comple jos DNA/lípido/PLL. Purificados v sin Purificar, con la del Complejo DNA/Lipido de Mezclado conjunto Las actividades de transfección de los complejo DNA / lípido / PLL, purificados y sin purificar, y del complejo de mezclado conjunto FDNA/lípido, en tres cepas de células (293, BL6 y C3), fueron medidos como sigue: el complejo DNA/lípido/PLL, purificado, fue formado mezclando 1 µg de DNA de pRSVL con 10 nmoles de liposomas DC-Chol/DOPE (2:3 mol/mol) y 1 µg de PLL (MW = 25.600) seguido por purificación mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad de la sucrosa, tal como se describe en el Capítulo: Métodos. Los complejos DNA/lípido/PLL sin purificar fueron formados mezclando 100 µg de DNA pRSVL con 80 µg de PLL (MW = 25.600) y 1702 nmol de liposomas DC-Chol/DOPE (2:3 mol / mol) (es decir, una relación de DNA lípido PLK, de 1 µg de DNA 17 nmol de lípido/0,8 µg de PLL) en un volumen final de 500µl de agua. 20 µl del complejo DNA/lípido/PLL no purificado (es decir, 4 µg de DNA, 3,2 µg de un medio exento de suero, adecuado para que la cepa de célula sea transfectada. El complejo de mezclado conjunto DNA/lípido, fue formado mezclando 1 µg de DNA de pRSDVL con 10 nmols de liposomas DC- Chol/DOPE (3:2 mol/mol). Unas células 293, C3 y BL6, cultivadas a una confluencia del 80 % en placas de 24 cavidades, fueron transfectadas durante 4 horas a una temperatura de 37 °C con 1 µg de DNA en la forma de complejo DNA/lípido/PLL purificado, complejo de mezo DNA lípido o complejo FDNA / lípido/PLL sin purificar. Después de la transfección, las células fueron sometidas a un cultivo 15 ulterior durante de 36 a 48 horas en el medio adecuado que contenía suero fetal de ternero al 10 %. La actividad de la transferasa fue seguidamente medida, tal como se describe en el Capítulo: Métodos. Los resultados presentados en las Figuras 7A (células 293), 7B (células C3) y 7c (células BL6), demuestran que el complejo DNA/lípido PLL sin purificar, presentaba la actividad de transfección mas elevada en la totalidad de las tres cepas de células sometidas a ensayo. Si bien en lo que precede hemos descrito una cantidad de formas de realización de la presente invención, es evidente que sus construcciones básicas pueden ser altera das a efectos de proveer otras formas de realización ****. que recurren a los métodos y dispositivos de esta invención.

Por ello, debe apreciarse que los alcances de la pre senté invención se definen por las reivindicaciones adjun tas a la presente, en lugar de serlo por las formas de rea lización especificas que han sido presentadas en la presen te a título de ejemplo.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1.- Un método para producir complejos de droga/lípidos que tienen lípidos con un exceso de carga positiva del con respecto a la droga, caracterizado porque comprende mezclar dicha droga con liposomas catiónicos con una relación entre la droga y el lípido, tal que se forman dichos complejos de droga/lípidos. 2.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracteriza porque dicha relación entre la droga y el lípido a efectos de formar dicho complejo, es de aproximadamente 1 µg/0,1 nmol a aproximadamente 1 µg/200 nmol. 3.- El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracteriza porque dicho método además comprende el paso de la purificación de dichos complejos. 4.- El método de acuerdo con la reivindicación 3, caracteriza porque dicho paso de la purificación, es la centrifugación a través de un gradiente de densidades de la sucrosa. 5.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracteriza porque la droga es un ácido nucleico y los liposomas son liposomas DC- Chol/DOPE. 6.- Un método para producir complejos droga/lípido/policatiónicos que tienen un exceso de carga positiva del lípido y policatión con respecto a la droga, caracterizado porque comprende: el mezclar dicha droga con liposomas catiónicos y por lo menos un policatión, en una relación: droga/lípido/policatión, tal que se forman dichos complejos de acuerdo con la reivindicación 1. 7.- El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicha relación: droga/lípidos, es de aproximadamente 1 µg/0, 1 nmol a aproximadamente l µg/200 nmol. 8.- El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho policatión se halla presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 µg a aproximadamente 100 µg. 9.- El método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el policatión es la poli-L-lisina que tiene un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 200.000 Dalton. 10.- El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el liposoma catiónico comprende un lípido catiónico y un fosfolípido neutro. 1 1.- El método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el lípido catiónico es el DC-Chol. 12.- El método de acuerdo con la reivindicación 1 1, caracterizado porque el fosfolípido neutro es la dioloeíl fosfatidil-etanolamina. 13.- El método de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la droga es ácido nucleico. 14.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 6, caracterizado porque dicho complejo tiene un diámetro promedio inferior a 300 nm. 15.- El método de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque el diámetro promedio de dicha formulación, se mantiene sin cambios sustanciales durante hasta un año bajo condiciones de almacenamiento. 16.- Un complejo de droga/lípido, según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: por lo menos una especie de lípido y una droga; siendo la relación entre dicha especie de lípido y dicha droga, tal que dicho complejo tiene un exceso de carga positiva, del lípido con respecto a la droga. 17.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque dicha droga es ácido nucleico. 18.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque dicha relación entre la droga y el lípido, es de aproximadamente 1 µg/0,1 nmol a aproximadamente 1 µg/200 mmol. 19.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 16, ; caracterizad porque dicha especie de lípido, es un lípido catiónico. 20.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque dicho complejo además comprende una especie de fosfolípido neutro. 21.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque dicho complejo está purificado de la droga libre en exceso y de la especie de lípido libre en exceso. 22.- Un complejo de droga/lípido/policati?n, según la reivindicación 16, caracterizada porque comprende por lo menos una especie de lípido, por lo menos un policati?n y una droga; siendo la relación entre dicha droga, dicha especie de lípido y dicho policatión, tal que dicho complejo tiene un exceso de carga positiva del lípido y del policatión, con respecto a la droga. 23.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque dicha relación entre el lípido y el DNA, es de aproximadamente 1 µg/nmol a aproximadamente 1 µg/200 nmol. 24.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque dicho policatión se halla presente en aproximadamente .01 µg a aproximadamente 100 µg. 25.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizados porque dicho policatión es la poli-L-lisina que tiene un peso molecular de aproximadamente 300 a 200.000. 26.- Los complejos de acuerdo con las reivindicaciones 16 y 22, caracterizados porque la carga positiva de dichos complejos, existe con un pH de 6,0 a 8,0. 27.- Los complejos de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizáis porque las especies de lípido, son el DC-Chol y el DOPE. 28.- Un método para entregar droga a un individuo, caracterizado porque comprende la administración del complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 22, en una cantidad terapéuticamente activa, a un individuo que necesite el tratamiento. 29.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque el complejo es un complejo droga/lípido. 30.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque el complejo es un complejo de droga/lípido/policatión.