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MX2015005582A - Anticuerpos anti-receptor de il-13 alfa-2 y conjugados de anticuerpo y farmaco. - Google Patents

Anticuerpos anti-receptor de il-13 alfa-2 y conjugados de anticuerpo y farmaco.

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MX2015005582A
MX2015005582A MX2015005582A MX2015005582A MX2015005582A MX 2015005582 A MX2015005582 A MX 2015005582A MX 2015005582 A MX2015005582 A MX 2015005582A MX 2015005582 A MX2015005582 A MX 2015005582A MX 2015005582 A MX2015005582 A MX 2015005582A
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MX
Mexico
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antibody
seq
light chain
heavy chain
variable region
Prior art date
Application number
MX2015005582A
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English (en)
Inventor
Puja Sapra
Lioudmila Gennadievna Tchistiakova
Dangshe Ma
Fang Jin
Original Assignee
Pfizer
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Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
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Abstract

En la presente se describen anticuerpos anti-IL-13-Ra2 y conjugados de anticuerpo y fármaco y métodos para su preparación y uso.

Description

ANTICUERPOS ANTI-RECEPTOR DE IL-13 ALFA 2 Y CONJUGADOS DE ANTICUERPO Y FÁRMACO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos anti-receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13-Ra2) y conjugados de anticuerpo y fármaco para el tratamiento del cáncer.
REFERENCIA DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se presentó mediante EFS y se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN Se identificaron altos niveles de IL-13-Ra2 en diversas células tumorales que incluyen células tumorales pancreáticas, de mama, de ovarios y glioma maligno. Por el contrario, solo algunos tipos de tejidos normales expresan IL-13-Ra2, y solo en niveles bajos. El tratamiento del cáncer ha mejorado durante la última década con la cirugía, la terapia de radiación y la quimioterapia como opciones primarias de tratamiento. Dichos tratamientos pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero no es probable que constituyan una cura para muchos pacientes. Aún existe una necesidad considerable de opciones terapéuticas adicionales contra el cáncer.
Por lo tanto, los conjugados de anticuerpo anti-IL-13-Ra2 y fármaco que pueden ejercer un efecto citotóxico clínicamente útil sobre células tumorales que expresan IL-13-Ra2, en particular, sin causar efectos no deseados en células que no expresen IL-13-Ra2, satisfacen una necesidad clínica no resuelta en el tratamiento de varias células tumorales que expresan IL-13-Ra2.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona conjugados de anticuerpo anti-IL-13-Ra2 y fármaco y métodos de uso para el tratamiento del cáncer.
La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de fijación al antígeno que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el anticuerpo comprende: una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia VH de SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena liviana que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia VL de SEQ ID NO: 5.
La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una CDR2 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 3; (c) una CDR3 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 4; (d) una CDR1 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 6; (e) una CDR2 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 7; y (f) una CDR3 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 8.
La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el anticuerpo aislado también comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana de SEQ ID NO: 5.
La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno que se fija, específicamente, al IL-13-Ra2 humano, en donde el anticuerpo aislado comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y en donde dicho anticuerpo aislado comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un agente citotóxico conjugado con un anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el conjugado tiene la siguiente fórmula: Ab-(L-D)/?, en donde (a) Ab es el anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este de la presente invención; (b) L-D es una porción ligador-fármaco, en donde L es un ligador, y D es un fármaco; y (c) p s un entero de 1 a alrededor de 8.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el ligador se selecciona del grupo que consiste en maleimidocaproilo (me) y maleimidocaproilo-Val-Cit-PABA (ve).
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde la porción ligador-fármaco tiene la fórmula designada vc-0101 o mc-3377 como se muestra en el Ejemplo 14.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde Ab comprende: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia VH de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de la cadena liviana que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia VL de SEQ ID NO: 5.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde Ab comprende: (a) una CDR1 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una CDR2 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 3; (c) una CDR3 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 4; (d) una CDR1 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 6; (e) una CDR2 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 7; y (f) una CDR3 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 8.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde L-D se selecciona del grupo que consiste en vc-0101, mc-3377, mc-0131, MalPeg-6121, MalPeg-0131, mc-6121, vc-3906, vc-6780, mc-8261, mc3906, y MalPeg-8261.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el conjugado utiliza conjugación específica de sitio sobre residuos de cisterna modificados por ingeniería genética y tiene la siguiente fórmula: Ab-fL-D) o una sal de este aceptable desde el punto de vista farmacéutico, en donde: (a) Ab es el anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia VH que se muestra en SEQ ID NO: 1; una región variable de la cadena liviana que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia VL que se muestra en SEQ ID NO: 5; y una región Fe modificada por ingeniería genética que comprende al menos un par de sustituciones de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34; o una región Fe modificada por ingeniería genética y al menos una región constante de la cadena liviana modificada por ingeniería genética seleccionada del grupo que consiste en L443C (SEQ ID NO: 28), Q347C (SEQ ID NO: 29), kK183C (SEQ ID NO: 31), L443C/kAlllC (SEQ ID NOS: 28 y 30), L443C/kK183C (SEQ ID NOS: 28 y 31), Q347C/kAlllC (SEQ ID NOS: 29 y 30), y Q347C/kK183C (SEQ ID NOS: 29 y 31); (b) L-D es una porción ligador-fármaco, en donde L es un ligador y D es un fármaco; y (c) p es un entero de 1 a alrededor de 8.
La presente invención también proporciona el conjugado de anticuerpo y fármaco que se describió anteriormente que utiliza conjugación específica de sitio sobre residuos de cisteína modificados por ingeniería genética, en donde la porción ligador-fármaco tiene la fórmula designada vc-0101 o mc-3377 como se muestra en el Ejemplo 14, o una sal o una forma de solvato de esta aceptables desde el punto de vista farmacéutico, y p es un entero de alrededor de 4.
La presente invención también proporciona el conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención que utiliza teenología de conjugados de anticuerpos multifuncionales (MAC), en donde el anticuerpo o la porción de fijación al antígeno de este se fija, específicamente, a IL-13Ra2 humano, en donde el anticuerpo tiene la mutación D185A en la posición 185 de la LC (cadena liviana) como se muestra en SEQ ID NO: 52, y el anticuerpo está conjugado en forma covalente con al menos una porción fármaco mediante un ligador unido a una cadena lateral de K188 de la LC de SEQ ID NO:49; en donde la porción fármaco tiene la fórmula designada 0101 o 3377 como se muestra en el Ejemplo 13, o una sal o forma de solvato de esta aceptables desde el punto de vista farmacéutico, y p es un entero en un rango cuyo límite inferior se puede seleccionar del grupo que consiste en alrededor de 1.5, alrededor de 1.6, alrededor de 1.7, alrededor de 1.8, alrededor de 1.9 y alrededor de 2.0, y cuyo límite superior se puede seleccionar del grupo que consiste en alrededor de 2.0, alrededor de 2.1, alrededor de 2.2, alrededor de 2.3, alrededor de 2.4, alrededor de 2.5. En algunos aspectos, pes alrededor de 2.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención y un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
La presente invención también proporciona un método para tratar un tipo de cáncer que exprese IL-13-Ra2 en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención.
La presente invención también proporciona un método para tratar un tipo de cáncer que exprese IL-13-Ra2, en donde el tipo de cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinomas de vejiga, mama, cuello uterino, colon, gliomas malignos, endometrio, riñón, pulmón, esófago, ovario, próstata, páncreas, estómago, testículos y melanoma.
Con mayor preferencia, la presente invención proporciona un método para tratar un tipo de cáncer que exprese IL-13-Ra2, en donde el tipo de cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, de colon, de estómago, de páncreas, de ovario, gliomas malignos y melanoma.
La invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente Invención para usar en el tratamiento.
La invención también proporciona el uso de un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención para la fabricación de un medicamento para la terapia.
La invención también proporciona el uso de un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención, en donde el uso es para el tratamiento de un tipo de cáncer que expresa IL-13-Ra2.
La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un anticuerpo IL-13-Ra2, un vector que comprende el ácido nucleico y una célula huésped que comprende ese vector.
La invención también proporciona un proceso para producir un anticuerpo IL-13- Ra2, en donde el proceso comprende cultivar la célula huésped que comprende el vector mencionado anteriormente y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.
La invención también proporciona un proceso para producir un conjugado de anticuerpo IL-13-Ra2 y fármaco que comprende: (a) unir un ligador seleccionado del grupo que consiste en maleimidocaproilo y maleimidocaproilo-Val-Cit-PABA a un fármaco seleccionado del grupo que consiste en 0101 y 3377 que resulta en una porción ligador-fármaco; (b) conjugar la porción ligador-fármaco con el anticuerpo recuperado del cultivo celular indicado anteriormente; y (c) purificar el conjugado de anticuerpo y fármaco.
La invención también proporciona un anticuerpo aislado que compite con un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de este de la presente invención para fijarse específicamente al IL-13-Ra2 humano.
La invención también proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de este de la presente invención para fijarse específicamente al IL-13-Ra2 humano.
La Invención también proporciona un método para predecir si un sujeto con cáncer responderá a un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención que comprende determinar si una muestra biológica del cáncer del sujeto expresa hIL-13-Ra2.
La invención también proporciona un proceso para determinar el nivel de hIL-13-Ra2 en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas: evaluar en un inmunoensayo una muestra de un sujeto que se sospecha que tiene cáncer usando un anticuerpo de la presente invención, determinar los niveles de superficie celular de hIL-13-Ra2 en la muestra y comparar los niveles de superficie celular de hIL-13-Ra2 con los de un sujeto de referencia o estándar.
La invención también proporciona un método para tratar un tipo de cáncer que expresa IL-13-Ra2 que comprende determinar el nivel de hIL-13-Ra2 en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas: evaluar en un Inmunoensayo una muestra de un sujeto que se sospecha que tiene cáncer usando un anticuerpo de la presente invención, determinar los niveles de superficie celular de hIL-13-Ra2 en la muestra, comparar los niveles de superficie celular de hIL-13-Ra2 con los de un sujeto de referencia normal o estándar; y administrar un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Especificidad de fijación de anticuerpos quiméricos ch07 y ch08 a hIL-13-Ra2, pero no a hIL-13Ral.
Figura 2A y Figura 2B: Los anticuerpos MAB614, ab27414, ch07 y ch08 tienen epítopos de unión a IL-13Ra2 diferentes.
Figura 2C: Análisis Biacore que indica que ch07 y ch08 carecen de competencia en la fijación.
Figura 3: ch07 y ch08 son anticuerpos no neutralizantes.
Figuras 4A - 4G: SEQ ID NOS: 1 - 55.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona conjugados de anticuerpo IL-13-Ra2 y fármaco para el tratamiento del cáncer. A fin de comprender mejor la presente invención, primero se definen ciertos términos y téenicas generales.
Todas las abreviaturas de aminoácidos que se usan en la presente descripción están aceptadas por la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos en virtud del 37 C.F.R. § 1.822 (d)(1).
A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos que se usan con respecto a la presente invención tendrán el significado que les otorgan habitualmente las personas del oficio de nivel medio. Además, a menos que el contexto indique lo contrario, los términos en singular incluirán el plural, y los términos en plural incluirán el singular. En general, la nomenclatura que se usa y las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación que se describen en la presente son las que se conocen y se usan habitualmente en el arte.
En general, los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan de acuerdo con los métodos convencionales conocidos en el arte y como se describen en varias referencias generales y específicas que se citan y se analizan en la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. Molecular Clonlng: A Laboratory Manual, 3.a ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et ai, Short Protocols ¡n Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wilcy, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lañe Using Antibodies: A Laboratory Manual Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan etai, Short Protocols ¡n Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003).
Un "anticuerpo" o "Ab" es una molécula de inmunoglobulina que se puede fijar específicamente a una diana, tal como un hidrato de carbono, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., mediante al menos un sitio de reconocimiento de antígenos ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también cualquier fragmento de fijación al antígeno (es decir, "porción de fijación al antígeno") o una cadena simple de este, proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de ¡nmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígenos que incluye, por ejemplo, scFv, anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, anticuerpos de tiburón y de camélidos), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, dlacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136). Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o una subclase de estos), y no es necesario que el anticuerpo sea de una clase en particular. Según la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas se pueden dividir a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Se conocen las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.
El términio "aislado" se refiere a una molécula que es sustancialmente libre de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo aislado es sustancialmente libre de material celular u otras proteínas de la fuente celular o tisular de la que se derivó.
La expresión "fragmento de fijación al antígeno" de un anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que retiene la capacidad de fijarse específicamente a un antígeno específico (por ejemplo, IL-13-Ra2 diana). Las funciones de fijación al antígeno de un anticuerpo se pueden realizar mediante fragmentos de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de fijación incluidos en la expresión "porción de fijación al antígeno" de un anticuerpo incluyen Fab; Fab'; F(ab')2Í un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de un anticuerpo de dominio simple (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546) y una región determinante de la complementariedad aislada (CDR).
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena liviana (VL) del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo, ya sea solo o combinado. Como se sabe en el arte previo, las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena liviana consisten en cuatro regiones de marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3), también conocidas como regiones hipervariables, y contribuyen a la formación del sitio de fijación al antígeno de los anticuerpos. Si se desean variantes de una región variable sujeto, en particular con sustitución en los residuos de aminoácidos fuera de una región CDR (es decir, en la región de marco), la sustitución de aminoácidos adecuada, preferentemente la sustitución de aminoácidos conservadora, se puede identificar mediante la comparación de la región variable sujeto con las regiones variables de otros anticuerpos que contienen secuencias CDR1 y CDR2 en la misma clase canónica que la región variable sujeto (Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987). Cuando se elige FR para flanquear CDR sujetas, por ejemplo, cuando se humaniza o se optimiza un anticuerpo, se prefieren FR de anticuerpos que contienen secuencias CDR1 y CDR2 en la misma clase canónica.
Una "CDR" de un dominio variable son residuos de aminoácidos dentro de la región variable que se Identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación de Kabat y Chothia, AbM, contacto, y/o definiciones conformacionales o cualquier método de determinación de CDR conocido en el estado de la téenica. Las CDR de anticuerpos se pueden Identificar como las regiones hipervariables definidas originalmente por Kabat et al. Véase, por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Las posiciones de las CDR también pueden identificarse como las estructuras de bucle estructurales descritas originalmente por Chothia y otros. Véase, por ejemplo, Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883. Otros enfoques para la identificación de CDR incluyen la "definición de AbM", que es un acuerdo entre Kabat y Chothia y se obtiene usando el software de modelación de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®) o la "definición de contacto" de las CDR en función del contacto de antígenos observado, establecido en MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. En otro enfoque, denominado en la presente "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR se pueden identificar como los residuos que realizan contribuciones entálpicas a la fijación al antígeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. De todos modos, otras definiciones de los límites de CDR pueden no seguir necesariamente uno de los enfoques anteriores, pero aún así se superpondrán con ai menos una porción de las CDR de Kabat; sin embargo, se pueden acortar o alargar en virtud de los descubrimientos experimentales o predictivos de que los residuos o grupos de residuos particulares o incluso CDR completas no tienen un impacto considerable en la fijación al antígeno. Como se usa en la presente, una CDR se puede referir a las CDR definidas por cualquier enfoque conocido en el arte, que incluye combinaciones de enfoques. Los métodos de la presente pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos enfoques. Para cualquier modalidad que contenga más de una CDR, las CDR se pueden definir de acuerdo con cualquiera de Kabat, Chothia, extendida, AbM, contacto y/o las definiciones conformacionales.
Las expresiones "región IgG Fe", "región Fe", "dominio Fe" y "Fe", como se usan indistintamente en la presente, se refieren a la porción de una molécula IgG que se correlaciona con un fragmento cristalizable obtenido mediante la digestión de papaína de una molécula IgG. La región Fe consiste en la mitad del terminal C de las dos cadenas pesadas de una molécula IgG que están unidas mediante enlaces de disulfuro. No tiene actividad de fijación al antígeno, pero contiene la porción carbohidrato y los sitios de fijación para receptores complementarios y Fe, que incluyen el receptor FcRn (véase a continuación). El fragmento Fe contiene el segundo dominio constante CH2 completo (residuos 231-340 de IgGl humana, de acuerdo con el sistema de numeración Kabat) y el tercer dominio constante CH3 (residuos 341-447).
Como se usan indistintamente en la presente, las expresiones "polipéptido Fe modificado por ingeniería genética", "región Fe modificada por ingeniería genética" y "Fe modificado por ingeniería genética" se refieren a un polipéptido Fe o porción de este, que comprende al menos una mutación, por ejemplo, una sustitución de aminoácidos, que introduce un sitio de conjugación. Preferentemente, la mutación introduce una cisterna en lugar del residuo de aminoácido natural en esa posición, donde la mutación crea un sitio reactivo (por ejemplo, un grupo sulfhidrilo reactivo) para la conjugación de una porción con Fe.
La expresión "anticuerpo monoclonal" o "mAb" se refiere a un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon, que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no al método mediante el cual se produce. Preferentemente, un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención existe en una población homogénea o sustancialmente homogénea.
La expresión "humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de fijación al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Preferentemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor), en donde los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.
Las expresiones "anticuerpo humano" o "anticuerpo completamente humano" se refieren a los anticuerpos derivados de ratones transgénlcos que tienen genes de anticuerpos humanos o de células humanas.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos en donde las secuencias de la región variable derivan de una especie, y las secuencias de la región constante derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en donde las secuencias de la región variable derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante derivan de un anticuerpo humano.
Un "agente terapéutico" es un agente que ejerce un efecto citotóxico, citostático y/o inmunomodulador sobre células cancerosas o células inmunitarias activadas. Algunos ejemplos de agentes terapéuticos incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes citostáticos y agentes inmunomoduladores.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer.
La expresión "efecto citotóxico" se refiere a la disminución y/o eliminación de células diana. Un "agente citotóxico" se refiere a un agente que tiene un efecto citotóxico y/o citostático sobre una célula.
Un "efecto citostático" se refiere a la inhibición de la proliferación celular. Un "agente citostático" se refiere a un agente que tiene un efecto citostático sobre una célula, lo que inhibe el crecimiento y/o la expansión de un subconjunto de células específico.
"Conjugado de anticuerpo y fármaco" o "ADC" se refiere a anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de estos, que incluyen derivados de anticuerpo que se fijan a IL-13-Ra2 y que se conjugan con agentes citotóxicos, citostáticos y/o terapéuticos.
"Conjugado de anticuerpo anti-IL-13-Ra2 y fármaco" se refiere a un anticuerpo anti-IL-13-Ra2 o fragmento de fijación al antígeno de este, como se describe en la presente unido a un fármaco (D) citotóxico mediante un ligador (L).
"Ligador (L)" describe el enlace directo o indirecto del anticuerpo al fármaco. La unión de un ligador a un mAb se puede lograr de diversas maneras, por ejemplo, mediante lisinas superficiales, el acoplamiento reductor a carbohidratos oxidados y la liberación de residuos de cisteína mediante la reducción de los enlaces de disulfuro intercatenarios. Diversos sistemas de enlace ADC se conocen en el estado de la téenica, que incluyen enlaces de hidrazona, disulfuro y péptido.
"Fármaco (D)" es cualquier sustancia que tenga actividad biológica o detectable, por ejemplo, agentes terapéuticos, etiquetas detectables, agentes de fijación, etc., y profármacos, que se metabolizan en un agente activo in vivo. Las expresiones "fármaco", "porción fármaco", "carga útil" y "compuesto" se usan de manera indistinta.
"L-D" es una porción ligador-fármaco resultante de un fármaco (D) citotóxico ligado a un ligador (L).
El término "epítopo" se refiere a esa porción de una molécula capaz de ser reconocida y fijada por un anticuerpo en una o más de las regiones del anticuerpo de fijación al antígeno. A menudo, los epítopos consisten en una agrupación superficial químicamente activa de moléculas, tales como cadenas laterales de azúcar o aminoácidos, y tienen características estructurales tridimensionales específicas y características de carga específicas. Como se usa en la presente, la expresión "epítopo antigénico" se define como una porción de un polipéptido a la que se puede fijar específicamente un anticuerpo, según se determina mediante cualquier método conocido en el arte, por ejemplo, inmunoensayos convencionales. "Epítopo no lineal" o "epítopo conformadonal" comprenden polipéptidos (o aminoácidos) no contiguos dentro de la proteína antigénica a la que se fija un anticuerpo específico del epítopo. Una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, por ejemplo, usando las téenicas descritas en la presente memoria descriptiva. Durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede esclarecer información sobre los epítopos deseables. Sobre la base de esta información, es posible analizar de manera competitiva los anticuerpos para determinar la fijación al mismo epítopo. Un enfoque para lograrlo es realizar estudios de competencia y competencia cruzada para hallar anticuerpos que compitan o que compitan de manera cruzada entre sí, por ejemplo, los anticuerpos compiten por la fijación al antígeno.
La expresión "afinidad de fijación ("KD)", como se usa en la presente, se refiere a la velocidad de disociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular. La KD es la relación entre la velocidad de disociación (Kd), también denominada "disociación (k^)", y la velocidad de asociación (Ka), o "asociación (kon)"· Así, KD es igual a ,A / kon y se expresa como una concentración molar (M). Por ende, cuanto menor es KD, mayor es la afinidad de fijación. Por lo tanto, una KD de 1 mM indica una afinidad de fijación débil comparada con una KD de 1 nM. Los valores KD de los anticuerpos se pueden determinar usando métodos establecidos en el estado de la técnica. Un método para determinar la KD de un anticuerpo es mediante resonancia de plasmones superficiales, por lo general, con un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®.
La expresión "se fija específicamente" se usa en la presente en referencia a la fijación entre un anticuerpo y un antígeno IL-13-Ra2, y el anticuerpo se fija al antígeno IL-13-Ra2 con una KD de menos de alrededor de 30 nM como se determinó mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) a 25 °C.
"Sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico", como se usa en la presente, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas de una molécula o macromolécula aceptables desde el punto de vista farmacéutico.
El término "potencia" es una medición de actividad biológica y puede designarse como ICS0 o la concentración inhibidora de un anticuerpo o un conjugado de anticuerpo y fármaco con un antígeno IL-13-Ra2, necesaria para inhibir un 50 % del crecimiento de una línea celular positiva IL-13-Ra2 como se describe en el Ejemplo 15.
"EC50" es una medición de la capacidad de fijación y se define como concentración máxima de eficacia media de un anticuerpo o un conjugado de anticuerpo y fármaco necesario para producir una respuesta intermedia entre el inicio y el máximo.
La expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en la presente, se refiere a una cantidad necesaria (en dosis, durante periodos de tiempo y a fin de la administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz es al menos la cantidad mínima, pero menor a una cantidad tóxica, de un agente activo que es necesario para producir un beneficio terapéutico a un sujeto.
Como se usan en la presente, los términos "inhibir" o "neutralizar", con respecto a la bioactividad de un anticuerpo de la invención, se refieren a la capacidad del anticuerpo para antagonizar, prohibir, prevenir, impedir, hacer más lenta, alterar, eliminar, detener, reducir o revertir considerablemente, por ejemplo, la progresión o la gravedad del aspecto que se desea inhibir, que incluye, por ejemplo, una actividad biológica.
El término "competir", como se usa en la presente con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o una porción de fijación al antígeno de este, se fijan a un epítopo de manera suficientemente similar a la fijación de un segundo antígeno o una porción de este de fijación al antígeno, de manera que el resultado de la fijación del primer anticuerpo a su epítopo cognado disminuye de manera detectable en presencia del segundo anticuerpo, en comparación con la fijación del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. De manera alternativa, es posible que la fijación del segundo anticuerpo a su epítopo también disminuya de manera detectable en presencia del primer anticuerpo, pero no es necesariamente el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la fijación de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la fijación del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de manera detectable la fijación del otro anticuerpo a su ligando o epítopo cognado en menor, igual o mayor grado, se dice que los anticuerpos "compiten de manera cruzada" entre sí por la fijación de sus epítopos respectivos. La presente invención abarca tanto los anticuerpos que compiten como los anticuerpos que compiten de manera cruzada. Independientemente del mecanismo mediante el cual se produce la competencia o competencia cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o fijación a un epítopo común o a una porción de este), los expertos en el arte comprenderán, en función de las explicaciones provistas en la presente, que se incluyen los anticuerpos que compiten y/o los que compiten de manera cruzada y pueden ser útiles para los métodos descritos en la presente.
Las expresiones "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico", como se usan en la presente, incluyen moléculas de ADN y moléculas de ARN. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es, preferentemente, ADN bicatenario.
Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la presente invención pueden incluir lo siguiente: solo la secuencia codificante de la variante, la secuencia codificante de la variante y secuencias codificantes adicionales, tales como un polipéptido funcional, o una secuencia de señales o secretora o una secuencia proproteica; la secuencia codificante del anticuerpo y la secuencia no codificante, tal como intrones o secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia codificante del anticuerpo. La expresión 'polinucleótido que codifica un anticuerpo" abarca un polinucleótido que incluye una secuencia codificante adicional de la variante, pero también un polinucleótido que incluye una secuencia codificante y/o no codificante adicional. En el estado de la téenica se conoce que una secuencia de polinucleótidos que se optimiza para un sistema de célula huésped/expresión específico se puede obtener fácilmente de la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada (véase GENEART AG, Regensburg, Alemania).
Una "célula huésped" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o que fue un receptor de los vectores para la incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células huésped incluyen la progenie de una sola célula huésped, y no es necesario que la progenie sea completamente idéntica (en términos de morfología o complemento de ADN genómico) a la célula original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido de la invención.
El término "vector" significa un constructo, que es capaz de suministrar y, preferentemente, expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, entre otros, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores plásmidos, cósmidos o de fago, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucarióticas, tales como células productoras.
La expresión "secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o un promotor inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión se liga operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que se transcribirá.
Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la presente invención incluyen, generalmente, una secuencia de polinucleótidos de control de la expresión ligada operativamente a las secuencias codificantes de anticuerpos, que incluyen regiones promotoras asociadas naturalmente u homologas conocidas en el estado de la técnica. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucarióticas, pero también se pueden usar secuencias de control para huéspedes procarióticos. Cuando el vector se haya incorporado a la línea celular huésped adecuada, la célula huésped se propaga en condiciones adecuadas para expresar las secuencias de nucleótidos, y, si se desea, para la recolección y purificación de los anticuerpos. Las líneas celulares eucarióticas preferidas incluyen las líneas de células CHO, varias líneas de células COS, células HeLa, líneas celulares de mieloma, linfocitos B transformados o líneas de células renales de embrión humano. La célula huésped de máxima preferencia es la línea de células CHO.
Anticuerpos Los anticuerpos de la invención pueden producirse mediante téenicas conocidas en el arte, por ejemplo, tecnologías recombinantes, tecnologías de expresión de fagos, tecnologías sintéticas o combinaciones de esas tecnologías u otras tecnologías ya conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999) y Fellouse, F.A., et al, J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)).
Las siguientes Tablas 1 y 2 representan las CDR para anticuerpos preferidas de la presente invención.
TABLA 1 TABLA 2 Una modalidad de la presente invención incluye un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de este, que comprende: a) una región variable de la cadena liviana que comprende: i) una LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 6 y 14; ii) una LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 7 y 15; y iii) una LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 8 y 16; y b) una región variable de la cadena pesada que comprende: i) una HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2 y 10; ii) una HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3 y 11; y iii) una HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 4 y 12.
Un anticuerpo o porción de fijación al antígeno de este preferido de la invención comprende: a) una LCVR que comprende: una LCDR1 de SEQ ID NO: 6, una LCDR2 de SEQ ID NO: 7, y una LCDR3 de SEQ ID NO: 8; y b) una HCVR que comprende: una HCDR1 de SEQ ID NO: 2, una HCDR2 de SEQ ID NO: 3, y una HCDR3 de SEQ ID NO: 4.
Otro anticuerpo o porción de fijación al antígeno de este preferido de la invención comprende: a) una LCVR que comprende: una LCDR1 de SEQ ID NO: 14, una LCDR2 de SEQ ID NO: 15, y una LCDR3 de SEQ ID NO: 16; y b) una HCVR que comprende: una HCDR1 de SEQ ID NO: 10, una HCDR2 de SEQ ID NO: 11, y una HCDR3 de SEQ ID NO: 12.
Los anticuerpos monoclonales preferidos de la invención se denominan, en la presente, hu08 (un anticuerpo IgGl anti-IL-13-Ra2 humanizado); y, hu07 (un anticuerpo IgGl anti-IL-13-Ra2 humanizado). Los números de SEQ ID de las secuencias de aminoácidos que codifican los mAb hu08 y hu07 se proporcionan en la Tabla 3 a continuación: TABLA 3 Una modalidad de la invención es un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de este que se fija específicamente al mismo epítopo IL-13Ra2 como un anticuerpo que comprende una primera secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 5.
Otra modalidad de la invención es un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de este que se fija específicamente al mismo epítopo IL-13Ra2 como un anticuerpo que comprende una primera secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 48 y una segunda secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 41.
En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento de fijación al antígeno de este se fija específicamente a IL-13Ra2, y el anticuerpo o fragmento de este inhibe competitivamente la fijación de un anticuerpo que comprende una primera secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 5.
En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento de fijación al antígeno de este se fija específicamente a IL-13Ra2, y el anticuerpo o fragmento de este inhibe competitivamente la fijación de un anticuerpo que comprende una primera secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 48 y una segunda secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 41.
Los materiales representativos de la presente invención se depositaron en la Colección de Cultivos Tipo de EE. UU. (ATCC) el 06 de noviembre de 2012. Un vector que tiene el N.° de acceso a ATCC PTA-13304 es un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena liviana de un anticuerpo anti-IL-13 humano denominado hu08-VLvl.0, y un vector que tiene el N.° de acceso a ATCC PTA-13305 es un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL-13 humano, denominado hu08-VHvl.0. Los depósitos se obtuvieron conforme las cláusulas del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con respecto al procedimiento de patentes y regulaciones afines (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito estará disponible por medio de ATCC conforme los términos del Tratado de Budapest, y estará sujeto a un acuerdo entre Pfizer, Inc. y ATCC, lo que garantiza la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo de depósito al público al momento de la emisión de la patente estadounidense correspondiente, o de revelar al público cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que suceda primero, y garantiza la disponibilidad de la progenie a quien determine el Comisionado de Patentes y Marcas de los Estados Unidos que tendrá derecho a ello de acuerdo con el Artículo 122 del Título 35 del Código de los Estados Unidos y las reglamentaciones del Comisionado al respecto (incluido el Artículo 1.14 del Título 37 del Código de Reglamentaciones Federales, con particular referencia a 886 OG 638).
Conjugación de porciones fármaco con un anticuerpo La porción fármaco tiene, o se modifica para incluir, un reactivo de grupo con un punto de conjugación en el anticuerpo. Por ejemplo, una porción fármaco se puede unir mediante alquilación (por ejemplo, en las Usinas de grupo epsilon-amino o el terminal N de los anticuerpos), aminación reductora de carbohidrato oxidado, transesterificación entre los grupos hidroxilo y carboxilo, amidación en grupos amino y carboxilo y conjugación con tioles. En algunas modalidades, la cantidad de porciones fármaco, p, conjugadas por molécula de anticuerpo varía de un promedio de 1 a 8; 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 1 a 2. En algunas modalidades, p varía de un promedio de 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o 2 a 3. En otras modalidades, p es un promedio de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8. En algunas modalidades, p varía de un promedio de alrededor de 1 a alrededor de 8; alrededor de 1 a alrededor de 7, alrededor de 1 a alrededor de 6, alrededor de 1 a alrededor de 5, alrededor de 1 a alrededor de 4, alrededor de 1 a alrededor de 3, o alrededor de 1 a alrededor de 2. En algunas modalidades, p varía de alrededor de 2 a alrededor de 8, alrededor de 2 a alrededor de 7, alrededor de 2 a alrededor de 6, alrededor de 2 a alrededor de 5, alrededor de 2 a alrededor de 4 o alrededor de 2 a alrededor de 3. Para ver ejemplos de las químicas que se pueden usar para la conjugación, véase, por ejemplo, Current Protocols in Protein Science (John Wilcy 8i Sons, Inc.), capítulo 15 (Chemical Modifications of Proteins).
Liaadores La porción fármaco se puede ligar a un anticuerpo mediante un ligador. Los ligadores adecuados incluyen, por ejemplo, ligadores escindióles y no escindióles. Un ligador escindible es, generalmente, susceptible a escisión en condiciones intracelulares. Los ligadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, un ligador peptídico escindible mediante una proteasa intracelular, tal como una proteasa lisosómica o endosómica. En modalidades de ejemplo, el ligador puede ser un ligador dipeptídico, tal como valina-citrulina (val-cit), un ligador de fenilalanina-lisina (phe-lys) o un ligador maleimidocapronic-valin-citrulin-p-aminobenciloxicarbonilo (ve). Otro ligador es sulfosuccinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexan-1-carboxilato (smee). La conjugación Sulfo-smcc ocurre mediante un grupo maleimida que reacciona con sulfhidrilos (tioles, -SH), mientras que el éster Sulfo-NHS reacciona hacia las aminas principales (como se encuentra en la lisina y la proteína o el péptido de terminal N). Aún otro ligador es maleimidocaproilo (me). Otros ligadores adecuados incluyen ligadores que son hidrolizables en un pH o rango de pH específico, tal como un ligador de hidrazona. Otros ligadores escindibles adecuados incluyen ligadores de disulfuro. El ligador puede estar ligado en forma covalente al anticuerpo de tal manera que el anticuerpo se deba degradar de manera intracelular para que el fármaco se libere, por ejemplo, el ligador me y similares.
Los ligadores preferidos de la presente invención son maleimidocapronic— valin-citrulin-p-aminobenciloxicarbonilo (ve) y maleimidocaproilo (me).
Polipeptido Fe modificado por ingeniería genética Ya se ha informado que ciertos residuos que están presentes, aparentemente, en la superficie del dominio CH2 o CH3 de la cadena pesada de los anticuerpos o en el dominio constante de la cadena liviana, o accesibles de otra manera, son adecuados para la sustitución del aminoácido natural de tipo silvestre con, por ejemplo, cisteína, y, por ende, son útiles para modificar un sitio capaz de conjugarse con varios agentes (véase la solicitud de patente provisional estadounidense USSN 61/580169 que se incorpora a la presente por referencia).
Las modificaciones de aminoácidos se pueden llevar a cabo mediante cualquier método conocido en el estado de la téenica, y varios de esos métodos son conocidos y rutinarios para un experto en el arte. Por ejemplo, entre otras, sustituciones, eliminaciones e inserciones de aminoácidos se pueden lograr mediante una técnica basada en PCR conocida. La sustituciones de aminoácidos se pueden llevar a cabo mediante mutagénesis dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Zoller and Smith, 1982, Nucí. Acids Res. 10:6487-6500; an d Kunkel, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci USA 82:488).
En algunas modalidades, el polipéptido Fe modificado por ingeniería mecánica de la descripción se puede usar para preparar un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de este, de modo que el anticuerpo o el fragmento de este comprenda la región Fe modificada por ingeniería genética que se puede usar para conjugar, en el residuo modificado por ingeniería genética (es decir, el aminoácido sustituido comparado al Fe de tipo silvestre no modificado), una amplia variedad de porciones.
En algunas modalidades, el polipéptido constante de cadena liviana kappa modificado por ingeniería genética de la descripción se puede usar para preparar un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de este, de modo que el anticuerpo o el fragmento de este comprenda una región CL modificada por ingeniería genética que comprende una mutación de aminoácido, o de una porción de este, que se puede usar para conjugar, en el residuo de aminoácido modificado por ingeniería genética, una amplia variedad de porciones.
Los anticuerpos IL-13-Ra2 de la presente invención pueden abarcar un polipéptido Fe modificado por ingeniería genética, donde 1, 2 o más aminoácidos se eligen de las siguientes posiciones: 347, 392, 398, 422 y 443 de la cadena pesada del anticuerpo, en donde el sistema de numeración de la región constante es el del índice EU como se indica en Kabat et al. (1991, N1H Publication 91- 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA, en adelante, "Kabat"), de un anticuerpo de origen, nativo o de tipo silvestre, sustituido con otro aminoácido (incluso aminoácidos naturales y no naturales/sintéticos).
Cabe destacar que una sustitución única en un polipéptido Fe, por ejemplo, de un residuo de cisteína, resulta, normalmente, en que se muestran dos residuos correspondientes en el anticuerpo IgG resultante debido a la naturaleza homodimérica de las moléculas de anticuerpo IgG. Por ello, los anticuerpos IgG modificados por ingeniería genética resultantes de la invención pueden mostrar al menos 1, 2, 3, 4 o más grupos reactivos a fin de la conjugación con un fármaco o compuesto. En una modalidad, una o más de las sustituciones se lleva a cabo con un residuo de cisterna, y los anticuerpos modificados por ingeniería genética resultantes pueden mostrar al menos 1, 2, 3, 4 o más grupos tiol a fin de la conjugación con un fármaco o compuesto.
En otras modalidades, el polipéptido Fe modificado por ingeniería genética de la descripción comprende una o más sustituciones seleccionadas de las posiciones 347, 392, 398, 422 y 443 de la cadena pesada de un anticuerpo, y en donde el sistema de numeración de la región constante es el del índice EU como se indica en Kabat et al. (supra).
En algunas modalidades, el polipéptido Fe modificado por ingeniería genética de la descripción comprende al menos un par de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; y (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34.
En algunas modalidades, el polipéptido Fe modificado por ingeniería genética de la descripción comprende una sustitución seleccionada del grupo que consiste en (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; y (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29.
Polipéptido CK modificado por ingeniería genética Los anticuerpos IL-13-Ra2 de la presente invención pueden abarcar una región constante de la cadena liviana (LC) de un anticuerpo modificado por ingeniería genética o una porción de este, donde 1, 2 o 3 aminoácidos seleccionados de las posiciones 111, 183 o 188 de la cadena liviana del anticuerpo, en donde el sistema de numeración de la región constante de la cadena liviana es el sistema de numeración Kabat, como se indica en Kabat et al. (1991, N1H Publication 91- 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA, en adelante, "Kabat"), de un anticuerpo de origen, nativo o de tipo silvestre, sustituido con otro aminoácido (que incluye aminoácidos naturales y no naturales/sintéticos).
En algunas modalidades, el polipéptido de LC modificado por ingeniería genética de la descripción comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31; y (c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32.
En otras modalidades, debido a la naturaleza dimérica de varios anticuerpos (por ejemplo, los IgG comprenden dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende un polipéptido Fe), un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender al menos un polipéptido Fe modificado por ingeniería genética y también puede comprender al menos un polipéptido constante de cadena liviana modificado por ingeniería genética, y por lo tanto, proporcionar al menos dos sitios de conjugación específica de sitio - uno en el polipéptido Fe y otro en el polipéptido CL. Los anticuerpos preferidos de acuerdo con la invención que comprenden al menos un polipéptido Fe modificado por ingeniería genética, y al menos un polipéptido de región constante de la cadena liviana modificado por ingeniería genética seleccionado del grupo que consiste en L443C/kAlllC (SEQ ID NOS: 28 y 30), L443C/kK183C (SEQ ID NOS: 28 y 31), Q347C/kAlllC (SEQ ID NOS: 29 y 30), y Q347C/kK183C (SEQ ID NOS: 29 y 31).
Teenología de conjugación MAC La expresión "conjugado de anticuerpo multifuncional", o MAC, se refiere a un anticuerpo como se define en la presente, o una porción de fijación al antígeno de este, conjugado en forma covalente mediante la región constante kappa con al menos una porción fármaco, que ejerce un efecto biológico sobre una diana. Preferentemente, el anticuerpo, o la porción de fijación al antígeno de este, comprende K90 y H91 de SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 o SEQ ID NO:55, y la porción fármaco se conjuga con K90. La tecnología MAC se describió anteriormente en W02012/007896 y en USSN 61/584,675, que se incorporan en la presente por referencia.
La porción fármaco ejerce un efecto biológico sobre la diana y puede ser un péptido, una molécula pequeña, una proteína, una molécula de ácido nucleico, una toxina, un aptámero, o un anticuerpo de fijación al antígeno o fragmento de este. La porción fármaco puede ser un fármaco que tiene actividad citotóxica contra células diana. En algunos aspectos, la citotoxina es de la clase de compuestos conocidos como auristatina. Las auristatinas representativas son los compuestos 0101 y 3377 descritos en la presente en el Ejemplo 13.
La reacción de la porción fármaco con el dominio constante liviano de un anticuerpo tiene como objetivo particularmente deseable minimizar o prevenir cualquier interferencia con la fijación de la porción Fe del anticuerpo a los receptores Fe (tales como FcyR y FcRn) o la fijación del anticuerpo a su diana respectiva. Por el contrario, la conjugación de la porción fármaco respectiva con la porción Fe de un anticuerpo puede disminuir la vida media ¡n vivo del anticuerpo y/o su capacidad para interactuar con el sistema inmunitario (función efectora). La conjugación de la porción fármaco en la región variable de la cadena pesada (VH) o de la cadena liviana (VL) del anticuerpo conlleva el riesgo de disminuir la fijación del anticuerpo a su cognado.
Una de las ventajas de la tecnología MAC es que, en función de los reactivos y las condiciones de reacción (en especial, el éster del grupo saliente y la relación molar anticuerpo-ligador), se pueden generar composiciones y muestras de la Invención con una cantidad determinada de porciones fármaco con respecto a una cantidad determinada de anticuerpos. Esto puede ser particularmente útil cuando se calcula la ventana terapéutica y de reactividad relativa de la porción fármaco y el anticuerpo. Además, en algunas situaciones, aumentar la cantidad de porciones fármaco por anticuerpo por sobre un umbral determinado puede no resultar en un aumento de la fijación o efecto terapéutico de la diana. Por ello, es útil poder controlar la cantidad de porciones fármaco conjugadas por anticuerpo y, de esta manera, dirigir la ubicación de la conjugación a fin de minimizar Fe o combinar la interferencia de sitio. Por ello, en algunas situaciones, los aspectos de la invención que permiten una conjugación reducida, preferentemente, decorando un único residuo de lisina, tal como K90 de la región constante de la LC de hu08, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, o SEQ ID NO:55, puede ser ventajoso. Asimismo, mientras que la conjugación con K90 es confiable y robusta, la conjugación con otras lisinas superficiales del anticuerpo, cada una con una reactividad y ml levemente diferentes, puede resultar en una muestra heterogénea de anticuerpos conjugados que pueden liberar moléculas conjugadas en momentos inoportunos o irregulares, por ejemplo, durante la circulación y antes de la administración de la porción fármaco a la diana mediante reconocimiento por parte del anticuerpo.
Otro aspecto de la presente invención es el descubrimiento de que ciertas mutaciones de D77 de la cadena kappa constante de tipo silvestre (SEQ ID NO: 55) mejora la accesibilidad y/o la reactividad del sitio K90 para la conjugación del fármaco. Además, la presente invención proporciona polimorfismos conocidos de la cadena kappa V/A en la posición 45 y A/L en la posición 83 (lo que dio los 3 polimorfismos constantes kappa humanos identificados Km(l):V45/L83, Km(1,2): A45/L83, y Km(3) A45/V83). En consecuencia, la presente invención proporciona los MAC que comprenden SEQ ID NO:53. En algunos aspectos, la presente invención proporciona un MAC de polimorfismo Km(3), en donde el dominio constante kappa se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54 y SEQ ID NO:55.
La presente invención también proporciona un anticuerpo que se fija específicamente a IL-13Ra2 humano, en donde el anticuerpo tiene una región constante de la LC como se muestra en SEQ ID NO: 52, y esa región constante de la LC tiene un residuo de lisina en la posición 80 (K80) y un residuo de alanina sustituido por un residuo de ácido aspártico en la posición 77 (D77A).
La presente invención también proporciona un anticuerpo que se fija específicamente a IL-13Ra2 humano, en donde el anticuerpo tiene una región constante de la LC como se muestra en SEQ ID NO: 53, en donde la posición 45 es V o A, la posición 83 es A o L, y la posición 77 se selecciona del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H y W. En algunos aspectos, donde la posición 45 es V, la posición 83 es L. En algunos aspectos de SEQ ID NO:53, la posición 77 se selecciona del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H y W. La variabilidad de residuos en las posiciones 45 y 83 en SEQ ID NO:53 se puede seleccionar de modo que solo proporcione uno, dos o tres de los polimorfismos Km(l), Km(l,2) y Km(3).
La presente invención también proporciona un anticuerpo que se fija específicamente a IL-13Ra2 humano, en donde el anticuerpo tiene una región constante de la LC como se muestra en SEQ ID NO: 54, en donde la posición 77 se selecciona del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H y W.
La presente invención también proporciona un anticuerpo que se fija específicamente a IL-13Ra2 humano, en donde el anticuerpo tiene una región constante de la LC como se muestra en SEQ ID NO: 55.
Terapia contra el cáncer Los tipos de cáncer que incluyen, entre otros, un tumor, metástasis u otra enfermedad o trastorno caracterizado por el crecimiento celular no controlado, se pueden tratar o prevenir mediante la administración de un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención.
Los ADC anti-IL-13-Ra2 de ejemplo son útiles para tratar tipos de cáncer que expresen o sobreexpresen IL-13-Ra2 con respecto a lo normal (por ejemplo, tejido no canceroso). El tratamiento o la prevención de un tipo de cáncer que expresa IL-13-RA2, de acuerdo con los métodos descritos en la presente, se pueden lograr mediante la administración a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un ADC anti-IL-13-Ra2. En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-IL-13-Ra2 de longitud completa o fragmento de fijación al antígeno o derivado de este que se conjuga con un agente citotóxico. En algunas modalidades de ejemplo, un ADC de acuerdo con la presente invención (i) se fija a células cancerosas que expresan IL-13-Ra2 y (ii) ejercen un efecto citotóxico o un efecto citostático con el fin, por ejemplo, de inhibir la proliferación de las células cancerosas que expresan IL-13-Ra2 o eliminar las células cancerosas que expresan IL-13-Ra2.
En otras modalidades, los ADC anti-IL-13-Ra2 se coadministran con otro agente terapéutico o se administran secuencialmente con otro agente terapéutico. En algunas modalidades, los ADC anti-IL-13-Ra2 se coadministran con medicamentos quimioterapéuticos, que incluyen los medicamentos quimioterapéuticos de cuidado estándar, o se administran secuencialmente.
En algunas modalidades, el otro agente terapéutico será un agente de cuidado estándar para la enfermedad específica que se desea tratar o es parte de un régimen de rescate para la enfermedad específica que se debe tratar. Los agentes antineoplásicos y los regímenes quimioterapéuticos incluyen, por ejemplo, anticuerpos antineoplásicos, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, Alemtuzumab), anticuerpos ant¡-CD20 (por ejemplo, Rituximab), y anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, SGN40); regímenes quimioterapéuticos que incluyen, por ejemplo, CHOP (ciclofosfamida, doxorubicin, vincristine y prednisone); CVP (dclofosfamida, vincristine y prednisone); RCVP (Rituximab+CVP); RCHOP (Rituximab+CHOP); RICE (RituximAb+ifosamide, carboplatino, etoposide); RDHAP, (Rituximab+dexamethasone, cytarabine, cisplatin); RESHAP (Rituximab+etoposide, methylprednisolone, cytarabine, cisplatin); gemcitabine; tratamiento combinado con vincristine, prednisone y anthracycline, con o sin asparaginase; tratamiento combinado con daunorubicin, vincristine, prednisone, y asparaginase; tratamiento combinado con teniposide y Ara-C (cytarabine); tratamiento combinado con methotrexate y leucovorin; tratamiento combinado con bleomycin, doxorubicin, etoposide, mechlorethamine, prednisone, vinblastine y vincristine; inhibidores de moléculas pequeñas; e inhibidores de proteosome que incluyen, por ejemplo, bortezomib.
En algunas modalidades, los métodos para tratar el cáncer incluyen administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un ADC anti-IL-13-Ra2 en combinación con el tratamiento de radiación, y, opcionalmente, otro agente terapéutico. En algunas modalidades, el ADC anti-IL-13-Ra2 se administra de manera simultánea o secuencial con un agente antineoplásico (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) y/o con terapia de radiación. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico o la terapia de radiación se administra al menos 1 hora, 5 horas, 12 horas, 1 día, 1 semana, 1 mes, varios meses (por ejemplo, hasta 3 meses) antes o después de la administración de un compuesto de la presente invención.
Los ADC de la presente invención pueden ser una composición farmacéutica para la administración que se formula para que sea adecuada para la forma de administración seleccionada y un diluyente o excipiente aceptables desde el punto de vista farmacéutico, tal como amortiguadores, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes, portadores y similares. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18.° ed., 1995, proporciona un compendio de téenicas de formulación conocidas, generalmente, por los médicos especializados.
Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualquier modo conocido en el estado de la técnica, que logre el objetivo generalmente pretendido de tratar el cáncer. La vía de administración preferida es parenteral, definida en la presente como formas de administración que incluyen, entre otras, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea e intraarticular. La dosis administrada depende de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, si hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Las composiciones dentro del alcance de la invención incluyen todas las composiciones en donde un ADC está presente en una cantidad que es eficaz para lograr el efecto médico deseado para tratar el cáncer. Aunque las necesidades individuales pueden variar de un paciente a otro, la determinación de rangos óptimos de cantidades efectivas de todos los componentes está dentro de la capacidad de la persona del oficio de nivel medio, en este caso, el médico.
Diagnóstico Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la presente invención también se pueden usar para detectar hIL-13-Ra2 en una muestra biológica in vitro o ¡n vivo. En una modalidad, los anticuerpos anti-hIL-13-Ra2 de acuerdo con la invención se usan para determinar el nivel de hIL-13-Ra2 en un tejido o en células derivadas del tejido. En una modalidad preferida, el tejido es tejido enfermo. En una modalidad preferida del método, el tejido es de un tumor o una biopsia de este. En una modalidad preferida del método, un tejido o una biopsia de este se extrae primero de un paciente, y los niveles de hIL-13-Ra2 en el tejido o la biopsia se puede determinar en un inmunoensayo con los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos de la invención. El tejido o la biopsia de este se pueden congelar o fijar. El mismo método se puede usar para determinar otras propiedades de la proteína hIL-13-Ra2, tales como los niveles de superficie celular o de localización celular.
El método descrito anteriormente se puede usar para diagnosticar el cáncer en un sujeto que se sabe o se sospecha que tiene un tipo de cáncer, en donde el nivel de hIL-13-Ra2 que se midió en el paciente se compara al de un sujeto de referencia normal o estándar. El método luego se puede usar para determinar si un tumor expresa hIL-13-Ra2, lo que puede sugerir que el tumor responderá bien al tratamiento con los conjugados de anticuerpo y fármaco de la presente invención. Preferentemente, el tumor es un tipo de cáncer de pulmón, colon, estómago, páncreas, ovario, un glioma maligno, melanoma u otro carcinoma que expresa hIL-13-Ra2, y otros tipos de cáncer, que todavía deben determinarse, que expresan hIL-13-Ra2 en forma predominante.
Una modalidad de acuerdo con la invención es un método para tratar un tipo de cáncer que exprese IL-13-Ra2 que comprende: determinar el nivel de hIL-13-Ra2 en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas: obtener una muestra de un sujeto que se sospecha que tiene cáncer, evaluar la muestra en un inmunoensayo usando un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, determinar los niveles de superficie celular de hIL-13-Ra2 en la muestra, comparar los niveles de superficie celular de hIL-13-Ra2 con los de un sujeto de referencia normal o estándar, y administrar al sujeto un conjugado de anticuerpo y fármaco de la presente invención.
La presente invención también proporciona anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados y fragmentos de fijación al epítopo de estos que también se etiquetan para el uso en la investigación o en aplicaciones de diagnóstico. En modalidades preferidas, la etiqueta es una radioetiqueta, un fluoróforo, un cromóforo, un agente formador de imágenes o un ion de metal.
También se proporciona un método para el diagnóstico en el que los anticuerpos o fragmentos de fijación al epítopo de estos etiquetados se administran a un sujeto que se sospecha que tiene cáncer, y la distribución de la etiqueta dentro del cuerpo del sujeto se mide o se controla.
Ktt La presente invención también incluye kits, por ejemplo, que comprenden un conjugado citotóxico descrito e instrucciones de uso del conjugado citotóxico para eliminar tipos celulares particulares. Las instrucciones pueden incluir el uso de conjugados citotóxicos in vitro, in vivo o ex vivo. Generalmente, el kit tendrá un compartimento que contiene el conjugado citotóxico. El conjugado citotóxico puede tener una forma liofilizada, líquida u otra forma modificable para que se pueda incluir en el kit. El kit también puede contener elementos adicionales necesarios para practicar el método descrito en las instrucciones del kit, tales como una solución esterilizada para reconstituir un polvo liofilizado, agentes adicionales para combinar con el conjugado citotóxico antes de que sea administrado al paciente, y herramientas que ayuden a la administración del conjugado al paciente.
Todas las publicaciones y los documentos de patentes citados anteriormente, o en los siguientes ejemplos, se incorporan a la presente por referencia en su totalidad, para todos los fines con el mismo alcance como si se indicaran en forma individual.
La invención se describe adicionalmente en referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, cabe aclarar que la invención no se limita a tales ejemplos.
Los siguientes ejemplos de aspectos específicos para realizar la presente invención se brindan únicamente con fines ilustrativos, y no se pretende que limiten de ninguna manera el alcance de la presente invención.
EJEMPLO 1 Generación v evaluación de anticuerpos ant¡-IL-13Ra2 murinos mu07 v mu08 Los anticuerpos anti-hIL-13Ra2 se prepararon en ratones usando antígeno IL-13Ra2 humano y métodos estándares de inmunización. (Zhang, C., Antibody Methods and Protocole, Methods in Molecular Biology, vol. 901, DOI 10.1007/978-1-61779-931-0_7, © Springer Science+Business Media, LLC 2012). Se identificó que dos anticuerpos murinos, mu07 y mu08, se unieron a células A375, una línea celular del melanoma que expresa de manera endógena niveles elevados de IL-13Ra2 en la superficie celular.
Una característica importante de un anticuerpo en un ADC es la internalización rápida luego de la fijación al receptor. Los anticuerpos mu07 y mu08 se evaluaron, y se descubrió que se internalizaron 38 % y 31 % respectivamente, después de la incubación con células A375 a 37 °C durante 1 hora.
EJEMPLO 2 Regiones variables de los anticuerpos anti-IL-13Ra2 murinos mu07 v mu08 Se clonaron las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena liviana de los anticuerpos anti-IL-13Ra2 mu07 y mu08 usando el sistema de síntesis de cDNA de SMARTer® (Clontech Laboratories Inc. de Mountain View, Calif.) seguido de amplificación por PCR. El cDNA se sintetizó mediante téenicas estándares y se amplificó por PCR usando un cebador que se aparea a la oligosecuencla HA de SMARTer®, y el cebador específico de regiones constantes de ratón (Kappa de ratón para la cadena liviana y IgGl de ratón para la cadena pesada) con supermezcla para PCR de alta fidelidad (PCR SuperMix High Fidelity, Invitrogen, Carlsbad, CA.)· Los productos de PCR de la región variable de la cadena pesada y de la cadena liviana se subclonaron en vector pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se determinó la secuencia de ácidos nucleicos.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de mu07 y mu08 se indican como residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:23, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena liviana de mu07 y mu08 se indican en SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:24, respectivamente.
EJEMPLO 3 Especificidad de fijación v cinética de fijación de anticuerpos quiméricos ch07 v ch08 Los anticuerpos quiméricos 07 y 08 (ch07 y ch08) se construyeron con secuencias murinas de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena liviana y regiones constantes de la cadena pesada de IgGl humano y regiones constantes de la cadena liviana de kappa humano usando métodos conocidos en el estado de la técnica. Para evaluar la actividad y especificidad de fijación de ch07 y ch08, se realiza un protocolo ELISA estándar directo usando hIL-13-Ra2 y hlL-13Ral recombinantes, receptores de atocina IL-13. La fijación se detectó mediante IgGKappa antihumana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (HRP). Los resultados en la Figura 1 demuestran que los dos anticuerpos quiméricos se pueden fijar específicamente a hIL-13Ra2, pero no a hIL-13Ral. ED50 es 0.15nM y 0.076nM para ch07 y ch08, respectivamente.
Para evaluar la cinética de fijación de los anticuerpos ch07 y ch08, se realizaron experimentos con SPR (resonancia de plasmones superficiales) en un instrumento Biacore® T100 o T200 usando un Biacore® Human Fab Capture Kit (GE Healthcare). Todos los datos se analizaron usando un software de evaluación Biacore® T100 versión 2.0 con un modelo de fijación de Langmuir 1:1.
Ka, Kd y KD se muestran en la Tabla 5. Con pH7.4, la afinidad de fijación a hIL-13-Ra2 de ch07 y ch08 se encuentra en el rango pM, 648pM y 964pM, respectivamente. La disociación de ch07 de hIL-13-Ra2 es alrededor de dos veces más lenta que la de ch08. Con pH6.0, la afinidad de fijación de ch07 y ch08 a hIL-13-Ra2 se encuentra en el rango nM inferior. La velocidad de disociación de ch08 y ch07 es muy similar. KD más altos con pH6.0 que con pH7.4 se deben a una velocidad de asociación más lenta.
TABLA S Análisis cinetico de los anticuerpos quiméricos ch07 v ch08 EJEMPLO 4 Epítopos de unión de los anticuerpos ch07 v ch08 Se llevó a cabo ELISA de competencia para examinar si ch07 y ch08 tienen epítopos de unión distintos. Antes del experimento ELISA de competencia, ch07 y ch08 se biotinilaron. El EC50 de ch07 (biotin-ch07) y ch08 (biotin-ch08) biotinilados se determinó mediante ELISA estándar directo. Para el ELISA de competencia, se recubrió hIL-13-Ra2 recombinante en placas de 96 cavidades a 50ul de 2pg/mL en PBS durante la noche a 4 °C. Luego, las placas se bloquearon y se lavaron de acuerdo con el protocolo ELISA estándar. Los ch07 y ch08 diluidos en serie 3 veces (2x concentración final) se mezclaron con una cantidad constante de biotin-ch07 (Figura 2A) o biotin-ch08 (Figura 2B), respectivamente, se agregaron a la placa y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de anticuerpo quimérico biotinilado unido se detectó mediante estreptavidina conjugada con HRP a 1:5000 durante 1 hora. Los resultados se muestran en las Figuras 2A a 2C. El ch07 quimérico sin etiquetar compite en la fijación a hIL-13-Ra2 con biotin-ch07, mientras que el ch08 sin etiquetar no muestra signos de competencia (Figura 2A). Se obtienen resultados similares cuando el mismo conjunto de anticuerpos se usa para competir con biotin-ch08 (Figura 2B). Esto demuestra claramente que los anticuerpos ch07 y ch08 tienen epítopos de unión a hIL-13Ra2 distintos.
El ELISA de competencia también se llevó a cabo con dos anticuerpos disponibles en el comercio, IgGl monoclonal de ratón, MAB614 (R8iD Systems), y IgGl monoclonal de ratón, ab27414 (Abcam). Las Figuras 2A y 2B muestran que los dos anticuerpos comerciales no compiten con biotin-ch07 o biotin-ch08 en la fijación a IL-13Ra2, lo que indica que los anticuerpos ch07 y ch08 tienen epítopos de unión diferentes a los de los dos anticuerpos comerciales.
El resultado se confirmó mediante un experimento BiaCore. Se Inmovilizaron alrededor de 100RU de hIL-13-Ra2 en un chip CM5 usando química de acoplamiento de amina. Se Inyectaron secuencialmente ch07 (lOOnM y 200nM) y ch08 (lOOnM y 200nM) sobre el canal de experimento y el canal de control hIL-13-Ra2 a una velocidad de flujo de 10ul/m¡n durante 150 s. Se alcanzaron 50RU cuando se Inyectaron 100nM de ch07 a hIL-13Ra2 inmovilizado. No volvió a aumentar RU cuando la concentración de ch07 aumentó a 200nM, lo que Indica que los sitios de fijación en hIL-13-Ra2 para ch07 estaban saturados. Con la Inyección de lOOnM de ch08, se agregaron 100RU. La señal de fijación positiva indica que los dos anticuerpos carecen de competencia. Además, los resultados confirman que los anticuerpos ch07 y ch08 tienen diferentes epítopos de unión (Figura 2C).
EJEMPLO 5 Estudios de neutralización con ch07 v ch08 A fin de evaluar si ch07 y ch08 pueden neutralizar la función de IL-13, se llevó a cabo ELISA de competencia. Un Ab anti-Flag se recubrió en placas de 96 cavidades y se incubó durante la noche a 4°C. Luego las placas se bloquearon y se lavaron de acuerdo con el protocolo ELISA estándar. Una dilución en serle triple de anticuerpos de ratón, anticuerpos quiméricos, IL-13Ra2 desnudos de control positivo y hIL-21R de control negativo se incubó con una cantidad constante de IL-13Ra2-Fc blotinllado (4x ED50) y una cantidad constante de IL-13 (4x ED50) a temperatura ambiente durante 1 h. Se agregaron 100 ul del complejo a la placa de ELISA y se Incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de IL-13-Ra2 blotinllado unido se detectó mediante estreptavldlna conjugada con HRP a 1:5000 durante 1 hora. Los resultados se muestran en la Figura 3. Los anticuerpos 07 y 08 (formas murlna y quimérica) no compiten con IL-13 por el sitio de fijación a IL-13-Ra2, mientras que el IL-13-Ra2 desnudo compite con IL-13Ra2 blotinllado. Esto Indica que los anticuerpos 07 y 08 (formas murina y quimérica) son anticuerpos no neutralizantes.
EJEMPLO 6 Humanización de mu08 El anticuerpo murino monoclonal mu08 (Seq ID NO: 23 y 24) se humanizó utilizando DP-54 y DPK9 como marcos del aceptar humano. Los anticuerpos 08 humanizados (hu08) se prepararon mediante injerto de CDR con o sin retromutaciones. Las CDR del anticuerpo mu08 murino se identificaron mediante el esquema Kabat.
Una región variable de la cadena pesada de hu08 (VH versión 1.0) se construyó mediante injerto directo de las CDR de mu08 en una región del marco de DP-54 humano. La versión 1.1 se realizó mediante retromutaciones de marco DP-54 en las posiciones A40T, G42D, G44R y N83S. vl.O y vl.l se clonaron en el vector pSMED2 que contenía la región constante de hlgGl. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de la cadena pesada de hu08 humanizado son SEQ ID: NO: 17 para vl.O y SEQ ID: NO: 20 para vl.l. Las secuencias de aminos que codifican regiones variables de la cadena pesada de hu08 son SEQ ID: NO: 1 para vl.O y SEQ ID: NO: 19 para vl.l.
Una región variable de la cadena liviana de hu08 (VK versión 1.0) se construyó mediante injerto directo de las CDR de mu08 murlna en una región marco DPK9 humano. La versión 1.1 se realizó mediante retromutaciones del marco DPK9 en las posiciones K39I, S60D, T72S, T73F y T74I. Las versiones vl.O y vl.l se clonaron en el vector pSMEN3 que contenía la región constante hlgKappa. Las secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables de la cadena liviana de hu08 son SEQ ID: NO: 18 para vl.O y SEQ ID: NO: 22 para vl.l. Las secuencias de aminoácidos que codifican regiones variables de la cadena liviana hu08 son SEQ ID: NO: 5 para vl.O y SEQ ID: NO: 21 para vl.l.
EJEMPLO 7 Caracterización del hu08 humanizado El hu08 humanizado que se fija a hIL-13-Ra2 recombinante se evaluó mediante ELISA directo estándar. El hIL-13-Ra2 recombinante se recubrió en una placa de 96 cavidades. Los anticuerpos quiméricos diluidos en serie o los anticuerpos humanizados en combinaciones de cadenas pesadas y livianas de las versiones 1.0 y 1.1, por ejemplo, hu08 vl.O HC/1.0 LC, hu08 vl.O HC/vl.l LC, hu08 vl.l HC/vl.O LC y hu08 vl.l HC/vl.l LC, se agregaron a la placa y se incubaron a temperatura ambiente durante 1-2 horas. La fijación se detectó mediante Ig Kappa antihumana de cabra conjugada con HRP. Los resultados se muestran en la Tabla 6 siguiente y demuestran que las cuatro combinaciones de anticuerpos humanizados se pueden fijar a hIL-13-Ra2 recombinante, y ED50 es comparable a ch08.
El análisis FACS (separación de células activadas por fluorescencia) estándar se realizó para evaluar la actividad de fijación de los anticuerpos a la superficie celular de IL-13Ra2. Las células A375 se lavaron con PBS helado que contenía 1 % de albúmina de suero bovino y 0.001 % de azida de sodio. Las células se Incubaron con diluciones en serie de anticuerpos hu08 vl.O y hu08 vl.l, por ejemplo, hu08 vl.O HC/1.0 LC, hu08 vl.O HC/vl.l LC, hu08 vl.l FIC/vl.O LC y hu08 vl.l HC/vl.l LC, durante 30 min a 4 °C, y luego se tiñeron con IgG antihumana de cabra etiquetada con fosfatidiletanolamina, se fijaron en PBS que contenía 4 % de paraformaldehído y se analizaron en un FACScan® (BD Bíosciences). Los datos son consistentes con la fijación al receptor recombinante e ilustran que la fijación al antígeno de la superficie celular para las 4 combinaciones es comparable con ch08 (Tabla 6).
Se llevó a cabo ELISA de competencia para evaluar si hu08 1.0 y hu08 vl.l compiten con ch08 para la fijación a IL-13-Ra2. Se recubrió hIL-13-Ra2 recombinante en placas de 96 cavidades a 50ul de 2pg/ml en PBS durante la noche a 4 °C. Luego, las placas se bloquearon y se lavaron de acuerdo con el protocolo ELISA estándar. ch08, hu08 1.0 y hu08 vl.l diluidos en serie 3 veces y ch07 de control negativo (2x concentración final) se mezclaron con ch08 biotinilado (2x EC50). 50? del anticuerpo y la mezcla de biotin-ch08 se agregaron a la placa y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de biotin-ch08 unido se detectó mediante estreptavidina conjugada con HRP. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Las 4 combinaciones de anticuerpos humanizados son similares al anticuerpo quimérico ch08 en cuanto a la competencia con el ch08 biotinilado, que indica que hu08 1.0 y hu08 vl.l retuvieron el mismo epítopo de unión que ch08 y tienen afinidad similar a la superficie soluble y celular de IL-13-Ra2.
TABLA S hu08 vl.O HC/vl.O LC y hu08 vl.1HC /vl.lLC se aumentaron para generar proteínas purificadas. Ambos anticuerpos se expresaron de manera transitoria en células de suspensión HEK293F. Sorprendentemente, la humanización de 08 mejoró el rendimiento de la producción de anticuerpos 5-6 veces más, en comparación con el rendimiento de ch08 (Tabla 7).
TABLA 7 Existe una correlación directa entre la estabilidad térmica de una proteína o dominio de proteína con la estabilidad general de la proteína o dominio de proteína. Un punto de fusión mayor de una proteína o dominio de proteína frecuentemente proporciona mayor capacidad de elaboración y vida útil/estabilidad más prolongadas. La estabilidad térmica de ch08 y hu08 (v 1.0 y vl.l) se examinó mediante Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). El despliegue térmico de anticuerpos quiméricos y humanizados mediante DSC se realizó con un protocolo estándar en un instrumento MicroCal VP-DSC. Los anticuerpos humanizados, hu08 vi.0/1.0 y hu08 vi.1/1.1, mostraron un Tm2 (Fab) mayor que la versión quimérica ch08 (Tabla 8). Esto demuestra que la humanización de cu08 mejora la estabilidad térmica de este anticuerpo.
TABLA 8 La cinética de fijación de los anticuerpos hu08 se realizó en un Biacore® T100, como se describió anteriormente, con los resultados que se muestran en la Tabla 9.
TABLA 9 EJEMPLO 8 Humanización de mu07 La estrategia general de humanizar el anticuerpo monoclonal murino mu07 es la misma que la descrita para mu08 en el Ejemplo 6. Una región variable de la cadena pesada de hu07 humanizado (VH versión 1.0) se construyó mediante el injerto directo de las CDR de mu07 en una región del marco DP-54 humano. Las versiones 1.1-1.5 se realizaron mediante retromutaciones del marco DP-54 en diferentes posiciones (Tabla 10). Todas las versiones se clonaron en vector pSMED2 que contenía la región constante de hlgGl.
Una región variable de la cadena pesada de hu07(VK versión 1.0) se construyó mediante el injerto directo de las CDR de mu07 en una región del marco DPK9 humano. Las versiones 1.1-1.7 se realizaron mediante retromutaciones del marco DPK9 en diferentes posiciones (Tabla 10). Todas las versiones se clonaron en vector pSMEN3 que contenían la región constante de hlg Kappa. Los números de SEQ ID de las secuencias de aminoácidos que codifican las regiones variables de hu07 se enumeran en la Tabla 10.
TABLA 10: EJEMPLO 9 Caracterización de hu07 humanizado Para evaluar las propiedades de fijación/competencia de las diferentes versiones de huO, se efectuaron transfecclones transitorias con 19 combinaciones de cadenas pesadas y livianas de hu07 en células COS-1 M6. Se incluyeron 6 cadenas pesadas y 3 cadenas livianas: la cadena pesada quimérica, la cadena pesada vl.0-1.5 humanizada, la cadena liviana quimérica y la cadena liviana vl.0-1.1 humanizada. Los medios condicionados (CM) se cosecharon 2 días después de la transfección y se sometieron a fijación directa a IL-13-Ra2 recombinante mediante ELISA estándar, a fijación al receptor de superficie celular mediante ELISA basado en células con células A375, y ELISA de competencia con ch07 biotinilado, utilizando los protocolos conocidos en el estado de la téenica.
Sobre la base de los datos de cribado iniciales de los CM, se seleccionó la cadena pesada vi.5 para un estudio adicional. La cadena pesada vl.5 se apareó con la cadena liviana vl.O y vl.l quimérica humanizada. La Tabla 11 sintetiza la actividad de fijación, las propiedades de competencia y la citoxicidad de los anticuerpos hu07. hu07 vl.5 apareado con Kc de cadena liviana quimérica demuestra un ED50 y IC50 similares al anticuerpo quimérico. La actividad de competencia en las células A375 y la proteína recombinante disminuyó cuando esta cadena pesada vl.5 se apareó con la cadena liviana vl.O y vl.l.
TABLA 11 Se usó la cadena pesada vi.5 de hu07 para la optimización de la cadena liviana. Se realizaron transfecciones transitorias con 10 combinaciones de las cadenas pesadas y livianas de hu07 en células COS-1 M6. La cadena pesada vi.5 se apareó con las versiones de cadena liviana quimérica y humanizadas vl.0-1.7. Se cosecharon y se usaron CM en experimentos para determinar la afinidad de fijación a hIL-13a2 recombinante (rhIL-13a2) mediante ELISA y la actividad de competencia con ch07 biotinilado mediante ELISA de competencia. Los datos indican que la combinación de cadena pesada vi.5 y cadena liviana vl.7 es óptima. Este resultado se confirmó con proteína purificada (Tabla 12).
TABLA 12 EJEMPLO 10 Reactividad cruzada entre especies de ch07. hu07. ch08 y hu08 IL-13-Ra2 de mono Macaca fascicularis (dominio extracelular (ECD)) y el dominio de transmembranas (TM) se aislaron de los testículos y los tejidos adiposos del mono Macaca fascicularis mediante RT-PCR. La secuencia de aminoácidos de IL-13-Ra2 de mono Macaca fascicularis se muestra en la SEQ ID NO: 27. La identidad es de 94 % entre IL-13Ra2 humano y de mono Macaca fascicularis.
El dominio ECD/TM del IL-13-Ra2 de mono Macaca fascicularis fusionado con etiqueta FLAG en el extremo del terminal C se clonó en el vector de expresión pSMED2. Las células de suspensión HEK293 se transfectaron transitoriamente con IL-13-Ra2 de mono Macaca fascicularis que contenían vector plásmidos y pSMED2 (como una transfección simulada). Las células se cosecharon 72 horas más tarde y se sometieron a análisis FACS. Se evaluaron 4 anticuerpos, que incluyen ch07, ch08, hu08vl.0/1.0 y hu08vl.1/1.1. La fijación en la superficie celular de IL-13-Ra2 de mono Macaca fascicularis se detectó con IgG de ratón o antihumana de cabra etiquetada con R-ficoeritrina. Los datos demuestran que ch07, ch08, hu08vl.0/1.0 y hu08vl.1/1.1 pueden fijarse a la superficie celular de IL-13-Ra2 de mono Macaca fascicularis y tienen afinidades de fijación similares (ED50) (Tabla 13).
TABLA 13 La fijación de hu07 y hu08 a IL-13-Ra2 de ratón se evaluó mediante ELISA directo. La identidad entre IL-13-Ra2 humano y de ratón en el nivel de aminoácidos es de aproximadamente 64 %. mIL-13-Ra2 o hIL-13-Ra2 recombinante (como control positivo) se recubrió en una placa de 96 cavidades. ch07 y ch08 quiméricos purificados se diluyeron en serie y se agregaron a la placa recubierta con antígeno. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante anticuerpo secundario específico IgGFc antihumano de cabra conjugado con HRP. No existió señal detectable para la fijación a mIL-13-Ra2, mientras que la fijación a hIL-13-Ra2 de control positivo fue fuerte, lo que Índica que hu07 y hu08 no presentan reactividad cruzada a mIL-13Ra2 murino.
EJEMPLO 11 Fijación a líneas celulares humanas que expresan IL13R-a2 Las líneas celulares que expresan el antígeno IL-13-Ra2 y las células de control negativo se colocaron en placas a una densidad de 200,000 células por cavidad de placa de 96 cavidades profundas y se mantuvieron en hielo. Los anticuerpos monoclonales de ratón mu07 o mu08 preparados en 3 % de albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS) se agregaron a una placa a una concentración final de 10 mg/ml. Luego, las placas se incubaron en hielo durante 1 hora, y luego se lavaron 2 veces. El anticuerpo secundario, IgG Fe anti-ratón de cabra conjugado con PE (ficoeritrina), se agregó en las cavidades. Luego de 30 minutos de incubación a 4 °C, la intensidad de fluorescencia media se analizó mediante FACS en un FACScan™ (BD Biosciences).
Los datos en la Tabla 14 indican que los anticuerpos mu07 y mu08 se fijan a un panel variado de líneas celulares positivas de IL-13R-a2 de diversas indicaciones de enfermedades.
TABLA 14 EJEMPLO 12 Internalización La internalización de anticuerpos es una característica crítica para el suministro de ADC para la citotoxicidad en células que expresan IL-13-R02. La internalización del anticuerpo luego de la fijación a IL-13-Ra2 se examinó usando anticuerpos mu07 y mu08 y un anticuerpo monoclonal de ratón de control positivo (ab27414), en cuatro líneas celulares (PC3MM2, A375, Hs766T y H460R ). Los anticuerpos (10 mg/ml) se incubaron con las diferentes células durante 1 hora en hielo y el anticuerpo no unido se eliminó mediante dos lavados con medio frío. Las placas de cultivo celular se incubaron a 37 °C. Las muestras de células se fijaron a los 15 minutos y a las 4 horas. El porcentaje de internalización en distintos puntos de tiempo se muestra en la Tabla 15. Los datos muestran que mu07 y mu08 se internalizaron fácilmente en células que expresan IL-13-Ra2.
TABLA 15 EJEMPLO 13 Síntesis de los compuestos 0101 v 3377 Los compuestos 0101 y 3377 se prepararon de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente estadounidense N.° 13/670,612, incorporada a la presente por referencia.
Estudio experimental para el compuesto 0101 (#54 en el esquema') Preparación de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(lR,2R)-l-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(lS)-2-fenil-l-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-l-il>-5-metil-l-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#54) . , .
, Etapa 1. Síntesis de /V-[(9/ fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-/\/-[(3 ?/45/55)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(l/?/2/?)-l-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(15)-2-fenil-l-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino>propil]pirrolidin-l-il}-5-metil-l-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (#53). De acuerdo con el procedimiento general D, de #32 (2.05 g( 2.83 mmol, 1 eq.) en diclorometano (20 mi, 0.1 M) y /,/V-dimetilformamlda (3 mi), la amina #19 (2.5 g, 3.4 mmol, 1.2 eq.), HATU (1.29 g, 3.38 mmol, 1.2 eq.) y trietilamina (1.57 mi, 11.3 mmol, 4 eq.) se sintetizó material crudo deseado, que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 % a 55 % acetona en heptano), que produjo #53 (2.42 g, 74 %) como un sólido. LC-MS: m/z 965.7 [M+H+], 987.6 [M+Na+], tiempo de retención = 1.04 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 965.4 [M+H+], tiempo de retención = 11.344 minutos (pureza > 97 %); H NMR (400 MHz, DMSO-ck), supuesta mezcla de rotámeros, señales características: d 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, 7=3.3 Hz) y 7.79 (d, 7=3.2 Hz), total 1H], 7.67-7.74 (m, 2H), [7.63 (d, 7=3.2 Hz) y 7.65 (d, 7=3.2 Hz), total 1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39 (ddd, 7=11.4, 8.4, 4.1 Hz) y 5.52 (ddd, 7=11.7, 8.8, 4.2 Hz), total 1H], [4.49 (dd, 7=8.6, 7.6 Hz) y 4.59 (dd, 7=8.6, 6.8 Hz), total 1H], 3.13, 3.17, 3.18 y 3.24 (4 s, total 6H), 2.90 y 3.00 (2 br s, total 3H), 1.31 y 1.36 (2 br s, total 6H), [1.05 (d, 7=6.7 Hz) y 1.09 (d, 7=6.7 Hz), total 3H], Etapa 2. Síntesis de 2-metilalanil-/V-[(3/?/45,55)-3-metoxi-l-{(25)-2-[(l/?/2/?)-l-metoxl-2-metll-3-oxo-3-{[(lS)-2-fenil-l-(l,3-tiazol-2-ll)etil]amino>propiI]pirrolidin-l-il>-5-metil-l-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinam¡da (#54) De acuerdo con el procedimiento general A, de #53 (701 mg, 0.726 mmol) en diclorometano (10 mi, 0.07 M) se sintetizó el material crudo deseado, que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 % a 10 % de metanol en diclorometano). El residuo se diluyó con dietiléter y heptano y se concentró al vacío para obtener #54 (406 mg, 75 %) como un sólido blanco. LC-MS: m/z 743.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.70 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 743.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.903 minutos, (pureza > 97 %); H NMR (400 MHz, DMSO-cy, supuesta mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, 7=8.5 Hz) y 8.86 (br d, 7=8.7 Hz), total 1H], [8.04 (br d, 7=9.3 Hz) y 8.08 (br d, 7=9.3 Hz), total 1H], [7.77 (d, 7=3.3 Hz) y 7.80 (d, 7=3.2 Hz), total 1H], [7.63 (d, 7=3.3 Hz) y 7.66 (d, 7=3.2 Hz), total 1H], 7.13-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, 7=11, 8.5, 4 Hz) y 5.53 (ddd, 7=12, 9, 4 Hz), total 1H], [4.49 (dd, 7=9, 8 Hz) y 4.60 (dd, 7=9, 7 Hz), total 1H], 3.16, 3.20, 3.21 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.93 y 3.02 (2 br s, total 3H), 1.21 (s, 3H), 1.13 y 1.13 (2 s, total 3H), [1.05 (d, 7=6.7 Hz) y 1.10 (d, 7=6.7 Hz), total 3H], 0.73-0.80 (m, 3H).
Estudio experimental para el compuesto 3377 (#115 en el esauemal Preparación de N^-dlmetilalanil-N- flS^R -f Sl^-ITlR^RyS-flYlsyi-carboxi-2-fen¡letinam¡noVl-metox¡-2-met¡l-3-oxoDroDillD¡rral¡din-1-ilV2-metoxi-l-reiSM-metilDroDill-4- :¡l -N-metil-L-valinamlda, sal del ácido trlfluoroacétlco , i I 1 - - - l l - , - i l l i , i , I . , , I — Etapa 1. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-l-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbonll]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metllheptanoll}pirrolldln-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fen¡lalaninato de metilo (#113). A una mezcla agitada del dímero del ácido#5 (12. lg, 23.0 mM) y #67 (11.5 g, 23.0 mM) en 75 mi de dlclorometano en nitrógeno, se agregó HATU (10.8 g, 27.6 mM) seguido de base de Hunig (12.1 mi, 69.0 mM). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La reacción se concentró a un volumen más pequeño, se absorbió con acetato de etilo y se lavó con HCI 1 N dos veces. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. Luego, el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 % a 70 % acetona en heptanos) y produjo #113 (12.3 g, 62 %) como un sólido blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 855.3 [M+H+], 877.2 [M+Na+], tiempo de retención = 2.32 minutos; HPLC (Protocolo R): /z 855.5 [M+H+], tiempo de retención = 9.596 minutos (pureza > 97 %).
Etapa 2. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-l-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metll(L-valll)amino]heptanoll>plrrolldln-2-ll]-2-metllpropanoil>-L-fenllalaninato de metilo (#114). De acuerdo con el procedimiento general A, de #113 (12 g, 14 mmol, 1 eq.), diclorometano (60 mi, 0.24 M) y dletilamina (40 mi, 390 mM) se sintetizó #114 (5.9 g, 67 %) como un sólido blanco/ligeramente amarillo luego de la purificación mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 % a 25 % de metanol en diclorometano). LC-MS (Protocolo Q): m/z 633.0 [M+H+], tiempo de retención = 1.19 minutos. HPLC (Protocolo A): /z 633.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.142 minutos (pureza > 98 %).
Etapa 3. Síntesis de la sal del ácido N,2-dimetilalanil-N-{(lS,2R)-4-{(2S)-2-[(lR,2R)-3-{[(lS)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-l-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-l-il>-2-metoxi-l-[(lS)-l-metilpropil]-4-oxobutil>-N-metil-L-valinamid-trifluoroacético (#115). A una mezcla agitada de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-dimetilalanina (167 mg, 0.493 mM), #114 (260 mg, 0.411 mM) y HATU (188 mg, 0.493 mM) en 10 mi de diclorometano, se agregó base de Hunig (0.14 mi, 0.82 mM) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y 20 minutos. La reacción se redujo. Se agregó THF (9 mi) al material crudo, y, a esta mezcla agitada, se agregó hidróxido de litio (49.2 mg, 2.06 mM) disuelto en 3 mi de agua. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se concentró y luego se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media (C18) (Gradiente: 5 % a 45 % de agua en acetonitrilo con 0.02 % de TFA en cada fase) #115 (218 mg, 64 %) sólido blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 718.7 [M+H+], 740.6 [M+Na+], tiempo de retención = 1.21 minutos. HPLC (Protocolo A a 45 °C): m/z 718.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.903 minutos.
EJEMPLO 14 Preparación de ADC anti-IL-13-Ro2 Los ADC de la presente invención se pueden preparar usando una sección del ligador que tiene un sitio reactivo para la fijación a un compuesto químico e introduciendo otra sección del ligador que tiene un sitio reactivo para un anticuerpo. En un aspecto, un ligador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrofílico que es reactivo con un grupo nucleofílico presente en una unidad de anticuerpos, tal como un anticuerpo. Los grupos nucleofílicos útiles en un anticuerpo incluyen, entre otros, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleofílico de un anticuerpo es reactivo con un grupo electrofílico en un ligador y forma un enlace covalente en un ligador. Los grupos electrofílicos útiles incluyen, entre otros, grupos de maleimida y haloacetamida.
Un ligador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleofílico que es reactivo con un grupo electrofílico presente en una unidad de anticuerpos. El grupo electrofílico en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión a un ligador. Los grupos electrofílicos útiles en un anticuerpo incluyen, entre otros, grupos carbonilo de aldehidos y cetonas. El heteroátomo de un grupo nucleofíilico de un ligador puede reaccionar con un grupo electrofílico en un anticuerpo y formar un enlace covalente con el anticuerpo. Los grupos nucleofílicos útiles en un ligador incluyen, entre otros, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
Como se usa en la presente, "me-" se refiere a Como se usa en la presente, "ve-" se refiere a: Los ADC anti-IL-13-Ra2 se prepararon mediante reducción parcial de mAb con tris(2-carbox¡et¡l)fosfina (TCEP), y luego mediante reacción de residuos de cisterna reducida con el ligador-carga útil deseado terminado con maleimida. En particular, hu08 se redujo parcialmente mediante adición de 2.2 de exceso molar de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en 100 mM HEPES (amortiguador del ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfónico), pH 7.0 y 1 mM de ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA) durante 2 h a 37 °C. El ligador-carga útil deseado luego se agregó a la mezcla de reacción a una relación molar ligador-carga útil/mAb de 7.0 de maleimidocapronic - valin-citrulin- -aminobenciloxicarbonil- aurstatln-0101 [vc-0101, véase más adelante]), o 7.0 de maleimidocapronic-auristatin-3377 [mc-3377, véase más adelante], y se hizo reaccionar durante 1 h más a 25 °C, en presencia de 15 % v/v de dimetilacetamida (DMA). Luego de 1 h de periodo de incubación, se agregó N-etilmaleimida (3 veces en exceso para vc-0101 y mc-3377) para limitar los tioles sin reacción, la reacción continuó durante 15 minutos, y luego se agregó 6 veces en exceso L-Cys para ¡nactlvar cualquier ligador-carga útil sin reaccionar. La mezcla de reacción se dializó durante la noche a 4 °C en solución salina amortiguada con fosfato (PBS), pH 7.4 y se purificó mediante SEC (AKTA Explorer, columna Superdex 200 10/30 GL). El ADC se caracterizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para fines de pureza, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y cromatografía de líquidos- ionización por electrospray- espectrometría de masa en tándem (LC-ESI MS) para calcular la relación fármaco-anticuerpo (carga). La concentración de proteínas se determinó mediante espectrofotómetro de UV. mc-3377 (conjugación con el anticuerpo X mediante un residuo de cisteína) vc-0101 (conjugación con el anticuerpo X mediante un residuo de cisteína) Ensayo de citotoxicidad in vitro Las líneas celulares que expresan el antígeno IL-13-Ra2 y una línea celular de control negativo, se cultivaron con concentraciones crecientes de ADC anti-IL-13-Ra2. Luego de cuatro días, se evaluó la viabilidad de cada cultivo. Se calcularon los valores IC50 mediante regresión no lineal logística y se presentaron como ng Ab/ml. Los ligador-carga útil preferidos fueron vc-0101 y mc-3377.
El anticuerpo anti-IL-13Ra2 humanizado hu08 se conjugó con diferentes combinaciones ligador-carga útil, como se proporciona en la Tabla 16. Los conjugados de anticuerpo y fármaco se prepararon de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los EE. UU. N.° 13/670,612, que se incorporan a la presente por referencia, con la nomenclatura correspondiente y el número de esquema de síntesis química experimental indicado en la Tabla 16.
TABLA 16 Además, una versión mutante de hu08 (hu08MAC) se generó como se describe en el Ejemplo 21, y de acuerdo con los protocolos estándares. El compuesto 0101 se conjugó con un ligador escindióle para formar la estructura: y luego se conjugó con hu08MAC de acuerdo con las téenicas descritas en la presente para formar hu08MAC -0101.
Los datos demuestran que el anticuerpo anti-IL-13-Ra2 hu08vl.0/1.0 conjugado con seis cargas útiles distintas de auristatina fue eficaz contra ambas líneas celulares positivas de IL-13-Ra2 evaluadas (PC3MM2 y A375), con un IC50 en el rango de 1.1 a 4.9 ng Ab/ml o 7.3-32.7 pM) (Tabla 17). Además, hu08MAC-0101 resultó eficaz contra ambas líneas celulares positivas de IL-13Ra2 evaluadas (PC3MM2 y A375), con un IC50 de 7.9 ng Ab/ml. Todos los ADC no resultaron activos contra la línea celular negativa de IL-13-Ra2, H460, y los ADC de control sin fijación a IL-13-Ra2, hIgG8.8-vc-0101 y hIgG8.8-mc-3377, no resultaron activos contra ninguna de las líneas celulares probadas.
TABLA 17 EJEMPLO 16 Modelos de xenomiertos subcutáneos Los ratones femeninos atímicos (Nude) se inyectaron por vía subcutánea con células tumorales PC3MM2 o A375. A los ratones con tumores desarrollados, aproximadamente 0.2 a 0.8 g (n = 8 a 10 ratones/grupo de tratamiento), se les administró por vía intravenosa q4d x 4 con salina normal (vehículo), ADC hu08vl.0/1.0 con ligador-carga útil vc-0101, vc-6780, vc-3906, mc-8261, mc-0131, mc-6121, mc-3377, MalPeg-8261, MalPeg-0131, MalPeg-6121 y MalPeg-3906, y un Ab sin fijación (hIgG8.8) conjugado con vc-0101 o mc-3377, a una dosis de 2 o 3 mg Ab/kg. Los ADC se dosificaron según el contenido de Ab. Los tumores se midieron al menos una vez a la semana, y su tamaño se calculó como mm3 = 0.5 x (ancho de tumor2) x (longitud del tumor).
Los resultados de la eficacia in vivo enumerados en la Tabla 18 muestran un rango de actividad antitumoral con ios distintos ADC probados. El orden relativo de potencia es hu08-vc-0101 > hu08-vc-6780 > hu08-mc-0131 > hu08-mc-6121 > hu08-mc-3906 > hu08-MalPeg-0131 >hu08-MalPeg-6121 > hu08-MalPeg-3906 > hu08-mc-8261.
Los datos en la Tabla 19 indican que los ADC hu08-vc-0101 y hu08-mc-3377 resultaron eficaces 3mg/kg en la reducción del crecimiento tumoral en PC3MM2. En comparación con el grupo de control de vehículo que se terminó el Día 15 debido al gran tamaño de los tumores (>2500 mm3 de algunos animales), hu08-vc-0101 y hu07-mc-3377 tienen 5 entre 8 o 3 entre 8 animales sin tumores medibles el Día 76, respectivamente. De modo similar al grupo de control de vehículo, grupos de control ADC irrelevantes de hIgG8.8-vc-0101 a 3 mg/kg y hIgG8.4-mc-3377 a 10 mg/kg se terminaron el Día 15 y el Día 19, respectivamente debido al gran tamaño de los tumores, respectivamente. Estos resultados demuestran que la eficacia terapéutica significativa (en algunos animales se curó la enfermedad) de hu08-vc-0101 y hu07-mc-3377 fue mediada por la diana IL-13- Ral.
TABLA 18 GT= grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño TABLA 19 GT= grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño Los datos en la Tabla 20a indican que los ADC de hu08-vc-0101 y hu08 -mc-3377 fueron eficaces en 3 mg/kg en un segundo modelo de xenoinjerto in vivo usando células A375. El grupo de control de vehículo y los grupos de control ADC irrelevantes de hIgG8.8-vc-0101 y hIgG8.8-mc-3377 se terminaron debido a un tumor de gran tamaño en el Día 19, 22, 27, respectivamente. El tratamiento con hu08-vc-0101 y hu08-mc-3377 a 3 mg/kg ocasionó la regresión del tumor en todos los animales y proporcionó ventaja de supervivencia significativa. No de observó tumor medible en ninguno de los animales tratados con hu08-mc-3377 en los Días 19 -22. Aunque algunos tumores recidivaron, se registraron 5 entre 10 animales sin tumores medióles en el Día 71. Se monitoreó el grupo tratado con hu08-vc-0101 durante 100 días, luego de lo cual 8 animales no presentaron tumores medióles en el Día 19-100. Estos resultados demostraron actividades antitumorales potentes de hu08-vc-0101 y hu08-mc-3377 contra tumores IL-13-Ra2 positivos.
TABLA 20A GT= grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño Los datos en las Tablas 20b y 20c Indican que los ADC hu08-vc-0101 y hu08-mc3377 resultaron eficaces en un tercer modelo de xenoinjerto in vivo usando línea celular de cáncer de ovario HEY-C2. El grupo de control de vehículo y el grupo de control ADC negativo hIgG8.8-vc-0101 (3 mg/kg y 10 mg/kg) y hIgG8.8-mc-3377 (10 mg/kg) se terminaron debido a un tumor de gran tamaño, como se indicó con la designación GT. El tratamiento con hu08-vc-0101 y hu08-mc-3377 a niveles de dosis 1, 3 y 10 mg/kg, produjeron una repuesta dependiente de la dosis. Cinco entre nueve animales tratados con 3 mg/kg de hu08-vc-0101, y siete de nueve animales tratados con 10 mg/kg de hu08-vc-0101 sobrevivieron hasta la finalización del estudio (Día 103). De manera similar, cinco entre nueve animales tratados con 3 mg/kg de hu08-mc-3377, y nueve entre nueve animales tratados con 10 mg/kg de hu08-mc-3377 sobrevivieron hasta la finalización del estudio (Day 103).
TABLA 20B TABLA 20C GT = grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño EJEMPLO 17 Generación de imitantes de cisterna para conjugación específica de sitio Se realizó una conjugación específica de sitio de ligador-carga útil con anticuerpos para mejorar la carga del fármaco homogénea y evitar subpoblaciones ADC con fijación al antígeno alterada o farmacocinética alterada, frecuentemente observado mediante métodos de conjugación. Un método de conjugación específica de sitio es introducir residuos de cisteína en sitios específicos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo diana. Una cantidad de posiciones de aminoácidos en la cadena pesada constante y la cadena liviana constante se identificaron previamente (véase, solicitud de patente USSN 61/580.169) y se sustituyeron con un residuo de cisteína en la posición de aminoácido específica en el anticuerpo hu08vl.0/1.0. Todas las mutaciones de cisteína se construyeron mediante mutagénesis dirigida al sitio o PCR de superposición basado en pSMED-hu08vl.0 y pSEMN3-hu08vl.0. A continuación se muestra una lista de mutantes de cisteína derivados de hu08vl.0/1.0 y los números de SEQ ID respectivos (Tabla 21).
TABLA 21 EJEMPLO 18 Caracterización de mutantes de cisteína Los mutantes de cisteína de hu08vl.0/1.0 se expresaron tanto en cultivos celulares de suspensión HEK293 transfectados transitoriamente en medio de expresión 293 Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) o en acervos estables de cultivos celulares CHO. Los anticuerpos se aislaron del medio de cultivo celular mediante cromatografía de Proteína A (ProA) en condiciones estándares. Las fracciones de columnas se agruparon y se concentraron con un tubo giratorio Millipore equipado con una membrana MWCO 30,000. La proteína luego se cargó en una columna de exclusión por tamaño (Superdex 200) equilibrado con PBS-CMF, pH 7.2. Las fracciones pico se agruparon y se concentraron en un tubo giratorio Millipore equipado con una membrana MWCO 30,000 y, finalmente, se filtraron a través de un filtro de 0.22um. Los datos se muestran en la Tabla 22 de expresión transitoria y en la Tabla 23 de los acervos estables celulares CHO. hu08vl.0/1.0 de tipo silvestre y sus derivados de cisteína tienen rendimiento final y pureza comparables después de la captura de ProA, alcanzan una pureza de 99 % luego de SEC y permanecen estables luego de 2-3 ciclos de congelación y descongelación. Estos datos demuestran que los mutantes de cisteína mantienen el perfil de expresión y las propiedades de purificación, en comparación con hu08vl.0/1.0.
TABLA22 TABLA23 Propiedades de fijación de imitantes de cisterna de hu08yl.0/1.0 Las propiedades de fijación de los mutantes de cisteína a hIL-13-Ra2 se evaluaron mediante ELISA estándar y ELISA de competencia. Los resultados muestran que todos los mutantes de Cys tienen un ED50 similar en comparación con hu08vl.0/1.0 de tipo silvestre (Tabla 23). Esta conclusión se confirmó mediante ELISA de competencia con ch08 biotinilado. La Tabla 24 demuestra que todos los mutantes de Cys tienen un IC50 similar al hu08 de tipo silvestre, que indica que la afinidad de fijación es la misma que hu08 de tipo silvestre. ch07 se usó como control negativo.
TABLA24 Estabilidad termica de mutantes de cisteína de hu08yl.0/1.0 La estabilidad térmica del mAb mutante de cisteína anti-IL-13-Ra2 se analizó mediante Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) con un sistema Capillary-DSC de MicroCal equipado con un muestreador automático (Northampton, MA). Se utilizó un protocolo estándar. La diferencia de capacidad calórica entre la célula de muestra y la célula de referencia se registró y se analizó con un modelo sin dos estados en 3 transiciones térmicas en el software Origin7.0 (OriginLab, Northampton, MA). Un termograma de inicio también se generó con un tampón PBS, tanto en las células de muestra como en las de referencia, y se usó para la sustracción de cualquier sistema de calor que no se asocia a la desnaturalización de la proteína. Los resultados en la Tabla 25 muestran que 2 anticuerpos mutantes de cisteína simple y 3 dobles tienen Tms comparables con hu08vl.0/1.0 de origen.
TABLA25 Estabilidad termica de ADC mutante de cisteína de huQ8yl.0/1.0 Se conjugaron hu08vl.0/1.0 de tipo silvestre y 5 mutantes de cisteína con vc-0101, como se describe en la solicitud de patente provisional de los EE. UU. 61/580,169. La estabilidad térmica de todos los ADC se midió mediante Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, véase detalles precedentes). Como se muestra más abajo en la Tabla 26, el Tml del conjugado vc-0101 hu08vl.0/1.0 de tipo silvestre es significativamente menor (> 5°C) que su anticuerpo desnudo (véase Tabla 8). El Tm2 del ADC es alrededor de 1-2°C menor que el anticuerpo desnudo, mientras que el Tm3 es comparable. En cuanto a los mutantes de cisteína de hu08vl.0/1.0, Tml, Tm2 y Tm3 de los conjugados vc-0101 son similares o levemente inferiores a (< 1-2°C) sus anticuerpos desnudos correspondientes (véase, Tabla 25). Esto indica que los mutantes de cisteína presentan una estabilidad térmica mayor que el anticuerpo de tipo silvestre luego de la conjugación.
TABLA 2$ Estabilidad de plasma v alutatión de mutantes de cisteína de hu08yl.0/1.0 conjugados con vc-0101 Preparación de la muestra para la estabilidad de GSH: 30pg de un ADC hu08-vc-0101 o un ADC hu08-cys mutante-vc-0101 en PBS se mezclaron con una solución de glutatión (GSH) para producir una concentración final de 0.5 mM de GSH. El ADC en 0.5 mM de GSH y el ADC de control (0 mM de GSH) se incubaron a 37 °C y se tomaron muestras en los días 0, 3 y 6. Se usó TCEP (£r/s(2-carboxietil)fosfina) para la reducción.
Preparación de muestra para estabilidad de plasma de ratón: La muestra de 90pg de ADC en PBS se mezcló con plasma de ratón, diluido 1:1 con 20 % de MPER (Reactivo de Extracción de Proteínas Mamíferas). Las muestras de ADC/plasma se incubaron a 37 °C, y las alícuotas se tomaron en los días 0, 1 y 2, y se sometieron a ¡nmunoprecipitación con proteína hIL-13-Ra2 recombinante blotinilada. Los ADC se eluyeron con 0.15 % de solución de ácido fórmico y se neutralizaron con amortiguador Tris HCI concentrado a pH 7.8. Las muestras se deglucosilaron con la adición de PNGaseF (Péptido: N-Glucosidasa F) y se redujo con TCEP.
Procedimiento del análisis LC/MS: Las alícuotas de las muestras de estabilidad de ADC/plasma y ADC/GSH se acidificaron con la adición de 0.1 % de solución de ácido fórmico con 10 % de acetonitrilo, y luego se realizó el análisis LC/MS mediante un HPLC de barrido Agilent 1100 acoplado con un espectrómetro de masa Water Xevo G2 Q-TOF. Los analitos se cargaron en una columna Zorbax Poroshell 300SB C8 (0.5 mm X 75 mm, mantenida a 80 °C) con 0.1 % de ácido fórmico y se eluyeron con un gradiente de 20-40 % amortiguador B (80 % acetonitrilo, 18 % 1-propanol, 2% agua con 0.1 % de ácido fórmico) a una velocidad de flujo de 20pl/min durante 5.5 minutos. La detección de espectrometría de masa se realizó en modo de sensibilidad positivo con voltaje capilar en 3.3 kV. El análisis de datos se realizó con la función MaxEnt 1 en MassLynx y se usaron intensidades para el cálculo de la carga según la fórmula siguiente: Carga =2*[LC1/(LC0+LC1)]+2*HC1/(HC0+HC1+HC2)]+4*HC2/(HC0+HC1+HC2)].
Los ADC de hu08 y sus mutantes de cys conjugados con vc-0101(de la Tabla 26) se sometieron a ensayo de estabilidad de plasma y GSH. Los resultados demuestran que los ADC derivados de mutantes de cisteína son más estables que los ADC derivados de la teenología de conjugación convencional (Tabla 27).
TABLA 27 EJEMPLO 19 Ensayo de citotoxicidad in vitro de los APC mutante de cvs Las líneas celulares que expresan el antígeno IL-13-Ra2 o la línea celular IL-13-Ra2 negativa, H460, se cultivaron con concentraciones crecientes de mutantes de cisteína de hu08vl.0/1.0 conjugados con vc-0101 o mc-3377. Luego de cuatro días, se evaluó la viabilidad de cada cultivo. Se calcularon los valores IC50 mediante regresión no lineal logística y se presentaron en ng/mL (Tablas 28a y 28b).
TABLA 28a TABLA 28B EJEMPLO 20 Modelos de xenomierto subcutáneo de ADC mutante de cvs Los ratones femeninos atímicos (Nude) se inyectaron por vía subcutánea con células tumorales PC3MM2. Ratones con tumores desarrollados, aproximadamente 0.2 a 0.5 g (n = 8 a 10 ratones/grupo de tratamiento) recibieron administración de una dosis única a 1.5 o 4.5 mg/kg por vía Intravenosa con salina normal (vehículo) mutantes de cisteína L443C-vc-0101, K392C/L443C-vc-0101, L443C/K183C-vc-0101, Q347C-VC-0101, o hAB-vc-0101, o 3, 6, y 12 mg/kg L443C-mc-3377, K392C/L443C-mc-3377, L443C/K183C-mc-3377. Todos los ADC se dosificaron según el contenido de Ab. Los tumores se midieron al menos una vez a la semana, y su tamaño (mm3 ± SEM) se calculó como mm3 = 0.5 x (ancho de tumor2) x (longitud del tumor).
Los datos en la Tabla 29 Indican que L443C-vc-0101, K392C/L443C-vc-0101, L443C/K183C-vc-0101 y hu08-vc-0101, tanto en 1.5 mg/kg como en 4.5 mg/kg, todos inhiben el crecimiento de xenolnjertos PC3MM2 en comparación con el grupo de control de vehículo. L443C/K183-vc-0101 es el compuesto más potentes probado en el experimento, como se Indica con el mayor tiempo de monltoreo en el Día 70 antes de la terminación del grupo a nivel de dosis de 4.5 mg/kg.
TABLA 29 GT= grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño Los datos en la Tabla 30 Indican que Q347C-vc-0101 y Q347C/K183C-vc-0101 inhiben el crecimiento de los xenoinjertos PC3MM2 en 1.5 mg/kg y 4.5 mg/kg, en comparación con el grupo de control de vehículo. Además, los datos demuestran que hu08MAC-0101 inhibe el crecimiento de los xenoinjertos PC3MM2 en 1.5 mg/kg en comparación con el grupo de control de vehículo. El compuesto más potente fue Q347C/K183C-vc-0101, como se indica en el nivel de dosis de 4.5 mg/kg, con el mayor tiempo de monitoreo en el Día 77. Estos resultados muestran que los conjugados vc-0101 específico de sitio son comparables o presentan una eficacia mayor que los conjugados de hu08-vc-0101 de tipo silvestre.
TABLA 30 GT= grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño Los datos en las Tablas 31A y 31B Indican que L443C-mc-3377, K392C/L443C-mc-3377, L443C/K183C-mc-3377 y hu08-mc-3377 ocasionaron regresión tumoral de manera dependiente de la dosis en comparación con el grupo de control de vehículo. L443C/K183C-mc-3377 resultó el compuesto más potente probado en el experimento como se indica con el tamaño de tumor pequeño promedio a 12 mg/kg de nivel de dosis en comparación con otros compuestos. Además, se observaron 6 entre 8 animales sin tumores medlbles del grupo tratado con L443C/K183C-mc3377 a 12 mg/kg en el Día 60.
TABLA 31A GT= grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño TABLA 31B GT= grupo terminado debido a un tumor de gran tamaño EJEMPLO 21 Conjugación específica de sitio con teenología MAC Un método para preparar un conjugado de anticuerpos multifuncionales (MAC) que comprende un anticuerpo o un fragmento de fijación el antígeno de este se describió anteriormente (WO2012/007896 y USSN 61/584,675). Un aspecto de la presente invención es un método para preparar un MAC usando un anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este, que se fija específicamente a IL-13Ra2 humano, en donde el anticuerpo tiene la mutación D185A en la posición 185 de la LC, como se muestra en SEQ ID NO: 52, y el anticuerpo está conjugado en forma covalente con al menos una porción fármaco, mediante un ligador unido a una cadena lateral de K188 de la LC de SEQ ID NO:49. El método comprende unir en forma covalente la porción fármaco usando un éster de PFP (pentafluorofenilo) y hacer reaccionar el complejo porción efectora-ligador-grupo saliente, formado de este modo con el anticuerpo a una relación molar de entre alrededor de 3.5:1 a alrededor de 4.5:1 de porción fármaco:anticuerpo. En algunos aspectos, la relación molar es de alrededor de 3.7:1 a alrededor de 4.3:1. El MAC descrito en la presente se denomina hu08MAC-0101, y comprende la mutación D185A de la LC de SEQ ID NO: 52; y la porción fármaco 0101 (Ejemplo 13), que se conjuga con la cadena lateral del residuo de lisina en la posición 188 (K188) de la LC de SEQ ID NO: 52. La actividad ¡n vitro de hu08MAC-0101 se muestra en la Tabla 17 (Ejemplo 15). La actividad in vivo en el modelo de xenoinjerto PC3MM2 se muestra en la Tabla 30 (Ejemplo 20).

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena liviana que comprenden (a) una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 1; y una región variable de la cadena liviana que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 5; (b) una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 48; y una región variable de la cadena liviana que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 41.
2. Un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este que se fija, específicamente, a IL-13-Ra2 humano, en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 2; una CDR2 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 3; una CDR3 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 4; una CDR1 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 6; una CDR2 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 8; o (b) una CDR1 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 10; una CDR2 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 11; una CDR3 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 12; una CDR1 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 14; una CDR2 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 15 y una CDR3 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 16.
3. El anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho anticuerpo aislado en (a) también comprende una región variable de la cadena pesada déla secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y dicho anticuerpo aislado en (b) también comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48.
4. El anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado además porque dicho anticuerpo aislado en (a) también comprende una región variable de la cadena liviana de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, y dicho anticuerpo aislado en (b) también comprende una región variable de la cadena liviana de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41.
5. El anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 50 o 52.
6. El anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 51 o 53.
7. Un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un agente citotóxico conjugado con el anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un conjugado anticuerpo y fármaco de la fórmula: Ab-(L-D) en donde (a) Ab es un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y (b) L-D es una porción ligador-fármaco, en donde L es un ligador y D es un fármaco.
9. El conjugado anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque L se selecciona del grupo que consiste en ve, me y MalPeg.
10 El conjugado anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque D se selecciona del grupo que consiste en 0101, 3377, 0131, 6121, 3906, 6780 y 8261.
11. El conjugado anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque L-D se selecciona del grupo que consiste en vc-0101 y mc-3377.
12. El conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado además porque Ab comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena liviana que comprenden: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 1; y una región variable de la cadena liviana que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 5, o (b) una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 48; y una región variable de la cadena liviana que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 41.
13. El conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado además porque Ab comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena liviana que comprenden: (a) una CDR1 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 2; una CDR2 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 3; una CDR3 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 4; una CDR1 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 6; una CDR2 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 8; o (b) una CDR1 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 10; una CDR2 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 11; una CDR3 de la cadena pesada, que comprende SEQ ID NO: 12; una CDR1 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 14; una CDR2 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 15 y una CDR3 de la cadena liviana, que comprende SEQ ID NO: 16.
14. Un conjugado de anticuerpo y fármaco de la fórmula: Ab-(L-D) en donde (a) Ab es un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y (b) L-D es una porción ligador-fármaco de vc-0101.
15. Un conjugado de anticuerpo y fármaco de la fórmula: Ab-(L-D) en donde (a) Ab es un anticuerpo aislado o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y (b) L-D es una porción ligador-fármaco de mc-3377.
16. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 y un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
17. El conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 7 a 15 para usarse en el tratamiento de un cáncer que expresa IL-13-Ra2.
18. El uso de un conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 7 a 15 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que expresa IL-13-Ra2.
19. El conjugado de anticuerpo y fármaco para usarse como el que se reclama en la reivindicación 17, o el uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, de colon, de estómago, de páncreas, de ovario, gliomas malignos y melanoma.
20. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1 a 6.
21. Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20.
22. Una célula huésped que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 21.
23. Un proceso para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 22 y recuperar el anticuerpo de un cultivo celular.
24. Un proceso para producir un conjugado de anticuerpo anti-IL-13-Ra2 y fármaco de conformidad con la reivindicación 8, que comprende: (a) ligar un ligador seleccionado del grupo que consiste en ve, me y MalPeg al fármaco; (b) conjugar dicha porción ligador-fármaco con el anticuerpo recuperado del cultivo celular de conformidad con la reivindicación 23; y, (c) purificar el conjugado de anticuerpo y fármaco.
25. Un anticuerpo aislado que compite con un anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para fijarse específicamente a IL-13-Ra2 humano.
26. Un método para predecir si un sujeto con cáncer responderá a un conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 que comprende determinar si una muestra biológica de dicho cáncer del sujeto expresa IL-13-Ra2 humano, en donde la expresión de IL-13-Ra2 humano indica que el sujeto responderá.
27. Un proceso para determinar el nivel de IL-13-Ra2 humano en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra de un sujeto que se sospecha que padece cáncer con un anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; (b) determinar los niveles de superficie celular de IL-13-Ra2 humano en dicha muestra; y (c) comparar los niveles de superficie celular de IL-13-Ra2 humano con los de un sujeto de referencia o estándar.
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