MX2014010953A

MX2014010953A - Metodos para tratamiento de melanoma con inhibidores pak1.

Info

Publication number: MX2014010953A
Application number: MX2014010953A
Authority: MX
Inventors: Klaus P Hoeflich; Adrian M Jubb; Hartmut Koeppen; Christy C Ong
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2014-10-13
Also published as: RU2014141018A; EP2844248A1; JP2015511598A; BR112014020173A8; CN104168898A; BR112014020173A2; WO2013135745A1; KR20140135198A; CA2860994A1; HK1200093A1

Abstract

La presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de melanoma utilizando un inhibidor PAK1. En algunas modalidades, PAK1 se sobreexpresa y/o amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre.

Description

MÉTODOS PARA TRATAMIENTO DE MELANOMA CON INHIBIDORES PAKl El melanoma maligno representa aproximadamente 80 por ciento de muertes por cáncer de piel. Aunque el melanoma es quirúrgicamente curable cuando se descubre en las etapas tempranas, diseminación regional y sistémica de la enfermedad considerablemente empeora el pronóstico con sólo 14% de pacientes de melanoma metastásico que sobreviven por cinco años (American Cáncer Society. Cáncer facts & figures, 2011) . La ruta de proteina quinasa activada con mitógeno (MAPK) se ha elucidado recientemente como una ruta de crecimiento crítica en varios subtipos de melanoma (López-Bergami P. Pigment Cell Melanoma Res. 2011, 24 (5) : 902-921) . Por ejemplo, de un análisis acumulado de datos de 4493 pacientes, la ocurrencia de BRAF (homólogo oncogén viral de sarcoma murino v-Raf Bl) es 41% en melanomas cutáneos (Lee JH, et al., Br J Dermatol. 2011, 164 (4) : 776-784) . La más frecuente mutación somática BRAF en melanoma maligno es sustitución de valina en el residuo 600 para conferir actividad catalítica constitutiva y señalización (Davies H, et al., Nature. 2002; 417(6892), 949-954.). Estudios genéticos han confirmado que BRAF se requiere para inicio y mantenimiento de melanoma en sistemas de modelo preclínico (Davies H, et al., 2002, ibid; Hoeflich KP, et al., Cáncer Res. 2006, 66 (2) : 999-1006 ; Dankort D, et al., Genes Dev. 2007, 21 (4) : 379-3844-6) . Estos descubrimientos impulsaron una oleada de actividad de descubrimiento de fármacos para desarrollar inhibidores de molécula pequeña de BRAF, incluyendo GDC-0879, PLX-4720, PLX-4032/vemurafenib (Zelboraf™) y GSK2118436 (Hoeflich KP, et al., Cáncer Res. 2009, 69 (7) : 3042-3051;Tsai J, et al., Proc Nati Acad Sci U.S. A. 2008, 105 (8 ): 3041-3046 ; Bollag G, et al., Nature 2011, 467 (7315) : 596-599 ; Ribas A, & Flaherty KT. , Nature Rev. 2011, 8 (7) :426-433) . Éstos inhibidores disminuyen selectivamente el crecimiento de células de tumor adictas a oncogén BRAF y proporcionan esperanza para pacientes con el subconjunto de melanoma que tiene mutaciones activantes en el oncogén BRAF (Ribas A, & Flaherty KT. , 2011, ibid) . Sin embargo, significativamente menos eficacia antitumor con actuales inhibidores de molécula pequeña BRAF se observa para células de melanoma BRAF de tipo silvestre (Hoeflich KP, et al., 2009, ibid: 3042-3051,-Tsai J, et al., ibid) , haciendo surgir la necesidad por identificar genes impulsores asociados con melanoma adicionales para promover nuevos conocimientos en la biología, señalización oncogénica y posibles agentes terapéuticos para manejo de enfermedad de pacientes de melanoma de todas las clasificaciones.

La familia RAF quinasa comprende tres miembros, ARAF, BRAF y CRAF, que juegan un papel ivotal para transducir señales en la ruta de señalización MAPK canónica de RAS a quinasas corriente abajo, MEKl/2 y ERKl/2. Sin embargo, quinasas adicionales se han reportado que también juegan un papel en la activación ERK. En particular, se han reportado varios grupos que agrupan-I quinasas activadas p21 (PAKs) contribuyen a activación de ruta MAPK por fosforilación tanto de CRAF en Ser338, un residuo crítico de activación y MEK1 a Ser298, un sitio que es próximo a los residuos bucle de activación Ser217/Ser221 que son sustratos para RAF quinasas (King AJ, et al., Nature. 1998; 396(6707), 180-183; Tang Y, et al., Mol Cell Biol. 1999, 19(3): 1881-1891; Frost JA, et al., EMBO J. 1997, 16 (21) : 6426-6438) . La comunicación de ruta entre la señalización de ruta PAKs y MAPK en células epiteliales puede ser inducida por una variedad de condiciones, incluyendo estímulo de factor de crecimiento y adhesión celular a la matriz extracelular (Slack-Davis JK, et al., J Cell Biol. 2003, 162 (2 ): 281-291 ; Zang M, et al., J Biol Chem. 2001, 276 (27) : 25157-25165 ; Beeser A, et al., J Biol Chem. 2005, 280 (44) : 36609-36615) . Como un efector mayor corriente abajo de las GTPasas pequeñas de familia Rho Cdc42 y Racl, PAK1 también juega un papel fundamental para vincular señales extracelulares con cambios en organización de citoesqueleto actina, forma de célula y dinámicas de adhesión (Arias-Romero LE, & Chernoff J. , Biology Cell. 2008, 100 (2) : 97-108 ; Kumar R, et al., Nat Rev Cáncer 2006, 6 (6) :459-471; Ong CC, et al., Oncotarget . 2011, 2 (6) : 491-496) . PAK1 se expresa ampliamente en una variedad de tejidos normales y la expresión se incrementa significativamente en cánceres de mama y pulmón (Holm C, et al., J Nati Cáncer Inst. 2006, 98 (10) : 671-680 ; Arias-Romero LE, et al., Oncogene 2010, 29 (43 ): 5839-5849 ; Ong CC, et al., Proc Nati Acad Sci U.S.A. 2011, 108 (17) : 7177-7182) . Estudios funcionales también han sido implicados en transformación de célula PAK1 (Vadlamudi RK, et al., J Biol Chem. 2000, 275 (46) :36238-36244) y crecimiento de tumor (Ong CC, et al., 2011, ibid; Yi C, et al., Cáncer Res. 2008, 68 (19) : 7932-7937 ; Chow HY, et al., PloS One 2010, 5 ( 11) : el3791) . Estos hallazgos indican que PAK1 puede contribuir a tumorigenesis en ciertos contextos de enfermedad.

La presente invención se refiere a métodos para tratar un melanoma en un individuo, que comprenden contactar el melanoma con una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAK1. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, PAK1 se sobreexpresa en el tumor en comparación con células de piel no cancerosas. En algunas modalidades, PAK1 se amplifica en el tumor. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre, en donde PAK1 se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAK1 se sobreexpresa en el melanoma y PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, PAK1 se sobreexpresa en el melanoma y PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF mutante. En algunas modalidades, el individuo es un humano. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un melanoma en un individuo, que comprenden poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1, en donde el inhibidor PAK1 es una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polipéptido. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un melanoma en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1, en donde el inhibidor PAK1 es una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polipéptido.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un melanoma en un individuo, que comprenden poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1 en donde el inhibidor PAK1 se emplea en combinación con un agente terapéuti<3 .^ En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un melanoma en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl en donde el inhibidor PAKl se emplea en combinación con un agente terapéutico.

En algunos aspectos, la invención proporciona usos de inhibidores PAKl para el tratamiento de melanoma en un individuo. La invención proporciona usos de inhibidores PAKl en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el tumor en comparación con células de piel no cancerosas. En algunas modalidades, PAKl se amplifica en el tumor. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre, en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF mutante . En algunas modalidades, el individuo es un humano.

En algunos aspectos, la invención proporciona composiciones y equipos que comprenden un inhibidor PAKl para utilizar en el tratamiento de melanoma. Diversas modalidades referentes a estos métodos de tratamiento se describen aquí y aplican a composiciones y equipos. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el tumor en comparación con células de piel no cancerosas. En algunas modalidades, PAKl se amplifica en el tumor. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF mutante. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para inhibir señalización CRAF y/o señalización MEK en un melanoma en un individuo, que comprenden poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva del inhibidor PAKl. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el tumor y en comparación con células de piel no cancerosas. En algunas modalidades, PAKl se amplifica en el tumor. En algunas modalidades, PAK1 se sobreexpresa en el tumor en comparación con células de piel no cancerosas. En algunas modalidades, PAK1 se amplifica en el tumor. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAK1 se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF mutante. En algunas modalidades, el individuo es un humano. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl que comprende determinar el genotipo BRAF del melanoma, en donde el melanoma que comprende un BRAF de tipo silvestre indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl que comprende determinar la expresión de PAKl en el melanoma, en donde la sobreexpresión de PAKl en el melanoma en comparación con células de piel no cancerosas indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl, que comprende determinar el número de copias de PAKl en el melanoma, en donde la amplificación de PAKl en el melanoma indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl, que comprende determinar el genotipo BRAF del melanoma y determinar la expresión de PAKl en el melanoma, en donde la presencia de un BRAF de tipo silvestre y/o la sobreexpresión de PAKl en el melanoma en comparación con células de piel no cancerosas, indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl, que comprende uno o más de determinar el genotipo BRAF de melanoma, determinar la expresión de PAKl en el melanoma, y determinar el número de copia de PAKl en el melanoma, en donde uno o más de la presencia de un BRAF de tipo silvestre, la sobreexpresion de PAKl en el melanoma en comparación con células de piel no cancerosas y amplificación de PAKl en el melanoma, indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl .

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar un paciente de melanoma humano con un inhibidor PAKl que comprende: (a) seleccionar un paciente con base en el genotipo BRAF del melanoma, en donde un melanoma que comprende un BRAF de tipo silvestre indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar a un paciente con melanoma humano con un inhibidor PAKl que comprende: (a) seleccionar un paciente con base en el nivel de expresión de PAKl del melanoma, en donde una sobreexpresion de PAKl en el melanoma en comparación con células no cancerosas indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar a un paciente de melanoma humano con un inhibidor PAKl que comprende: (a) seleccionar un paciente con base en el número de copias de PAKl en el melanoma, en donde la amplificación de PAKl en el melanoma indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para el tratamiento de un paciente con melanoma humano con un inhibidor PAKl, que comprenden: (a) seleccionar un paciente con base en el genotipo BRAF del melanoma y nivel de expresión PAKl del melanoma, en donde un melanoma que comprende un BRAF de tipo silvestre y/o sobreexpresión de PAKl en el melanoma en comparación con células no cancerosas, indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl .

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratamiento de un paciente con melanoma humano con un inhibidor PAKl, que comprenden: (a) seleccionar un paciente con base en uno o más de los genotipos BRAF de melanoma, nivel de expresión PAKl de melanoma y número de copia de PAKl en el melanoma, en donde un melanoma comprende uno o más de BRAF de tipo silvestre, sobreexpresión de PAKl en el melanoma en comparación con células no cancerosas y amplificación de PAKl, indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para ajustar el tratamiento de melanoma en un paciente que se somete a tratamiento con un inhibidor PAKl, el método comprende estimar la expresión de PAKl en el melanoma, en donde la sobreexpresión de PAKl en el melanoma indica que el tratamiento del individuo se ajusta hasta que la sobreexpresión de PAKl no es más detectada. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma de tipo silvestre y PAKl se amplifica en el melanoma.

La Figura 1A-1C muestra que PAKl se expresa altamente en melanoma humano. (Fig.lA) Análisis de ganancias de número de copias llql3 en tejidos de melanoma humano. La línea roja vertical representa ubicación de cromosoma del gen PAKl. (Fig.lB) DNA copia PAKl y expresión de mRNA (de señal 226507_at Affymetrix MAS 5.0) correlacionado para muestras de tumor de melanoma. (FIG.1C) Imágenes representativas de inmunohistoquímica PAKl en melanomas malignos humanos primarios. Calificación de expresión citoplásmica : 0 (I), 1 (II) , 2 (III) y 3 (IV) . Deposición de cromógeno indica inmunoreactividad contra una contratinción de hematoxilina. Expresión de PAKl también se ve en células estromales (III) y células que intercalan dentro de la epidermis que pueden representar células de Langerhan (IV) .

La Figura 2A-2D demuestra que PAK1 juega un papel crítico para proliferar células de melanoma de tipo silvestre BRAF. (Fig.2A) Proliferación de células de melanoma después de transfección con siR A oligonucleótido se midió por el ensayo de consumo Cell TiterGlo ATP. PAK1 se requiere para crecimiento celular y los datos se normalizaron para control y muestran como el promedio + SD. (Fig.2B) En un panel de lineas de células de melanoma, inhibición PAK1 deteriora selectivamente el crecimiento de células sin mutación BRAF(V600E) (n = 5; 537 EL, HS940T, MeWO, SK-MEL2 , SK-MEL23 , SK-MEL30) en comparación con aquellos con mutación BRAF(V600E) (n = 9; p = 0.07; 624 EL, 888MEL, 928 EL, RPMI-7951, A375, Colo829, LOX-IMVI, Malme-3M, A375) . (FÍg.2C) Inhibición de PAKl/2 disminuye la fosforilación ERK1/2 y MEK1/2 y acumulación de ciclina DI. (Fig.2D) Inhibición PAKl/2 en células de melanoma de tipo silvestre SK-MEL23 BRAF disminuye la señalización al citoesqueleto, MAPK, proliferación y rutas NF- ? como se determina mediante un análisis de matriz de proteína de fase inversa (RPPA) . Los resultados de RPPA normalizado se presentan como promedio, + SD. siNTC = siRNA de control sin diana, si RAS = siRNA específico de NRAS, siPAKl = siRNA específico PAK1, ????1 = deleción cromosomal del gen PAK1.

La Figura 3A-3E ilustra una serie de inmuno transferencias que demuestran que PAK1 se requiere para activación CRAF en células de melanoma de tipo silvestre BRAF. (Fig.3A) siRNA oligonucleótidos de control -PAK1 y -PAK2selectivo o sin diana (NTC) se transfectaron en células de melanoma SK-MEL23 y 537MEL. Después de 48 h, proteínas MEKl endógenas (Fig.3A), MEK2 (Fig.3B) o CRAF (Fig.3C) se inmuno precipitaron y los complejos se inmuno transfirieron para detectar la fosforilación de residuos críticos para la activación catalítica. Total de niveles de proteína en los inmuno complejos también se determinó como controles de carga. (Fig.3D) Células se trataron con DMSO o PF-3758309 5 µ? por 4 h y CRAF endógeno se inmuno precipitó y inmuno transfirió para fosforilación Ser338. Total de niveles CRAF en los inmuno complejos también se ilustra. (Fig.3E) células SK-MEL23 se trataron con DMSO, PF-3758309 5 µ? o IPA-3 20 µ? por 4 h. Inmuno complejos CRAF se incubaron con proteína MEKl inactiva en amortiguador quinasa por 30 minutos. Niveles de fosfo-MEKl (Ser217/Ser221) se determinaron y actividad catalítica CRAF se reporta como los niveles de fosforilación MEKl normalizadas a total de proteínas CRAF.

La Figura 4A-4B contiene imágenes que demuestran que PAK se requiere para migración de células de melanoma. Después de control sin diana (NTC) o transfección oligonucleótido PAKl/2 siRNA por 72 h, células de melanoma WM-266-4 confluentes se lesionaron y se registraron imágenes cuando se realizaron las heridas (sombreo obscuro) y después de incubación por 28 h (campo brillante) . Diferencias en densidad de herida relativa fueron significativas estadísticamente (p < 0.001; n=3) .

La Figura 5A-5B ilustra una serie de inmuno transferencias que demuestran sensibilidad diferencial in vitro de señalización MAPK en células de melanoma BRAF de tipo silvestre y BRAF (V600E) tratadas con inhibidores PAK. (Fig.5A) células SK-MEL23 y A375 se trataron con DMSO, PF-3758309 5 µ? o PLX-4720 0.2 µ? por 4 h y lisados se analizaron para fosforilación de componentes de ruta MAPK. Exposiciones más ligeras y más obscuras de inmuno transferencias p-MEKl/2 (S217/S221) se muestran. (Fig.5B) Expresión ectópica PAK1 de etiquetada con epítopo Flag dirigió la activación de ruta MAPK en células A375. Especificidad se demostró utilizando tratamiento con un inhibidor PF-3758309 como un control.

La Figura 6A-6B ilustra una serie de gráficas que demuestran viabilidad disminuida de células de melanoma de tipo silvestre BRAF debido a tratamiento con inhibidores PAK en-casa. Inhibición catalítica de PAK1 por tratamiento de I-007, 1-054, 1-087 y PF-3758309 se probó in vitro utilizando (Fig.6A) SK-MEL23 y (Fig.6B) células 537MEL utilizando un ensayo de viabilidad Cell TiterGlo (Promega) de 4 -días.

La Figura 7A-7B muestra la sensibilidad diferencial in vivo de señalización MAPK debido a inhibición PAK en modelos de ratón de tumor-xenoinj erto de melanoma BRAF de tipo silvestre y BRAF (V600E) . (Fig.7A) Respuesta farmacodinámica de tumores mutantes y de tipo silvestre BRAF medidos por fosforilación de CRAF (Ser338) siguiendo ya sea administración de vehículo o 35 mg/kg de PF-3758309. (Fig.7B) Eficacia de anti-tumor de 10, 15 y 25 mg/kg de PF-3758309 i.p. diariamente de dosificación en el modelo de tumor pre-clínico SK-MEL23 de melanoma de tipo silvestre BRAF.

La Figura 8A-8B ilustra una serie de gráficas que demuestran datos de tumor individuales para el modelo de tumor pre-clínico SK-MEL23 de melanoma de tipo silvestre BRAF. (Fig.8A) Inhibición de crecimiento de tumor y (Fig.8B) pérdida de peso corporal se muestran para animales tratados con 10, 15 y 25 mg/kg de PF-3758309. Para analizar la medición repetida de volúmenes de tumor de los mismos animales con el tiempo, splines de regresión cubica se emplearon para ajustar a un perfil no lineal a los cursos de tiempo de volumen de tumor log2 en cada nivel de dosis. Estos perfiles no lineales después se relacionaron con dosis dentro del modelo mixto. Splines de regresión cúbica se emplearon para ajustar un perfil no lineal a los cursos de tiempo de volumen de tumor log2 en cada nivel de dosis. Estos perfiles no lineales después se relacionaron a dosis dentro del modelo mixto. Inhibición de crecimiento de tumor como un porcentaje de Vehículo (% TGI) se calcula como el porcentaje del área bajo la curva ajustada (AUC) para el grupo de dosis respectivo por día en relación al vehículo, utilizando la fórmula: %TGI = 100 x (1 - AUCdose/AUCveh) · El trazo de realizó y generó utilizando R versión 2.8.1 y Excel, versión 12.0.1 (Microsoft). Los datos se analizan utilizando R versión 2.8.1 (R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria) , y los modelos mixtos se ajustaron dentro de R utilizando el paquete nlme, versión 3.1-89.

La Figura 9 muestra inmuno transferencias que demuestran diferentes respuestas farmacodinámicas de tumores de tipo silvestre BRAF tratados ya sea con inhibidor G945 BRAF o PF-3758309. Fosforilación de CRAF(Ser338) se determina para tumores de xenoinjerto SK-MEL23 después de administración de cualquiera de 35 mg/kg de PF-3758309 i.p. o 10 mg/kg de G945 (inhibidor BRAF) compuestos p.o. Tumores se recolectaron 1 hora posterior a dosis y congelaron en forma instantánea. Cada carril representa lisado de tumor de un ratón de xenoinjerto individual.

La Figura 10A-10B es un diagrama que ilustra el mecanismo de acción para PAK1 en el melanoma de tipo silvestre BRAF. (Fig.lOA) en el contexto de mutación oncogénica, BRAF dirige fuertemente la activación de la ruta de señalización MAPK y estas células de tumor son sensibles a inhibición de está quinasa. (Fig.lOB) En melanomas en donde BRAF no se muta, expresión elevada y amplificación genómica de PAKl es frecuente y resulta en señalización incrementada a CRAF-MEK-ERK y potencialmente en las rutas efectoras adicionales. Este subconjunto de melanoma es relativamente insensible a inhibición BRAF y la capacidad proliferativa depende de PAKl .

La presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de melanoma en un individuo, que comprende contactar al melanoma con una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAKl. La invención también proporciona estos métodos de tratamiento que comprenden administrar al individuo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAKl. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas. En algunas modalidades, PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre y sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre, el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas y PAKl se amplifica en el melanoma.

Todas las referencias aquí citadas, incluyendo solicitudes de patentes, publicaciones de patentes y números - - de Acceso Genbank aquí se incorporan por referencia, como si cada referencia individual se indicara en forma específica e individual por referencia.

Definiciones Las técnicas y procedimientos descritos o referidos aquí en general son bien comprendidos y comúnmente empleados utilizando metodología convencional por aquellos con destreza en la técnica, tales como por ejemplo, las metodologías ampliamente empleadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds . , (2003)); la serie METHOD IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lañe, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CÉLULA CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Síntesis de Oligonucleótidos (M. J. Gait, ed. , 1984) ; Method in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Célulais, ed. , 1998) Academic Press; Animal Célula Culture (R. I. Freshney), ed. , 1987); Introducción a Célula y Cultivo de Tejido (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press ; Procedimientos de Laboratorio de Cultivo de Tejido y Célula (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley y Sons; Handbook of Experimental Immunology - - (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds . ) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Células (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al. , eds . , 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty. , ed. , IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Utilizando Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995) ; y Cáncer: Principies and Practice de Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

A menos que se defina de otra forma, términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad a la cual pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary de Microbiology y Molecular Biology 2nd ed. , J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994) , y March, Advanced Organic Chemistry Reacciones, Mechanisms and Structure 4th ed. , John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992) , proporcionan a una persona con destreza en la técnica con una guía general pera muchos de los términos - - empleados en la presente solicitud.

"PAK," como se emplea aquí, se refiere a una familia de serina/treonina proteína quinasas (STKs) no receptoras. La familia proteína quinasa proteína (PAK) activada p21 de serina/treonina proteína quinasas juega papeles importantes en organización de citoesqueleto, morfogénesis celular, procesos celulares y supervivencia celular (Daniels et al., Trends Biochem. Sci . 1999 24: 350-355; Sells et al., Trends Cell. Biol. 19977: 162-167). La familia PAK consiste de seis miembros subdividos en dos grupos: PAK 1-3 (grupo I) y PAK 4-6 (grupo II) que se distinguen con base en homologías de secuencia y la presencia de una región auto inhibitoria en PAKs del grupo I. Quinasas p21- activadas (PAKs) sirven como mediadores importantes de función Rae y Cdc42 GTPase al igual que rutas requeridas para tumorigénesis dirigida por Ras-. (Manser et al., Nature 1994 367:40-46; B Dummler et al., Cáncer Metathesis Rev. 2009 28:51-63; R. Kumar et al., Nature Rev. Cáncer 2006 6:459-473) .

"PAK1" o "quinasa activada por proteína p21-activada (Cdc42/Rac) -1" como se emplea aquí, se refiere a una PAK1 nativa de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratas y ratones) , a menos que se indique de otra forma. Los términos abarcan la ubicación - - genómica (por ejemplo Ilql3-ql4 banda citogenética, cromosoma 11:77033060-77185108, y/o GC11M077033 ) , "longitud íntegra", PAKl no procesado así como cualquier forma de PAKl que resulta en procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de PAKl, por ejemplo variante de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de ácidos nucleicos PAKl humano ejemplar es NC_000011.9. Una secuencia de aminoácidos PAKl humano ejemplar es NP_0011220921 o NP_002567.3. La secuencia de ácidos nucleicos PAKl de ratón ejemplar es NC_000073.6 o una secuencia de aminoácidos PAKl de ratón ejemplar NP_035165.2. La secuencia de ácidos nucleicos PAKl de rata ejemplar es NC_005100.2 o una secuencia de aminoácidos PAKl de rata ejemplar NP_058894.1. La secuencia de ácidos nucleicos PAKl de perro ejemplar es NC_006603.3 o una secuencia de aminoácidos PAKl de perro ejemplar XP_849651.1. La secuencia de ácidos nucleicos PAKl de vaca ejemplar es AC_000186.1 o NC_007330.5. Una secuencia de aminoácidos PAKl de vaca ejemplar es NP_001070366.1. La secuencia de ácidos nucleicos PAKl de mono rhesus ejemplar es NC_007871.1. Una secuencia de aminoácidos PAKl de mono rhesus ejemplar es XP_001090310.1 o NP_001090423.2. La secuencia de ácidos nucleicos PAKl de pollo ejemplar es NC_006088.3 o una secuencia de aminoácidos PAKl de pollo ejemplar NP_001155844.1 "BRAF" o "Serina/treonina-proteína quinasa B-Raf", como se emplea - - aquí, como se emplea aquí se refiere a un BRAF nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratone y ratas) , a menos que se indique de otra forma. Los términos abarcan la ubicación genómica [por ejemplo, banda citogenética 7q34, cromosoma 7:140433812-140624564, y/o GC07M140424) , "longitud íntegra", BRAF no procesado así como cualquier forma de BRAF que resulta de procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de BRAF, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de ácidos nucleicos BRAF humano ejemplar es NC_000007.13 o una secuencia de aminoácidos BRAF humanos ejemplares NP_004324.2. La secuencia de ácidos nucleicos BRAF de ratón ejemplar es NC_000072.6 o una secuencia de aminoácidos BRAF de ratón ejemplar NP_647455.3. La secuencia de una ácido nucleico BRAF de rata ejemplar es NC_005103.2 o una secuencia de aminoácidos BRAF de rata ejemplar XP_231692.4. La secuencia de ácidos nucleicos BRAF de perro ejemplar es NC_006598.3 o una secuencia de aminoácidos BRAF de perro ejemplar XP_532749.3. La secuencia de ácidos nucleicos BRAF de pollo ejemplar es NC_006088.3 o una secuencia de aminoácidos BRAF de pollo ejemplar NP_990633.1. La secuencia de un ácidos nucleicos BRAF de vaca ejemplar es AC_000161.1 o una secuencia de aminoácidos BRAF de vaca ejemplar - - XP_002687048.1. La secuencia de ácidos nucleicos BRAF de caballo ejemplar es NC_009147.2 o una secuencia de aminoácidos BRAF de caballo ejemplar XP_001496314.2.

"BRAF tipo silvestre" se refiere aquí a BRAF de origen natural (incluyendo variantes de origen natural) no asociadas con melanoma. Un ejemplo de BRAF de tipo silvestre se proporciona por Número de Acceso GenBank NP_004324.2. Como se conoce en la técnica, con respecto a melanomas BRAF puede categorizarse y clasificarse por tipo BRAF: BRAF tipo silvestre y BRAF mutante.

"BRAF Mutante" como se emplea aquí se refiere a una proteína BRAF con uno o más mutaciones que se asocian con melanoma. Un ejemplo de BRAF mutante es aquel en donde una valina en la posición 600 se reemplaza con un glutamato (V600E) . Como se conoce en la técnica, melanomas pueden ser categorizados por tipo BRAF: tipo silvestre BRAF y BRAF mutante .

"CRAF" o "oncogén viral de leucemia v-raf 1" como se utilizan aquí se refiere a un CRAF nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , a menos que se indique de otra forma. Los términos abarcan la ubicación genómica (por ejemplo, banda citogenética de 3p25, cromosoma 3:12625100-12705700, y/o GC03M012625) , "longitud íntegra", CRAF no procesado así como - - cualquier forma de CRAF que resulta de procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de CRAF, por ejemplo variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de ácidos nucleicos CRAF humano ejemplar es NC_000003.11 o una secuencia de aminoácidos CRAF humano ejemplar NP_002871.1.

"MEK" o "proteína quinasa quinasa activada por mitógeno" , como se emplea aquí, se refiere a una familia de enzimas quinasa que fosforilan proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) . Hay siete genes: MAP2K1 (MEK1) , MAP2K2 (MEK2) , MAP2K3 (MKK3) , MAP2K4 (M K4), MAP2K5 (MKK5) , MAP2K6 (MKK6) , y MAP2K7 (MKK7) . Los activadores de p38 (MKK3 y MKK6) , JNK (MKK4 y MKK7) , y ERK (MEK1 y MEK2) definen rutas de transducción de señal MAP quinasa independientes . La secuencia de ácidos nucleicos de MEK1 humano ejemplar es NC_000015.9 o una secuencia de aminoácidos de MEK1 humano ejemplar NP_002746.1. La secuencia de ácidos nucleicos de MEK2 humano ejemplar es NC_000019.9 o una secuencia de aminoácidos de MEK2 humano ejemplar NP_109587.1. La secuencia de ácidos nucleicos de MEK3 humano ejemplar es NC_000017. io . Una secuencia de aminoácidos de MEK3 de humano ejemplar es NP_002747.2 o NP_659731.1. La secuencia de ácidos nucleicos de MEK4 humano ejemplar es NC_000017.10 o una secuencia de aminoácidos de MEK4 de humanos ejemplar NP 003001.1. La secuencia de ácidos nucleicos de MEK5 humano - - ejemplar es NC_000015.9. Una secuencia de aminoácidos de MEK5 de humano ejemplar es NP_001193733.1 , NP_002748.1, o NP_660143.1. La secuencia de ácidos nucleicos de MEK6 humano ejemplar es NC_000017.10 o una secuencia de aminoácidos de MEK6 de humano ejemplar NP_002749.2. La secuencia de ácidos nucleicos de MEK7 de humano ejemplar es NC_000019.9 o una secuencia de aminoácidos de MEK7 de humano ejemplar NP_660186.1.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico" , como se emplean aquí en forma intercambiable, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen DNA y RNA. Los nucleótidos pueden ser deoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas y/o sus análogos, o cualquier sustrato que puede ser incorporado en un polímero por DNA o RNA polimerasa o por reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación a la estructura del nucleótido puede impartirse antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótido. Un polinucleótido además puede ser modificado después de síntesis, tal como por conjugación con una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen por ejemplo "tapas", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones - - internucleótido, tales como por ejemplo aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres , fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos , etc.), aquellas que contienen porciones pendientes, tales como por ejemplo proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, pli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa numéricos, etc.), así como formas no modificadas del o de los polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares puede ser reemplazado por ejemplo por grupos fosfonato, grupos fosfonato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar enlaces adicionales con nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse a soportes sólidos y semisólidos. El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o sustituido con aminas o porciones del grupo de terminación de extremo orgánico desde 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse en grupos protectores estándar. Polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o deoxiribosa que en general se - - conocen en la técnica, incluyendo por ejemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2'-fluoro- o 21 -azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares ?-anuméricas, azúcares epiméricas tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas , análogos acíclicos y análogos de nucleósido abásicos tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos de enlace alternos. Estos grupos de enlace alternos incluyen pero no están limitados a, modalidades en donde el fosfato se reemplaza por P (O) S ( "tioato" ) , P(S)S ( "ditioato" ) , (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR", CO o CH2 ( "formacetal" ) , en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o sin sustituir, que opcionalmente contiene un enlace éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, ciclo alquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido requieren ser idénticos. La descripción precedente aplica a todos los polinucleótidos aquí referidos, incluyendo RA y DNA. "oligonucleótido" como se emplea aquí en general se refiere a polinucleótidos cortos, de una sola hebra, que tienen pero no necesariamente menos de aproximadamente 250 nucleotidos de longitud. Oligonucleótidos pueden ser sintéticos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos. El término - - "cebador" se refiere a un polinucleótido de una sola hebra que es capaz de hibridizar a un ácido nucleico y después de polimerización de un ácido nucleico complementario, generalmente proporciona un grupo 31 -OH libre.

La expresión "pequeña molécula" se refiere a cualquier molécula con un peso molecular de aproximadamente 2000 daltons o menos, de preferencia de aproximadamente 500 daltons o menos .

El término "anticuerpo" aquí se emplea en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo incluyendo pero no limitadas a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) y fragmentos de anticuerpo siempre que exhiban la actividad de enlace de antígeno deseada.

El término "detección" incluye cualesquiera medios para detectar, incluyendo detección directa e indirecta.

El término "biomarcador" como se emplea aquí se refiere a un indicador, por ejemplo predictivo, de diagnóstico y/o de pronóstico, que puede ser detectado en una muestra. El biomarcador puede servir como un indicador de un subtipo particular de una enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) caracterizado por ciertas características moleculares, patológicas, histológicas y/o clínicas. Por ejemplo, biomarcadores para melanoma incluyen pero no están - - limitados a la presencia de BRAF de tipo silvestre, sobreexpresxon de PAKl y amplificación de PAKl.

La "cantidad" o "nivel" de un biomarcador asociado con un beneficio clínico incrementado para un individuo es un nivel detectable en una muestra biológica. Esto puede medirse por métodos conocidos por una persona con destreza en la especialidad y también aquí descritos. El nivel de expresión o cantidad de biomarcador que se estima puede utilizarse para determinar la respuesta al tratamiento.

Las expresiones "nivel de expresión" o "expresión en nivel" en general se emplean en forma intercambiable y en general se refieren a la cantidad de un biomarcador en una muestra biológica. "Expresión" en general se refiere al proceso por el cual información (codificada por genes y/o epigenética) se convierte en estructuras presentes y que operan en la célula. Por lo tanto, como se emplea aquí "expresión" puede referirse a transcripción en un polinucleótido, traducción en un polipéptido o incluso modificaciones polinucleótido y/o polipéptido (por ejemplo, modificación post- raducción de un polipéptido) .

Fragmentos del polinucleótido transcrito, el polipéptido traducido o modificaciones polinucleótido y/o polipéptido (por ejemplo, modificaciones post-traducción de un polipéptido) también habrán de considerarse como expresadas ya sea si se originan de una transcripción - - generada por corte y empalme alterno o una transcripción degradada, o de un procesamiento postproducción del polipéptido, por ejemplo por proteólisis. "Genes expresados" incluyen aquellos que se transcriben en un polinucleótido como mR A y después traducen en un polipéptido, y también aquellos que se transcriben en R A pero no traducen en un polipéptido (por ejemplo, RNAs de transferencia y ribosomal) .

"Expresión elevada" , "niveles de expresión elevados", "niveles elevados" y "sobreexpresado" se refieren a una expresión incrementada o niveles incrementados de un biomarcador en un individuo respecto a un control, tal como un individuo o individuos que no sufren de la enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) ^ o un control interno (por ejemplo, biomarcador de mantenimiento) . En algunos ejemplos, expresión o severa expresión elevada es el resultado de amplificación de genes.

"Expresión reducida" , "niveles de expresión reducida" o "niveles reducidos" se refieren a niveles disminuidos o expresión disminuida de un biomarcador en un individuo respecto a un control, tal como un individuo o individuos que no sufren de la enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) , o un control interno (por ejemplo, biomarcador de mantenimiento) .

La expresión "biomarcador de mantenimiento" se refiere a un biomarcador o grupo de biomarcadores (por - - ejemplo, polinucleótidos y/o polipéptidos) que típicamente están presentes de manera similar en todos los tipos de células. En algunas modalidades, el biomarcador de mantenimiento es un "gen de mantenimiento" . Un "gen de mantenimiento" se refiere aquí a un gen o grupo de genes que codifican proteínas de las cuales las actividades son esenciales para el mantenimiento de función celular y que típicamente están presentes en forma similar en todos los tipos de células .

"Amplificación", como se emplea aquí, se refieren en general al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada. "Múltiples copias" significa al menos dos copias. Una "copia" no necesariamente significa complementariedad de secuencia perfecta o identidad a la secuencia plantilla. Por ejemplo, copias pueden incluir análogos nucleótido tales como deoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionales (tales como alteraciones de secuencia que se introducen a través de un cebador que comprende una secuencia que es hibridizable pero no complementaria a la plantilla) , y/o errores de secuencia que ocurren durante amplificación. Células diploides típicamente contienen dos copias de un gen determinado, una en cada cromosoma. En algunos aspectos de la invención "amplificación" o un gen cromosomal y en una célula se refiere a un proceso en donde dos o más copias del gen están presentes en la célula.

- - La expresión "PCR multiplex" se refiere a una sola reacción PCR que se lleva a cabo en ácido nucleico que se obtiene de una sola fuente (por ejemplo un individuo) utilizando más de un conjunto de cebadores para el propósito de amplificar dos o más secuencias de DNA en una sola reacción.

El término "diagnóstico" se emplea aquí para referirse a la identificación o clasificación de un estado molecular o patológico, enfermedad o condición (por ejemplo, cáncer) . Por ejemplo "diagnóstico" puede referirse a la identificación de un tipo de cáncer particular. "Diagnóstico" también puede referirse a la clasificación de un subtipo de cáncer particular, por ejemplo por criterios histopatológicos, o por características moleculares (por ejemplo, un subtipo caracterizado por expresión de uno o una combinación de biomarcadores (por ejemplo, genes o proteínas particulares codificados por los genes) ) .

La expresión "auxiliar de diagnóstico" se emplea aquí para referirse a métodos que ayudan en hacer una determinación clínica respecto a la presencia o naturaleza de un tipo particular de síntoma o condición de una enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) . Por ejemplo, un método para ayudar a diagnóstico de una enfermedad o condición (por ejemplo, cáncer) puede comprender medir ciertos biomarcadores en una muestra biológica de un individuo.

- - Por "correlaciona" o "correlacionar" se entiende comparar en cualquier forma el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo segundos protocolos y/o se pueden utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si un segundo análisis o protocolo deberá realizarse. Con respecto a la modalidad de análisis o protocolo de polinucleótidos, se pueden utilizar los resultados de un análisis de expresión de polinucleótidos o protocolo para determinar si un régimen terapéutico específico deberá realizarse. "Respuesta individual" o "respuesta" pueden estimarse utilizando cualquier punto extremo que indique un beneficio para el individuo, incluyendo sin limitación, (1) inhibición, en cierta medida de progreso de la enfermedad (por ejemplo, progreso de cáncer) , incluyendo frenado y detención completa; (2) una reducción en tamaño del tumor; (3) inhibición (es decir, reducción, frenado o detención completa) de infiltración de células de cáncer en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (4) inhibición (es decir, reducción, frenado o detención completa) de metástasis; (5) alivio, en cierta medida de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) ; (6) incrementar la duración - - de supervivencia libre de progreso; y/o (9) disminuir la mortalidad en un punto determinado de tiempo después de tratamiento.

El término "predicción" o "pronosticar" se emplea aquí para referirse a la probabilidad de que un paciente responda ya sea en forma favorable o desfavorable a una terapia anticáncer particular. En una modalidad, la predicción o pronóstico se refiere a la extensión de esas respuestas. En una modalidad, la predicción o pronóstico se refiere a si y/o la probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore después de tratamiento, por ejemplo tratamiento con un agente terapéutico particular y por un cierto periodo de tiempo sin recurrencia de la enfermedad. Los métodos predictivos de la invención pueden emplearse en forma clínica para tomar decisiones de tratamiento al seleccionar las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas para pronosticar si un paciente probablemente responda en forma favorable a un régimen de tratamiento, tal como un régimen terapéutico determinado, incluyendo por ejemplo administración de un agente o combinación de terapéuticos determinados, intervención quirúrgica, tratamiento con esteroides, etc. o si es probable supervivencia a largo plazo del paciente después de un régimen terapéutico.

- - La expresión "sustancialmente igual" como se emplea aquí, denota un grado suficientemente elevado de similaridad entre dos valores numéricos, tal como una persona con destreza en la técnica considerará la diferencia entre los dos valores de poca o ninguna significancia biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores o expresión Ka) . La diferencia entre los dos valores, por ejemplo es menos que aproximadamente 50%, es menos que aproximadamente 40%, es menos que aproximadamente 30%, es menos que aproximadamente 20%, y/o es menos que aproximadamente 10% como una función del valor comparador/referencia .

La frase "sustancialmente diferente" como se emplea aquí, denota un grado suficientemente elevado de diferencia entre dos valores numéricos tal que una persona con destreza en la técnica considere la diferencia entre los dos valores de significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores K¿) . La diferencia entre los dos valores por ejemplo es mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 20%, mayor que aproximadamente 30%, mayor que aproximadamente 40%, y/o mayor que aproximadamente 50% como una función del valor para la molécula de referencia/comparador .

La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se - - refiere a un compuesto o composición detectable. La etiqueta típicamente se conjuga o fusiona directa o indirectamente con un reactivo, tal como una sonda polinucleótido o un anticuerpo, y facilita la detección del reactivo al cual se conjuga o fusiona. La etiqueta misma puede ser detectable (por ejemplo, etiquetas radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar alteración química de un compuesto o composición sustrato que resulta en un producto detectable.

Una "cantidad efectiva" de un agente se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéutica efectiva también es aquella en la que cualesquiera efectos tóxicos o nocivos de la sustancia/molécula, agonista o antagonista son superados por los efectos benéficos terapéuticos.

Una "cantidad profiláctica efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosis y por períodos de tiempo - - necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado. En forma típica pero no necesaria, ya que una dosis profiláctica se emplea en sujetos antes de o en una etapa previa de la enfermedad, la cantidad profiláctica efectiva será menos que la cantidad terapéutica efectiva. En el caso de melanoma, la cantidad terapéutica efectiva del inhibidor PAK1 puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, frenar en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir (por ejemplo, frenar en cierta medida y de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibir o retrasar, en cierta medida, crecimiento de tumor o progreso del tumor; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el desorden. En la extensión el fármaco puede evitar crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para terapia de cáncer, la eficacia in vivo puede ser por ejemplo medida al evaluar la duración de supervivencia, tiempo para progreso de la enfermedad (TTP) , velocidades de respuesta ( ) , duración de respuesta y/o calidad de vida.

"Reducir" o "inhibir" es disminuir o reducir una actividad, función y/o cantidad en comparación con una referencia. En ciertas modalidades, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad por provocar una disminución total de 20% o mayor. En otra modalidad, por "reducir" o "inhibir" - - se entiende la capacidad para provocar una disminución total de 50% o mayor. Todavía en otra modalidad, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad por provocar una disminución total de 75%, 85%, 90%, 95%, o mayor. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del desorden que se trata, la presencia o tamaño de metástasis, el tamaño del tumor primario o el tamaño o número de vasos sanguíneos en desórdenes angiogénicos .

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permita que la actividad biológica del ingrediente activo es efectiva y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual la formulación se va a administrar. Estas formulaciones pueden ser estériles.

Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los organismos vivos y sus esporas .

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente de una formulación farmacéutica diferente a un ingrediente activo que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéutico aceptable incluye pero no está limitado a un amortiguador, excipiente, estabilizante o conservador .

Como se emplea aquí, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados benéficos o clínicos deseados. Para - - propósitos de esta invención, resultados clínicos benéficos o deseados incluyen pero no están limitados a cualquiera o uno o más de: alivio de uno o más síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, evitar o retrasar diseminación (por ejemplo, metástasis, por ejemplo metástasis al pulmón o al nodo linfático) de la enfermedad, evitar o retrasar recurrencia de la enfermedad, retraso o freno de progreso de la enfermedad, mejora del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total) . También abarcada por "tratamiento" está una reducción de consecuencia patológica de una enfermedad proliferativa . Los métodos de la invención contemplan cualquiera de uno o más de estos aspectos de tratamiento .

El término "melanoma" se refiere a un tumor de alta malignidad que empieza en melanocitos de piel normal o lunares y se somete a metástasis en forma rápida y ampliamente . El término "melanoma" pueden emplearse en forma intercambiable con los términos "melanoma maligno" , "melanocarcinoma" , "melanoepitelioma" y "melanosarcoma" .

"Tumor" , como se emplea aquí se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea maligno o benigno, y todas las células y tejidos de precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso" , "desorden proliferativo celular" , "desorden proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como - - se refiere aquí.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen pero están limitados a, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epitelial) , cáncer pulmonar incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer gastrointestinal estromal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, melanoma, carcinoma de diseminación superficial, melanoma lentigo maligna, melanomas acrales lentiginosos, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de células B (incluyendo linfoma no Hodgkin de bajo - - grado/folicular, (NHL) ; NHL linfocítico pequeño (SL) ; NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no disociadas pequeñas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa; linforna de células de manto; linfoma relacionado a SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; leucemia linfocitica aguda (ALL) ; leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y desorden linfoproliferativo post-trasplante (PTLD) , así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores del cerebro) , síndrome de Meigs, cerebro, así como cáncer de cabeza y cuello, y metástasis asociadas. En ciertas modalidades, cánceres que son susceptibles a tratamiento por los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de mamá, cáncer colorectal, cáncer rectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas, glioblastoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido suave, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovarios, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunas modalidades, el cáncer se elige de: cáncer pulmonar de células pequeñas, glioblastoma, neuroblastomas , melanoma, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorectal (CRC) , y carcinoma hepatocelular . Sin - - embargo, en algunas modalidades, el cáncer se elige de.-cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer colorectal, glioblastoma y carcinoma de mamá, incluyendo formas metastásicas de estos cánceres.

La expresión "terapia anticáncer" se refiere a una terapia útil para tratar cáncer. Ejemplos de agentes terapéuticos anticáncer incluyen pero no están limitados a agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes empleados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis, agentes apoptósicos, agentes antitubulina y otros agentes para tratar el cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesylate) ) , un inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferonas, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que ligan a uno o más de los siguientes blancos PDGFR-beta, BlyS, APRIL, receptor (es) BCMA, TRAlL/Apo2, y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc. Sus combinaciones también se incluyen en la invención.

La expresión "agente citotóxico" como se emplea aquí se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de células. La expresión se pretende que incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos - - radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalano, mitoraicina C, clorarabucilo, daunorubicina u otros agentes de intercalado, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, plantas o animal, incluyendo fragmentos y/o sus variantes y los diversos agentes antitumor o anticáncer descritos a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor.

Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto nocivo en crecimiento o proliferación de una célula.

Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXA ®) ; alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenetiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona) ; delta-9- tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapachona; lapachol; colchicinas ; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYGAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcaraptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; caliestatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, en especial calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (ver, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor alfa-4 integrina oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos antibióticos de cromoproteína enediina - relacionados) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposomas HC1 doxorubicina (DOXIL®) , doxorubicina liposomal TLC D-99 (MIOCET®) , doxorubicina liposoraal pegilada (CAELIX®) , y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofebólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti- metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®) , una epotilona, y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como - - aminoglutetímida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frol nico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglücido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2', 2' -triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®) , formulación de nanopartículas de ingeniería de albúmina de paclitaxel (ABRAXANETM) , y docetaxel (TAXOTERE®) ; clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato ; agentes de platino tales como cisplatina, oxaliplatina (por ejemplo, ELOXATIN®) , y carboplatina; vincas, que evitan polimerización de tubulina que formen microtúbulos , incluyendo vinblastina (VELBAN®) , vincristina (ONCOVIN®) , vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) , y - - vinorelbina (NAVELBINE®) ; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidores de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®) ; bisfosfatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ( ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®) , pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) , o risedronato (ACTONEL®) ; troxacitabina (un análogo 1, 3-dioxolano nucleóxido citosina) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes, tales como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia de genes, por ejemplo vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECA ®) ; rmRH (por ejemplo, ABARELIX®) ; BAY439006 (sorafenib; Bayer) ; SU-11248 (sunitinib, SÜTENT®, Pfizer) ; perifosina, inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib) , inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341) ; bortezomib (VELCADE®) ; CCI-779; tipifarnib (R11577) ; orafenib, ABT510; inhibidor Bcl-2 tal como oblimersen sodio (GENASENSE®) ; pixantrona; inhibidores EGFR (ver definición a - - continuación) ; inhibidores de tirosina quinasa (ver definición a continuación) ; inhibidores de serina-treonina quinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®) ; inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASARTM) ; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptable, de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATINTM) combinado con 5-FU y leucovorina.

Agentes quimioterapéuticos como se define aquí incluyen "agentes anti-hormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer. Pueden ser las hormonas mismas, incluyendo pero no limitadas a: anti-estrogenos con perfil misto agonista/antagonista, incluyendo, tamoxifen (NOLVADEX®) , 4-hidroxitamoxifen, toremifen (FARESTON®) , idoxifen, droloxifen, raloxifen (EVISTA®) , trioxifen, keoxifen, y moduladores de receptor de estrógeno selectivo (SERMs) tales como SERM3 ; anti-estrógenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®) , y EM800 (estos agentes pueden bloquear la dimerización de receptor de estrógeno (ER) , inhibir enlace de DNA, - - incrementar recambio y/o suprimir niveles ER) ; inhibidores de aromatasa, incluyendo inhibidores de aromatasa esteroidal tales como formestan y exemestan (AROMASIN®) , e inhibidores de aromatasa no esteroidal tales como anastrazol (ARIMIDEX®) , letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyendo vorozol (RIVISOR®) , megestrol acetato (MEGASE®) , fadrozol y (5) -imidazoles ; agonista de hormona de liberación de hormona luteinizante, incluyendo leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides de sexo, incluyendo progestinas tales como megestrol acetato y medroxiprogesterona acetato, estrógenos tales como dietilestilbestrol y premarina, y andrógenos/retinoides tales como fluoximesterona, todos de ácido transretiónico y fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores por decremento de receptor estrógeno (ERDs) ; anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticos aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores .

El término "profármaco" como se emplea en esta solicitud se refiere a una forma de precursor o derivado de una substancia farmacéutica activa que es menos citotóxica a células de tumor en comparación con el fármaco precursor y es capaz de ser activada enzimáticamente o convertida en la forma precursora más activa. Ver, e.g. , Wilman, "Prodrugs in - - Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions , 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen pero no están limitados a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente constituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente substituida, profármacos de 5-fluorocitosina y otros de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma profármaco para utilizar en esta invención incluyen pero no están limitados a aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente .

Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se emplea aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe crecimiento de una célula (por ejemplo, una célula de melanoma) . Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un sitio diferente a la fase S) , tales como agentes que - - inducen freno Gl y freno de fase M. Bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que frenan Gl también derraman sobre el freno fase S, por ejemplo agentes de alquilación de DNA tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Mayor información puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders : Philadelphia, 1995), en especial página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo europeo es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el armado de microtúbulos de dímeros de tubulina y estabilizan microtúbulos al evitar despolimerización, que resulta en la inhibición de mitosis en las células .

Por "terapia de radiación" entiende el uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir suficiente daño a una célula para limitar su capacidad para funcionar normalmente o para destruir por completo la célula. Se - - apreciará que habrá muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosis y duración de tratamiento. Tratamientos típicos se dan como una administración única e intervalos de dosis típicos están desde 10 a 200 unidades (Grays) por día.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Mamíferos incluyen, pero no están limitados a animales domésticados (por ejemplo, vacas, obejas, gatos, perros y caballos) , primates (por ejemplo, humanos y primates no-humanos tales como monos) , conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.

Administración "en combinación con" uno o más adicionales agentes terapéuticos incluye administración simultánea (concurrente) y consecutivo o secuencial en cualquier orden.

El término "concurrentemente" se emplea aquí para referirse a administración de dos o más agentes terapéuticos, en donde al menos parte de la administración se superpone en el tiempo. De acuerdo con esto, administración concurrente incluye un régimen de dosis cuando la administración de uno o más agentes continua después de interrumpir la administración del uno o más otro u otros agentes .

Por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad para provocar una disminuación total de 20%, 30%, 40%, 50%, - - 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o mayor. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del desorden que se trata, la presencia o tamaño de metástasis, o el tamaño del tumor primario.

La expresión "inserto de empaque" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos. En algunas modalidades, el inserto de empaque de la invención comprende instrucciones para tratar melanoma con un inhibidor PAK1.

Un "artículo o manufactura" es cualquier manufactura (por ejemplo, empaque o recipiente) o equipo que comprende al menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) , o una sonda para detectar específicamente un biomarcador aquí descrito. En ciertas modalidades, la manufactura o equipo se promueve, distribuye o vende como una unidad para realizar los métodos aquí descritos.

Un "auditorio diana" es un grupo de personas o una institución a quienes o con quienes se promueve o pretende promover un medicamento particular, tal como por comercialización o publicidad, en especial para usos, - - tratamientos o indicaciones particulares, tales como individuos, poblaciones, lectores de periódicos, literatura médica, y revistas, expectadores de televisión o internet, oyentes de radio o internet, médicos, compañías farmacéuticas, etc.

Como se entiende por una persona con destreza en la especialidad, referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro aquí incluye (y describe) modalidades dirigidas a un valor o parámetro per se. Por ejemplo, descripción referente a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X" .

Se entiende que aspectos y modalidades de la invención aquí descritos incluyen "consistente" y/o consiste esencialmente de "aspectos y modalidades". Como se emplea aquí, la forma en singular "un", "una", y "el/la" incluye referencias en plural a menos que se indique de otra forma.

Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Mamíferos incluyen pero no están limitados a animales de granja (tales como vacas) , animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros y caballos) , primates, ratones y ratas. En ciertas modalidades, un mamífero es un humano .

El término "muestra" o "muestra de prueba" como se emplea aquí, se refiere a una composición que se obtiene o - - deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otra molecular que se caracterizará y/o identificará por ejemplo con base en características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra de la enfermedad" y sus variaciones se refiere a cualquier muestra que se obtiene de un sujeto de interés que se esperará o se conoce que contiene la entidad celular y/o molecular que se va a caracterizar. En una modalidad, la definición abarca sangre y otras muestras de líquido de origen biológico y muestras de tejido tales como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido o células de ahí derivadas. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido tal como de muestra biopsia o aspirado de órgano o tejido fresco, congelado y/o conservado; sangre o constituyentes de sangre; fluidos corporales; y células de cualquier tiempo de gestación o desarrollo del sujeto o plasma. Muestras incluyen pero no están limitadas a, células o líneas celulares primarias o cultivadas, sobrenadantes de células, lisados celulares, plaquetas, suero, plasma, fluido vitreo, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, sangre entera, células derivadas de sangre, orina, fluido cerebro-espinal, saliva, esputo, lágrimas, transpiración, moco, lisados de tumor, y medio de cultivo de tejido, extractos de tejido tales como tejido homogeneizado, tejido de tumor, extractos celulares, y - - sus combinaciones.

El término "muestra" o "muestra de prueba" incluye muestras biológicas que se han manipulado en cualquier forma después de su procuración, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o incrustación en una matriz semi-sólida o sólida para propósitos de seccionamiento. Para los presentes propósitos una "sección" de una muestra de tejido se pretende una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una rebanada delgada de tejido o células que se cortan de una muestra de tejido. En una modalidad, la muestra es una muestra clínica. En otra modalidad, la muestra se emplea en un ensayo de diagnóstico. En algunas modalidades, la muestra se obtiene de un tumor primario o metastático. Biopsia de tejido a menudo se emplea para obtener una pieza representativa de tejido de tumor. En forma alterna, células de tumor pueden obtenerse indirectamente en la forma de tejidos o fluidos que se conoce o se considera que contienem las células de tumor de interés; por ejemplo muestras de piel .

Por "muestra de tejido" o "muestra de células" se entiende una colección de células similares que se obtienen de un tejido de un sujeto o individuo. La fuente de la muestra de tejido o célula puede ser un tejido sólido tal - - como de órgano, muestra de tejido, biopsia y/o aspirado fresco, congelado y/o conservado; sangre o cualesquiera constituyentes de sangre tal como plasma; fluidos corporales tales como fluido cerebro espinal, fluido amniótico, fluido peritoneal, o fluido intersticial; células de cualquier tiempo de gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido también puede ser células primarias o cultivadas o líneas celulares. Opcionalmente, la muestra de tejido de células se obtiene de un tej ido/órgano enfermo. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se entremezclan naturalmente con el tejido en naturaleza tales como conservadores, anticoagulantes, amortiguadores, fijadores, nutrientes, antibióticos, o semejantes.

Una "muestra de referencia", "célula de referencia", "tejido de referencia", "muestra de control", "célula de control", o "tejido de control", como se emplea aqui, se refiere a una muestra de célula de tejido, estándar o nivel que se emplea para propósitos de comparación. En una modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, células de control, o tejido de control se obtiene de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejido o células) del mismo sujeto o individuo. Por ejemplo, células o tejidos sanas y/o no enfermas adyacentes a las células o tejidos enfermos (por ejemplo, células o tejidos adyacentes a un tumor). En - - algunas modalidades, la muestra de referencia son células de piel no cancerosas. En otra modalidad, una muestra de referencia se obtiene de un tejido y/o célula sin tratar del cuerpo del mismo sujeto o individuo. En algunas modalidades, la muestra de referencia son células de piel no-cancerosas del cuerpo del mismo sujeto o individuo. Todavía en otra modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejidos o células) de un individuo que no es el sujeto o individuo. En algunas modalidades, la muestra de referencia son células de piel no-cancerosas, de un individuo que no es el sujeto o individuo. En todavía otra modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control se obtiene de un tejido no tratado y/o célula del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o individuo.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia es una sola muestra o múltiples muestras combinadas del mismo sujeto o paciente que se obtienen en uno o más puntos en tiempo diferentes que cuando se obtiene la muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de referencia se obtiene en un punto en tiempo previo del mismo sujeto o paciente que cuando se obtiene la muestra de prueba. Esta muestra de referencia puede ser útil si la muestra de referencia se obtiene durante diagnóstico inicial de cáncer y la muestra de prueba posteriormente se obtiene cuando el cáncer se vuelve metastásico .

En ciertas modalidades, una muestra de referencia incluye todos los tipos de muestras biológicas como se define anteriormente bajo el término "muestra" que se obtiene de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia se obtiene de uno o más individuos con un desorden angiogénico (por ejemplo, cáncer) que no es el sujeto o paciente.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia son múltiples muestras combinadas de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia son múltiples muestras combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o desorden (por ejemplo, un desorden angiogénico tal como por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia son muestras acumuladas de RNA de tejidos normales o plasma o muestras de suero acumuladas de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia son muestras de RNA acumuladas de tejidos de tumor o plasma o muestras de suero acumuladas de uno o más individuos con una enfermedad o desorden (por ejemplo, un - - desorden angiogénico tal como por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o paciente.

Para los propósitos presentes, una "sección" de una muestra de tejido se entiende una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo, una rebanada delgada de tejido o células que se cortan de una muestra de tejido. Se entiende que múltiples secciones de muestras de tejido pueden tomarse y someterse a análisis, siempre que se entienda que la misma sección de muestra de tejido puede ser analizada tanto a niveles morfológicos como moleculares, o analizada con respecto tanto a polipéptidos como polinucleótidos .

Niveles/cantidad de expresión de un gen o biomarcador puede determinarse en forma cuantitativa y/o en forma cuantitativa con base en cualquier criterio conveniente conocido en la técnica, incluyendo pero no limitados a mR A, cDNA, proteínas, fragmentos de proteínas y/o número de copia de genes. En ciertas modalidades, expresión/cantidad de un gen o biomarcador en una primera muestra se incrementa en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, expresión/cantidad de un gen o biomarcador en una primera muestra se disminuye en comparación con expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, la segunda muestra es muestra de referencia .

En ciertas modalidades, los términos "incrementar" - - o "sobre-expresar" se refieren a un incremento total de aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de proteína o ácido nucleico, detectado por métodos conocidos en la técnica estándar tales como aquellos aquí descritos, en comparación con una muestra de referencia. En ciertas modalidades, los términos "incrementar" o "sobre-expresar" se refieren al aumento en el nivel/cantidad de expresión de un gen o biomarcador en la muestra en donde el aumento es al menos aproximadamente cualquiera de 1.5x, 1.75x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, ???, 25x, 50x, 75x, o lOOx el nivel/cantidad de expresión del gen respectivo o biomarcador en la muestra de referencia.

En ciertas modalidades, el término "disminuir" aquí se refiere a una reducción total de aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de proteína o ácido nucleico, detectado por métodos conocidos en la técnica estándar tales como aquellos aquí descritos, en comparación con una muestra de referencia. En ciertas modalidades, el término disminuir se refiere a la disminución en nivel/cantidad de expresión de un gen o biomarcador en la muestra en donde la disminución es al menos aproximadamente cualquiera de 0.9x, 0.8x, 0.7x, 0.6x, 0.5x, 0.4x, 0.3x, 0.2x, O.lx, 0.05x, o O.Olx el nivel/cantidad de expresión del gen o - - biomarcador respectivo en la muestra de referencia.

"Detección" incluye cualesquiera medios para detectar, incluyendo detección directa e indirecta.

En ciertas modalidades, por "correlacionar" o "correlaciona" se entiende comparar, en cualquier forma, el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevara a cabo un segundo protocolo y/o se puede utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si un segundo análisis o protocolo deberá realizarse. Con respecto a la modalidad del análisis o protocolo de expresión de genes, se pueden utilizar los resultados del análisis o protocolo de expresión de genes para determinar si un régimen terapéutico específico deberá realizarse.

La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí se refiere a un compuesto o composición que se conjuga o fusiona directa o indirectamente a un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo al cual se conjuga o fusiona. La etiqueta misma puede ser detectable (por ejemplo, etiquetas radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar alteración química de un compuesto o composición substrato que es detectable.

- - El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero aminoácido que se ha modificado en forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente etiquetado. También se incluye dentro de la definición por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. El término "polipéptido" como se emplea aquí abarca específicamente una "proteína" . Los términos "polipéptido" y "proteína" como se emplea aquí específicamente abarcan anticuerpos .

Una molécula de ácido nucleico "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual ordinariamente se asocia en la fuente natural del ácido nucleico polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislado es diferente en la forma o ámbito y en que se encuentra en la naturaleza. Moléculas de ácido nucleico aislado por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en - - células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenido en células que expresan ordinariamente el polipéptido, en donde por ejemplo la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de las células naturales.

Un "gen", "gen diana", "biomarcador diana", "secuencia diana", "ácido nucleico diana" o "proteína diana", como se emplean aquí, es un polinucleótido o proteína de interés, la detección del cual se desea. En general, una "plantilla", como se emplea aquí, es un polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos diana. En algunos casos, las expresiones "secuencia diana", "DNA plantilla", "polinucleótido plantilla", "ácido nucleico diana", "polinucleótido diana" y sus variaciones, se emplean en forma intercambiable .

Un polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido derivado de la naturaleza. De esta manera, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de polipéptido de origen natural de cualquier mamífero. Este polipéptido de secuencia nativa puede ser aislado de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término polipéptido de "secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o - - secretadas de origen natural del polipéptido (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternas) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido.

Un polipéptido "aislado" o anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En ciertas modalidades, el polipéptido será purificado (1) a más de 95% en peso de polipéptido como se determina por el método Lowry, o más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul Coomassie, o tinción con plata. Polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente. En forma ordinaria, sin embargo polipéptido aislado será preparado por al menos una etapa de purificación.

Una "variante" polipéptido significa un polipéptido - - biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa. Estas variantes incluyen por ejemplo polipéptidos en donde uno o más residuos aminoácidos se agregan o eliminan en el extremo -N o -C del polipéptido. De manera ordinaria, una variante tendrá al menos aproximadamente 80% identidad de secuencia de aminoácidos, más preferible al menos aproximadamente 90% identidad de secuencia de aminoácidos, e incluso más preferible al menos aproximadamente 95% identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa.

El término "beneficio" se emplea en el sentido más amplio y se refiere a cualquier efecto deseable e incluye específicamente beneficio clínico como se define aquí.

Beneficio clínico puede medirse al estimar diversos puntos extremo, por ejemplo inhibición, en cierta medida, de progreso de la enfermedad, incluyendo frenado y detención completa; reducción en el número de episodios y/o síntomas de la enfermedad; reducción en tamaño de lesión; inhibición (es decir, reducción, frenado o detención completa) de infiltración de células enfermas en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; inhibición (es decir reducción, frenado o detención completa) de la diseminación de enfermedad; disminución de respuesta auto- inmune, que puede pero no tiene que resultar en la regresión o ablación de la - - lesión enferma; alivio, en cierta medida de uno o más síntomas asociados con el desorden; incremento en la longitud de la presentación libre de enfermedad después de tratamiento, por ejemplo, supervivencia libre de progreso; supervivencia total incrementada; superior velocidad de respuesta; y/o disminuida mortalidad en un punto determinado de tiempo después de tratamiento.

Métodos de la invención La presente invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, que comprende contactar el melanoma con una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAKl . En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl .

Melanoma es un tumor maligno de melanocitos, por ejemplo, células que producen melanina, un pigmento oscuro que es responsable por el color de la piel . Los melanomas predominantemente ocurren en la piel, pero también se encuentran en otras partes del cuerpo, incluyendo los intestinos y el ojo, por ejemplo melanoma uveal) . El melanoma puede originarse en cualquier parte del cuerpo que contenga melanocitos.

Ejemplos de melanoma incluyen, pero no están limitados a melanoma de dispersión superficial, melanoma nodular, melanoma Lentigo maligna, y melanoma Acral - - lentiginoso. Melanomas pueden clasificarse dependiendo de una cantidad de criterios incluyendo tamaño, ulceración, diseminación a nodos linfáticos, y/o diseminación a otros tejidos u órganos. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un melanoma Etapa I en un individuo al contactar el melanoma con un inhibidor de PAK1. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un melanoma Etapa II en un individuo al poner en contacto el melanoma con un inhibidor de PAK1. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar el melanoma Etapa III en un individuo al poner en contacto el melanoma con un inhibidor de PAK1. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma Etapa IV en un individuo al poner en contacto el melanoma con un inhibidor de PAK1. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma metastásico en un individuo, al poner en contacto el melanoma con un inhibidor de PAK1. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma recurrente en un individuo al poner en contacto el melanoma con un inhibidor de PAK1. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva del inhibidor PAK1. En algunas modalidades, el inhibidor PAK1 es un inhibidor de molécula pequeña de PAK1. En algunas modalidades, el individuo es un mamífero. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, en donde el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma BRAF tipo silvestre que comprenden poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma BRAF tipo silvestre que comprende administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1. BRAF es un miembro de la familia Raf quinasa de proteínas quinasas específica de serina/treonina. BRAF juega un papel para regular la ruta de señalización MAP quinasa/ERKs (la ruta RAF-MEK-ERK) , que afecta división, diferenciación y secreción celular. Señalización RAF-MEK-ERK frecuentemente es desregulada en cáncer. Más de 30 mutaciones del gen BRAF asociado con cánceres humanos se han identificado. La frecuencia de mutaciones BRAF varía ampliamente en cánceres humanos de más de 80% en melanomas, a tan poco como 0-18% en otros tumores, tales como 1-3% en cánceres pulmonares y 5% en cáncer colorectal . Una mutación común que se encuentra en cánceres, particularmente melanoma es una substitución de valina en el codón 600 con glutamato (i.e., V600E) . Por ejemplo, una timina se substituye con adenina en el nucleótido 1799 que lleva a la mutación V600E.

Mutaciones V600 de BRAF llevan a actividad de BRAF quinasa constitutiva. Métodos para determinar el genotipo de BRAF en un melanoma se conocen por aquellos con destreza en la técnica; por ejemplo, la secuencia de nucleótido del gen BRAF de melanoma puede determinarse utilizando métodos de secuenciado estándar o al utilizar el sistema de genotipado KASP SNP (KBioscience) . En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, en donde el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo en donde el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre y el melanoma sobre-expresa PAKl en comparación con células no-cancerosas . En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo en donde el melanoma comprende BRAF tipo silvestre y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma comparado con células no-cancerosas y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, en donde el melanoma es un melanoma BRAF mutante.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, en donde el melanoma es un melanoma BRAF mutante y el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas . En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, en donde el melanoma comprende un BRAF mutante y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, en donde el melanoma comprende un BRAF mutante en donde el mutante no es un mutante BRAF V600E. En algunas modalidades, el individuo es un mamífero. En algunas modalidades, el individuo es un humano .

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos de tratamiento de melanoma en un individuo al poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de inhibidor PAKl. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos de tratamiento de melanoma en un individuo al administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva del inhibidor PAKl . PAKs participa en una cantidad de rutas que son comúnmente desreguladas en células de cáncer humano. PAKl es un componente de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) , quinasa N-terminal JUN (J K) , receptor de hormona esteroide, y rutas de señalización del factor nuclear (NF) , que todas se han asociado con oncogénesis. PAKs activa MEK y RAF1 al fosforilarlas en serina 298 y serina 338, respectivamente.

- - El aumento de transformación inducida por Ras por PAK1 correlacionado con sus efectos en señalización a través de la ruta MAPK de quinasa regulada por señal extracelular (ERK) , y fue disociable de efectos en las rutas JNK o p38-MAPK. (R. Kumar et al. Nature Rev. Cáncer 2006 6:459). Activación constitutiva de la ruta ERK/MEK está implicada en la formación, progreso y supervivencia de tumores y además está asociada con un fenotipo agresivo, caracterizado por proliferación descontrolada, pérdida de control de apoptosis y mal pronóstico (J.A. Spicer, Expert Opin. Drug Discov. 2008 3:7) .

Formación de tumor y progreso requieren la inactivación de señales pro-apoptósicas en células de cáncer. Actividad de PAK se ha mostrado que regula por decremento varias rutas pro-apoptósicas importantes. La fosforilación PAK1 de RAF1 induce translocación RAF1 de mitocondrios , en donde fosforilan al antagonista BCL2 de proteína pro-apoptósica de muerte celular (BAD) . PAK1, PAK2, PAK4 y PAK5 también se ha reportado que fosforilan directamente e inactivan BAD en tipos de células selectos tales como CV-1 (simio) de origen y transporta las células de riñon SV40 (COS) , de ovarios de hámster chino (CHO) y de riñon embriónico humano (HEK) 293T (R. Kumar et al., ibid) . Sin embargo, las rutas relevantes corriente abajo de PAK1 en células de tumor humano permanecen sólo parcialmente - - comprendidas .

PAK1 se expresa ampliamente en una variedad de tejidos normales; sin embargo, la expresión se incrementa significativamente en cáncer de ovarios, mama y vejiga. (S. Balasenthil et al., J. Biol. Chem. 2004 279:4743; M . Ito et al., J. Urol. 2007 178:1073; P. Schraml et al., Am. J. Pathol. 2003 163:985). En cáncer de mama luminal, amplificación genómica de PAK1 se asocia con resistencia a terapia de tamoxifen, posiblemente que ocurre como resultado de fosforilación directa y transactivación independiente de ligando de receptor de estrógeno por PAK1 (S. K. Rayala et al., Cáncer Res. 2006. 66:1694-1701).

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo al poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo al administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1. En algunas modalidades, el gen PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el número de copia de PAK1 en el melanoma es aproximadamente cualquiera de 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 o mayor que 5.0. Métodos para determinar el número de copia del gen PAK1 en un melanoma se conocen en la técnica. Por ejemplo, el número de copia del gen PAK1 puede ser determinado al utilizar matrices - - SNP tales como el análisis de matriz Affymetrix 500K SNP. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, en donde el número de copia de PAKl en el melanoma es mayor que aproximadamente 2.5. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para determinar el número de copia de PAKl en un melanoma subsecuente a tratamiento con un inhibidor PAKl. En algunas modalidades, el número de copia de PAKl en un melanoma se compara con el número de copia de PAKl en células no cancerosas; por ejemplo, células de piel no cancerosas. En algunas modalidades, PAKl se amplifica en el melanoma y el melanoma sobreexpresa PAKl. En algunas modalidades, PAKl se amplifica en el melanoma y el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, el individuo es un mamífero. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo al poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo al administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma. Métodos para determinar expresión de PAKl se conocen en la técnica. Ejemplos de métodos para determinar niveles de - - expresión de PAKl en un melanoma incluyen pero no están limitados a inmunohistoquímica, matriz de proteína de fase inversa (RPPA) , PCR cuantitativa, inmunoensayos y semejantes. Niveles de expresión PAKl pueden compararse con otros tumores y células al utilizar la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) .

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo al contactar melanoma con un inhibidor PAKl en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma en comparación con células no cancerosas . En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar melanoma en un individuo, al administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor de PAKl en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, la expresión de PAKl en el melanoma es aproximadamente cualquiera de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o mayor que 100% de expresión en células no cancerosas. En algunas modalidades, la expresión de PAKl en el melanoma es aproximadamente cualquiera de 1.5-veces, 2.0-veces, 2.5-veces, 3, 3.5-veces, 4.0-veces, 4.5-veces, 5.0-veces, 6.0-veces, 7.0-veces, 8.0-veces, 9.0-veces, 10-veces o mayor que 10-veces en comparación con expresión de PAKl en células no cancerosas. En algunas modalidades, el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas y el melanoma es un melanoma BRAF de tipo - - silvestre. En algunas modalidades, el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas y el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el individuo es un mamífero. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para inhibir señalización CRAF en un melanoma en un individuo que comprende poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para inhibir señalización CRAF en un melanoma en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl . Métodos para medir señalización CRAF se conocen en la técnica. Por ejemplo, activación CRAF puede ser determinada por inmunotransferencia de CRAF aislado de un melanoma de un individuo antes y/o después de tratamiento con un inhibidor PAKl . La activación de CRAF puede medirse utilizando anticuerpos fosfo-CRAF (Ser338) . En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl - - se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAK1 se sobreexpresa en el melanoma y PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, PAK1 se sobreexpresa en el melanoma y PAK1 se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el individuo es un mamífero. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para inhibir señalización MEK en un melanoma en un individuo, que comprende poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para inhibir señalización MEK en un melanoma en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1. Métodos para medir señalización MEK se conocen en la técnica. Por ejemplo, activación MEK puede ser determinada por inmunotransferencia de MEK aislado de un melanoma de un individuo antes y/o después de tratamiento con un inhibidor PAK1. La activación de MEK puede medirse utilizando anticuerpos fosfo-MEK1/1 (Ser217/Ser221) . En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, PAK1 se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el individuo es un mamífero. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

Inhibidores de PAKl Aquí se proporcionan inhibidores de PAKl (por ejemplo, antagonistas PAKl) útiles en los métodos descritos aquí. En algunas modalidades, el inhibidor PAKl es una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido o un anticuerpo. Ejemplos de inhibidores PAK se proporcionan en WO 2007/072153, y WO 2010/07184 ambas de las cuales se incorporan aquí por referencia.

Moléculas pequeñas Aquí se proporcionan moléculas pequeñas para utilizar como inhibidores PAKl para el tratamiento de melanoma .

Moléculas pequeñas de preferencia son moléculas orgánicas diferentes a polipéptidos o anticuerpos de enlace como se define aquí que ligan a PAKl o interfieren con - - señalización PAK1 como se describe aquí. Moléculas pequeñas orgánicas de enlace pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente utilizando metodología conocida (ver, por ejemplo, las Publicaciones de PCT Números WO 00/00823 y WO 00/39585). Moléculas pequeñas orgánicas de enlace usualmente tienen menos de aproximadamente 2000 daltons en tamaño, en forma alterna menos que aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons en tamaño, en donde estas moléculas pequeñas orgánicas que son capaces de enlazar de preferencia específicamente a un polipéptido como se describe aquí, pueden ser identificadas sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas para moléculas que son capaces de ligar a una diana polipéptido son bien conocidas en la especialidad (ver, por ejemplo, las Publicaciones del PCT Números WO 00/00823 y WO 00/39585) . Moléculas pequeñas orgánicas de enlace pueden ser por ejemplo aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas , carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas , hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílieos , ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, aril haluros, aril sulfonatos, alquil haluros, alquil sulfonatos, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, - - alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas , oxazolinas, tiazolidinas , tiazolinas, enaminas, sulfonamidas , epóxidos, aziridinas, isocianatos, sulfonil cloruros, compuestos diazo, cloruros de ácido o semejantes.

Inhibidores de moléculas pequeñas de PAK se han descrito (ver O2006072831, WO2007023382 , WO2007072153 , WO2010/071846, US20090275570 ) . (i) (II) Un serie de inhibidores PAK1 selectivos elaborados en el andamio 2-aminopirido [2 , 3-d] pirimidin-7 (8H) -ona (I) se han descrito por Afraxis, Inc., en una serie de solicitudes de patentes (WO2009086204 , WO2010071846 , WO2011044535, WO2011156646, WO2011156786,WO2011156640, WO2011156780, WO2011156775 , WO2011044264 ) AstraZeneca ha descrito inhibidores PAK1 heterocíclico bicíclicos de la fórmula II (ver WO2006106326) .

Pfizer ha descrito inhibidores PAK elaborados en 1H- tieno[3, 2-c]pirazol (III), 3 -amino-tetrahidropirrolo [3 , - c]pirazol (IV) y N4- (lH-pirazol-3-il)pirimidin-2,4-diamina (V) (ver WO 2004007504, WO 2007023382, WO2007072153 , y WO2006072831) .

PF-3758309 (VI) es un potente inhibidor ATP- competitivo de PAK1, 4, 5 y 6 que se ha empleado en pruebas clínicas. (B. W. Murray et al., Proc . Nati. Acad. Sci USA 2010 107 (20) : 9446; Rosen L et al. Phase 1, dose escalation, safety, farmacokinetic and farmacodinamic study of single agent PF-03758309, an oral PAK inhibitor, in patients with advanced solid tumors [abstract] . In: Proceedings of te AACR- NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cáncer Terapeutics ; 2011 Nov 12-16; San Francisco, CA. Philadelphia (PA) : AACR; Mol Cáncer Ter 2011;10(11 - - Suppl) :Abstract nr A177.

Una serie de derivados indolil, indazolil y benzimidazolil N2-bicíclicos de N4- (lH-pirazol-3-il) pirimidin-2 , 4-diaminas (VII) (Solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie: 61/527,453 presentada en 08/25/2011) y en sus derivados aza- indolil, indazolil y benzimidazolil (Solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie 61/579,227, presentada en 12/22/2011) se han descrito y esta referencia se incorpora por referencia en su totalidad. (A = indolil, indazolil y benzimidazolil o derivados aza de los mismos) . Ácidos nucleicos La invención proporciona aquí antagonistas polinucleótido de PAKl para el tratamiento de melanoma en un individuo. El polinucleótido puede ser RNAi tal como siRNA o miRNA, un oligonucleótido antisentido, RNAzimas, DNAzimas, oligonucleótidos , nucleótidos o cualesquiera fragmentos de estos, incluyendo DNA o RNA (por ejemplo, mRNA, rRNA, tRNA) de origen genómico o sintético, que pueden ser de una sola - - hebra o de doble hebra y pueden representar una hebra sentido o antisentido ácido nucleico péptido (PNA) , o a cualquier material tipo DNA o tipo RNA, de origen natural o sintético, incluyendo, por ejemplo, iRNA, ribonucleoproteínas (por ejemplo, iRNPs) . En algunas modalidades, el polinucleótido hace diana en la expresión PAK1 (por ejemplo, hace diana en PAK1 mRNA) .

El polinucleótido puede ser un ácido nucleico antisentido y/o ribosima. Los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia complementaria con al menos una porción de una transcripción RNA de PAK1. Sin embargo, no se requiere complementaridad absoluta aunque se prefiere.

Una secuencia "complementaria cuando menos una porción de un RNA" aquí referido significa una secuencia que tiene complementaridad suficiente para ser capaz de hibridizar con RNA, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido PAK1 de doble hebra, una sola hebra del DNA dúplex puede de esta manera ser probada o puede ensayarse por formación triplex. La capacidad de hibridizar dependerá tanto del grado de complementariedad como la longitud del ácido nucleico antisentido.

En general, entre mayor sea el ácido nucleico hibridizante, más mal apareamientos base con PAK1 RNA puede contener y todavía formar un dúplex estable (o triplex según pueda ser el caso) . Una persona con destreza en la técnica - - puede evaluar un grado tolerable de mal apareamiento por el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado.

Polinucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo la secuencia 5' sin traducir hasta e incluyendo el codón de inicio AUG, deberán trabajar más eficientemente para inhibir la traducción. Sin embargo, secuencias complementarias a las secuencias 3 ' sin traducción de mRNAs se ha mostrado que son efectivas para inhibir traducción de mRNAs por igual. Ver en general, Wagner, R. , 1994, Wature 372:333-335. De esta manera, oligonucleótidos complementarios a cualquiera de las regiones sin codificación no traducidas 5' o 3' del gen PA 1, pueden emplearse en un enfoque antisentido para inhibir traducción de PAK1 mRNA endógeno. Polinucleótidos complementarios a la región sin traducir 51 de mRNA deberán incluir el complemento del codón de inicio AUG. Polinucleótidos antisentido complementarios a las regiones de codificación mRNA son inhibidores menos eficientes de traducción pero pueden ser empleados de acuerdo con la invención. Ya sea diseñados para hibridizar la región 5'-, 3'- o de codificación de PAKl mRNA, ácidos nucleicos antisentido deberán ser al menos de seis nucleótidos de longitud y de preferencia son oligonucleótidos en el intervalo de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 - - nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos.

En una modalidad, el ácido nucleico antisentido PAK1 de la invención se produce en forma intracelular por transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o su porción se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (RNA) del gen PAK1. Este vector contendrá una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido PAK1. Este vector puede permanecer episomal o ser cromosomalmente integrado, siempre que pueda ser transcrito para producir el RNA antisentido deseado. Estos vectores pueden ser construidos por métodos de tecnología de DNA recombinante estándar en la técnica. Vectores pueden ser plásmido, viral u otros conocidos en la técnica, utilizados para replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de secuencia que codifica PAK1, o sus fragmentos pueden ser por cualquier promotor conocido en la técnica para que actúe en células de vertebrados de preferencia de humanos. Estos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Estos promotores incluyen pero no están limitados a la región promotora temprana SV40 (Bernoist and Chambón, Nature 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal 3 ' larga de virus Rous sarcoma (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), el promotor de herpes timidina (Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. - - 78:1441-1445 (1981), las secuencias regulatorias del gen metalotioneína (Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)), etc .

RNAs inhibitorios pequeños (siR As) también pueden funcionar como inhibidores PAK1 para uso en el tratamiento de melanoma. La expresión PAK1 puede ser por contacto del melanoma con un RNA de doble hebra pequeño (dsRNA) o un vector o construcción que provoca la producción de RNA de doble hebra pequeño, tal que la expresión de PAK1 se inhiba específicamente. Métodos para seleccionar un dsRNA o vector que codifica dsRNA apropiado son bien conocidos en la técnica (Tuschi, T et al (1999) Genes Dev. 13 (24) .3191-3197; Elbashir, SM et al., (2001) Nature 411:494-498; Hannon, GF (2002) Nature 418:244-251; McManus MT and Sharp, PA (2002) Nature Reviews Genetics 3:737-747 ; Bremmelkamp, TR et al. (2002) Science 296:550-553, Patentes de los E.U.A. Números 6,573,099 y 6,506,559 y Publicaciones de Patente Internacionales WOOl/36646, WO 99/32619 y WO 01/68836.

Ejemplos de secuencias de oligonucleótido PAK1 siRNA incluyen pero no están limitadas a 1) GAAGAGAGGTTCAGCTAAA, 2) GGAGAAATTACGAAGCATA, 3) ACCCAAACATTGTGAATTA, 4) GGTTTATGATTAAGGGTTT, todas obtenidas de Dharmacon, Inc.

Polipéptidos La invención proporciona inhibidores polipéptido de - - actividad PAKl para el tratamiento de melanoma en un individuo. Por ejemplo, polipéptidos de enlace son polipéptidos que ligan de preferencia y específicamente a PAKl como se describe aquí. En algunas modalidades, los polipéptidos de enlace son antagonistas PAKl. Polipéptidos de enlace pueden ser químicamente sintetizados utilizando metodología de síntesis de polipéptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante. Polipéptidos de enlace usualmente tienen al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos apreoximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 aminoácidos de longitud o más, en donde estos polipéptidos de enlace que son capaces de enlace de preferencia específicamente a un PAKl, como se describe aquí. Polipéptidos de enlace pueden ser identificados sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas polipéptido para ligar polipéptidos que son capaces de ligar específicamente a un polipéptido diana, son bien conocidas en la especialidad - - (ver, por ejemplo las Patentes de los E.U.A. Números 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones de PCT Números WO 84/03506 y W 084/03564 ; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986) ; Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668).

En este aspecto, expresión de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite cribar grandes bibliotecas polipéptido para identificar el o los miembros de estas bibliotecas que son capaces de ligar específicamente a un PAK1 diana. Expresión en fago es una técnica por la cual polipéptidos variantes se exhiben como proteínas de fusión a la proteína de revestimiento en la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386) . La utilidad de expresión en fago se encuentra en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas - - aleatorizadas selectivamente (o cDNAs aleatoriamente clonados) pueden ser clasificados en forma rápida y eficiente por aquellas secuencias que ligan a una molécula diana con alta afinidad. La expresión de bibliotecas péptido (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378) o proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D . et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) en fago se han empleado para cribar millones de polipéptidos u oligopéptidos por aquellos con propiedades de enlace específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). Clasificar bibliotecas fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar una gran cantidad de variantes, un procedimiento para purificación de afinidad utilizando el receptor diana, y medios para evaluar los resultados de enriquecimientos de enlace . Patentes de los E.U.A. Números 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143.

Aunque la mayoría de los métodos de expresión en fago han empleado fago filamentoso, sistemas de expresión en fago lambdoide ( O 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de expresión T4 fago (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) : 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 - - (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de expresión T7 fago (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); Patente de los E.U.A. Número 5,766,905), también se conocen.

Mejoras adicionales incrementan la capacidad de sistemas de expresión en cribar bibliotecas péptido para ligar a moléculas diana selectas y exhibir proteínas funcionales con el potencial de criba de esas proteínas por propiedades deseadas. Dispositivos de reacción combinatoria para reacciones de expresión en fago se han desarrollado (WO 98/14277) y bibliotecas de expresión en fago se han utilizado para analizar y controlar interacciones biomoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en donde una biblioteca de expresión en fago se pone en contacto con una solución en donde el ligando enlazará a una molécula diana y una segunda solución en donde el ligando de afinidad no enlazará a la molécula diana, para aislar selectivamente ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método para biocribado de una biblioteca de expresión en fago aleatoria con un anticuerpo purificado de afinidad y después aislar el fago de enlace, seguido por un proceso de microcribado utilizando pozos de microplacas para aislar fago de enlace de alta afinidad. El uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como una etiqueta - - de afinidad también se ha reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de expresión en fago. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para utilizar en detergentes empleando expresión en fago se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace específicas se describen en las Patentes de los E.U.A. Números 5,498,538, 5,432,018, y WO 98/15833.

Métodos para generar bibliotecas péptido y cribar estas bibliotecas también se describen en las Patentes de los E.U.A. Números 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323.

Anticuerpos En algunas modalidades de la invención, el inhibidor PAK1 para el tratamiento de melanoma en un individuo son anticuerpos aislados que ligan a PAK1. En algunas modalidades, el anticuerpo es humanizado. En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-PAKl o un anticuerpo que inhibe función PAK1. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico humanizado o humano. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o fragmento F(ab')2. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud integra, por ejemplo, un anticuerpo IgGl" intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define aquí .

En ciertas modalidades, variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y/o los polipéptidos de enlace que aquí se proporcionan, se contemplan. Por ejemplo, puede ser conveniente el mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o polipéptido de enlace. Variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y/o polipéptido de enlace pueden prepararse al introducir modificaciones apropiadas en las secuencias de nucleótidos que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de enlace o por síntesis de péptido. Estas modificaciones incluyen por ejemplo deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo y/o polipéptido de enlace. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución puede realizarse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo enlace de diana.

En ciertas modalidades, variantes de anticuerpo y/o variantes de polipéptido de enlace que tienen uno o más sustituciones de aminoácido se proporcionan. Sitios de interés para mutagénesis sustitucional incluyen HVRs y FRs. Sustituciones de aminoácidos pueden ser introducidas en un anticuerpo y/o polipéptido de enlace de interés y los productos cribarse por una actividad deseada, por ejemplo enlace de antígeno retenido/mejorado, disminuida inmunogenecidad o mejorado ADCC o CDC.

Un tipo de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes selectas para mayor estudio tendrán modificaciones (por ejemplo mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, incrementada afinidad, reducida inmunogenicidad) respecto al anticuerpo precursor y/o tendrán ciertas propiedades biológicas sustancialmente retenidas del anticuerpo precursor. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado de afinidad, que puede ser generado convenientemente, por ejemplo utilizando técnicas de maduración de afinidad basadas en expresión en fago tales como aquellas aquí descritas. Brevemente, uno o más residuos HVR se mutan y los anticuerpos variantes exhiben en fago y criban para una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de enlace) .

Alteraciones (por ejemplo, sustituciones) pueden realizarse en HVRs, por ejemplo, para mejorar afinidad de - - anticuerpo. Estas alteraciones pueden realizarse en "puntos calientes" HVR, es decir residuos codificados por codones que se someten a mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDRs (a-CDRs) , y la variante resultante VH o VL se prueba por afinidad de enlace. Maduración de afinidad por construcción y reselección de bibliotecas secundarias se han descrito por ejemplo en Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas modalidades de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables selectos para maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR tendiente a error, entremezclado de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótido) . Una biblioteca secundaria es entonces creada. La biblioteca entonces se criba para identificar cualesquiera variantes de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra enfoques dirigidos a HVR, en donde varios residuos HVR (por ejemplo, 4 a 6 residuos a la vez) son aleatorizados . Residuos HVR involucrados en enlace de antígeno pueden ser identificados especificamente, por ejemplo utilizando modelado o mutagénesis de barrido de alanina. CDR-H3 y CDR-L3 en particular a menudo son dianas .

En ciertas modalidades, sustituciones, inserciones o deleciones pueden ocurrir dentro de uno o más HVRs siempre que dichas alteraciones no reducen sustancialmente la capacidad del anticuerpo para ligar antígeno. Por ejemplo, alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona aquí) que no reducen sustancialmente la afinidad de enlace pueden elaborarse en HVRs. Estas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" HVR o SDRs . En ciertas modalidades de las secuencias variantes VH y VL que se proporcionan anteriormente, cada HVR ya sea sin alterar o contienen no más de uno, dos o tres sustituciones aminoácido.

Terapia de combinación Los inhibidores PAKl de los métodos aquí descritos pueden emplearse ya sea solos o en combinación con otros agentes en una terapia para el tratamiento de melanoma. Por ejemplo, un inhibidor PAKl aquí descrito puede ser coadministrado con al menos un agente terapéutico adicional incluyendo otro inhibidor PAKl. En ciertas modalidades, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional puede ser Aldesleukin, Dacarbazina, DTIC-Dome (Dacarbazina) , Ipilimumab, Proleukin (Aldesleukin) , Vemurafenib, Yervoy (Ipilimumab) , y/o Zelboraf (Vemurafenib) . Por ejemplo el uso de inhibidores PAKl en terapias de combinación se proporciona por PCT/EP2011/070008 presentada en noviembre 14, 2011.

- - Estas terapias de combinación anotadas anteriormente abarcan administración combinada (en donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma o formulaciones separadas) , y administración separada, en cuyo caso la administración del inhibidor PAKl puede ocurrir antes de, en forma simultánea y/o después de administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante . En algunas modalidades, inhibidores PAKl se emplean para el tratamiento de melanoma en un individuo, en combinación con terapia de radiación. En algunas modalidades, inhibidores PAKl son empleados para el tratamiento de melanoma en un individuo, en combinación con separación quirúrgica de todo o una porción del melanoma del individuo.

En algunas modalidades de la invención, el individuo ha sido previamente tratado por melanoma, por ejemplo utilizando terapia anticáncer. En un ejemplo, la terapia anticáncer es cirugía. En otra modalidad, el sujeto puede ser adicionalmente tratado con una terapia anticáncer adicional antes, durante (por ejemplo, en forma simultánea) o después de administración del inhibidor PAKl. Ejemplos de terapias anticáncer incluyen sin limitación, cirugía, terapia de radiación (radioterapia) , bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia o una combinación de estas terapias .

Ruta de administración La ruta de administración es de acuerdo con métodos - - conocidos y aceptados, tales como por bolo o infusión sencillos o múltiples sobre un prolongado periodo de tiempo en una forma conveniente, por ejemplo por inyección o infusión por rutas subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional o intraarticular, administración tópica, inhalación o por medios de liberación sostenida o liberación extendida. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para el tratamiento de melanoma en un individuo con un inhibidor PAK1 en donde el inhibidor PAK1 se administra intravenosamente al individuo. En otras modalidades, la invención proporciona métodos para el tratamiento de melanoma en un individuo con un inhibidor PAK1 en donde el inhibidor PAK1 se administra en forma tópica al individuo .

Composiciones farmacéuticas Para los métodos de la invención, formulaciones terapéuticas de la invención se preparan para almacenamiento al mezclar el inhibidor PAK1 que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen amortiguadores tales - - como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, butil o benzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisisna; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) .

La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser conveniente el proporcionar además un agente inmunosupreso . Estas moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidades que - - son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsula preparadas, por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-part culas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) .

Preparaciones de liberación sostenida pueden elaborarse. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, estas matrices está en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (Patente de los E.U.A. Número 3,773,919), copolxmeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido-glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímeros de ácido láctico-ácido glicolico y acetato - - leuprolido) , y ácido poli-D- (- ) -3-hidroxibutirico. Mientras que polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por más cortos periodos de tiempo. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de exposición a humedad a 37 "C, resultando en pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Estrategias racionales pueden diseñarse para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es formación de enlace S--S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, puede lograrse estabilización al modificar residuos sulfhidrilo, liofilizado a partir de soluciones acídicas, controlar contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas .

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición que comprende un inhibidor PAK1 para utilizar en el tratamiento de melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre . En algunas modalidades, PAK1 es sobre expresado en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre en donde PAK1 se sobreexpresa en el melanoma en - - comparación con células no cancerosas; por ejemplo, células de piel no cancerosas. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre en donde PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma mutante BRAF. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma mutante BRAF y el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas y/o PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende inhibidor PAKl para utilizar en el tratamiento de melanoma en un mamífero. En algunas modalidades, la invención proporciona composición que comprende inhibidor PAKl para uso en el tratamiento de melanoma en un humano.

En algunos aspectos, la invención proporciona un uso para un inhibidor PAKl en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma en comparación con células no cancerosas; por ejemplo células de - - piel no cancerosas. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre en donde PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre en donde PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, PAKl se sobreexpresa en el melanoma y PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma mutante BRAF. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma mutante BRAF y el melanoma sobreexpresa PAKl en comparación con células no cancerosas y/o PAKl se amplifica en el melanoma. En algunas modalidades, la invención proporciona un uso para un inhibidor PAKl en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de melanoma en un mamífero. En algunas modalidades, la invención proporciona un uso para un inhibidor PAKl en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de melanoma en un humano .

Equipos La invención también proporciona equipos, medicinas, composiciones, y formas de dosis unitarias para uso en cualquiera de los métodos aquí descritos .

Los equipos de la invención incluyen uno o más recipientes que comprenden un inhibidor PAKl (o formas de dosis unitarias y/o artículos de manufactura) y en algunas modalidades, además comprende instrucciones para utilizar en - - el tratamiento de melanoma de acuerdo con cualquiera de los métodos aquí descritos. El equipo además puede comprender una descripción de selección de un individuo conveniente al tratamiento (por ejemplo selección con base en genotipo BRAF) . Instrucciones proporcionadas en los equipos de la invención típicamente son instrucciones escritas en una etiqueta o inserto de empaque (por ejemplo, una hoja de papel que se incluye en el equipo) , pero instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones que se transportan un disco de almacenamiento óptico o magnético) también son aceptables. En algunas modalidades, el equipo además comprendes otro agente terapéutico.

Los equipos de la invención están en empaque conveniente. Empaque conveniente incluyen, pero no está limitado a, ampolletas, botellas, tarros, empaque flexible (por ejemplo, bolsas de plástico o Milar selladas) y semejantes. Equipos pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como amortiguadores e información interpretativa. La presente solicitud de esta manera también proporciona artículos de manufactura, que incluyen ampolletas (tales como ampolletas selladas) , botellas, tarros, empaque flexible y semejantes.

Biomarcadores de melanoma y tratamiento La invención proporciona métodos para identificar pacientes de melanoma humano adecuados para tratamiento con - - un inhibidor PAKl al determinar la presencia de uno o más biomarcadores de melanoma. En algunas modalidades, el biomarcador de melanoma es sobreexpresión de PAKl en el melanoma, amplificación de PAKl en el melanoma, y/o la presencia de BRAF tipo silvestre en el melanoma. En algunas modalidades la expresión de PAKl se determina por comparación con tejido no canceroso; por ejemplo tejido de piel no canceroso. En algunas modalidades, los biomarcadores se detectan en una muestra de prueba que se obtiene del individuo. En algunas modalidades, la presencia del biomarcador se determina en comparación con una muestra de prueba con una muestra de referencia.

En una modalidad, la invención proporciona métodos para identificar pacientes de melanoma humano adecuados para tratamiento con un inhibidor PAKl al determinar la expresión de PAKl en el melanoma en donde la sobreexpresión de PAKl en el melanoma comparado con células no cancerosas indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl . En algunas modalidades, la sobreexpresión de PAKl en aproximadamente cualquiera de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o mayor que 100% en el melanoma en comparación con células no cancerosas indica que el paciente es conveniente para tratamiento con un inhibidor PAKl . En algunas modalidades, sobreexpresión de PAKl en aproximadamente de cualquiera de 1.5-veces, 2.0-veces, 2.5- - - veces, 3, 3.5-veces, 4.0-veces, 4.5-veces, 5.0-veces, 6.0-veces, 7.0-veces, 8.0-veces, 9.0-veces, o 10-veces en comparación con expresión de PAKl en células no cancerosas indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl . Métodos para determinar expresión de PAKl se conocen en la técnica. Ejemplos de métodos para determinar niveles de expresión de PAKl en un melanoma incluyen, pero no están limitados a inmunohistoquímica, matriz de proteínas de fase inversa (RPPA) , PCR cuantitativo, inmunoensayos y semejantes. Niveles de expresión PAKl pueden compararse con otros tumores y células al utilizar la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) .

En otra modalidad, la invención proporciona métodos para identificar pacientes de melanoma humano adecuados para el tratamiento con un inhibidor PAKl al detectar la amplificación de PAKl en el melanoma en donde amplificación del gen PAKl en el melanoma indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl . En algunas modalidades, un número de copia PAKl de aproximadamente cualquiera de 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10 o mayor que 10 en el melanoma indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl . Métodos para determinar amplificación de un gen se conocen en la técnica. Por ejemplo, el número de copia del gen PAKl puede ser - - determinado utilizando matrices SNP tales como el análisis de matriz SNP Affymetrix 500K.

En otra modalidad, la invención proporciona métodos para identificar pacientes de melanoma humano adecuados para tratamiento con un inhibidor PAK1 al detectar el genotipo de BRAF en el melanoma en donde BRAF tipo silvestre en el melanoma indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAK1. Métodos para determinar el genotipo del gen BRAF en el melanoma se conocen en la técnica; por ejemplo, la secuencia de nucleótidos del gen BRAF del melanoma puede determinarse utilizando métodos de secuenciado estándar o al utilizar el sistema de genotipado KASP SNP (KBioscience) .

La invención proporciona métodos para tratar melanoma en un paciente siempre que el paciente se ha encontrado que tiene un biomarcador para melanoma selecto de sobreexpresión de PAK1 en el melanoma, amplificación de PAK1 en el melanoma y/o la presencia de BRAF tipo silvestre en el melanoma; el método que comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1. En algunas modalidades, el paciente es un paciente humano. En algunas modalidades de la modalidad anterior, al menos uno de los biomarcadores es sobreexpresión de PAK1 en donde PAK1 se sobreexpresa en aproximadamente cualquiera de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o mayor en el melanoma en - - comparación con células no cancerosas. En algunas modalidades, la expresión de PAKl en el melanoma es mayor que aproximadamente cualquiera de 1.5-veces, 2.0-veces, 2.5-veces, 3, 3.5-veces, 4.0-veces, 4.5-veces, 5.0-veces, 6.0-veces, 7.0-veces, 8.0-veces, 9.0-veces, o 10-veces en comparación con la expresión de PAKl en células no cancerosas . Métodos para determinar la expresión de PAKl se conocen en la técnica. Ejemplos de métodos para determinar niveles de expresión de PAKl en un melanoma incluyen, pero no están limitados a inmunohistoquímica, matriz de proteína de fase inversa (RPPA) , PCR cuantitativa, inmunoensayos y semejantes. Niveles de expresión PAKl pueden compararse con otros tumores y células al utilizar la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) .

En algunas modalidades de la modalidad anterior, al menos uno de los biomarcadores es amplificación de PAKl en el melanoma en donde un número de copia de PAKl es aproximadamente de cualquiera de 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, o mayor que 10 en el melanoma. Métodos para determinar amplificación de un gen se conocen en la técnica. Por ejemplo, el número de copias del gen PAKl puede ser determinado al utilizar matrices SNP tales como el análisis de matrices SNP Affymetrix 500K.

En algunas modalidades de la modalidad anterior, al - - menos uno de los biomarcadores es el genotipo de BRAF en el melanoma en donde el paciente tiene un melanoma que contiene un melanoma de tipo silvestre.

En algunas modalidades de la modalidad anterior, la presencia de biomarcadores de melanoma en el paciente se ha determinado previamente antes de tratamiento con el inhibidor PAKl.

La invención proporciona métodos para a ustar tratamiento de melanoma en un paciente que se somete a tratamiento con un inhibidor PAKl en donde la expresión de PAKl en el melanoma se determina. En algunas modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre. En algunas modalidades, la sobreexpresión de PAKl en el melanoma indica que el tratamiento con el inhibidor PAKl puede continuar. En algunas modalidades, la expresión de PAKl en un melanoma en un paciente que se somete a tratamiento con PAKl se supervisa con el tiempo. En algunas modalidades, la expresión de PAKl en el melanoma se supervisa al menos diariamente, al menos semanalmente, al menos mensualmente . En algunas modalidades, la expresión de PAKl en un melanoma en un paciente que se somete a tratamiento con un inhibidor PAKl se supervisa con el tiempo. Si la expresión de PAKl aumenta con el curso de tratamiento con el inhibidor PAKl, la cantidad de inhibidor PAKl administrado al paciente se incrementa o permanece igual. En algunas modalidades, la cantidad de inhibidor PAKl - - administrada al paciente se incrementa hasta que el nivel de expresión PAKl disminuye o no es más detectable. Si la expresión de PAKl disminuye en el curso de tratamiento con el inhibidor PAKl, la cantidad de inhibidor PAKl administrada al paciente se disminuye o permanece igual . En algunas modalidades, la expresión de PAKl en un melanoma de un paciente que se somete a tratamiento con un inhibidor PAKl se supervisa con el tiempo en donde el tratamiento con el inhibidor PAKl se continua hasta que la expresión PAKl en el melanoma ya no se detecta más.

Modalidades ejemplares En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un melanoma en un individuo, que comprenden poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl. En adicionales modalidades, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En aún adicionales modalidades, PAKl se sobreexpresa en el tumor en comparación con células de piel no cancerosas . En modalidades adicionales de cualquiera de las modalidades anteriores, PAKl se amplifica en el tumor. En modalidades adicionales, el número de copia de PAKl en el tumor es mayor que aproximadamente 2.5.

En modalidades adicionales de cualquiera de las modalidades anteriores, el inhibidor es una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polipéptido. En algunas modalidades, - - la molécula pequeña es PF-3758309. En algunas modalidades, la molécula pequeña es un compuesto de la fórmula I .

En modalidades adicionales, la molécula pequeña es un compuesto de la fórmula I y A es 4-indolilo, 5-indolilo, 4-indazolilo, 5-indazolilo, 4-benzimidazolilo o 5-benzimidiazolilo; Ra, Rla y Rlb son independientemente hidrógeno o Ci-3 alquilo; R5 es hidrógeno o Ci-6 alquilo; R6 es hidrógeno, halógeno o Ci-e alquilo; y, R7 es cicloalquilo opcionalmente sustituido por flúor.

En modalidades adicionales de cualquiera de las modalidades anteriores, el individuo es un humano.

En modalidades adicionales de cualquiera de las modalidades anteriores, el inhibidor PAK1 se emplea en combinación con un agente terapéutico.

La invención proporciona el uso de un inhibidor PAK1 para el tratamiento de melanoma en un individuo. En algunas modalidades del uso, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre.

La invención proporciona composiciones que - - comprenden un inhibidor PAK1 para uso en el tratamiento de melanoma. En algunas modalidades de la composición, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre. En algunas modalidades, la composición además comprende un excipiente farmacéutico aceptable .

La invención proporciona el uso de un inhibidor PAK1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de melanoma. En algunas modalidades del uso, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre .

La invención proporciona equipos que comprenden un inhibidor PAK1 para utilizar en el tratamiento de melanoma que comprende inhibidor PAK1 e instrucciones para uso en el tratamiento de melanoma. En algunas modalidades del equipo, el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre.

La invención proporciona métodos para inhibir señalización CRAF en un melanoma en un individuo, que comprenden poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1.

La invención proporciona métodos para inhibir señalización MEK en un tumor de melanoma que comprende poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1.

La invención proporciona métodos para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para tratamiento con un inhibidor PAK1, que comprende determinar el genotipo BRAF - - del melanoma, en donde un melanoma que comprende un BRAF de tipo silvestre indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl .

La invención proporciona métodos para identificar a un paciente de melanoma humano adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl que comprende determinar la expresión de PAKl en el melanoma, en donde la sobreexpresion de PAKl en el melanoma comparado con células de piel no cancerosas, indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl. En algunas modalidades del método, la sobreexpresion de PAKl en el melanoma es 2.5 veces mayor que la expresión de PAKl en las células de piel no cancerosas. La invención proporciona métodos para tratar a un paciente de melanoma humano con un inhibidor PAKl que comprenden: (a) seleccionar un paciente con base en el genotipo BRAF del melanoma, en donde un melanoma que comprende un BRAF de tipo silvestre indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl.

La invención oportuna métodos para tratar a un paciente de melanoma humano con un inhibidor PAKl que comprenden: (a) seleccionar un paciente con base en el nivel de expresión PAKl del melanoma, en donde la sobreexpresion de PAKl en el melanoma indica que el paciente es adecuado para - - el tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl. En algunas modalidades de los métodos, las sobreexpresión de PAKl en el melanoma es 2.5 veces mayor que la expresión de PAKl en las células de piel no cancerosas.

La invención proporciona métodos para tratar a un paciente con melanoma humano que comprende administrar al individuo selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl, en donde el genotipo del melanoma se ha determinado que es tipo silvestre de BRAF.

La invención proporciona métodos para tratar un paciente con melanoma humano que comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl, en donde el melanoma se ha determinado que sobreexpresa PAKl en comparación con células de piel no cancerosas. En algunas modalidades de los métodos, la sobreexpresión de PAKl en el melanoma es 2.5 veces mayor que la expresión de PAKl en las células de piel no cancerosas .

La invención proporciona métodos para ajustar tratamiento de melanoma en un paciente que se somete a tratamiento con un inhibidor PAKl, el método comprende estimar la expresión de PAKl en el melanoma, en donde la sobreexpresión de PAKl en el melanoma indica que el tratamiento del individuo se ajusta hasta que la sobreexpresión de PAKl no es más detectada.

- - Todas las características descritas en esta especificación pueden ser combinadas en cualquier combinación. Cada característica descrita en esta especificación puede ser reemplazada por una característica alterna que sirve al mismo, equivalente o similar propósito. De esta manera, a menos que se establezca expresamente de otra forma, cada característica descrita es sólo un ejemplo de una serie genérica de equivalentes o características similares .

Adicionales detalles de la invención se ilustran por los siguientes Ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las referencias en la especificación se incorporan expresamente aquí por referencia.

EJEMPLOS Los ejemplos a continuación se pretenden como puramente ejemplares de la invención y por lo tanto no deberán ser considerados que limitan la invención en forma alguna. Los siguientes ejemplos y descripción detallada se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

Ejemplo 1: Expresión de proteína PAK1 elevada y amplificación genómica en melanoma.

Para determinar la extensión posible de desregulación PAK1 en melanoma humano, tejido de tumor primario de 87 pacientes de melanoma se ensayó para cambios de número de copia de DNA utilizando matrices de polimorfismo - - de nucleótidos sencillos de alta resolución (SNP) . Análisis de matriz SNP Affimetrix 500K, preparación de DNA genómico, procesamiento de chip y análisis de datos se realizaron como se publicó previamente (Harvey PM, et al., (2008) Genes Chromosomes Cáncer, 47 (6) : 530-542) para medir ganancias de copias de llql3, la región del cromosoma 11 que aloja al gen PAKl, en el tejido de melanoma muestreado. Para recolectar datos de matriz de expresión por muestras de tumor apareadas, RNA se extrajo de tejido de tumor congelado y aplicó a micromatrices de expresión de gen HGU133 Affimetrix (Santa Clara, CA) . La frecuencia de amplificación PAKl fue 9% (8 de 87 especímenes con número de copia = 2.5) en este panel de tumor (Figura 1A) . RNA se purificó de 48 especímenes de líneas celulares y tumor de melanoma y el número de copia PAKl incrementado se correlacionó con la expresión mRNA (correlación Pearson = 0.75; Figura IB). Expresión de PAKl desregulada fue más frecuente de lo que se pronosticaría por amplificación genómica sólo, de esta manera sugiriendo que los mecanismos regulatorios o de transcripción adicionales incrementan la expresión PAKl en esta indicación (Reddy SD, et al, (2008) Cáncer Res, 68 (20) : 8195-8200 y de la Torre-Ubieta L, et al., (2010) Genes Dev, 24 (8) : 799-813) . Expresión elevada de PAKl en melanoma comparada con tejidos de piel normal también se demostró utilizando datos de expresión de gen depositados en la base de datos Gene - - Expression Omnibus (GSE4587) . De manera interesante, amplificación de gen PAKl de preferencia se observa en tumores que carecen de mutaciones activantes en el oncogén BRAF a 22% contra 0% para BRAF de tipo silvestre o mutante, respectivamente (p = 0.005, prueba t de dos lados; Figura IB) . Los niveles de expresión de PAKl mRNA difieren entre los genotipos tipo silvestre y BRAF(V600E) o BRAF (V600M) (p = 0.006 y p=0.125, respectivamente; Figura IB). En conjunto, esto sugiere que PAKl puede ser un gen "impulsor" que promueve tumor en un subconjunto de melanoma BRAF de tipo silvestre .

Para evaluar adicionalmente la extensión de desregulación PAKl en melanomas humanos, nivel de expresión de proteína PAKl y localización subcelular se evaluaron por tinción inmunohistoquímica (IHC) de un conjunto distinto de micromatrices de tejido. Brevemente, bloques de tejidos incrustados en parafina fijos con formalina y reportes de patología correspondientes se obtuvieron para 92 melanomas primarios resecados entre 1993 y 2009 (Oxford Radcliffe Hospitals, Oxford, UK) . Las series de melanoma comprenden 23 especímenes de melanoma nodulares, 3 de lentigo maligna, 45 de diseminación superficial, 3 de desmoplásticos , 5 acrales lentiginosos y 13 no clasificables . Cuatro cánceres fueron etapa pTl, 17 fueron etapa pT2, 28 fueron etapa pT3 , 35 fueron etapa pT4 y 8 casos no pudieron ser clasificados en forma precisa. Micromatrices de tejido (TMAs) se ensamblaron como se describió previamente (Bubendorf L, et al., (2001) J Pathol, 195 (1) : 72-79) . Se obtuvo aprobación para el uso de tejido todo humano del Comité Ético de Investigación Local (C02.216) . inmunohistoquímica (IHC) se realizó como se describió previamente (Ong CC, et al., (2011) PNAS, 108 (17) : 7177-7182) . La intensidad de expresión PAKl se calificó por separado en el citoplasma y núcleos de células neoplásicas en una escala de 0 a 3. La calificación de más alta intensidad entre núcleos replicados se empleó como la calificación para cada paciente. El mismo patólogo calificó todos los casos ciego a los datos clínicos. La prueba chi cuadrada se empleó para evaluar asociaciones entre variables categóricas. Reactividad IHC robusta y selectiva de anticuerpo PAKl se demostró previamente (Ong CC, et al., (2011) PNAS, 108 (17) .7177-7182) . En melanoma maligno, 46 de 92 (50%) muestras de tumor primario fueron positivas para expresión de PAKl y 26% de todos los casos mostró tinción de intensidad moderada (2+) o fuerte (3+) en las células malignas (Figura 1C, paneles III y IV; Tabla 1) . Localización nuclear de PAKl solo fue evidente en una muy pequeña proporción de melanomas. Resultados idénticos se ven con una etiqueta de fosfatasa alcalina y cromógeno rojo rápido en lugar de etiqueta de peroxidasa de rábano picante y - - diaminobenzidina café. PAK1 fue débilmente expresado en queratinocitos básales en piel normal, y linfocitos y células de Langerhans supuestas fueron positivas para expresión de PAK1 (Figura 1C, panel IV) . En conjunto, estos datos muestran que el número de copia PAK1 DNA, mR A y expresión de proteína se regulan por incremento ampliamente en melanoma humano.

Ejemplo 2: Asociación negativa entre sobreexpresión de PAK1 y mutación BRAF en melanomas primarios.

Dada la prevalencia de mutación oncogénica de BRAF y NRAS en melanoma (Lee JH, et al., (2011) Br J Dermatol, 164 (4) : 776-784) , tejidos de melanoma fueron genotipados para mutaciones de punto caliente conocidas en genes BRAF (codón 600) y NRAS (codones 12, 13, 61 y 146) . Estado de mutación se determinó para BRAF codón 600 y NRAS codones 12, 13 61 y 146 por KASPar (KBioscience, Herts, England) y métodos de secuenciado de DNA Sanger convencionales. Datos de genotipo para BRAF (39 Val600Glu, 1 Val600Lys y 46 tipo silvestre) y NRAS (1 Gln61His, 7 Gln61Lis, 1 Gln61Lis + Gln61Arg + Leu59Ala, 1 Gln61Leu, 19 Gln61Arg, 2 Gln61Arg + Gln61Lis y 53 tipo silvestre) estuvieron disponibles para 86 y 84 tumores respectivamente y fueron consistentes con los intervalos de frecuencias de mutación que se han publicado previamente para melanoma cutáneo (Lee JH, et al., (2011) Br J Dermatol, 164 (4) : 776-784) . Tinción PAK1 IHC se calificó ciega a detalles clinicopatológicos y estado de mutación y el - - resultado se resume en la Tabla 1. En forma notable, expresión de proteína PAKl fue desregulada selectivamente en tumores de tipo silvestre BRAF (19 de 46 fueron positivos para fuerte tinción IHC de PAKl) en comparación con melanomas que expresan mutantes oncogénicos V600E o V600K (4 de 40 tumores con alta tinción IHC) . Esta correlación negativa entre expresión de PAKl y mutación BRAF fue estadísticamente significante (p < 0.001, Chi-cuadrado 10.702). Mutaciones BRAF y NRAS no fueron mutuamente excluyentes, y la presencia de tumores con cualquier mutación también se asoció negativamente con la expresión de proteína PAKl (p=0.004, Chi-cuadrado 8.128). Una tendencia similar, aunque no estadísticamente significante, se observó cuando muestras dicotomizadas en solo estado mutante o no mutante NRAS (p=0.45, Chi-cuadrado 0.569). No hubo asociación significante entre expresión de proteina PAKl y conteo mitótico (p=0.61 prueba T de Student) , etapa tumor patológico (pT) (p=0.14 Chi-cuadrado), espesor Breslow (p=0.85 prueba T de Student) o ulceración (p=0.91 Chi-cuadrado). En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que desregulación de PAKl se asocia fuertemente con melanomas cutáneos que carecen de mutación oncogénica de BRAF y definen un subconjunto de melanoma humano para el cual no hay terapia dirigida efectiva.

Tabla 1. Sobreexpresion de proteína PAKl en melanoma de tipo - - silvestre BRAF Ejemplo 3: PAK1 se requiere para proliferación de células de melanoma tipo silvestre BRAF Dados los datos genómicos e histológicos para expresión PAK1 elevada en el subconjunto de melanoma humano que es tipo silvestre para BRAF, expresión PAK1 y el efecto de interferencia génica mediada por RNAi de PAK1 se examinó en un panel de líneas de células de melanoma a fin de aclarar la contribución de PAK1 hacia proliferación de células de tumor. Se adquirieron líneas celulares de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) y mantuvieron a 37 grados C y C02 al 5% en Medio Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM) o medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) con suero bovino fetal al 10% y L-glutamina 4 mM.

- - Líneas celulares se transfectaron con dúplex de oligonugléotido de RNA interférente corto (siRNA) comercialmente disponible de Dharmacon RNAi Technologies (Chicago, IL) que previamente se caracterizaron por eficiencia y selectividad de interferencia génica PAKl y PAK2 (Ong CC, et al., (2011) PNAS, 108 (17) : 7177-7182) . Se estimó viabilidad celular mediante contenido ATP utilizando el Ensayo Luminiscente CellTiter-Glo (Promega, Madison, I) y los resultados representan desviación promedio + estándar de tres experimentos. Incrementada expresión de proteína PAKl en melanomas que expresan tipo silvestre contra BRAF mutante también se observa para líneas de células inmortalizadas en cultivo. Análisis de viabilidad celular demuestra que células de melanoma 537MEL, eWo, SK-MEL23 y SK-MEL30 expresan altos niveles de proteína PAKl e interferencia génica transitoria de PAKl mediante un acumulado de múltiples oligonucleótidos siRNA selectivos de PAKl resulta en una reducción de 1.8- a 4.3 -veces en viabilidad celular cuando se compara con células transfectadas con oligonucleótido siRNA de control negativo no diana (p < 0.0001; Figura 2A) . Además, inhibición de PAKl generalmente reduce proliferación de células de melanoma de tipo silvestre BRAF respecto a células BRAFV600E (p < 0.07; n=14) , soportando adicionalmente un papel para PAKl como un impulsor para la proliferación en este subtipo de melanoma (Figura 2B) . Para mejor estimar el - - mecanismo por el cual PAK1 contribuye a proliferación, señalización celular dependiente de PAK se estima en células 537MEL y SK-MEL23. Extractos de proteínas de lisados celulares se preparan a 4 grados C con Amortiguador de Extracción de Células (Invitrogen, Carlsbad, CA) , fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) , Cóctel Inhibidor de Fosfatasa 1/2 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) , y una tableta de cóctel inhibidor de proteasa MiniTM libre de EDTA completo (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . Para análisis de Transferencia Western, se resolvieron proteínas por SDS-PAGE 4-12% y transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore Corporation, Billerica, MA) . Inunotransferencia se realizó utilizando los anticuerpos primarios indicados y analizó utilizando anticuerpos secundarios para mejorada quimioluminiscencia (ECL) . Activación de ruta MAPK, como se determina por fosforilación de ERK y MEK, se inhibió dramáticamente por interferencia génica PAK (Figura 2C) . De acuerdo con este resultado, niveles de ciclina DI (que son esenciales para regular quinasas dependientes de ciclina y progreso Gl/S) también se disminuyeron como consecuencia de ablación PAK1. Señalización PAK1 en células de melanoma tipo silvestre BRAF se investigó adicionalmente utilizando una plataforma de fosfoproteómica de matriz de proteínas de fase inversa (RPPA) . Lisados de proteína se analizan por RPPA (Theranostics Health, LLC) al primero diluir todas las - - muestras a una concentración final de 0.5 mg/mL. Las diluciones de muestra se imprimieron en duplicado en portaobjetos que fueron entonces sometidos a inmunotinción con un panel de anticuerpos primordialmente dirigido contra fosforilación específica o proteínas disociadas. Cada uno de estos anticuerpos previamente se han sometido a validación extensa tanto para fosforilación como especificidad de proteína utilizando detección de banda sencilla al peso molecular apropiado por inmunotransferencia. El valor de intensidad para cada punto extremo se determina por identificación de puntos por cada curva de dilución duplicada para cada muestra que estaban dentro del intervalo dinámico lineal de la tinción después de subtracción de fondo con cada punto (dentro de fondo local de porta-objetos y también contra un porta-objetos teñido con solo anticuerpo secundario) . Cada valor se normalizó respecto al valor de intensidad total de proteína para esa muestra derivada de un porta-objetos teñido con Sypro Ruby (Invitrogen) . Datos RPPA se procesaron por transformación log2 y escala lineal (conversión de calificación z) para asegurar normalidad y linearidad. Análisis RPPA mostró una disminuida señalización a MAPK, factor nuclear- ? (NF-??) y rutas de citoesqueleto que sigue la inhibición PAK1 en BRAF tipo silvestre (SK-MEL23 ) , pero no BRAF mutante (A375), células de melanoma (Figura 2D) .

- - PAK1 se ha mostrado que fosforila tanto CRAF (Ser338) como MEKl(Ser298) (17, 29-31). Por lo tanto, el mecanismo molecular por el cual PAKl dispara la activación de la ruta MAPK en células de melanoma tipo silvestre BRAF se investigó. Ya que anticuerpos fosfo-específicos que se desarrollan a sitios de bucle de activación Ser217/Ser221 en proteínas MEK no distingue entre MEK1 y MEK2 , las isoformas MEK se inmunoprecipitaron de células transfectadas ya sea con control u oligonucleótido si NA selectivos PAK como se describió previamente (Hatzivassiliou G, et al., (2010) Nature, 464 (7287) : 431-435) y activación MEK se detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpos fosfo-MEK1/2 (Ser217/Ser221) . La interferencia genica PAK disminuyó tanto fosforilación de MEK1 (Figura 3A) como MEK2 (Figura 3B) en células 537MEL y SK-MEL23. Ya que el sitio de fosforilación Ser298 en MEK1 no se conserva en MEK2, la activación dependiente de PAK de ambas isoformas MEK sugerirá que señalización corriente arriba a CRAF puede ser un impulsor de regulación de ruta MAPK en células de melanoma tipo silvestre BRAF. CRAF se inmunoprecipitó de células transfectadas ya sea control u oligonucleótidos siRNA selectivos PAK como se describió previamente (Hatzivassiliou G, et al., (2010) Nature, 464 (7287) :431-435) y activación CRAF se detectó por inmunotransferencia con anticuerpos fosfo-CRAF (Ser338) . Análisis Western demostró que la - - ablación PAK reduce fosforilación de CRAF en Ser338, un residuo crítico para completa activación de esta quinasa (Figura 3C) . La dependencia de fosforilación CRAF(Ser338) (Figura 3D) y señalización de efector CRAF (Figura 3E) en actividad catalítica PAK también se confirmó utilizando PF-3758309, un inhibidor de PAKs que actualmente está en desarrollo clínico (Murray BW, et al, (2010) PNAS, 107(20): 9446-9451) , y IPA-3, un inhibidor alostérico que liga a PAK1-3 y evita activación por GTPasas familia Rho (Deacon SW, et al., (2008) Chemistry & Biology, 15 (4) : 322-331) .

Adicionales estudios de pérdida-de-función para analizar el papel de PAKl en células de melanoma tipo silvetre BRAF se realizan al investigar la contribución de PAKl a migración de células de melanoma. Brevemente, células de melanoma WM-266-4 se transfectan con control no diana (NTC) u oligonucleótido PAKl/2 siRNA por 72 h y confluentes células de melanoma WM-266-4 subsecuentemente se lesionaron. Imágenes se registraron cuando se realizaron las heridas (sombra oscura) y 28 h después de lesión (campo brillante) . Diferencias en densidad de herida relativa fueron estadísticamente significantes (p < 0.001; n=3) revelando un requerimiento por PAKl en migración de células de melanoma (Figura 4A-B) . Tomadas en conjunto, las consecuenciales funcionales de bloqueo PAKl en células de melanoma tipo silvestre BRAF abarca efectos citostáticos pronunciados - - mediante activación CRAF reducida y subsecuente señalización de ruta MAPK.

Ejemplo 4: Sensibilidad diferencial de células de melanoma tipo silvestre BRAF a inhibición PAK y BRAF Para investigar más cercanamente la actividad y mecanismo celular de acción de señalización PAK dentro de tipos de tumor sensibles e insensibles, medición de molécula pequeña de PAK y BRAF se compara utilizando células SK-MEL23 BRAF de tipo silvestre y A375 BRAF(V600E) . Para análisis de modulación de ruta, células se trataron con PF-3758309 5 µ? o con PLX-4720 0.2 µ?, un inhibidor BRAF, por 4 horas antes de que se analizaran lisados celulares por fosforilación de componentes de ruta MAPK. La administración de PF-3758309 resultó en modulación de ruta MAPK profunda en células SK-MEL23 (carril 2) , pero no células A375 (carril 5) , como se determina por medición de fosforilación ERKl/2 y MEK1/2 en residuos de bucle quinasa que son críticos para actividad catalítica (Figura 5A) . En comparación, análisis de cambios de señalización mediados por PLX-4720 reveló solo inhibición modesta de fosforilación ERKl/2 y MEKl/2 en células SK-MEL23 (carril 3) , en donde las mismas condiciones de tratamiento inhiben en forma potente activación MAPK en células BRAF(V600E) (carril 6). Como un control, no se notaron diferencias para el total de niveles de proteínas ERKl/2 o MEKl/2 en este experimento. Consistente con reportes - - previos, MEK1-Ser298 se confirmó como un sitio de fosforilación específico de PAK pero fosforilación Ser298 no fue ligada a la fosforilación de bucle de activación MEK en células de melanoma BRAF(V600E) (carril 5) . La consecuencia biológica de fosforilación PAKl de MEK1-Ser298 actualmente no se comprende bien, sin embargo se ha mostrado que la señalización PAK1- EK1 puede ser mediada por contactos célula-célula y adhesión (Slack-Davis JK, et al., (2003) J Cell Biol, 162 (2) : 281-291) . Señalización PAK también se indujo mediante expresión ectópica de Flag-PAKl en células BRAF(V600E) con solo expresión endógena moderada de PAKl. Señalización PAKl elevada en células A375 resultó en un aumento significante en fosforilación CRAF y MEK que fue reversible por adición de PF-3758309 (Figura 5B) , sugiriendo que la adquisición de sobre-expresión PAKl puede ser otro mecanismo para superar la dependencia en BRAF oncogénico en melanoma (Johannessen CM, et al., (2011) Nature, 468 (7326) : 968-972) .

Para determinar si inhibidores PAK disminuyen la viabilidad celular de células de melanoma BRAF tipo silvestre, células SK-MEL23 y 537MEL se ensayaron con el Ensayo Luminiscente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI) después de tratamiento con PF-3758309 o con (S) -N2- (1- (1H-indol-5-il) etil) -N4- (5-ciclopropil-lH-pirazol-3-il) -6-metil-pirimidina-2,4-diamina (1-007), N2- ( (lH-indol-4-il)metil) -N4- - - (5-ciclopropil-lH-pirazol-3-il) -6-metil-pirimidina-2 ,4-diamina (1-054) y N2- ( (4 -cloro- ??-benzo [d] imidazol-5-il)metil) -N4- (5-ciclopropil-lH-pirazol-3-il) -N2-metil-pirimidina-2,4-diamina (1-087) . La inhibición de PAK1 por tratamiento con todos los inhibidores PAK probados, reduce significativamente proliferación celular indicando que la inhibición de señalización PAK es una diana para tratamiento de melanoma de tipo silvestre BRAF (Figuras 6A y B) .

Para extender las observaciones in vitro, modulación farmacodinámica por inhibidores de molécula pequeña PAK se evalúa utilizando modelos de xenoinjerto de tumor. Células cultivadas SK-MEL-23, A2058.X1 y A375.X1 se retiran de cultivo, suspenden en solución salina amortiguada de Hank (HBSS) , mezcla 1:1 con Matrigel (BD Biosciences, USA) , e implantan subcutáneamente en el flanco derecho de ratones desnudos NCR hembras sin tratamiento previo (Taconic Farms, Hudson, NY) o XID Desnudos Beige (Harían Laboratories, CA) . Animales con tumores de un volumen promedio de aproximadamente 250 mm3 se agruparon en cohortes de tratamiento. Volúmenes de tumor se calcularon al seguir la fórmula: Volumen de Tumor = 0.5 x (a x b2) , en donde ¾a' es el diámetro de tumor más grande y *b' es el diámetro de tumor perpendicular. Resultados de volumen de tumor se presentan como promedio de volúmenes de tumor ± el error estándar del promedio (SEM) . Por ciento de inhibición de crecimiento - - (%INH) al final del estudio (EOS) se calcula como %INH = 100 [(Tratamiento EOS Vehículo EOS) / (Vehículo EOS)]. Análisis de datos y generación de valores p utilizando la prueba t Dunnett se realizó utilizando el programa JMP (SAS Institute, Cary, NC) . Todos los procedimientos experimentales se conformaron a los principios guía de la American Physiology Society y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional Genentech. Después de establecimiento del tumor, los animales ya fueron administrados con salino o PF-3758309 (25 mg/kg, i.p.) y los tumores se recolectaron 1 h después de dosis. Tumores se congelaron y pulverizaron en hielo seco utilizando un pulverizador de tejido Bessman pequeño (Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA) y extractos de proteína se prepararon a 4 grados C con Amortiguador de Extracción Celular (Invitrogen, Carlsbad, CA) , fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) , Cóctel Inhibidor de fosfatasa 1/2 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) , y una tableta de cóctel inhibidor de proteasa MiniTM libre de EDTA Completo (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . Proteínas subsecuentemente se resolvieron por SDS-PAGE 4-12% y transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore Corporation, Billerica, MA) para inmunotransferencia con los anticuerpos indicados .

Tratamiento con PF-3758309 resultó en una disminución substancial en fosforilación CRAF, MEK1/2 y ERKl/2 en tumores SK-MEL23 (Figura 7A) . En tumores A2058.X1 BRAF (V600E) , disminuido en fosforilación de CRAF(Ser338) se observó después de dosis PF-3758309. El efecto de PF-3758309 en crecimiento y mantenimiento de tumores tipo silvestre BRAF también se evalúo en un experimento de eficacia por 21 días (Figura 7B y Figura 8A-B) . Tratamiento con 10, 15 y 25 mg/kg PF-3758309 deteriora significativamente el crecimiento de tumor (74%, 76% y 91% de inhibición respecto a la cohorte de control, respectivamente) con relación a la cohorte de vehículo como se mide el día final de la dosis (prueba t Dunnett, p<0.0001). En comparación, eficacia anti-tumor mínima e inhibición de fosforilación CRAF se observan por tumores SK- EL23 tratados con un inhibidor RAF potente in vivo (Figura 9B) (Hoeflich KP, et al., (2009) Cáncer Res, 69 (7) : 3042-3051) . Además, análisis fosfoproteómico de mutante BRAF (A375) y células de tipo silvestre (SK-MEL23) con inhibidor PLX-4720 BRAF demostraron que estos subtipos de células de melanoma exhiben diferentes respuestas de señalización debido a inhibición de BRAF (Figura 9A) .

En conjunto, la magnitud de la inactivación de ruta MAPK por PF-3758309 se correlaciona con eficacia anti-tumor en modelo de xenoinjerto en melanoma tipo silvestre BRAF y estos datos soportan la conclusión que interferir con señalización PAK puede tener eficacia terapéutica en este subconjunto de melanoma (modelo ilustrado en la Figura 10) .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar melanoma en un individuo, que comprende poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAK1.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el melanoma es un melanoma BRAF tipo silvestre.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el PAK1 se sobreexpresa en el tumor en comparación con células de piel no-cancerosas .

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde PAK1 se amplifica en el tumor .

5. El método de conformidad con la reivindicación 4 , en donde el número de copia de PAK1 en el tumor es mayor que aproximadamente 2.5.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el inhibidor es una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polipéptido.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde la molécula pequeña es PF-3758309.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde la molécula pequeña es un compuesto de la fórmula VII.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la molécula pequeña es un compuesto de la fórmula VII y A es 4-indolilo, 5-indolilo, 4-indazolilo, 5-indazolilo, 4-benzimidazolilo o 5-benzimidiazolilo; Ra, Rla y Rlb son independientemente hidrógeno o Ci-3 alquilo; R5 es hidrógeno o Ci-6 alquilo; R6 es hidrógeno, halógeno o Ci-6 alquilo; y R7 es cicloalquilo opcionalmente substituido por flúor .

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el individuo es un humano.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el inhibidor PAK1 se emplea en combinación con un agente terapéutico.

12. Uso de un inhibidor PAK1 para el tratamiento de melanoma en un individuo.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre.

1 . Una composición que comprende un inhibidor PAK1 para uso en el tratamiento de melanoma.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, en donde el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 14 o 15, en donde además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable .

17. Uso de un inhibidor PAKl en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de melanoma.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre .

19. Un quipo que comprende un inhibidor PAKl para utilizar en el tratamiento de melanoma que comprende inhibidor PAKl e instrucciones para uso en el tratamiento de melanoma.

20. El equipo de conformidad con la reivindicación 19, en donde el melanoma es un melanoma BRAF de tipo silvestre .

21. Método para inhibir señalización CRAF en un melanoma en un individuo que comprende poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl.

22. Un método para inhibir señalización MEK en un tumor de melanoma que comprende poner en contacto el melanoma con una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAK1.

23. Método para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl que comprende determinar el genotipo BRAF del melanoma, en donde un melanoma que comprende un BRAF de tipo silvestre indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl.

24. Método para identificar un paciente de melanoma humano adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl que comprende determinar la expression de PAKl en el melanoma, en donde la sobreexpresión de PAKl en el melanoma en comparación con células de piel no cancerosas, indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde la sobreexpresión de PAKl en el melanoma es X% mayor que la expresión de PAKl en células de piel no cancerosas .

26. Método para tratar un paciente de melanoma humano con un inhibidor PAKl que comprende: (a) seleccionar un paciente con base en el genotipo BRAF del melanoma, en donde un melanoma que comprende un BRAF de tipo silvestre indica que el paciente es adecuado para el tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéutica efectiva de un inhibidor PAKl .

27. Método para tratar un paciente de melanoma humano con un inhibidor PAKl que comprende: (a) seleccionar un paciente con base en el nivel de expresión PAKl del melanoma, en donde una sobreexpresion de PAKl en el melanoma indica que el paciente es adecuado para tratamiento con un inhibidor PAKl; y (b) administrar al paciente selecto una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAKl.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la sobreexpresion de PAKl en el melanoma es 2.5-vecesn mayor que la expresión de PAKl en las células de piel no cancerosas .

29. Método para tratar a un paciente de melanoma humano, que comprende administrar al individuo selecto, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAKl, en donde el genotipo del melanoma se ha determinado que es de tipo silvestre para BRAF.

30. Método para tratar un paciente humano de melanoma que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor PAKl, en donde el melanoma se ha determinado que sobreexpresa PAKl en comparación con células de piel no cancerosas.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la sobreexpresion de PAKl en el melanoma es 2.5-veces mayor que la expresión de PAKl en las células de piel no cancerosas .

32. Método para ajustar el tratamiento de melanoma en un paciente que se somete a tratamiento con un inhibidor PAKl, el método comprende estimar la expresión PAKl en el melanoma, en donde la sobreexpresion de PAKl en el melanoma indica que el tratamiento del individuo se ajusta hasta que la sobreexpresion de PAKl no es más detectada.

33. La invención como se describió previamente.