MX2011010610A - Metodo para el tratamiento de leucemia mieloide aguda. - Google Patents
Metodo para el tratamiento de leucemia mieloide aguda.Info
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Abstract
La invenci6n se relaciona al campo de la medicina molecular y proporciona métodos para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda. Estos métodos se basan en la observación de que microARN-9 y microARN9* están implicados en la patogénesis de la enfermedad ya que la sobre expresión de microARN9/9* bloquea la diferenciación mieloide in vitro. Más en particular, los microARN-9/9* son encontrados para jugar un papel en la transformación leucémica en leucemia mieloide aguda.
Description
METODO PARA EL TRATAMIENTO DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA
Campo de la Invención
La invención se relaciona al campo de la medicina molecular y proporciona métodos para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda. Estos métodos se basan en la observación de que microAR -9 y microARN- 9* están implicados en la patogénesis de la enfermedad ya que la sobre expresión de microR a- 9/9* bloquea la diferenciación mieloide in vitro. Más en particular, se encuentra que microAR -9/9* juegan un papel en la transformación leucémica en leucemia mieloide aguda .
Antecedentes de la Invención
La leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés) es una enfermedad maligna remarcablemente heterogénea, caracterizada por el crecimiento clonal incontrolable de células progenitoras hematopoyéticas , bloqueadas en diferentes etapas de la diferenciación. La biología clínica variable y la prognosis está determinada principalmente por las anormalidades citogenéticas somáticas por ejemplo, las anormalidades t(15;17), j^t(8;21), inv(16), llq23, 3q26 y el card.otipo raonosoraal (1-3) y una variedad de mutaciones genéticas. Los ejemplos prominentes son mutaciones en nucleofosmin- 1 (NPM1 por sus siglas en inglés) , receptor de tirosina quinasa como fms (FLT3- duplicaciones aleatorias
REF.:224181 interenales (ITD por sus siglas en inglés) ) y CCAAT factor de transcriipción de enlace CEBPA (4-7). Estas aberraciones genéticas adquiridas pueden coexistir y son pensadas para cooperar sinergísticamente en el desarrollo de la leucemia.
La patogénesis de AML es un proceso multietapas que afecta la diferenciación, proliferación y apoptosis celular que lleva por último a la transformación maligna de los progenitores hematopoyéticos . La noción patogenética es que por lo menos dos, probablemente en la mayoría de los casos múltiples golpes son requeridos para transformación leucémica. Una categoría de las anormalidades genéticas (clase 1) , resulta en activación constitutiva de señalización proliferativa e implica señalar moléculas como RAS, FLT3 y c- IT . Un segundo tipo de lesiones (clase 2) como la formación de genes de fusión, como un resultado de las lesiones cromosomales t(8;21) o inv(16) que implican factores de transcripción resultan en un bloque de diferenciación mieloide. Varios estudios en los modelos de ratones establecen la cooperación de ambos tipos de regulación en desarrollo de AML.
Hay una caudal de información en genes expresados aberrantemente en AML. Usualmente, la diagnosis de AML y sus subgrupos clínicos se basa en la expresión de perfiles de genes referidos colectivamente como clasificadores.
Se ha demostrado recientemente que el perfil de expresión microARN en AML también revela perfiles de expresión de microARN altamente distintivos (8) .
Los microARN son una clase de ARN no codificantes pequeños que regulan posttranscripcionalmente la expresión de genes (9) . Ellos regulan la expresión de genes por formar pares de bases con las secuencias en la región 3' no traducida (3'UTR) de ARNm por lo mismo reprimiendo la traducción o induciendo la degradación de sus transcripciones de ARNm objetivas. A la fecha, más de 400 microARN han sido descritos en los humanos; sin embargo, la función precisa de estos ARN no codificantes, regulatorios permanece bastante oscuro .
Los microARN expresados diferencialmente parecen caracterizar los genotipos de AML particulares. Los varios microARN supresores de tumores y oncogénicos establecidos, como microARN-155 , microARN-21 y let-7 parecen estar asociados con los subtipos genéticos específicos de AML(8).
Lu et al. (10) muestran que los patrones de actividad de genes de microARN pueden distinguir entre varios tipos de cánceres humanos. Ellos miden la actividad de 217 genes que codifican microARN en un nuevo método de perfil de expresión de microARN citométrico de flujo a base de perlas. Las firmas de microARN pueden por lo tanto permitir la clasificación del cáncer. Este descubrimiento puede permitir determinar el tipo de tejido original el cual genera un cáncer y objetiva un curso de tratamiento en base al tipo de tejido original. Lu et al., observan una regulación descendente general de microARN en tumores comparados con los tejidos normales.
Adicionalmente , son capaces de clasificar exitosamente tumores diferenciados deficientemente usando perfiles de expresión de microARN, mientras que los perfiles de ARN mensajeros son altamente inexactos cuando se aplican a los mismos ejemplos. Estos descubrimientos resaltan el potencial del perfil de microARN en diagnóstico del cáncer.
Estudios recientes han mostrado una asociación entre las firmas de expresión de microARN y subgrupos citogenéticos de AML(8, 11, 12) . Adicionalmente, se demuestra que la firma de expresión de microARN que contiene microRNa-233, 128a-128b y let7b pueden distinguir exactamente AML de la leucemia linfoblástica aguda ALL (por sus siglas en inglés) (13) .
La expresión incrementada de microARN-191 y 199a se asocia con deficiente sobreviviencia en un estudio AML (12) .
Una firma microARN de AML normal citogenéticamente se identifica y es predictiva para prognosis adversa (14) .
Otro estudio muestra que la aglomeración let-7/miR-98 es regulada descendente y comúnmente mientras que microARN-21, microARN- 155 , microARN- 18Ib, ¦' microARN-221 y microARN-222 son regulados ascendentemente en forma frecuente en tanto tumores sólidos y hematológicos (15) .
Chen y colegas (16) son los primeros que clonan microAR a partir de la médula ósea de ratón normal y encuentran microAR -223 , 142 y 181 preferentemente expresados en tejido hematopoyético . MicroARN-233 es encontrado para ser expresado en bajos niveles en progenitores hematopoyéticos CD34+ (HPC por sus siglas en inglés) y esta expresión se incrementa durante la diferenciación mieloide hacia granulocitos .
No obstante el hecho de que estos y otros estudios proporcionan información importante para la diagnosis de AML, no proporcionan señales para nuevas terapias para AML, ya que no se ha establecido si la sobre expresión o bajo expresión de un gen particular o microARN es un epifenómeno o contribuye a la patogénesis de la enfermedad.
Solamente unas cuantas publicaciones han aparecido recientemente en la relevancia de microARN en la terapia del cáncer. Un estudio de ratones alterados para producir c-myc en exceso - una proteína implicada en varios cánceres-muestra que el policistron 17-92 miARN tiene un efecto en el desarrollo del cáncer. Los ratones que son modificados para producir un excedente de tipos de microARN encontrados en células de linfoma desarrollan la enfermedad dentro de 50 días y mueren dos semanas más tarde. En contraste, los ratones sin el excedente de microARN viven más de 100 días (17) . Estos estudios indican que AR no codificantes, específicamente microAR , pueden modular la formación tumoral, e implican la aglomeración microARN-17-92 como un oncogén humano potencial .
La sobre expresión de microARN- 125b, que es enlazada directamente a t(2;ll) parece abrogar la diferenciación celular mieloide in vitro implicando una función de este microARN en leucemogenesis (18).
La sobre expresión de microARN- 155 en médula ósea de ratón expande la población de granulocitos/monocitos con características patológicas de neoplasia mieloide (19) .
En AML, la sobreregulación de microARN-155 es asociada con mutaciones en el gen del receptor de quinasa tirosina quinasa 3 similar a Fms (Fit3), así llamado FLT3-ITD.
En un estudio reciente la expresión incrementada de microARN- 196b por proteínas de fusión LL ha sido sugerida para contribuir al desarrollo de AML por medio de capacidad de proliferación celular incrementada y sobrevivencia así como también bloqueo parcial en diferenciación in vitro (20) .
Otro estudio encuentra que dos tipos de microARN (miARN-17-5p y miARN-20a) inhiben la proteína E2F1, lo cual regula la proliferación celular.
Johnnidis et al (21) , que usa una pérdida de función de alelos en ratones, demuestra que microARN-223 regula negativamente la proliferación del progenitor y diferenciación de granulocito por objetivar Mef2c, un factor de transcripción que promueve la proliferación del progenitor mieloide .
Usando un modelo de línea celular de leucemia promielocítica aguda, ha sido propuesto un modelo de auto regulación de microARN-223 , CEBPA y NF1A (22). Adicionalmente , PU.l se sabe que sirve activar la transcripción de microARN-223 en ratones (23) .
MicroAR diferenciales y significativamente expresados durante la diferenciación de monocitos/micrófagoa de la línea celular HL60 son identificados (24) . Además de los resultados obtenidos a partir de los modelos de las líneas celulares (25, 26) están disponibles datos muy limitados en perfiles de expresión de microA durante la diferenciación mieloide normal usando células humanas primarias (27) .
Los estudios funcionales han demostrado que let-7/miR-98 regula negativamente RAS (28) y el homólogo de oncogen v-myc de mielocitomatosis viral (MYC) (29) mientras que microARN-21 regula negativamente la muerte celular programada 4 (PDCD4) (30) y fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) (31) .
A pesar de estos descubrimientos, permanece una necesidad para objetivos adicionales y más específicos para el tratamiento de cánceres, en particular para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (AML) .
Sumario de la Invención
Se identifican microARN candidatos con expresión aberrante en AML cuando se comparan con progenitores hematopoyéticos normales. Los MicroARN-9/9* aparecen fuertemente sobreexpresados en un gran número de muestras de AML y está implicado activamente en el proceso de transformación .
Por otra parte, se encuentra que microARN- 9/9* proporciona un objetivo atractivo para la terapia de leucemia mieloide aguda. Los presentes experimentos muestran que microRNa- 9/9* induce un bloque en diferenciación granulocítica en el factor de crecimiento de murino dependiente a la línea celular mieloide 32D in vitro. Esto lleva a concluir que la leucemia mieloide aguda puede ser tratada efectivamente por interferir con el enlace entre microARN- 9/9* y sus objetivos.
La invención por lo tanto se relaciona a un método para el tratamiento de AML en donde se administra una composición terapéutica a un paciente en necesidad del mismo la cual comprende como un ingrediente activo un compuesto capaz de interactuar con el enlace entre microARN-9/9* y su objetivo.
Breve Descripción de las Figuras
Figura 1: microARN-9 es significativamente sobre expresado en AML humano primario
El software SDS 2.3 (Applied Biosystems) es usado para analizar los datos de expresión de microARN-9 obtenidos por RT-PCR de tiempo real. La media geométrica de varios expresiones de snARN (ARN nucleares pequeños) es usada para normalización interna. El método de cuantificación relativo comparativo, 2-ddCt es usado para calcular la expresión relativa (cambio duplicado) de microARN-9 en AML comparados con las células CD34+ normales. Se presenta la expresión relativa (cambio duplicado) de microARN-9 en el eje vertical para todas las muestras 215 muestras de AML en el cohorte (eje horizontal) .
Figura 2: microARN-9 es sobreexpresado significativamente en AML humano primario.
Se usa el software SDS 23 (Applied Biosystem) para analizar los datos de expresión de microARN-9 obtenidos por RT-PCR de tiempo real. La expresión de R U48 es usada para normalización interna. La expresión relativa a los controles internos representados por los valores -dCt está presentada en el eje vertical para las etapas de maduración granulocíticas diferentes para todas las 215 muestras AML en el cohorte (eje horizontal) .
Figura 3: MicroARN9* es sobre expresado significativamente en AML humano primario
El software SDS 2.3 (Biosystem aplicado), se usa para analizar los datos de expresión de microARN-9* obtenidos por RT-PCR de tiempo real. La media geométrica de expresión de R U24 y RNU66 se usa para normalización interna. La expresión relativa a los controles internos de miR-9* representada por los valores -dCt es presentada en el eje vertical para todos los 215 pacientes de AML en el cohorte (eje horizontal) .
Figura 4: expresión de microR a- 9/9* en granulopoyesis humana normal
Se usa el software SDS 2.3 (Applied Biosystem) para analizar microARN-9 (y datos de expresión de miR-9* obtenidos por RT-PCR de tiempo real. La expresión de RNU48 es usada para normalización interna. Se presenta la expresión relativa para los controles internos por los valores -dCt en el eje vertical para las diferentes etapas de maduración granulocíticas .
Figura 5: sobre expresión de microAR - 9/9* en la línea celular 32D lleva a bloqueo en la diferenciación mieloide
Se transducen el microARN- 9/9* o vector de control en la línea celular de leucemia mieloide (32D) usando el vector retroviral que contiene el reportador GFP (proteína fluorescente verde) . Las células con alta expresión de GFP son clasificadas y usadas en un ensayo de proliferación/diferenciación. La sobreexpresión de microARN-9/9* no tiene efecto en la capacidad de proliferación de células 32D que crecen en el medio complementado con IL-3. Sin embargo, cuando se hacen crecer en medio que contiene G-CSF, las células transducidas de microARN- 9/9* continúan con la proliferación mientras que las células transducidas con el vector de control disminuyen el crecimiento.
Figuras 6-11: Efecto negativo del inhibidor de microARN- 9* en proliferación de las células de AML humanas primarias
Un inhibidor antisentido a base de ácido nucleico cerrado (LNA, por sus siglas en inglés) contra miR-9* ó un inhibidor de control es introducido en las células de blastocitos de AML aisladas frescas por transfección usando una concentración de 150 mM. La proliferación de las células blastocitas del tipo silvestre de AML o células transíectadas con el control y el inhibidor de miR-9* es medida bajo varias condiciones de estimulación de citocina usando el ensayo de incorporación de (3H) timidina por triplicado. Dos muestras independientes de diferentes pacientes con AML (muestra 1 y II) muestran una disminución en la proliferación celular ante tratamiento con inhibidor contra miR-9* como se compara con el inhibidor de control y células de control del tipo silvestre .
Descripción Detallada de la Invención
Se encuentra que microARN- 9/9* juega un papel en la transformación leucémica en leucemia mieloide aguda AML.
Como se usa en la presente, el término miARN 9/9* es propuesto para indicar microAR 9 y/o microARN9* .
Los microAR son ARN de cadena sencilla de 18-25 nucleótidos y son generados a partir de moléculas precursoras. Los microARN son codificados en el genoma y transcritos por ARN polimerasa II como transcripciones primarias llamadas pri-microARN los cuales son procesados en el núcleo en uno o más microARN precursores (pre-microARN por sus siglas en inglés) por la ARNsa III nuclear, Drosha, y la proteína de enlace de ARN de doble cadena, Pasha/DGCR8 (32, 33) . En el citoplasma, otra ARNsa III, conocida como Dicer, procesa además el pre-microARN en microARN maduro de 23 nucleótidos de doble cadena. Este dúplex microARN (34) comprende una cadena (cadena microARN) la cual es incorporada en el complejo silencioso inducido por ARN (RISC por sus siglas en inglés) y una cadena complementaria (cadena microARN*) , la cual es usualmente degradado.
Hay varias excepciones en donde la cadena de microARN* madura es también co-expresada . Esto es el caso con microARN- 9, ya que también microARN- 9* es usualmente expresada y no es degradada.
El RISC funcional que porta microARN- 9 y/o microARN- 9* madura puede enlazar a 3'UTR de su ARNm de gen objetivo para resultar en ya sea degradación de ARNm o inhibición de traducción de proteína (35, 36) .
Los genes que codifican microARN-9 y microARN-9* están ubicados en cromosomas humanos 1 (miR-9-l) , 5(miR-9-2) y 15 (miR-9-3) . Ante procesamiento de estos diferentes precursores de microARN-9, se derivan el microARN-9 (UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA, SEQ ID N0:1) y microARN-9* (AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU, SEQ ID NO .2 ) maduro bastante complementarios .
Se enriquece microARN-9 en cerebro y parece importante en desarrollo cerebral y confinamiento de linaje (37, 38) . En pescado cebra, microARN-9 es importante para la definición de limite de cerebro medio-cerebro posterior (39) . En desarrollo cortical de ratón, microARN-9 parece necesario para diferenciación apropiada de las células Cajal-Retzius (40) . MicroARN-9 regula REST y CoREST y es regulado descendentemente en enfermedad de Huntington (41) . MicroARN-9 es sobreregulado en una línea celular de neuroblastoma humano por ácido retinoico y es modulado descendentemente en tumores de neuroblastoma primarios (42). La expresión incrementada de microARN9 ha sido descrita en pacientes con AML con subtipo NPMc+ (Ramiro et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, (2008) 105, 3945-3950) y en subtipo llq23 (Jongen-Lavrencic et al., Blood (2008) 111; 5078-5088).
La expresión incrementada de microARN-9, la cual es expresada en células beta, daña la liberación de insulina estimulada con glucosa (43) . La última perturbación de las funciones secretorias se asocia con un incremento en el nivel de granufilina (SYTL4) un efector Rab3/Rab27 que juega un papel modulatorio negativo en la exocitosis de insulina.
MicroARN- 9 ha sido también demostrado para ser expresado diferencialmente en etapas sucesivas en el curso de carcinogénesis bronquial (44) . Roccaro et al (45) identifican una firma de microARN específica de Macroglulinemia de Waldenstrom con expresión disminuida de microARN-9. Recientemente la hipermetilación y expresión disminuida de microARN-9 en leucemia linfoblástica aguda (ALL por sus siglas en inglés) ha sido reportada correlacionando con la solución clínica de estos pacientes (46) .
Se ha encontrado en la presente que microARN- 9 y microARN9* son tanto sobreexpresados significativamente en AML humano primario. Se realiza en la presente un análisis supervisado usando un análisis de significancia de microdisposición (SAM por sus siglas en inglés) .
La expresión de microARN de todas las muestras de AML es comparada con los patrones de expresión de microARN de las células CD34+ de médula ósea normales. Uno de los microARN más discriminantes son microARN- 9 y microARN- 9*, que aparecen ambos para ser más de 100 veces sobreregulados en AML. Esto es mostrado en la Figura 1 para microARN- 9 y en las Figuras 2 y 3 para microARN 9 y 9* . Los resultados obtenidos para microARN-9* son comparables si no es que idénticos a los resultados obtenidos para microARN9.
Adicionalmente , se encontró que microARN-9 y microAR 9* no son expresados o solamente en un nivel muy bajo durante la mielopoyesis normal. Se estudia el papel de microARN-9 y microARN9* en la diferenciación hematopoyétierna se evalúa su expresión a través del desarrollo mieloide en poblaciones celulares altamente purificadas a partir de la médula ósea normal y durante el ensayo de diferenciación mieloide in vitro de células CD34+ humanas normales.
Usando ambos procedimientos la expresión de microARIM-9 y microARN-9* está en el nivel de detección del ensayo de RT-PCR cuantitativo en progenitores mieloides y permanece de tal forma que la diferenciación granulocítica procede a través de promielocitos , metamielocitos para madurar los neutrófilos. Esto es mostrado en la Figura 4.
Estos datos muestran que microARN-9 y microARN-9* no tienen una función en la diferenciación mieloide normal. Se concluye en la presente que la expresión aberrante de microARN-9/9* en AML como se detalla anteriormente se asocia con la leucemogénesis más que refleja la etapa de diferenciación de AML. Además, se encontró que miRNa-9/9* induce un bloque en la diferenciación mieloide de células 32D (línea celular de leucemia mieloide de murino) y células de médula ósea de murino primarias in vitro. Para ese propósito, microARN-9/9* es transducido retroviralmente en la línea celular 32D. Esta línea celular es conocida para proliferar cuando se agrega la interleucina-3 (IL-3) al medio pero es capaz de diferenciarse hacia los neutrófilos cuando IL3 es reemplazado por el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF por sus siglas en inglés) . Usando tinción celular de hematocitología (citospinas) de las células 32D se observa un bloque en la diferenciación bajo las condiciones de 11-3 y persistente proliferación celular bajo la condición G-CSF (Figura 5) . Adicionalmente , microARN-9 y microARN-9* son también introducidos en células de médula ósea de murino primario. La sobre expresión de microAR - 9/9* resulta en números disminuidos de neutrófilos maduros (CDllb + Grl + células) in vitro como se define por citometría de flujo. Esto corrobora los descubrimientos de la presente en la línea celular 32D.
Se realizan las tinciones de citospina en varios puntos de tiempo (día 0, 3, 7, 10, 15) durante el ensayo de diferenciación con G-CSF. Las células 32D transducidas con vector de control son diferenciadas de blastocitos en el día 0, para maduras completamente los granulocitos en el día 7. En forma interesante, en las células 32D transducidas con microARN- 9/9* se observan bloques en diferenciación, ya que no se observan granulocitos maduros en el día 7 y todos los puntos de tiempo tardíos.
Adicionalmente , se introduce microARN- 9/9* a las células de médula ósea de murino primarias. La sobreexpresión microARN- 9/9* usando vector retroviral resulta en porcentaje disminuido de neutrófilos maduros (CDllb+ Grl+ células) in vitro examinadas por inmunofenotipificación .
En la presente se es capaz de inhibir la proliferación de células AML humanas primarias por ponerlas en contacto con el inhibidor de miARN 9* . Esto es mostrado en las Figuras 6 a 11. Un inhibidor antisentido en base a LNA (ácido nucleico cerrado) contra miR-9* o un inhibidor de control es introducido en células de blastocitos de AML aisladas por transfección usando una concentración de 150 mM. La proliferación de las células blastocitas del tipo silvestre de AML o células transfectadas con inhibidor de control y miR-9* es medida bajo varias condiciones de estimulación de citocina usando el ensayo de incorporación de timidina (3H) por triplicado. Dos muestras de AML independientes obtenidas de diferentes pacientes muestra una disminución en la proliferación celular ante tratamiento con inhibidor contra miR-9* como se compara con el inhibidor de control y las células de control del tipo silvestre.
En resumen, se encuentra que la sobre expresión de microARN-9/9* resulta en fenotipo funcional, es decir bloque en diferenciación mieloide. En base a estos resultados se concluye que microARN- 9/9* juega un papel en la transformación leucémica en AML. En la presente se es capaz de mostrar también que los inhibidores de microARN- 9/9* en efecto bloquean efectivamente la proliferación de células de blastocito de AML. Con estos mismos inhibidores pueden probarse compuestos terapéuticos efectivos para inhibir la proliferación celular en AML, en otras palabras, los compuestos que interfieren con el enlace de microARN- 9 o microARN- 9* a sus objetivos pueden ser útiles en el tratamiento de AML.
Los descubrimientos como se detallan anteriormente hacen posible intervenir con la interacción de microARN-9/9* y sus objetivos celulares, por lo mismo proporcionando un método para el tratamiento de AML. La invención por lo tanto proporciona un método para el tratamiento de AML en donde se administra una composición terapéutica a un paciente en necesidad de la misma la cual comprende como un ingrediente activo un compuesto capaz de interactúar con el enlace entre microARN- 9 ó 9* y sus objetivos.
En la alternativa, la intervención puede estar en el nivel de transcripción de microARN- 9/9* y/o procesamiento de tal forma que el nivel de microARN-9/9* maduro en la célula es disminuido. Por lo tanto, la invención también se relaciona a un método para el tratamiento de AML en donde se administra una composición . terapéutica a un paciente en necesidad de la misma la cual comprende como un ingrediente activo un compuesto capaz de disminuir el nivel celular de microAR - 9/9* , preferentemente de microARN- 9 ó 9* maduro.
Esto puede ser efectuado por proporcionar un compuesto que interfiere con la transcripción o procesamiento de microARN-9 9* precursor. La invención por lo tanto preferentemente se relaciona a un método como se describe anteriormente en donde el compuesto es capaz de interferir con la transcripción o procesamiento de microARN-9/9* precursor .
Los compuestos, los cuales son capaces de interferir con la interacción de microARN-9 y/o microARN-9* y sus objetivos son conocidos en la técnica. Ellos pueden estar en dos categorías : primero la clase de compuestos que interfieren con el enlace por bloquear el sitio de enlace o el objetivo y lo hacen inaccesible para microARN- 9/9* y segundo la clase de compuestos que enlazan a microARN-9/9* para evitarlos de enlazar a sus objetivos.
La primera clase de compuestos puede ser desarrollada de tal forma que son específicos para cada objetivo. Esto es un procedimiento de rutina para la persona experta ya que las secuencias de los objetivos de ARN de microARN-9/9* son conocidos y nucleótidos complementarios pueden ser fácilmente desarrollados.
Con el fin de desarrollar los compuestos, la persona experta puede estar consciente de los principios de reconocimiento de microAR -obj etivo . Estos son detallados en Brennecke et al., PLOS Biology, (2005) 3(3) e85; 0404-0418. Varios algoritmos in silico en base a web son también disponibles (www.targetscan.org; www.pictart.org; www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/predicting) para la predicción de objetivos de microARN potenciales en base a la siembra de miARN y conservación. Es importante notar en este aspecto que microARN- 9 y microARN- 9* regulan un grupo completamente diferente de objetivos ya que no están compartiendo la misma secuencia de siembra.
La segunda categoría de compuestos que son capaces de interferir con la interacción de microARN- 9 y/o microARN-9* y sus objetivos son la clase de compuestos que enlazan a microARN- 9 ó 9* y evitan su enlace a cualquier objetivo de microARN- 9 ó 9*.
En una modalidad preferida, los compuestos capaces de interferir con la interacción de microARN- 9 y/o microARN-9* y sus objetivos son compuestos los cuales comprenden una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria a la secuencia de microARN-9 ó 9* madura, más en particular las secuencias mostradas en SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO: 2. Preferentemente, los compuestos son esencialmente complementarias a por lo menos 6 nucleótidos consecutivos, como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó más nucleótidos. Los compuestos hibridizan efectivamente a microAR - 9/9* bajo condiciones fisiológicas con el fin de evitar que microARN-9/9* se enlace a sus objetivos. Preferentemente, el compuesto hibridiza al total de microR a-9 ó microARN-9*.
Los compuestos son conocidos en la técnica y son incluso comercialmente disponibles. Ejemplos bien conocidos de los compuestos son llamados antagomires (Exiqon) y antimires (Dharmacon) .
Las secuencias de siembra de microARN- 9/9* son importantes para el reconocimiento del objetivo. La secuencia de siembra consiste de por lo menos 6 nucleótidos que inician en la posición 2 en el 5' del microARN maduro. Puede extenderse además en la dirección 3' pero es usualmente considerado para comprender no más de 8 nucleótidos. La región de siembra de microARN- 9 maduro por lo tanto comprende la secuencia de nucleótidos CUUUGG, CUUGGU o CUUUGGUU. La región de siembra de microARN- 9* maduro comprende la secuencia de nucleótidos UAAAGC, UAAAGCU o UAAAGCUA.
La invención por lo tanto se relaciona preferentemente a compuestos capaces de interactuar con la secuencia de siembra de microARN-9 ó microARN-9*. Preferentemente, los compuestos son capaces de hibridizar a las secuencias de siembra bajo condiciones fisiológicas. Los compuestos los cuales tienen una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria a la secuencia de siembra de microAR -9/9* son preferidos.
Los compuestos y compuestos adicionales pueden fácilmente ser encontrados por usar técnicas conocidas, por ejemplo un ensayo de Renilla Luciferasa en donde microAR -9 ó 9* es permitido para enlazar a 3' UTR del objetivo del tipo silvestre candidato y mutado. Los compuestos adicionales útiles en la invención pueden también ser encontrados por inmunoblotting (ensayo de Western) en donde los niveles de proteína de objetivos de microAR 9/9* candidato pueden ser examinados y comparados en células con o sin sobre expresión de microARN9/9* en combinación con el compuesto inhibitorio. La invención por lo tanto también se relaciona a un compuesto capaz de interactuar con el enlace entre microARN-9/9* y sus objetivos para el tratamiento de AML. También, la invención se relaciona a un compuesto capaz de disminuir el nivel celular de microARN- 9/9* para el tratamiento de AML.
En resumen, la invención se relaciona a un compuesto capaz de interactuar con el enlace entre microARN- 9 y/o microARN- 9* y sus objetivos para el tratamiento de AML. Más en particular, la invención se relaciona a un compuesto para el tratamiento de AML en donde el compuesto es capaz de enlazar a microARN- 9/9* , más en particular un compuesto el cual comprende una secuencia de nucleótido capaz de enlazar a microARN-9 y/o microARN-9*. La secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia la cual comprende un ácido nucleico de proteína (PNA por sus siglas en inglés) o un ácido nucleico cerrado (LNA por sus siglas en inglés) o cualquier otra forma de ácido nucleico o secuencia de enlace de ácido nucleico.
En otras palabras, la invención se relaciona a un método para el tratamiento de AML en donde un compuesto capaz de interferir con el enlace de microARN-9/9* a su objetivo es administrado a un paciente en necesidad de un tratamiento.
En una modalidad preferida, el compuesto comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria a la secuencia de microARN-9 o microARN-9* madura. El compuesto puede consistir de una cepa de nucleótidos de por lo menos 6, preferentemente 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos. Extensiones más largas de los nucleótidos son también factibles.
Preferentemente, el compuesto enlaza a la secuencia de siembra. Esto puede ser realizado por una secuencia que hibridiza a la secuencia de siembra, es decir comprende una secuencia esencialmente complementaria a por lo menos 6 nucleótidos de la secuencia de microARN-9 y/o microARN-9* iniciando del segundo nucleótido en el extremo 5' del microARN maduro. Los compuestos exhiben muy buenas propiedades de enlace a los microARN y son por lo tanto preferidos, mucho más los compuestos que comprenden 7, 8, 9, 10 ó más nucleótidos en común con microARN-9 y/o microARN-9*.
El término "esencialmente complementario" en este aspecto significa que las secuencias exhiben más de 60% de homología de secuencia, como 70, 80, 85, 90 ó más de 90 como 95% ó incluso 100%.
El microAR -9 maduro tiene la siguiente secuencia de nucleótidos: UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA, (SEQ ID NO:l) y microARN- 9* maduro tiene la secuencia de nucleótidos AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU (SEQ ID NO: 2) .
En una modalidad adicional preferida, el compuesto comprende una secuencia la cual es esencialmente complementaria a la secuencia entera de microARN-9 y/o microARN- 9*.
Algunas veces es preferido tratar solamente aquellos pacientes que pueden beneficiarse más de un tratamiento o un compuesto de acuerdo a la invención. En ese aspecto, son tratados preferentemente los pacientes con una AML caracterizada por niveles de expresión incrementados de microARN-9 ó microARN- 9* . Preferentemente, aquellos pacientes de los subgrupos AML que son caracterizados por mutación NPM1 ó anormalidades llq23 ya que aquellos pacientes muestran la regulación ascendente más alta de microARN- 9 y microARN- 9* dentro de los cohortes AML heterogéneos . Los subgrupos del paciente con AML con mutaciones t(8;21) , -5/-? y CEBPA pueden ser candidatos algo menos probables para un tratamiento ya que en estos pacientes los microARN- 9/9* son regulados descendentemente como se compara con el resto de AML (Jongen-Lavrencic et al., Blood 2008) .
La persona experta está consciente de métodos (análisis citogenético y diagnósticos molecuares) sobre cómo distinguir los subgrupos relevantes de AML. Los niveles elevados o incrementados de microARN-9/9* en este aspecto se refieren a niveles de microAR los cuales están arriba del nivel normal, es decir el nivel de microARN- 9/9* en una población de individuos normales sin AML.
Ej emplos
Ejemplo 1; Probar la Actividad de Nuevos compuestos inhibitorios de microARN- 9 potenciales usando un objetivo onecut2 de microARN- 9 conocido (OC2)
Ensayo de Luciferasa: el factor de transcripción onecut2 (OC2) es previamente identificado como un objetivo de microARN-9 (43). Para generar la construcción 3'-UTR-OC2, el segmento 3'-UTR del gen oc2 de rata es amplificado por PCR de ADN genómico e insertado en el sitio de clonación múltiple del plásmido psiCHECK-1 (Promega, Madison, WI) . El sitio de clonación múltiple de este plásmido es ubicado en 3'-UTR del gen de Renilla luciferasa entre el codon de detención y el sitio de poliadenilación artificial. Las secuencias de los cebadores PCR son como a continuación: sentido, 5'-GGATGTCTCGAGTGTTTTCTACAAAG-3 ' (SEQ ID NO : 3 ) y antisentido, 5 " -GAAGCAGCGGCCGTTGAGGCTCCTC-3 " (SEQ ID NO: 4) . La construcción del microARN- 9-sensor puede ser obtenido por clonar la secuencia madura de microARN- 9 en la orientación antisentido en la 3'-UTR del gen de Renilla luciferasa de psiCHECK-1 (Promega) .
Las transfecciones temporales de los plásmidos son entonces realizadas usando el kit de transfección Effectene (Qiagen, Valencia, CA) . Los experimentos que implican transfecciones temporales de microARN-9 y microARN de control pueden ser realizados con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) usando 100 nm de dúplex de ARN. Las actividades de luciferasa son medidas 2 días después de la transfección con el sistema de ensayo de reportador dual-luciferasa (Promega) . Para co-transfecciones de 3 ' -UTR-OC2- luc y microARN-9-sensor con el promotor de la luciferasa de luciérnaga SV40 pGL3 (Promega) o con la luciferasa de Renilla pRLCMV (pRLrénilla) , respectivamente, pueden ser usadas para normalización.
Ejemplo 2: Probar la actividad de nuevos compuestos inhibitorios de microARN- 9* potenciales usando REST y CoREST objetivos de microARN- 9* conocidos
Ensayo de luciferasa. El objetivo CoREST es identificado previamente como un objetivo de microARN-9* (Packer et al., J. Neurosci. 2008(53) 14341-6). Para generar la construcción 3 '-UTR-CoREST-luc, el segmento 3'-UTR del gen es amplificado por PCR a partir del ADN genómico e insertado en el sitio de clonación múltiple del plásmido psiCHECK-1 (Promega, Madison, WI) . El sitio de clonación múltiple de este plásmido es ubicado en el 3'-UTR del gen de Renilla luciferasa entre el codon de detención y un sitio de poliadenilación artificial. Las secuencias de los cebadores de PCR son como a continuación: sentido, CoREST 3'UTR 5'-GCATCTCGAGGTGACCCCAGGGTGGTTGCCAC- 3 ' (SEQ ID NO, 5) y 5'-CGATGCGGCCGCGAATGGATCACTGTTGCAGA- 3 ' (SEQ ID NO: 6) La construcción del microARN- 9* -sensor puede ser obtenida por clonar la secuencia madura de microARN- 9* en la orientación antisentido en el 3'-UTR del gen de Renilla luciferasa de psiCHECK-1 (Promega) .
Las transíecciones temporales de plásmidos son entonces realizadas usando el kit de transfección Effectene (Qiagen Valencia, CA) . Los experimentos que implican transfecciones temporales de microARN- 9* y MicroARN de control pueden ser realizados con lipofectamine 2000 (Invitrogen) usando 100 nM de dúplex de ARN. Se mide la actividad de la luciferasa 2 días después de la transfección con el sistema de ensayo de reportador dual-luciferasa (Promega) . Para cotransfecciones de 3 '-UTR-coREST-luc y microARN- 9* - sensor con la luciferasa de luciérnaga del promotor SV40 pGL3 (Promega) o con la luciferasa Renilla pRLCMV (pRLrenilla) , respectivamente, pueden ser usada para normalizació .
Ejemplo 3: Análisis de Inmunoblot
Para análisis de Western blot, las células deben ser lavadas una vez en solución salina amortiguada con fosfato enfriada en hielo, extractos de proteína son preparados como se describe anteriormente (43) , 15 ug de proteínas es sometido a SDS-PAGE y transferidos en membranas de difluoruro de polivinilideno . Las membranas son bloqueadas por 60 minutos en un amortiguador que contiene 0.1% de Tween 20 y 5% de leche y son entonces incubadas durante la noche en 4°C con un anticuerpo primario originado contra 0C2 de rata (aminoácidos 36-311) (32) . Las bandas inmunoreactivas deben ser visualizadas usando un substrato quimioluminiscente (Amersham Biosciences) después de la incubación de la membrana por 60 minutos con anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (10)
1. Un compuesto caracterizado porque es capaz de interactuar con el enlace entre microAR -9 y/o microARN-9* y sus objetivos para el tratamiento de AML .
2. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto comprende una secuencia de nucleótidos capaz de enlazar a microARN-9 y/o microAR-XT-9* .
3. El compuesto para uso de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el compuesto comprende una secuencia de nucleótido esencialmente complementaria a por lo menos 6 nucleótidos consecutivos de la secuencia de microARN-9 y/o microARN-9 madura.
4. El compuesto para uso de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el compuesto comprende una secuencia de nucleótidos la cual es esencialmente complementaria a la secuencia de siembra de microARN-9 y/o microARN-9.
5. El compuesto para uso de conformidad con las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el compuesto comprende una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar a microARN-9/9* maduro bajo condiciones fisiológicas.
6. El compuesto capaz de disminuir el nivel celular de microARN-9 y/o microARN- 9* maduro caracterizado porque es para el tratamiento de AML.
7. El compuesto para uso de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la AML tiene por niveles de expresión incrementadas de microARN- 9 ó microARN-9* .
8. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque AML es seleccionado del subgrupo particularizado por la mutación NPM1 o anormalidad cromosomal llq23.
9. Un método para el tratamiento de AML caracterizado porque comprende una composición terapéutica que es administrada a un paciente en necesidad de la misma la cual comprende como un ingrediente activo un compuesto capaz de interactuar con el enlace entre microARN-9 y/o microAR - 9* y sus objetivos.
10. Un método para el tratamiento de AML caracterizado porque comprende una composición terapéutica que es administrada a un paciente en necesidad de la misma la cual comprende como un ingrediente activo un compuesto capaz de disminuir el nivel celular de microARN- 9 y/o microARN- 9* maduro .
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