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MX2013002181A - Vacunas de virus herpes vectorizado con virus de enfermedad de newcastle. - Google Patents

Vacunas de virus herpes vectorizado con virus de enfermedad de newcastle.

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MX2013002181A
MX2013002181A MX2013002181A MX2013002181A MX2013002181A MX 2013002181 A MX2013002181 A MX 2013002181A MX 2013002181 A MX2013002181 A MX 2013002181A MX 2013002181 A MX2013002181 A MX 2013002181A MX 2013002181 A MX2013002181 A MX 2013002181A
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MX
Mexico
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herpes virus
ndv
vector
vaccine
seq
Prior art date
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MX2013002181A
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MX344103B (es
Inventor
Hervé Poulet
Frederic Raymond David
Michel Bublot
Frederic Reynard
Original Assignee
Merial Ltd
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Publication date
Application filed by Merial Ltd filed Critical Merial Ltd
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Abstract

La presente invención comprende vacunas o composiciones de virus herpes con Virus de Enfermedad de Newcastle recombinante. La invención comprende vectores NDV recombinantes que codifican y que expresan patógeno, antígenos, proteínas, epítopos o inmunógenos de virus herpes. Tales vacunas o composiciones se pueden usar para proteger animales contra enfermedad.

Description

VACUNAS DE VIRUS HERPES VECTORIZADO CON VIRUS DE ENFERMEDAD DE NEWCASTLE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende vacunas o composiciones de virus herpes vectorizado con NDV.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varios estudios en años recientes han destacado el potencial del virus de enfermedad de Newcastle (NDV) para ser usado como un vector de vacuna para enfermedades aviares (Krishnamurthy y colaboradores, Virology 278, 168-182,2000; Huang y colaboradores, J. Gen. Virol. 82, 1729-1736, 2001; Nakaya y colaboradores, J. Virol. 75, 11868-11873, 2001; Park y colaboradores. PNAS 103, 8203-8208, 2006; Veits y colaboradores PNAS 103, 8197-8202, 2006; Ge y colaboradores J. Virol. 81, 150-158, 2007; Romer-Oberdórfer y colaboradores, Vaccine 26, 2307-2313, 2008) .
El NDV pertenece a la familia Paramyxovirinae y el género Avulavirus. El NDV se replica en los tractos respiratorios y gastrointestinales, en el oviducto, y para algunos aislados, en el sistema nervioso. La transmisión es aerogénica y por vías orales y fecales. El NDV provoca una enfermedad altamente contagiosa y fatal que afecta todas las especies de aves, y puede infectar algunas especies de mamíferos. La enfermedad puede variar de formas clínicamente no aparentes a altamente virulentas, dependiendo de la cepa de virus y las especies hospederas. El espectro continuo de virulencia mostrado por las cepas NDV permitieron el agrupamiento de ellas en tres patotipos diferentes: lentogénicas, mesogénicas y velogénicas (Alexander, D. J., Diseases o f Poultry, Iowa State Uni. Press, Ames IA , 541-569, 1997) . Las cepas lentogénicas no provocan usualmente enfermedad en pollos adultos y se usan ampliamente como vacunas vivas en industrias de aves de corral en los Estados Unidos y o t ros países. Los virus de virulencia intermedia son llamados mesogénicos, mientras que los virus que provocan alta mortalidad son llamados velogénicos. La enfermedad tiene una distribución mundial y sigue siendo una amenaza mayor constante a la producción comercial de aves de corral.
El genoma de N DV es una hebra negativa no segmentada de RNA de aproximadamente 15kb. El RNA genómico contiene seis genes que codifican las siguientes proteínas en el orden de: la proteína de nucleocápside ( N P ) , fosfoproteína ( P ) , proteína de matriz ( M ) , proteína de fusión ( F ) , hemaglutin.i na-neuraminidasa ( HN ) y proteína polimerasa grande (L) . Dos proteínas adicionales, V y W , de función desconocida se producen por la edición de RNA durante la transcripción del gen P gene (Steward y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74:2539-2547). l desarrollo de métodos para recuperar virus de RNA negativos no segmentados completamente del cDNA clonado, establecido en años recientes, abrió la posibilidad de manipular genéticamente este grupo de virus, incluyendo NDV (Conzelmann, K.K., Ann. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Roberts and Rose, Virology 247, 1-6, 1998) . Esta metodología genética molecular única, llamada "genética inversa", proporciona un medio no solo para investigar las funciones de varios genes codificados por virus (Palese y colaboradores, PNAS 93, 11354-11358, 1996; Nagai, Y., Rev. Med. Virol. 9, 83-99, 1999) sino también para permitir el uso de estos virus para expresar genes heterologos (Bukreyev y colaboradores, J. Virol. 70, 6634-6641, 1996; Mebatsion y colaboradores, PNAS 93, 7310-7314, 1996; Schnell y colaboradores, PNAS 93, 11359-11365, 1996; Hasan y colaboradores, J. Gen. Virol. 78, 2813-2820, 1997; He y colaboradores, Virology 237, 249-260, 1997; Sakai y colaboradores., FEBS Lett . 45, 221-226, 1999). Esto proporciona un nuevo método para generar vacunas mejoradas y vectores de vacuna. Actualmente, el NDV se usó como un vector para la expresión de antígenos de influenza aviar (US2010/0255029, Merial Limited) .
La glicoproteína D (gD) del virus herpes es esencial para la entrada de FHV-1 (Virus Herpes Felino-1) y se implica en la interacción con la célula hospedera (gue se enlaza a los receptores) . La proteína gD tiene actividades de hemaglutinación en los glóbulos rojos de felino ( aeda y colaboradores, Virology 202, 1034-8, 1994; Maeda y colaboradores, Virus Res. 46, 75-80, 1996). La glicoproteína B (gB) de virus herpes es esencial para la entrada de FHV y se implica en el proceso de fusión (Spatz and Maes, Virology 197, 125-36, 1993; Maeda y colaboradores, Virus Res 39, 55-61, 1995) . Ambas glicoproteinas pueden inducir anticuerpos neutralizantes (Horimoto y colaboradores., Aren Virol 111, 127-32, 1990) .
Considerando la susceptibilidad de los animales, incluyendo humanos a virus herpes, es esencial un medio para prevenir la infección por virus herpes y para proteger animales. Por consiguiente, existe una necesidad por una vacuna efectiva contra el virus herpes.
La cita o identificación de cualquier documento en esta solicitud no es una admisión que tal documento está disponible como técnica previa para la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a una vacuna o composición vectorizada con NDV que comprende uno o más vectores NDV recombinantes , diseñados que alojan y expresan ciertos antigenos de virus herpes, tal como un antigeno de virus herpes felino, y opcionalmente un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptables. El NDV puede ser la cepa NDV AVINEWMR, una vacuna viva modificada comercializada por Merial Limited.
El antígeno de virus herpes puede ser una glicoproteina . El antígeno de virus herpes puede ser un antigeno de glicoproteina B (gB) o glicoproteina D (gD) de un virus herpes felino.
La invención también se relaciona a un método para vacunar un animal que comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una o más vacunas o composiciones que pueden comprender una cantidad efectiva de un vector NDV recombinante y opcionalmente un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. La administración puede ser a través de la administración in ovo, oro-nasal, gotas para los ojos, rocío, agua para beber o parenteral (subcutánea, intramuscular, transdérmica , intradérmica) .
La invención se relaciona además a la administración de la vacuna o composición usando un protocolo de inducción-refuerzo. La invención abarca adicionalmente un equipo para llevar a cabo un método para producir o inducir una respuesta inmune que puede comprender cualquiera de las composiciones o vacunas inmunológicas de virus herpes recombinantes, o composiciones o vacunas inmunológicas inactivadas, e instrucciones para llevar a cabo el método.
Por consiguiente, es un objetivo de la invención no abarcar dentro de la invención cualquier producto previamente conocido, proceso para hacer el producto, o método para usar el producto tal que los solicitantes se reservan el derecho y divulgan por medio de la presente una renuncia de cualquier producto, proceso o método previamente conocidos. Se observa además que la invención no se propone para abarcar dentro del alcance de la invención cualquier producto, proceso, o hacer del producto o método para usar el producto, que no cumple con la descripción escrita y requisitos de habilitación de la USPTO (35 U.S.C. § 112, primer párrafo) o la EPO (Articulo 83 de la EPC) , tal que los solicitantes se reservan el derecho y por la presente divulgan una renuncia de cualquier producto, previamente descrito, proceso para hacer el producto, o método para usar el producto.
Estas y otras modalidades se divulgan o son obvias de y abarcadas por, la siguiente Descripción Detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La siguiente descripción detallada, dada a manera de ejemplo, pero no propuesta para limitar la invención solamente a las modalidades especificas descritas, se puede entender mejor en conjunción con los dibujos acompañantes, en los cuales: la Figura 1 es una tabla que muestra la SEQ ID NO asignada a las secuencias de DNA y de proteina. la Figura 2A representa un mapa genético del genoma de NDV de longitud completa; la Figura 2B representa un mapa que ilustra el mapa genético de dos vectores NDV diseñados con inserción de gB o gD de virus herpes en dos sitios de inserción intergenéticos representativos en el genoma de NDV de longitud completa; la Figura 2C es un ejemplo de diagrama de flujo del sistema de genética inversa de NDV.
La Figura 3 representa la generación del plásmido de transcripción de NDV que contiene el gen gD de virus herpes felino (FHV) (plásmido pFR14) o el gen gD (plásmido pFR16) .
La Figura 4 representa los mapas de los plásmidos pFR14 y pFR16.
La Figura 5 muestra la temperatura rectal promedio de gatos después de la estimulación. El grupo A es NDV-HV por ON, grupo B es NDV-HV por SC, grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , grupo D es control negativo (sin vacunación) .
La Figura 6 muestra el peso corporal promedio de gatos después de la estimulación. El grupo A es NDV-HV por ON, grupo B es NDV-HV por SC, grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , grupo D es control negativo (sin vacunación) .
La Figura 7 muestra los datos recolectados en los signos clínicos de los datos después de la estimulación. El grupo A es NDV-HV por ON, grupo B es NDV-HV por SC, grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , grupo D es control negativo (sin vacunación).
La Figura 8 muestra el análisis estadístico de los signos clínicos de los gatos después de la estimulación. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , grupo D es control negativo (sin vacunación) .
La Figura 9 representa la diseminación viral de los gatos después de la estimulación. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , grupo D es control negativo (sin vacunación) .
I,a Figura 10 es el análisis estadístico de la diseminación viral de los gatos después de la estimulación. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , grupo D es control negativo.
La Figura 11 muestra la evolución del título FHV Ab (anti-gB) medio por grupo. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , grupo D es control negativo (sin vacunación ) .
La Figura 12 muestra la alineación de secuencia de la proteina gB y el porcentaje de identidad de secuencia.
La Figura 13 muestra la alineación de secuencia de la proteina gD y el porcentaje de identidad de secuencia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado atribuido a él en la ley de patente norteamericana; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares. Y los términos tales como "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente de" tienen el significado adscrito a ellos en la ley de patente norteamericana, por ejemplo, permiten elementos no citados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica previa o que afectan una característica básica novedosa de la invención.
A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta descripción pertenece. Los términos singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Similarmente, la palabra "o" se propone para incluir "y" a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.
En la presente invención, la cepa AVINEWMR se usa como el vector NDV (US2010/0255029) .
La presente invención se relaciona a una vacuna o composición que puede comprender una cantidad efectiva de uno o más vectores NDV diseñados, y opcionalmente un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinar lamente aceptable.
La presente invención abarca un vector NDV diseñado que expresa una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes que induce una respuesta inmunogénica en un animal. La proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes puede ser una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes felino.
Como se usa en la presente, el término "polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes" se refiere a cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de un virus herpes. El virus herpes puede ser un virus herpes felino, virus herpes canino, virus herpes fósido. El polipéptido de virus herpes puede ser glicoproteína de virus herpes, incluyendo pero no limitado a proteína qR o qD de virus herpes.
Por "animal" se proponen mamíferos, humanos, aves y II similares. El animal se puede seleccionar del grupo que consiste de equino (por ejemplo, caballo) , canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales) , felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo chitas y linces) , ovino (por ejemplo, oveja) , bovino (por ejemplo, ganado, vacas, búfalos) , cerdo (puerco) , aviares (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, perico, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emú y casuario) , primate (por ejemplo, prosimiano, tarsius, mono, gibón, simio), y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo etapas embriogénicas y fetales.
En una modalidad, la composición o vacuna inmunológica de virus herpes comprende uno o más vectores NDV diseñados, y opcionalmente un excipiente, adyuvante, portador o vehículo farmacéutico o veterinario aceptable. Le vector diseñado puede ser un vector de expresión NDV que comprende un polinucleótido que codifica una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes. La proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes puede ser una glicoproteína, o cualquier fragmento de la misma. La proteína, polipéptido, antígeno, epítopo e inmunógeno de virus herpes puede ser una proteína gB o gD, o cualquier fragmento de la misma.
Como se usa en la presente, el término "antigeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune especifica en un animal hospedero. El antigeno puede comprender un organismo completo, exterminado, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto que expresa un epítopo, polipéptido, péptido, proteina, o fragmento del mismo con propiedades inmunogénicas ; una pieza o fragmento de ácido nucleico capaz de inducir una respuesta inmune en la presentación a un animal hospedero; una proteina, un polipéptido, un péptido, un epitopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antigeno pueden comprender una toxina o antitoxina.
El término "proteina o péptido inmunogénico" como se usa en la presente también incluye péptidos y polipéptidos que son inmunogénicamente activos en el sentido que una vez administrado al hospedero, es capaz de evocar una respuesta inmune del tipo humoral y/o celular dirigido contra la proteina. Preferiblemente, el fragmento de proteina es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica como la proteina total. De esta manera, un fragmento de proteina de acuerdo con la invención comprende o consiste esencialmente de o consiste de por lo menos un epitopo o determinante antigénico. El término epitopo, también cocido como determinante antigénico, es la parte de una macromolécula reconocida por el sistema inmune y capaz de inducir una reacción inmune del tipo humoral (células B) y/o tipo celular (células T) . lili término "proteína o péptido inmunogénico" contempla además supresiones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre y cuando las funciones del polipéptido produzcan una respuesta inmunológica como se define en la presente. En este aspecto, sustituciones particularmente preferidas serán generalmente conservadoras en carácter, es decir, aquellas sustituciones se lleva a cabo dentro de- una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) aspartato y glutamato ácidos; (2) lisina, arginina, histidina básicos; (3) alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina, triptófano no polares; y (4) glicina, asparagina, glutamina, . cisterna, serina treonina, tirosina polares no cargados. La fenilalanina, triptófano, y tirosina se clasifican algunas veces como aminoácidos aromáticos. Es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato con un glutamato o viceversa; una treonina con una serina o viceversa; o un reemplazo conservador similares de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrán un mayor efecto en la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la molécula de referencia pero que poseen menores sustituciones de aminoácido que no afectan sustancialmente la inmunogenicidad de la proteina están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia.
El término epitopo es la parte de una macromolécula reconocida por el sistema inmune y capaz de inducir una reacción inmune del tipo humoral (células B) y/o tipo celular (células T) . El término también se usa intercambiablemente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epitopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo de bloquear el enlace de otro anticuerpo a un antigeno objetivo.
Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el hospedero de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpo a una composición o vacuna de interés. Usualmente, una "respuesta inmunológica" incluye peco no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el hospedero mostrará ya sea una respuesta inmunológica terapéutica o protectora que la resistencia a una nueva infección se aumentará y/o la gravedad clínica de la enfermedad se reducirá. La proteína se mostrará por ya sea una reducción o falta de síntomas normalmente mostrados por un hospedero infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el hospedero infectado.
El término proteína o polipéptido "inmunogénico" como se usa en la presente también se refiere a una secuencia de aminoácidos que induce una respuesta inmunológica como se describe en lo anterior. Una proteína o polipéptido "inmunogén :i co" , como se usa en la presente, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se propone un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de esta manera induce la respuesta inmunológica descrita en lo anterior. Tales fragmentos se pueden identificar usando cualquier variedad de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en el campo. Ver, por ejemplo, Epítopo Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, Los epítopos lineales se pueden determinar por ejemplo, al sintetizar concurrentemente grandes números de péptidos en soportes sólidos, los péptidos que corresponden a las porciones de la molécula de proteína, y al hacer reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos están aun unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas en el campo y se describen en, por ejemplo, patente norteamericana No. 4,708,871; Geysen y colaboradores, 1984; Geysen y colaboradores, 1986. Similarmente, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente al determinar la conformación espacial de los aminoácidos tal como por, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear dimensional. Ver, por ejemplo, Epítopo Mapping Protocole, supra.
Los antígenos sintéticos también se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos de flanqueo, y otros antígenos recombinantes o sintéticamente derivados. Los fragmentos inmunogénicos , para propósitos de la presente invención, incluirán usualmente por lo menos tres aminoácidos, aproximadamente 5 aminoácidos, aproximadamente 10-15 aminoácidos, aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos, de la molécula. No existe límite superior crítico a la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de proteínas, o aun una proteína de fusión que comprende por lo menos un epítopo de la proteína.
Por consiguiente, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es que comprende o que consiste esencialmente de o consiste de nucleótidos que codifican un epítopo o determinante antígeno de la proteína o polipéptido de virus herpes. Un polinucleótido que codifica un fragmento de la proteína o polipéptido total comprende o consiste esencialmente de o consiste de un mínimo de 15 nucleótidos, venta osamente de manera aproximada 30-45 nucleótidos, y de manera preferente de aproximadamente 45-75, por lo menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica la proteína o polipéptido total. Los procedimientos de determinación de epítopo, tales como generar bibliotecas de péptidos de solapamiento (Hemmer y colaboradores, 1998), Pepscan (Geysen y colaboradores, 1984/ Geysen y colaboradores, 1985; Van der Zee R. y colaboradores, 1989; Geysen, 1990; ultipin . RTM . Péptido Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (De Groot y colaboradores., 1999), se puede usar en la práctica de la invención, sin experimentación indebida.
Un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que contiene desoxir i bonucleótidos, ribonucleótidos, y análogos en cualquier combinación. Los polinucleótidos pueden tener estructura tridimensional, y pueden llevar a cabo cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye moléculas helicoidales de doble hebra, hebra individual y triple hebra. A menos que se especifique o requiera de otra manera, cualquier modalidad de la invención descrita en la presente que sea un polinucleótido abarca tanto la forma de doble hebra y cada una de las dos formas complemen arias conocidas o predichas para constituir la forma de doble hebra de ya sea el DNA, RNA o molécula híbrida .
El. término "optimización de codón" se refiere al proceso de configurar óptimamente la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo, dominio o fragmento para expresión/traducción en un hospedero seleccionado. En general, los niveles de expresión génica dependen de muchos factores, tales como secuencias promotoras y elementos reguladores. Uno de los factores más importantes es la adaptación del uso de codón de gen transcripto al uso de codón típico del hospedero (Lithwich, G. and Margalit, H. Genome. Res. 13, 2665-2673, 2003). Por lo tanto, los genes altamente expresados en genomas procarióticos bajo selección traduccional tienen una inclinación de uso de codón pronunciada. Esto es debido a que usan un pequeño subconjunto de codones que son reconocidos por las especies de tRNA más abundantes (Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151,389-409, 1981). La fuerza que modula esta adaptación de codón es llamada selección traduccional y su resistencia es importante en las bacterias de crecen rápido (Rocha, E.P., Genome Res. 14, 2279-2286, 2004; Sharp, P.M. y colaboradores, Nucleic Acids Res. 33, 1141-1153). Si un gen contiene codones que se usan raramente por el hospedero, su nivel de expresión no será máximo. Esto puede ser una de las limitaciones de la expresión de proteínas heterólogas (Gustafsson, C. y colaboradores, Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004) y el desarrollo de vacunas de DNA (Ivory, C. and Chadee, ., Genet. Vaccines Ther. 2, 17, 2004). Un al número de genes sintéticos se han rediseñado para incrementar su nivel de expresión. La Base de datos de genes sintéticos (SGDB) (Wu, G. y colaboradores, Nucleic Acids Res. 35, D76-D79, 2007) contiene información de más de 200 experimentos publicados en genes sintéticos. En el proceso de diseño de una secuencia de ácido nucleico gue se insertará en un nuevo hospedero para expresar una cierta proteina en cantidades óptimas, la optimización del uso de codón es usualmente una de las primeras etapas (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004) . La optimización del uso de codón implica básicamente alterar los codones raros en el gen objetivo de modo gue reflejan más estrechamente el uso de codón del hospedero sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). La información usada usualmente para el proceso de optimización es por lo tanto la secuencia de DNA o proteína gue se optimiza y una tabla de uso de codón (conjunto de referencia) del hospedero.
Existen varios servidores en la red públicos y aplicaciones independientes gue permiten alguna clase de optimización de codón por cualquier persona experta en la técnica. GeneDesign' (Richardson, S.M. y colaboradores, Genome Res. 16, 550-556, 2006), ^Synthetic Gene Designer' (Wu, G. y colaboradores, Protein Expr. Purif. 47, 441-445, 2006) and Gene Designer' (Villalobos, A. y colaboradores, BMC Bioinformatics, 7, 285, 2006) son paquetes que proporcionan una plataforma para diseño de genes sintéticos, incluyendo una etapa de optimización de codón. Con respecto a los métodos para la optimización de uso de codón disponibles en cada servidor o programa, los primeros programas desarrollados usaron solamente el procedimiento 'un aminoácido-un' . Programas y servidores más recientes ahora incluyen métodos adicionales para crear alguna variabilidad del uso de codón. Esta variabilidad refleja la variabilidad de uso de codón de genes altamente expresados naturales y permite criterios adicionales al ser introducidos (tal como la evitación de sitios de restricción) en el proceso de optimización. La mayoría de aplicaciones y servidores de la red descritos en la presente proporcionan tres métodos de optimización de codón: una optimización completa de todos los codón, una optimización basada en las frecuencias de uso de codón relativas del conjunto de referencia que usa un procedimiento Monte Cario y procedimientos novedosos diseñados para maximizar la optimización con los cambios mínimos entre las secuencias de consulta y optimizados.
En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina, antigeno, péptido, polipéptido, fragmento, dominio o epitopo recombinante es optimizada por codón para la expresión en un animal. En otra modalidad, las secuencias optimizadas por codón codifican proteínas, antígenos, péptidos, polipéptidos, fragmentos, dominios o epítopos de virus herpes felino para la expresión animal. En todavía otra modalidad, las secuencias optimizados por codón codifican proteínas gB o gD, antígenos, péptidos, polipéptidos, fragmentos, dominios o epítopos de virus herpes para la expresión animal.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos : un gen o fragmento de gen, exones, intrones, mRNA, tRNA, rRNA, siARN, ribozimas, cDNAc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, DNA aislado de cualquier secuencia, RNA aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácido nucleico. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace tal como fluororribosa y tiolato, y ramificaciones de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación, con un componente etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son tapas, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, e introducción de medios para unir, el . polinucleótido a las proteínas, iones de metal, componente etiquetado, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener mediante síntesis química o derivar de un microorganismo.
El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. De esta manera, los genes incluyen intrones y exones como una secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en cDNAs y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa mRNA o RNA, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
La invención comprende además una hebra complementaria a un polinucleótido que codifica una proteína, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes. La hebra complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud, y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación de los mismos.
Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y se puede interrumpir por porciones químicas diferentes a los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo formación de enlace de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente etiquetado o bioactivo.
Un polinucleótido o polipéptido "aislado" es uno que está sustancialmente libre de materiales con los cuales se asocian en su medio ambiente nativo. Por sustancialmente libre, se propone por lo menos 50%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, o por lo menos 95% libre de estos materiales.
Las reacciones de hibridación se pueden llevar a cabo bajo condiciones de astringencia diferente. Las condiciones que incrementan la astringencia de una reacción de hibridación son bien conocidas. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook y colaboradores, 1989.) . Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (a fin de incrementar la astringencia) : temperaturas de incubación de 25°C, 37°C, 50°C y 68°C; concentraciones de solución amortiguadora de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC (donde SSC es NaCl 0.15 M y solución amortiguadora de citrato 15 mM) y su equivalente usando otros sistemas amortiguadores; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50% y 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2 o 15 minutos, y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, o agua desionizada.
La invención abarca además polinucleótidos que codifican variantes funcionalmente equivalentes y derivados de los polipéptidos del virus herpes y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden aumentar, disminuir o no afectar significativamente las propiedades inherentes de los polipéptidos codificados en consecuencia. Estas variantes, derivados, y fragmentos funcionalmente equivalentes expresan la capacidad de retener la actividad. Por ejemplo, los cambios en la secuencia de DNA que no cambian la secuencia de aminoácidos codificada, asi como también aquellos que dan por resultado las sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o pocas supresiones o adiciones de aminoácido, y sustitución de residuos de aminoácido por análogos de aminoácidos son aquellos que no afectarán significativamente las propiedades del polipéptido codificado. En una modalidad, las variantes tienen por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 86 %, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, la homología de por lo menos 97%, por lo menos 98%> o por lo menos 99% de homología o identidad al polinucleótido o polipéptido de virus herpes de interés.
En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos del virus del herpes, particularmente polipéptidos gB de virus del herpes. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 o 15, y variante o fragmento de la misma.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, 96%, 97% , 98% o 99% de identidad de secuencia al polipéptido gB de virus herpes de la invención, particularmente al polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 o 15.
En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona fragmentos y variantes de los polipéptidos gB de virus herpes identificados en lo anterior (SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 o 15) que se pueden preparar fácilmente por una persona de experiencia en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
Las variantes son. polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a los polipéptidos antigénicos de la invención, particularmente la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 o 15.
Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gB de virus herpes incluye por lo menos 8, 10, 15 o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos, o por lo menos 30 aminoácidos de polipéptido gB de virus herpes que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 o 15, o variantes de la misma. En otra modalidad, un fragmento del polipéptido gB de virus herpes incluye un epitopo antigénico especifico encontrado en un polipéptido gB de virus herpes de longitud completa.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido gB de virus herpes, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 o 15. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 o 15, o una variante conservadora, una variante alélica, un homologo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos , o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gB del virus herpes se puede optimizar por codón para la expresión en una especie animal especifica.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 2, 3, 10, 12, 14 o 16, o una variante del mismo. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 95%, 96% , 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a un polinucleótido que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2, 3, 10, 12, 14 o 16, o una variante del mismo.
En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos, de virus herpes, particularmente polipéptidos gD de virus herpes. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 o 23, y variante o fragmento del mismo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia aun polipéptido gD de virus herpes de la invención, particularmente los polipéptidos que tienen una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 o 23.
En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona fragmentos y variantes de los polipéptidos gD de virus herpes identificados en lo anterior (SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 o 23) que se pueden preparar fácilmente . por una persona de experiencia en la técnica usando técnicas de biología molecular bi-en conocidas.
Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a los polipéptidos antigénicos de la invención, particularmente a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 o 23.
Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gD de virus herpes incluye por lo menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos, o por lo menos 30 aminoácidos del polipéptido gD de virus herpes que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 o 23, o variantes de la misma. En otra modalidad, un fragmento de un polipéptido gD de virus herpes incluye un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido gD de virus herpes de longitud completa.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido gD de virus herpes, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 o 23. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, 96%, 97 %, 98% o 99% de identidad de secuencia a un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 o 23, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gD de virus herpes se puede optimizados por codón por la expresión en una especie animal específica.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5, 6, 18, 20, 22 o 24, o una variante de la misma. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 95%, 96% , 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a uno de un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, 6, 18, 20, 22 o 24, o una variante de la misma.
En general, la comparación de secuencias de aminoácidos se logra al alinear una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de una estructura conocida con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de estructura desconocida. Los aminoácidos en las secuencias luego se comparan y los grupos de aminoácidos que son homólogos se agrupan conjuntamente. Este método detecta regiones conservadas de los polipéptidos y representa inserciones y supresiones de aminoácidos. La homología entre las secuencias de aminoácidos se puede determinar al usar algoritmos comercialmente disponibles (ver también la descripción de homología anterior) . Además aquellos mencionados de otra mansera en la presente, se hace mención de los programas BLAST, BLAST de espacios, BLASTN, BLASTP y PSI-BLAST, proporcionado por el Centro Nacional para Información de Biotecnología. Estos programas se usan ampliamente en la técnica para este propósito y pueden alinear regiones homologas de dos secuencias de aminoácidos.
Alternativa o adicionalmente, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se puede calcular como (Nref ~ Ndif) * 100/Nref, en donde Ndir- es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, la secuencia de DNA AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2) .
Alternativa o adicionalmente, "homología" o "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos idénticos o aminoácidos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en donde la alineación de los dos secuencias se puede determinar de acuerdo con un algoritmo de ilbur y Lipman (Wilbur y colaboradores, 1983) , por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización de espacio de 4, y análisis asistido por computadora e interpretación de los datos de secuencia, incluyendo alineación se puede llevar a cabo convenientemente usando programas comercialmente disponibles (por ejemplo, Vector NTI SoftwareMR, Invitrogen Inc. CA, USA) . Cuando las secuencias de RNA se dice que son similares, o tienen un grado de identidad de secuencia y homología con las secuencias de DNA, timidina (T) en la secuencia de DNA se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de RNA. De esta mansera, las secuencias de RNA están dentro del alcance de la invención y se puede derivar de secuencias de DNA, por timidina (T) en la secuencia de DNA se considera igual a uracilo (U) en las secuencias de RNA. Y, sin experimentación indebida, el artífice experto puede consultar con muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de homología.
La invención abarca adicionalmente los polinucleótidos de virus herpes contenidos en una molécula vector o un vector de expresión y enlazados operablemente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.
Un "vector" se refiere a un DNA o recombinante o plásmido de RNA, bacteriófago, o virus que comprende un polinucleótido heterólogo que se suministra a una célula objetivo, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para propósitos de prevención o terapia, y puede estar opcionalmente en la forma de un cásete de expresión. Como se usa en la presente, un vector necesita ser capaz de replicación en la célula objetivo o sujeto final. El término "vector" incluye vectores para clonación, así como también vectores virales.
El término "diseñado" o "recombinante" significa un polinucleótido de origen semi-sintético o sintético que ya sea no se presenta en la naturaleza o se enlaza a otro polinucleótido en un arreglo no encontrado en la naturaleza.
"Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la cual está siendo comparando. Por ejemplo, un polinucleótido se puede incorporar mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y de esta mansera es un polinucleótido heterólogo. Un promotor removido de su secuencia de codificación nativa y enlazada operativamente a una secuencia de codificación diferente a la secuencia nativa es un promotor heterólogo.
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, sitios de enlace a ribosomas, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control de los mismo o un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homologa, y transformación de una célula hospedera, y cualquier tal constructo como puede ser deseable para proporcionar modalidades de esta invención.
Elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno epítopo o inmunógeno de virus herpes están ventajosamente presentes en un vector inventivo. En una manera mínima, esto comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un codón de iniciación (ATG) , un codón de detención y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores tales como plásmido u ciertos vectores virales. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de polipéptido, por ejemplo, un péptido virus herpes, ventajosamente, en el vector, un ATG se coloca en 5' del marco de lectura y un codón de detención se coloca en 3' . Otros elementos para controla la expresión pueden estar presentes, tales como secuencias potenciadoras , secuencias estabilizantes, tales como intrón y o secuencias 5' o 3' no traducidas y secuencias señal que permiten la secreción de la proteina.
Los métodos para hacer y/o administrar un vector o recombinantes o plásmido para la expresión de los productos génicos de la invención, ya sea in vivo o in vitro puede ser cualquier método deseado, por ejemplo, un método que es por o análogo a los métodos divulgados en los documentos citados en: Patentes Norteamericanas Nos. 4,603,112; 4,769,330; 4, 394, 448; 4, 722, 848; 4,745, 051; 4, 769, 331; 4, 945, 050 5,494,807; 5, 514, 375; 5,744, 140; 5,744, 141; 5, 756, 103 5, 762, 938; 5, 766, 599; 5, 90, 091; 5, 174, 993; 5, 505, 41 5, 338, 683; 5, 494, 807; 5, 591, 639; 5, 589, 466; 5, 677, 178 5,591,439; 5, 552, 143; 5, 580, 859; 6, 130, 066; 6, 004, 777 6,130,066; 6, 97, 883; 6, 464, 984; 6, 451, 770; 6, 391, 314 6,387,376; 6, 376, 473; 6, 368, 603; 6, 348, 196; 6, 306, 400 6,228,846; 6,221,362; 6,217,883; 6,207,166; 6,207,165; 6,159,477; 6, 153,199; 6,090, 393; 6, 074, 649; 6,045, 803; 6,033,670; 6,485,729; 6,103,526; 6,224,882; 6,312,682; 6, 348,450; 6, '312, 683 y 6,596, 279; Solicitud de patente norteamericana No. de Serie 12/753,597; 90/01543; 91/11525; 94/16716; 96/39491; 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573.
La presente invención también se refiere a una composición o vacuna que comprende vectores, tales como vectores de expresión. La composición o vacuna puede comprender, consiste esencialmente de, o consistir en uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprende, que consiste esencialmente o que consiste de (o que expresan) uno o más de polipéptidos, antigenos, epitopos o inmunógenos de virus herpes. El vector contiene y expresa un polinucleótido que comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un polinucleótido que codifica (o que expresa) un antigeno, epitopo o inmunógeno de virus herpes, en un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.
De acuerdo con otra modalidad, el vector o vectores en la composición o vacuna comprenden, o consistir esencialmente de, o consisten de polinucleótido (s) que codifica una o más proteínas o fragmento (s) de las mismas o un polipéptido, antígeno, epitopo o inmunógeno de virus herpes. La composición o vacuna inventiva comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, uno o más vectores que comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, ventajosamente también expresar, in vivo bajo condiciones apropiadas o condiciones adecuadas o en una célula hospedera adecuada, polinucleótidos de diferentes aislados de virus herpes que codifican las mismas proteínas y/o para proteínas diferentes. La invención también se dirige en mezclas de vectores que contienen, consisten esencialmente de, o consistir de, codifican para, y expresan, diferentes proteínas del, polipéptidos , antígenos, epítopos o inmunógenos de virus herpes, por ejemplo, un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus herpes de diferente especies tal como, pero no limitado a, felino, humanos, caninos, equinos, bovinos (por ejemplo, ganado vacuno) , cerdo o aviar.
El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de DNA que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención y elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del hospedero u objetivo deseado; y, en este aspecto, se indica que un plásmido superenrrollado y todos sus topoisómeros, plásmido circular abierto, así como también formas lineales del plásmido, se proponen para estar dentro del alcance de la invención.
Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente de, además del polinucleótido heterólogo que codifica una proteina, antigeno, epitopo o inmunógeno recombinante fusionado opcionalmente con un polinucleótido que codifica una péptido, secuencia, variante, análogo o fragmento heterólogo, enlazado operablemente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor potente que sea funcional en células eucariotas. El promotor potente preferido es el promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV-IE) de origen humano o de murino, o que tenga opcionalmente otro origen tal como la rata o conejillo de indias. El promotor CMV-IE puede comprender el segmento promotor actual, que puede o no ser asociado con el segmento potenciador. Se puede hacer referencia al EP-A-260 148, EP-A-323 597, las Patentes norteamericanas Nos. 5,168,062, 5,385,839, y 4,968,615, asi como también a la Solicitud de PCT No 87/03905. El promotor CMV-IE es ventajosamente un CMV-IE humano (Boshart y colaboradores., 1985) o CMV-IE de murino.
En términos más generales, el promotor es ya sea de un origen viral s celular. Un promotor viral potente diferente a CMV-IE que puede se emplear útilmente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus de sarcoma Rous. Un promotor celular potente que puede se emplear útilmente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa y colaboradores, 2000) , o el promotor de actina (Miyazaki y colaboradores, 1989) .
Subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen una actividad promotora adecuada, se incluyen dentro de la presente invención, por ejemplo, promotores CMV-IE truncados de acuerdo con la Solicitud de PCT No 98/00166 o Patente norteamericana No 6,156,567. Un promotor en la práctica de la invención incluye consecuentemente derivados y sub fragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y por consiguiente funcionan como un promotor, promoviendo preferiblemente la actividad sustancialmente similar a aquella del promotor actual o de longitud completa del cual el derivado o sub fragmento se deriva, por ejemplo, similar a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de la Patente Norteamericana No 6,156,567 para la actividad de los promotores CMV-IE de longitud completa. De esta manera, un promotor de CMV-IE en la práctica de la invención puede comprender o consistir esencialmente de o consistir de la porción de promotora del promotor de longitud completa y/o la porción potenciadora del promotor de longitud completa, asi como también derivados y sub fragmentos.
Preferiblemente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente de otros elementos de control de expresión. Es particularmente ventajoso incorporar una secuencia (s) estabilizante, por ejemplo, secuencia (s) del intrón, preferiblemente el primer intrón del hCMV-IE (Solicitud de PCT No 89/01036), el intrón II del gen de ß-globina de conejo (van Ooyen y colaboradores, 1979) .
En cuanto a la señal de poliadenilación poli (A) para los plásmidos y vectores virales diferentes a los poxvirus, el uso se puede hacer más de la señal del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (ver Patente Norteamericana No 5,122,458), o la señal poli (A) del gen ß-globina de conejo o la señal de poli (A) del virus SV40.
De acuerdo con otra modalidad de la invención, los vectores de expresión son vectores de expresión usados para la expresión in vitro de proteínas en un sistema de células apropiado. Las proteínas expresadas se pueden recolectar en o del sobrenadante de cultivo después, o no después de la secreción (si no existe secreción se presenta o se lleva a cabo típicamente una lisis celular) , opcionalmente concentra por métodos de concentración tales como ultrafiltración y/o purificados por medios de purificación, tal como afinidad, intercambio iónico o métodos de cromatografía de tipo filtración en gel.
Una "célula hospedera" indica una célula procariota o eucariota que se ha alterado genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmidó o vector recombinante . Cuando se refieren a células genéticamente alteradas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada y a la progenie de la misma. Las células hospederas incluyen, pero no se limitan a, células de riñon de hámster bebe (BHK) , células de carcinoma de colon (Caco-2), células COS7, células MCF-7, células MCF-10A, lineas de riñon canino adin-Darby (MDCK) , células de pulmón de visón (MvlLu) , células MRC-5, células U937, células de ovario de hámster chino (CHO) , células Vero de mono, (linea de células con el origen del riñon de un mono verde africano) , codorniz (lineas de células de músculo de codorniz QM7) , linea células de pollo DF1, y células VERO. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada se puede insertar en un vector de clonación o expresión adecuado, y el vector a su vez puede introducir en una célula hospedera adecuada para replicación y amplificación. Los polinucleótidos se pueden introducir en células hospederas por cualquier medio conocido en la técnica. Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés se pueden introducir en la célula hospedera mediante cualquiera de una variedad de medios apropiados, incluyendo captación directa, endocitosis, transfección, F-acoplamiento, electroporación,' transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles ; lipofección; e infección (donde el vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retroviral) . La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá frecuentemente de las características de la célula hospedera.
En una modalidad de la presente invención, el vector es un vector de virus de enfermedad de Newcastle (NDV) como se describe en 2010/0255029 (incorporada en la presente a manera de referencia en sus totalidades) . El virus de enfermedad de Newcastle diseñado como un paramixovirus 1 aviar (APMV1, familia Paramyxoviridae, subfamilia Paramyxovirinae, género Avulavirus) es un patógeno aviar cuya cepas de origen naturalmente muestran un amplio intervalo de gravedad de enfermedad. El NDV es particularmente ventajoso como un vector de vacuna para uso veterinario debido a que el vector sirve como una vacuna de aves de corral necesaria. Los patotipos de la cepa NDV son entéricos asintomáticos (por ejemplo, Ulster 2C, Queensland V4), lentogénico (por ejemplo, Hitchner Bl, F (por ejemplo, Asplin) , La Sota), mesogénicos (por ejemplo, cepa H, ukteswar, Roakin, Beaudette C) o velogénica (por ejemplo, Texas GB, NY parrot 70181, Italien, Milano, Herts 33/56) . Las ventajas de vacunas de virus herpes con base en el vector NDV incluyen, pero no se limitan a, (1) inducir una inmunidad amplia, incluyendo respuestas humorales, celulares y de la mucosa (2) que no expresan proteínas NP y M y por lo tanto es compatible con la estrategia DIVA (diferenciados infectado de animales vacunados), (3) induce un inicio rápido de inmunidad, (4) bivalentes, y (5) la producción posee menos riesgo para el medio ambiente que las vacunas inactivadas en caso de liberación accidental.
Ciertas características de NDV sugieren que el NDV recombinante (rNDV) o NDV diseñado que expresa una proteína extraña serían candidatos de vacuna muy buenos. El NDV se desarrolla ha muy altos títulos en muchas líneas de células y huevos, e induce respuestas humorales e inmunes celulares potentes in vivo. El NDV infecta naturalmente a través de las superficies de la mucosa del tracto respiratorio y de alimentación, de modo que es especialmente útil para administrar antígenos protectores de patógenos de enfermedades respiratorias tal como FHV. Además, las vacunas de NDV vivas comercialmente disponibles se usan ampliamente en los Estados Unidos y la mayoría de los otros países. Las vacunas con base en recombinantes NDV en viso también pueden ser ventajosas sobre otros vectores de vacunas recombinantes vivas. Primero, la proteína extraña se expresa con solamente pocas proteínas NDV. En contraste, los vectores de pos virus y virus herpes expresar una gran variedad de proteínas adicionales de sus genomas de tamaño grande. Para la generación de respuestas inmunes específicas en las aplicaciones de vacunas, puede ser ventajoso tener solamente un número limitado de proteínas expresadas. Segundo, el NDV se replica en el citoplasma de las células infectadas sin una fase de DNA, que elimina el problema de integración del genoma viral en el DNA de la célula hospedera. El virus no se somete a recombinación genética detectable.
En una modalidad, el vector NDV es NDV AVINEW® como se describe en 2010/0255029. El vector NDV también puede ser el vector de la Patente Norteamericana No 5,118,502, en particular la cepa depositada como ATCC No. VR 2239.
En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición o vacuna farmacéutica para inducir una respuesta inmunológica en un animal hospedero inoculado con la vacuna o composición, la vacuna o composición que incluye uno o más de vectores virales recombinantes Avinew modificados. En todavía otro aspecto de la invención, el vector viral Avinew diseñado o recombinante incluye, si en una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de DNA del virus herpes que codifica una proteína antigénica de virus herpes derivada de un patógeno en donde la composición o vacuna cuando se administra a un hospedador, es capaz de inducir una respuesta inmunológica específica a la proteína codificada por el patógeno. La composición comprende opcionalmente un portador o vehículo o adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.
El término "región no esencial" se refiere a una región de un genoma del virus que no es esencial para la replicación y propagación del virus en el cultivo de tejido y cuya supresión o inactivación puede reducir la virulencia en una variedad de sistemas animales. Cualquier región o porción no esencial del misma se pueden suprimir genoma AVINE o una secuencia extraña se puede insertar en el, y la viabilidad y estabilidad de AVINEW diseñado que resulta de la supresión o inserción se puede usar para evaluar si una región o porción de suprimir del mismo no es de hecho esencial. En otra modalidad, la región no esencial del genoma AVINEW es la región entre el gen P y el gen M, o la región entre el gen M y el gen F del genoma AVINEW. En una modalidad, la región no esencial se localiza cadena arriba del gen NP o el genoma AVINEW. En otra modalidad, la región no esencial se localiza cadena abajo del gen L en el genoma AVINEW. En todavía otra modalidad, la región no esencial es una región no de codificación o intergénica . En este aspecto, la región no codificación o intergénica puede ser una región entre los genes NP y P, entre los genes P y M, entre los genes M y F, o entre los genes F y HN en el genoma AVINEW. En otra modalidad, la región no esencial puede estar en la región de lnt - 121nt, 1591nt - 1886nt, 3074nt - 3289nt, 4384nt - 4543nt, 6205nt - 6411nt, 8262nt - 8380nt o 14995nt - 15186nt de SEQ ID NO:27.
Un aspecto de la invención se refiere a vectores de NDV diseñados o recombinantes que expresan antigenos de virus herpes. El antigeno puede ser glicoproteina de virus herpes, tal como proteina gB o gD mencionada en lo anterior. El vector NDV diseñado puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antigenos de virus herpes. En otro aspecto, el vector de NDV-Virus herpes diseñado comprende uno o más polinucleótidos que codifican un antigeno de gB de Virus herpes o variante del mismo, un antigeno gD de Virus herpes o variantes del mismo, o una combinación de los mismos.
En una modalidad, la invención proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación para el suministro y expresión de una proteina, antigeno, epitopo o inmunogeno a célula hospedera. La determinación de la cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva es experimentación de rutinaria para una persona de experiencia ordinaria en el campo. En otra modalidad, la formulación comprende un vector de expresión ' que comprende un polinucleótido que expresa un antigeno, epitopo o inmunogeno de virus herpes y un portador, vehículo, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra modalidad, el portador vehículo, adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector o proteína.
Los portadores o vehículos o adyuvantes o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptable son bien conocidos por una persona experta en el campo. Por ejemplo, el portador o adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser agua estéril, 0.9% de una solución de NaCl (por ejemplo, solución salina) o una solución amortiguadora de fosfato. Otro portador o adyuvante o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptable que pueden usar para métodos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli- (L-glutamato) o polivinilpirrolidona . El portador o vehículo o adyuvante o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o proteína expresada de un vector inventivo in vitro) ; ventajosamente, el portador, vehículo o adyuvante o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína) . Las dosis y volúmenes de dosis se plantean en la presente en la descripción general y también se puede determinar por el artífice experto a partir de esta descripción leída en conjunción con el conocimiento en la técnica, sin ninguna experimentación indebida.
Los lipidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternaria que son, pero no son exclusivamente adecuados para plásmidos, son aquellos que tienen la siguiente fórmula: CH3 I + R,— 0— CH2— CH-CH2—N—R2—X I I OR, CH3 en la cual Rl es un radical alifático de cadena recta saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene de 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo el DMRIE. En otra modalidad, el lipido catiónico se puede asociar con un lipido neutro, por ejemplo, el DOPE.
Entre estos lipidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N- (2-hidroxietil) -N, N-dimetil-2 , 3-bis (tetradeciloxi) -1-propano amonio; 96/34109), asociado ventajosamente con un lipido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.
La mezcla de plásmido con el adyuvante se forma extemporánea y/o contemporáneamente con la administración de la preparación o poco antes de la administración de la preparación, por ejemplo, poco antes o después de la administración, se forma la mezcla de plásmido-adyuvante, ventajosamente para proporcionar suficiente tiempo antes de la administración para que la mezcla forme un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.
Cuando el DOPE está presente, la relación molar DMRIE: DOPE puede ser de aproximadamente 95: aproximadamente 5 a aproximadamente 5: aproximadamente 95, o aproximadamente 1: aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.
La relación en peso de DMRIE o DMRIE-DOPE adyuvante: plásmidos se puede estar entre aproximadamente 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5, y ventajosamente aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.
En otra modalidad, el portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. Ejemplos de emulsiones de agua-en-aceite adecuadas incluyen emulsiones de vacuna de agua-en-aceite basadas en aceite que son estables y fluyen a 4°C que contiene: de 6 a 50% v/v de una fase acuosa que contiene antígeno, preferiblemente de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% de v/v de una fase de aceite que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal, o ácido graso, ásteres de poliol o alcohol), de 0.2 a 20% p/v de surfactantes, preferiblemente de 3 a 8% p/v, el último que es en total o en parte, o en una mezcla ya sea de ásteres de poliglicerol, ásteres de poliglicerol que son preferiblemente (poli) ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de ricino de polioxietileno o también aceites de ricino de polioxietileno hidrogenados. Ejemplos de surfactantes que se pueden usar en una emulsión de agua-en-aceite incluyen ásteres de sorbitán etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitán de polioxietileno (20) (Tween 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ásteres de sorbitán (por ejemplo, monooleato de sorbitán (SPAN 80®) , disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO) . Además, con respecto a una emulsión de agua-en-aceite, ver también la Patente Norteamericana No 6,919,084. En algunas modalidades, la fase acuosa que contiene antigeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes amortiguadores. Un ejemplo de una solución amortiguadora adecuada es solución salina amortiguada con fosfato. En una modalidad, la emulsión de agua en aceite puede ser una emulsión triple de agua/aceite/agua (W/O/W) (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,358,500). Ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en la Patente Norteamericana No. 7,371,395.
Las composiciones y vacunas inmunológicas de acuerdo con la invención pueden comprender o consisten esencialmente de uno o más adyuvantes. Adyuvantes adecuados para uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros derivados de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen uno o más unidades CpG no metiladas (Klinman y colaboradores, 1996; 98/16247), (3) una emulsión de aceite en ' agua, tal como la emulsión SPT descrita en 147 de "Vaccine Design, The Subunxt and Adjuvant Approach", Publicada por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en pl83 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternaria, por ejemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina o (8) otros adyuvantes planteados en cualquier documento citado e incorporado a manera de referencia en la presente solicitud, o (9) cualquiera de las combinaciones o mezclas de los mismos .
La emulsión de aceite en agua. (3), que es esencialmente para vectores virales, se puede basar en: aceite de parafina líquido o ligero (tipo de farmacopea Europea), aceite de isoprenoide tal como escualeno, aceite que resulta de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena recta, tal como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol , di (caprilato/caprato) , tri (caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes o ácidos grasos, ramificados especialmente ésteres de ácido isoesteárico.
El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsificantes pueden ser surfactantes no iónicos, tales como: ésteres de por otra parte sorbitán, manuro (por ejemplo, oleato de anhidromanitol ) , glicerol, poliglicerol o propilenglicol y por otra parte ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, los ésteres que son opcionalmente etoxilados, o bloques de copolimero de polioxipropileno-polioxietileno, tal como Pluronic, por ejemplo, L121.
Entre el tipo (1) de polímeros adyuvantes, se da preferencia a los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes . Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero ( Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, june de 1996) . Una persona experta en el campo también puede referirse a la Patente Norteamericana No 2,909,462, que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto de polihidroxílico que tiene por lo menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho de tales grupos, los átomos de hidrógeno de por lo menos tres grupos hidroxilo que se reemplazan por radicales alifáticos, insaturados, que tienen por lo menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA) son especialmente adecuados. Se reticulan por sacarosa de alilo o por pentaeritritol de alilo. Entre ellos, se hace referencia al Carbopol 974P, 934P y 971P.
En cuanto a los copolimeros derivados de anhidro maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto) , que son copolimeros de etileno-anhidrido maleico reticulados o de cadena y son, por ejemplo, reticulados por el éter de divinilo. La referencia también se hace a J. Fields y colaboradores, 1960.
Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA se forman preferiblemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula: en la cual: - Rl y R2, que pueden ser los mismos o diferentes, representan H o CH3 - X = 0 o 1, preferiblemente x = 1 - y = 1 o 2, con x + y = 2.
Para EMA, x = 0 y = 2 y para carbómeros x = y = 1.
Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/1 de NaCl) y el pH se puede ajustar de 7.3 a 7.4, por ejemplo, por mediante sosa (NaOH) , para proporcionar la solución adyuvante en la el vector (s) se pueden incorporar. La concentración de polímeros en la composición inmunológica o de vacuna puede variar entre 0.01 y 1.5% p/v, 0.05 a 1% p/v o 0.1 a 0.4% p/v.
La citoquina o citoquinas (5) puede estar en forma de proteína en la composición inmunológica o de vacuna, o se pueden co-expresar en el hospedero con el inmunógeno o inmunógenos o epítopo(s) del mismo. La preferencia se da a la co-expresión de la citoquina o citoquinas, ya sea por el mismo vector como aquel que expresa el inmunógeno o inmunógenos o epítopo(s) del mismo, o por un vector separado del mismo.
La invención comprende preparar tales composiciones de combinación, por ejemplo al mezclar los componentes activos, ventajosamente juntos y con un adyuvante, portador, citoquinas y/o diluyente.
Las citocinas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) , interferón ( IFNa) , interferón ß (?G?ß), interferón ?, ( IFNy) , interleucina-la ( IL-la) , interleucina-?ß (IL-?ß), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNFa) , factor de necrosis tumoral ß (???ß) y factor de crecimiento de transformante ß (?TGß) . Se entiende que las citoquinas se pueden co-administrar y/o administrar secuencialmente con la vacuna o composición inmunológica de la presente invención. De esta manera, por ejemplo, la vacuna de la presente invención también puede contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresa in vivo una citocina adecuada, por ejemplo, una citoquina igualada a este hospedero se vacuna o en la cual una respuesta inmunológica se va ha inducir (por ejemplo, una citoquina felina para preparaciones que se administran a un felino) .
En otra modalidad, la composición de la presente invención se puede preparar usando el procedimiento químico o físico como se describe por Stauffer y colaboradores, (Patentes recientes en el Anti-Infective Drug Discovery, 1, 291-296, 2006) . Algunas de las técnicas de inactivación se resumen en la tabla a continuación.
La composición y/o vacuna inmunológica de acuerdo con la invención comprenden o consisten esencialmente de o consiste de una cantidad efectiva para producir una respuesta protectora o terapéutica de uno o más vectores y/o polipéptidos de expresión como se plantea en la presente; y, una cantidad efectiva se puede determinar a partir de esta descripción, incluyendo los documentos incorporados en la presente, y conocimiento en la técnica, sin experimentación indebida .
Las composiciones o vacunas de la presente invención se pueden administrar a un animal in ovo, a través de agua para beber, oro-nasal, rocíos, aerosoles, instilación intranasal, gotas para los ojos, inmersión del pico, perforación de la red del ala, inyección transdérmica, subcutánea o intramuscular. Ventajosamente, las vacunas se administran oro-nasal, subcutánea, gotas para los ojos, rocío o agua para beber.
La presente invención contempla por lo menos una administración a un animal de una cantidad deficiente de la composición terapéutica hecha de acuerdo con la invención. La composición terapéutica de acuerdo con la invención se puede administrar mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo con un aparato Pigjet, Dermojet, Biojector, Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EÜA) ) .
En una modalidad de la invención, se puede emplear un régimen de inducción-refuerzo, que es comprendido de por lo menos una administración primaria y por lo menos una administración de refuerzo usando por lo menos una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición o vacuna inmunológica usada en la administración primaria es diferente en naturaleza de aquellos usados como un refuerzo. Sin embargo, se observa que la misma composición se puede usar como la administración primaria y la administración de refuerzo. Este protocolo de administración es llamado "inducción-refuerzo".
En otro aspecto del protocolo de inducción-refuerzo de la invención, una composición que comprende en la vacuna o composición del virus herpes NDV Avinew diseñado se administra seguido por la administración de la vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antigeno de virus herpes in vivo, o una vacuna o composición viral inactivada que comprende el antigeno de virus herpes, o una vacuna o composición que comprende una subunidad de virus herpes (proteina), o una vacuna o composición de plásmido de DNA que contiene o expresa un antigeno de virus herpes. Del mismo modo, un protocolo de inducción-refuerzo puede comprender la administración de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antigeno de virus herpes in vivo, o una vacuna o composición viral inactivada que comprende el antigeno de virus herpes, o una vacuna o composición que comprende una subunidad (proteina) de virus herpes, o una vacuna o composición de DNA plásmido que contiene o expresa un antigeno de virus herpes, seguido por la administración de una composición que comprende la vacuna o composición de virus herpes NDV Avinew diseñada. Se observa que tanto las administraciones primarias como secundarias pueden comprender la composición que comprende la vacuna o composición de virus herpes NDV Avinew diseñada. Se observa adicionalmente que tanto las administraciones primarias como secundarias pueden comprender una o más composiciones que comprenden los vectores NDV-HV diseñados de la presente invención.
Un protocolo de inducción-refuerzo comprende por lo menos una administración de inducción y por lo menos una administración de refuerzo usando por lo menos un antigeno común. La vacuna o composición usadas en la administración de inducción puede ser diferente en naturaleza de aquellas usadas como una vacuna o composición de refuerzo posterior. La administración de inducción puede comprender una o más administraciones. Similarmente, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.
Las diversas administraciones se llevan a cabo preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 semanas separadas, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas separadas. El refuerzo repetido de cada 2 a 6 semanas o también se contempla un refuerzo anual. Los animales son preferiblemente por lo menos de' un día de edad en el momento de la primera administración.
La composición y/o vacuna inmunológica contiene por dosis de aproximadamente 104 a aproximadamente 1011, de manera ventajosa de aproximadamente 105 a aproximadamente 1010 y de manera más ventajosa de aproximadamente 106 a aproximadamente 109 partículas virales de adenovirus recombinante que expresa un antigeno, epitopo o inmunógeno de virus herpes. En el caso de la composición y/o vacuna inmunológica basada en un poxvirus, una dosis puede estar entre aproximadamente 102 pfu y aproximadamente 109 pfu. La composición y/o vacuna inmunológica contiene por dosis de aproximadamente 102 a aproximadamente 107, de manera ventajosa de aproximadamente 103 a aproximadamente 105 pfu de poxvirus o virus herpes recombinante que expresa el antigeno de virus herpes, epitopo o inmunógeno de virus herpes.
El vector viral puede ser un vector de expresión avipox atenuado. En una modalidad, el vector de expresión avipox puede ser un vector fowlpox, por ejemplo, TROVACMR. En otra modalidad, el vector de expresión avipox puede ser un vector canaripox, por ejemplo, ALVACMR. El antigeno, epitopo o inmunógeno de virus herpes puede ser una glicoproteina de virus herpes, tal como gB o gD. Otros virus que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, virus de vaccinia, tales como virus de vaccinia atenuado, por ejemplo NYVAC, adenovirus y virus herpes.
La eficacia de las vacunas se puede someter a prueba aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la última inmunización al estimular animales con una cepa virulenta de virus herpes. Ambas cepas homologas y heterólogas se pueden usar para estimulación para someter a prueba la eficacia de la vacuna. El animal se puede estimular por rocío, intranasal, gotas para los ojos, oculo-nasal, IM, intra-traqueal, y/u oral. La estimulación viral puede ser de aproximadamente 103 a aproximadamente 108 en volumen dependiendo en la vía de administración. Por ejemplo, si la administración es por roció, se aeroliza una suspensión viral para generar aproximadamente 1 a 100 m de gotitas, si la administración es intra-nasal, intra-traqueal u oral, el volumen del virus de estimulación es de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 5 mi. El Volumen de dosis de las composiciones para las especies objetivo, por ejemplo, el volumen de dosis de las composiciones felinas, puede ser de aproximadamente 50 µ? para in ovo, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 µ? de gotas para los ojos, de aproximadamente 0.25 mi a aproximadamente 1 mi para roció. Los animales se pueden observar diariamente durante 14 días después de la estimulación para signos clínicos y mortalidad. Además, los grupos de animales se pueden neutralizar y evaluar para descubrimientos patológicos. Torundas orofaríngeas , traqueales o cloacales se pueden recolectar de todos los animales después de la estimulación para detección de virus. La presencia o ausencia de antígenos virales en los tejidos se puede evaluar mediante inmunohistoquímica , aislamiento o titulación viral, o detección de ácidos nucleicos tales como reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) . Las muestras de sangre se pueden recolectar después de estimulación y se pueden analizar para la presencia de anticuerpos específicos de virus gB o gD antivirus herpes.
Se debe entender por aquellas personas de experiencia en la técnica que la descripción en la presente se proporciona a manera de ejemplo y la presente invención no se limita al mismo. A partir de la descripción en la presente y el conocimiento en la técnica, el artífice experto puede determinar el número de administraciones, la via de administración, y las dosis que se usan para cada protocolo de inmunización, sin ninguna experimentación indebida.
Otra modalidad de la invención es un equipo para llevar a cabo un método para inducir una en respuesta inmunológica o protectora contra el virus herpes en un animal que comprende una composición o vacuna inmunológica NDV recombinante o una composición o vacuna inmunológica de virus herpes inactivada e instrucciones para llevar a cabo el método de suministro en una cantidad efectiva para inducir una respuestas inmune en el animal.
La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS La construcción de insertos de DNA, plásmidos y vectores virales recombinantes se llevó a cabo usando las técnicas de biología molecular estándares conocidas en el campo, por ejemplo, descritas por J. Sambrook y colaboradores. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) .
Ejemplo 1 Construcción de los plásmidos de transcripción NDV que contienen el gen gB (plásmido pFR14) y el gen gD (plásmido pFR16) de virus herpes felino (FHV) .
El gen FHV gB insertado en el^ genoma de NDV se optimizó por codón para la expresión en mamíferos. El gen FHV gB sintético (SEQ ID NO: 2) se clonó en un vector basado en pBR322 dando por resultado el plásmido pFR15 que contiene un cásete de inserción como se muestra en la Figura 3. El plásmido pFR15 se digirió con Pací y Fsel generando un fragmento Pacl-Fsel de 3105bp en tamaño. El plásmido pIV029 (US2010/0255029) se digirió con Pací y Fsel generando un fragmento Fsel-PacI de 19140bp en tamaño. Los dos fragmentos se ligaron para generar el plásmido pFRl4 (Figura 4) .
El gen FHV gD insertado en el genoma de NDV se optimizó por codón para la expresión en mamíferos. El gen FHV gD sintético (SEQ ID NO: 5) se clonó en un vector basado en pBR322 dando por resultado el plásmido pFR15 que contiene un cásete de inserción como se muestra en la Figura 3. El plásmido pFR15 se digirió con Pací y Fsel generando un fragmento Pacl-Fsel de 1373bp en tamaño. El plásmido pIV029 se digirió con Pací y Fsel generando un fragmento Pacl-Fsel de 19140bp en tamaño. Los dos fragmentos se ligaron para generar el plásmido pFR16 (Figura 4).
Ejemplo 2 Generación y caracterización del gen FHV gB que expresa el vector NDV (vAVW07) El NDV es un virus de RNA negativo y la generación del virus NDV genéticamente modificado necesita un sistema de genética inversa. La transcripción de un RNA viral genómico de longitud completa y la expresión simultánea de las proteínas NP, Py L permiten el ensamblaje de RNP y la transcripción del RNA positivo en el genoma de RNA. Esto inicia el ciclo de replicación normal del virus NDV y permite la generación de partículas infecciosas (ver Figura 2).
Para generar el vector NDV diseñado que expresa el gen FHV gB, se usaron los siguientes reactivos y condiciones. El plásmido pFR14 (ver Ejemplo 1) se usó como' el plásmido de transcripción. Los plásmidos pIV32, pIV33 y pIV34 (US2010/0255029) se usaron como los plásmidos de expresión para las proteínas NP, P y L, respectivamente. El plásmido pNS151 (US2010/0255029) se usó como el plásmido de T7 RNA polimerasa. Estos cinco plásmidos se co-transfectaron conjuntamente en células de ovario de hámster chino (CHO) , como se muestra esquemáticamente en la Figura 2C. Después de 72 horas, los sobrenadantes de CHO se inocularon en huevos embrionados de 10 días de edad para amplificar el virus. Después de 3 días, el fluido alantónico se recolectó y se verificó para actividad de hemaglutinación (HA) usando glóbulos rojos de pollo. Las partículas infecciosas de NDV- FHV gB se obtuvieron exitosamente. El RNA se extrajo usando el equipo de extracción de RNA viral QuiaAMP (Qiagen) . Se llevó a cabo la RT-PCR usando el equipo One-Step RT-PCR (Qiagen) . El resultado de la secuenciación mostró que el gB es 100% idéntico a la secuencia original del gB clonado en él plásmido de transcripción. El vector viral NDV-FHV gB recombinante es diseñado vAVW07.
Ejemplo 3 Generación y caracterización del vector NDV que expresa el gen FHV gD (vAVW08) Para generar el vector NDV diseñado que expresa el gen FHV gD, se usaron los siguientes reactivos y condiciones. El plásmido pFR16 (ver Ejemplo 1) se usó como el plásmido de transcripción. Los plásmidos pIV32, pIV33 y pIV34 (US2010/0255029) se usaron como los plásmidos de expresión para las proteínas NP, P y L proteínas, respectivamente. El plásmido pNS151 (US2010/0255029) se usó como el plásmido de T7 RNA polimerasa. Estos cinco plásmidos se co-transfectaron conjuntamente en células de ovario de hámster chino (CHO) , como se muestra esquemáticamente en la Figura 2C. Después de 72 horas de transfección de la célula CHO, los sobrenadantes de CHO se inocularon en huevos embrionados de 10 días de edad para identificar el virus. Después de 3 días, el fluido alantónico se recolectó y se verificó para actividad de hemaglutinación (HA) usando glóbulos rojos de pollo. Las partículas infecciosas de NDV-FHV gD se obtuvieron exitosamente.
El RNA se extrajo usando el kit de extracción de RNA viral QuiaAMP (Qiagen) . Se llevó a cabo la RT-PCR usando el equipo One-Step RT-PCR (Qiagen) . Se usaron dos cebadores en la reacción RT-PCR: FR09: CGCAGCTGCAATCAATTCAG (SEQ ID NO: 25) FRIO: TGGGTGGACAGGGATCTGCT (SEQ ID NO: 26) El resultado de la secuenciación mostró que el gen gD es 100% idéntico a la secuencia original del gen gD clonado en el plásmido de transcripción. El vector viral NDV-HV gD recombinante se designa VAVW08.
Ejemplo 4 Evaluación clínica de la vacuna NDV-HV en gatos Treinta y dos gatos SPF (sin patógenos específicos) de 9-11 semanas se incluyeron en el estudio. Los gatos se asignaron aleatoriamente a 4 grupos de 8 gatos (grupos A a D) de acuerdo con la carnada, sexo y edad al usar una tabla de aleatorización con 4 elementos. Los gatos fueron atendidos y alojados de acuerdo con la cría de animales locales y procedimientos de bienestar animal.
El diseño experimental se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1 diseño experimental para vacunación en gatos * NDV-HV=NDV-HV gB y NDV-HV gD, ambos a 107"8 EID50/mL **ON=oro-nasal SC=subcutáneo ***control positivo = vacuna que contiene la cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited.
En DO y D28, se diluyeron vacunas NDV-HV gB y NDV-HV gD 1/25 y 1/35, respectivamente, a fin de alcanzar un titulo de 107'8 EIDso/mL para ambas vacunas. Luego, cada gato del grupo A recibió bajo anestesia general 1 mL de la vacuna NDV-HV (NDV-HV gB y NDV-HV gD) mediante la via oro-nasal (0.25 mL por fosa nasal y 0.5 mi en la boca). Los gatos del grupo B recibieron 1 mL de la vacuna NDV-HV mediante la via subcutánea entre los hombros. Los gatos del grupo C recibieron una dosis de la vacuna de control mediante la via subcutánea entre los hombros. Los gatos del grupo D no se vacunaron .
En D45, cada gato se le administró bajo anestesia general 1 mL de la cepa de estimulación 1/50 diluida 105,56CCID50/mL (0.25 mL por fosa nasal y 0.25 mL por ojo).
La prueba de temperatura rectal se muestra en la Figura 5. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited) , el grupo D es control (sin vacunación) . El resultado mostró que en el grupo de control, 7/8 gatos tuvieron hipertermia . · En los grupos de vacunación, no hubo hipertermia con control positivo y NDV-HV por ON, hubo hipertermia en 4/8 gatos vacunados con NDV-HV por SC.
El resultado del peso corporal se muestra en la Figura 6 y Tabla 2. Todos los gatos ganaron peso durante la fase de inmunización y el crecimiento fue similar entre los grupos .
Después de la estimulación (pe) , en el grupo D, todos los gatos perdieron peso en el día 4 pe al día 8 pe. Algunos gados (3 de 8) perdieron peso hasta el día 10 pe. Luego todos los gatos ganaron peso. Durante el periodo de supervisión después de la estimulación, se registró una pérdida de peso >5% en 6 de 8 gatos en una o dos ocasiones. En el grupo C, se observó una pérdida de peso en 6 de 8 gatos entre el día 4 pe y el día 6 o dia 8 pe. Esta pérdida de peso fue > 5% en 4 gatos. En el grupo B, todos los gatos perdieron peso entre el día 4 y el día 6 o el día 8 pe. Se observó una pérdida de peso >5% una vez en solamente 2 gatos.
Tabla 2 pérdida de peso observada durante el periodo de supervisión después de la estimulación La Figura 7 muestra los registros clínicos medios por grupo después de la estimulación y la tabla 3 resume los síntomas clínicos observados. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited), el grupo D es control (sin vacunación). En el grupo D, todos los gatos desarrollaron signos clínicos después de la estimulación. En el grupo A, un gato no mostró ningún signo clínico después de la estimulación, 3 gatos presentaron solamente ligera descarga nasal durante un día o descarga ocular ligera durante 2 días. Los otros gados del grupo A, los gatos del grupo B y los gatos del grupo C presentaron signos clínicos menos graves y más transientes que los gatos en el grupo D.
Tabla 3 resumen de los signos clínicos observados por grupo después de la estimulación La Figura 8 muestra la distribución del registro clínico global por grupo. El registro clínico global medio fue: 7.5 en el grupo A, 18.6 en el grupo B, 17.4 en el grupo C, y 33.8 en el grupo D. Hubo una diferencia significativa entre el grupo D y los tres grupos vacunados. Hubo una diferencia significativa en el registro global clínico entre los tres grupos vacunados (ANOVA, p=0.018). Los gatos del grupo A mostraron un registro global clínico significativamente reducido que los gatos de los grupos B y C. No hubo diferencia significativa para el registro clínico global entre los grupos B y C.
La Figura 9 muestra la diseminación viral media por grupo después de la estimulación y la tabla 4 resume el AUC medo por grupo. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, Merial Limited), el grupo D es control (sin vacunación).
Tabla 4 Área Bajo la Curva (AUC) media por grupo Ningún gato diseminó el virus herpes felino antes de la estimulación. Después de la estimulación, el FHV se aisló en todos los gatos. En el grupo D, la excreción se incrementó rápidamente y alcanzó el máximo en el día 4 pe, luego disminuyó regularmente hasta el dia 14 pe. En el día 14 pe, 5 de 8 gatos aun diseminaron bajas cantidades de virus. En los grupos vacunados, la excreción viral alcanzó el máximo en el dia 4 pe en los grupos B y C o en el dia 6 pe en el grupo A, luego disminuyó más rápidamente que en el grupo D. En el dia 14 pe, ningún gato diseminó virus.
La Figura 10 muestra la distribución del registro de diseminación' viral global por grupo. La diseminación viral se redujo significativamente y los grupos vacunados se compararon con el grupo D (sin vacunación) . Aunque los gatos del grupo A diseminaron virus después que los otros grupos vacunados, no hubo diferencia estadísticamente significativa en la excreción viral entre los tres grupos vacunados (ANOVA, p=0. 64) .
Los datos de serologia (FHV Ab anti-gB) se muestran en la Figura 11. El grupo A es NDV-HV por ON, el grupo B es NDV-HV por SC, el grupo C es control positivo (vacuna que contiene cepa F2 de virus herpes felino atenuado, erial Limited), el grupo D es control (sin vacunación). Todos los gatos fueron cero negativos para gB-FHV en DO. Todos los gatos en el grupo D permanecieron cero negativos hasta el día de la estimulación. Todos los gatos en el grupo D fueron positivos para gB FHV Ab después de D28. Una inyección de NDV-HV por SC u ON fue suficiente para inducir una cero-conversión en todos los gatos. La estimulación indujo un efecto de refuerzo en todos los vacunados y la producción de FHV Ab en todos los gatos de control. Los datos de serologia se correlacionan bien con los resultados clínicos.
Habiéndose descrito de esta manera con detalle modalidades preferidas de la presente invención, se va a entender que la invención definida por los párrafos anteriores no se va a limitar a detalles particulares expuestos en la descripción anterior ya que muchas variaciones evidentes de la misma son posibles sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.
Todos los documentos citados o referidos en los documentos citados por la solicitud, y todos los documentos citados o referidos en la presente ("documentos citados en la presente") , y todos los documentos citados o referidos en los documentos citados en la presente, junto con cualquier instrucción, descripciones, especificaciones de producto, y hojas de producto del fabricante para cualquier producto mencionado en la presente o en cualquier documento incorporado a manera de referencia en la presente, se incorporan por este acto en la presente a manera de referencia, y se pueden emplear en la práctica de la invención .

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Una composición o vacuna, caracterizada porque comprende (i) uno o más vectores de virus herpes de Virus de Enfermedad de Newcastle (NDV) recombinantes y (ii) un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable.
2. La composición tí vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el vector de virus herpes NDV recombinante comprende uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más de antigeno, polipéptido de virus herpes o variante de los mismos.
3. La composición o vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el Antigeno o polipéptido de virus herpes es una glicoproteina B (gB) o glicoproteina D (gD) del virus herpes o variante de la misma.
4. La composición o vacuna de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizada porque el vector de virus herpes NDV recombinante comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: .
5. La composición o vacuna de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizada porque el vector de virus herpes NDV recombinante comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 2, 3, 5 o 6.
6. La composición o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque la composición o vacuna comprende uno o dos vectores de virus herpes NDV.
7. La composición o vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la composición o vacuna comprende un primer vector recombinante de virus herpes NDV que comprende un antigeno gB de virus herpes o variante del mismo y un segundo vector recombinante de virus herpes NDV que comprende un antigeno gD de virus herpes o variante del mismo.
8. La composición o vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la composición o vacuna comprende un vector recombinante de virus herpes NDV que comprende un antigeno gB de virus herpes o variante del mismo, un antigeno gD de virus herpes o variante del mismo, o una combinación de los mismos.
9. La composición o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizada porque el vector recombinante de virus herpes NDV comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4.
10. La composición o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizada porque el vector de virus herpes NFV recombinante comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 2, 3, 5 o 6.
11. Un vector de virus herpes NDV recombinante, caracterizado porque comprende uno o más polinucleótidos que codifican un antigeno gB de virus herpes o variante del mismo, o un antigeno gB de virus herpes o variante del mismo, o una combinación de los mismos.
12. El vector de virus herpes NDV recombinante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el uno o más polinucleótidos codifican uno o más polipéptidos que tienen por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: l o SEQ ID NO : .
13. El vector de virus herpes NDV recombinante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el uno o más polinucleótidos tienen por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 2, 3, 5 o 6.
1 . El vector de virus herpes NDV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque el vector de virus herpes NDV comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1.
15. El vector de virus herpes NDV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque el vector de virus herpes NDV comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: .
16. El vector de virus herpes NDV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque el vector de virus herpes NDV comprende dos polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: .
17. El vector de virus herpes NDV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16, caracterizado porque el uno o más polinucleótidos se insertan en las regiones no esenciales del genoma de NDV Avinew.
18. Un método para inducir una respuesta protectora en un animal contra el virus herpes, caracterizado porque comprende administrar al animal un vector de virus herpes NDV recombinante que expresa por lo menos un antigeno de virus herpes y un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el vector de virus herpes NDV comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: .
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, caracterizado porque la administración es por administración oro-nasal, gotas para los ojos, rocío, agua para beber, in ovo, intramuscular, o administración subcutánea, intradérmica , transdérmica .
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque la administración es por inducción-refuerzo.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, caracterizado porque el animal es un felino o canino.
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