MX2011002837A

MX2011002837A - Anticuerpos dirigidos al ligando tipo delta 4 (dll4) y usos de los mismos.

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Publication number: MX2011002837A
Application number: MX2011002837A
Authority: MX
Inventors: Vahe Bedian; David Jenkins; Ian Foltz
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-07-29
Also published as: CA2735900A1; US8663636B2; US20140206853A1; JP5778577B2; KR20110057244A; US20100196385A1; US8192738B2; AU2009294415A1; RU2011115117A; US9206255B2; CN102264763A; WO2010032060A1; HK1216028A1; EP2344536A1; CN102264763B; RU2581962C2; JP2012502650A; EP2927244A1; AU2009294415B2; US20120195905A1

Abstract

La invención se refiere a los agentes de unión identificados contra DLL4 y los usos de tales agentes. Más específicamente, la invención se refiere a los anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos a DLL4. Los agentes de unión identificados descritos son útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o superproducción de DLL4 y como diagnósticos.

Description

ANTICUERPOS DIRIGIDOS AL LIGANDO TIPO DELTA 4 (DLL4) Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los agentes de unión identificados contra DLL4 y los usos de tales agentes. Más específicamente, la invención se refiere a los anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos a DLL4. Los agentes de unión identificados descritos son útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o superproducción de DLL4 y como diagnósticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La cascada de señalización de Notch es una ruta evolutivamente conservada que se ha implicado en la determinación destino celular, mantenimiento de las células madre y diferenciación en muchos tejidos durante el desarrollo. Hasta ahora, cuatro ligandos del receptor Notch (Notchl-4) y cinco ligandos (Jagged-1/2 y - ligando tipo Delta (Dll) 1/3/4) se identificaron en mamíferos. Los receptores Notch existen como heterodímeros, y comprenden dos subunidades de transmembrana y extracelular asociadas no covalentemente . La unión del ligando a la subunidad extracelular desencadena la escisión proteolítica por las enzimas tales como la enzima de conversión TNFa (TACE, por sus siglas en inglés) y gamma-secretasa que resulta en la creación de dominios intracelulares de Notch (NICD, por sus REF: 217955 siglas en inglés) , los que se translocan al núcleo y se unen al factor de transcripción que resulta finalmente en la activación de los genes identificados corriente abajo (ver Bray, 2006, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7, 678).

La evidencia emergente sugiere que múltiples componentes de la ruta de Noten se expresan en la vasculatura y que las aberraciones en la señalización normal de Notch pueden resultar en fenotipos vasculares. Por ejemplo, las mutaciones en Jagged 1 y Notch 3 resultan en síndrome de Alagille y arteriopatía dominante autosomal cerebral con infartos subcórticales y leucoencefalopatía, respectivamente, dos transtornos que exhiben defectos vasculares. Además, la deleción genética de Notchl y DLL4 en ratón resultan en letalidad embriónica con anormalidades vasculares . Adicionalmente, la deleción de un solo alelo de DLL4 en ratón resulta en letalidad embriónica con defectos vasculares severos en la mayoría de los fondos genéticos (Duarte y otros, 2004, Genes Dev., 18, 2474; Gale y otros, 2004, Proc. Nat. Acad. Sci., 101, 15949). Este fenotipo se reportó sólo previamente para VEGF-A y sugiere que DLL4 puede jugar un papel importante en el desarrollo vascular.

La expresión de DLL4 se reportó también en la vasculatura de tumores de carcinomas renales de células claras, glioblastomas y cánceres de las mamas y ve iga (Mailhos y otros, 2001, Differentiation, 69, 135; Patel y otros, 2005, Cáncer Res., 65, 8690; Patel y otros, 2006, Clin. Cáncer Res., 12, 4836; Li y otros, 2007, Cáncer Res., 67, 11244) . Un estudio reciente sugiere también que DLL4 se puede expresar en una pequeña proporción de células tumorales en el glioblastoma humano (Li y otros, 2007, Cáncer Res., 67, 11244). El efecto de bloquear la señalización de DLL4 en el crecimiento tumoral se evaluó también en varios modelos preclínicos de cáncer en los que las líneas de células tumorales crecen subcutáneamente en ratones inmunodeficientes (Ridgway y otros, 2006, Nature, 444, 1083; Noguera-Troise y otros, Nature, 444, 1032) . En estos estudios, se reportó la reducción en el crecimiento tumoral. Estos efectos anti-tumorales se asociaron con un aumento en la densidad de vasos pobremente funcionales en los tumores, concomitante con un aumento en la hipoxia. En conjunto, estos datos sugieren que, adicionalmente a su papel en desarrollo vascular, la DLL4 puede jugar un papel también en el desarrollo de la vasculatura del tumor.

Adicionalmente a los efectos en la angiogénesis , la señalización de Notch se ha implicado en células madre del cáncer de múltiples tipos de tumores (Dontu y otros, 2004, Breast Can. Res., 6, R605; Wilson & Radtke, 2006, FEBS Lett . , 580, 2860) . Las células madre del cáncer se aislaron a partir de una variedad de tumores sólidos y hematopoyéticos (Al-Hajj y otros, 2003, Proc. Nat. Acad. Sci., 100, 3983; Lapidot y otros, 1994, Nature, 17, 645; Tan y otros, 2006, Laboratory Investigation, 86, 1203) y la presencia de DLL4 en pequeñas poblaciones de células tumorales sugiere, además, que la DLL4 puede estar involucrada en la biología de las células madre del cáncer y que los antagonistas de DLL4 pueden mediar parcialmente los efectos anti-tumorales a través de 1 las interacciones con estos tipos de células.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con agentes de unión identificados que se unen específicamente a la DLL4 e inhiben la actividad biológica de la DLL4. Las modalidades de la invención se relacionan con agentes de unión identificados que se unen específicamente a la DLL4 e inhiben la unión de la DLL4 a un receptor Notch (por ejemplo, Notch 1, 2, 3 ó 4) .

Las modalidades de la invención se relacionan con agentes de unión identificados que se unen específicamente a la DLL4 e inhiben la unión de la DLL4 a un receptor Notch (por ejemplo, Notch 1 ó 4) . En una modalidad de la invención, el agente de unión identificado se une específicamente a DLL4 e inhibe la unión a un receptor Notch, por ejemplo, Notch 1. En una modalidad, el agente de unión identificado inhibe al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75% , al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de la unión de DLL4 a un receptor Notch (por ejemplo, Notch 1) , comparado con la unión que ocurriría en ausencia del agente de unión identificado.

En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a la DLL4 con una afinidad de unión (KD) de menos de 5 nanomolar (n ) . En otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 4 nM, 3 nM, 2 nM ó 1 nM. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a la DLL4 con una KD de menos de 950 picomolar (pM) . En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a la DLL4 con una KD de menos de 900 pM. En otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 800 pM, 700 pM óo 600 pM. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a la DLL4 con una KD de menos de 500 pM. En otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 400 pM. En aún otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 300 pM. En algunas otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 200 pM. En algunas otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 150 pM. En aún otra modalidad, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 100 pM. En otra modalidad, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 50 pM. En una modalidad específica, el agente de unión identificado de la invención puede unirse a la DLL4 humana con una afinidad KD de menos de 10 pM. En otra modalidad específica, el agente de unión identificado de la invención puede unirse a la DLL4 humana con una afinidad KD de menos de 1 pM. La KD puede evaluarse usando un método descrito en la presente o conocido por una persona con conocimientos en la materia (por ejemplo, un ensayo BIAcore, ELISA, FACS) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia) .

Las propiedades de unión del agente de unión identificado o anticuerpo de la invención se pueden también medir con referencia a las tasas de disociación o asociación (koff y kon respectivamente) .

En una modalidad de la invención, un agente de unión identificado o un anticuerpo puede tener una tasa kon (anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag)kon? Ab-Ag) de al menos 104 M"1s" x, al menos 5 X 104 M"1s"1, al menos 105 M"1s"1, al menos 2 X 105 M'V1, al menos 5 X 105 M'V1, al menos 106 M'V1, al menos 5 X 106 M"1s"1, al menos 107 M^s"1, al menos 5 X 107 M^s"1, o al menos 108 M'V1.

En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado o un anticuerpo puede tener una tasa koff ( (Ab-Ag)k¾r? anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag) ) de menos de 5xl0_1 s"1, menos de 10"1 s"1, menos de 5xl0"2 s"1, menos de 10"2 s"1, menos de 5xl0~3 s"1, menos de 10"3 s"1, menos de 5xl0~4 s"1, menos de 4xl0"4 s"1 , menos de 3xl0"4 s"1, menos de 2xl0"4 s"1, menos de 10"4 s"1, menos de 5xl0"5 s"1, menos de 10"5 s"1, menos de 5xl0"6 s" 1, menos de 10"6 s"1, menos de 5xl0"7 s"1, menos de 10"7 s"1, menos de 5xlQ~8 s"1, menos de 10"8 s"1, menos de 5xl0"9 s"1, menos de 10" 9 s"1, o menos de 10"10 s"1.

El agente de unión identificado de la invención se une a la DLL4 humana. En algunos ejemplos, el agente de unión identificado de la invención tiene reactividad cruzada con otras proteínas DLL4 de otras especies. En una modalidad, el agente de unión identificado de la invención tiene reactividad cruzada con la DLL4 del mono cinomolgo. En otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención tiene reactividad cruzada con la DLL4 del mono cynomolgus pero pero tiene sólo débil reactividad cruzada con las proteínas DLL4 de otras especies, por ejemplo, tiene solamente débil reactividad cruzada con la DLL4 de ratón, por ejemplo, el agente de unión identificado se une a la DLL4 de ratón con una KD de más de 360 nM como se evaluó por la tecnología BIAcore.

En otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención tiene una afinidad casi equivalente por las proteínas DLL4 de otras especies. En un ejemplo específico, el agente de unión identificado a DLL4 humana de la invención tiene una afinidad casi equivalente que la DLL4 del mono cynomolgus. Por nivel equivalente de afinidad se entiende que cuando la afinidad con respecto a la DLL4 humana es 1, la afinidad del anticuerpo con respecto a la DLL4 mono cynomolgus está entre 0.2-5 o entre 0.2-2.

En otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención es específico para DLL4 humana pero no se une a otros ligandos de Notch. En un ejemplo, el agente de unión identificado de la invención es específico para DLL4 humana pero no se une significativamente a DLL1, por ejemplo, la relación DLLl/control es menos de 2.5 como se determinó al probar la capacidad de un agente de unión identificado como se describe en la presente (15-300 µg/ml) para unir las células 293T transitoriamente transfectadas con DLL1 humana o las células HE 293 establemente transfectadas con Dlll. En otro ejemplo, el agente de unión identificado de la invención es específico para DLL4 humana pero no se une significativamente a Jagged 1, por ejemplo, la relación DLLl/control es menos de 1.5 como se determinó probando la capacidad de un agente de unión identificado como se describe en la presente (5 ug/ml) para unir las células 293T transitoriamente transfectadas con Jagged 1 humano o células HEK293 establemente transfectadas con Jagged 1 humano .

En aún otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención inhibe la unión del ligando al receptor DLL4-Notchl . En un ejemplo, la actividad poseída por el agente de unión identificado se puede demostrar a una concentración IC50 (una concentración para lograr 50% de inhibición de) por debajo de 10 µ?. En otro ejemplo, el agente de unión identificado de la invención puede tener una concentración IC50 de menos de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 2, 1, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5 ó 0.4 nM.

En aún otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención puede tener tanto actividad in vitro como in vivo. En un ejemplo específico, el agente de unión identificado invierte la inhibición estimulada por DLL4 de la proliferación celular de HUVEC en cultivo 2D. En un ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden invertir la inhibición estimulada por DLL4 de la proliferación celular de HUVEC en 70% o más, por ejemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, ó 95% comparado con un control (usando el ensayo del ejemplo 9 donde no se añade DLL4) .

En aún otra modalidad, los agentes de unión identificados, por ejemplo, anticuerpos, de la invención pueden inhibir la formación del tubo de HUVEC en cultivo 2D. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden exhibir más que 50% de inhibición, por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ó 95% de inhibición a una concentración de 0.08 pg/ml con relación a un control (el control es el máximo efecto inhibidor determinado usando 20 g/ml del mismo anticuerpo) .

En aún otra modalidad, los agentes de unión identificados de la invención pueden exhibir menos de 50%, por ejemplo, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ó 5 de internalización a las cuatro horas con relación a t=0 control.

En otra modalidad, los agentes de unión identificados de la invención pueden exhibir entre 5-50%, 10-40% ó 20-40% de internalización a las cuatro horas con relación a t=0 control (ver ejemplo 15) .

En una modalidad, los agentes de unión identificados de la invención que se unen específicamente a DLL4 pueden exhibir una o más de las siguientes propiedades, incluyendo se unen a DLL4 humana con una KD de menos de 200 pM; reaccionan de manera cruzada con la DLL4 de mono cynolmolgus ; reaccionan débilmente de manera cruzada con la DLL4 de ratón; se unen a la DLL4 de cynomologus con afinidad casi equivalente; no se unen significativamente a DLL1 o Jagged 1; exhiben más de 85% de inhibición inversa estimulada por DLL4 de la proliferación celular de HUVEC en cultivo 2D comparado con un control; exhiben más que 50% de inhibición de la formación del tubo de células HUVEC en cultivo 2D a una concentración de 0.08 µg/ml con relación a un control; y exhiben menos de 50% internalización relative a las cüatro horas con relación a t=0 control .

En otra modalidad, las proteínas de unión identificadas descritas en la presente poseen propiedades farmacodinámicas beneficiosas, eficaces y/o metabólicas.

En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado compite con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos de 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 o 21H3RK para unirse a Notch 1.

En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado inhibe el crecimiento del tumor y/o metástasis en un mamífero. En otra modalidad, el agente de unión identificado puede tratar una afección asociada con la angiogénesis .

En algunas modalidades de la invención, el agenté de unión identificado es un anticuerpo. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal. E una modalidad de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG . En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgG2. Este isotipo tiene potencial reducido para provocar una función efectora en comparación con otros isotipos, lo que puede conducir a reducir la toxicidad. En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGl. El isotipo IgGl tiene potencial aumentado para provocar ADCC en comparación con otros isotipos, lo que puede conducir a una eficacia mejorada. El isotipo IgGl tiene estabilidad mejorada en comparación con otros isotipos, por ejemplo el IgG4 , lo que puede conducir a una biodisponibilidad mejorada, o facilidad de preparación mejorada o una media vida más larga. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGl es del alotipo z, za ó f .

Una modalidad adicional es un agente de unión identificado o un anticuerpo que se une específicamente a la DLL4 y comprende una secuencia que comprende una de las secuencias de las regiqnes determinantes de complementariedad (CDR) mostradas en la Tabla 2. Las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende: cualquiera de una secuencia CDR1 , una CDR2 o una CDR3 como se muestra en la Tabla 2. Una modalidad adicional es un agente de unión identificado o un anticuerpo que se une específicamente a DLL4 y comprende una secuencia que comprende dos de las secuencias CDR mostradas en la Tabla 2. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una secuencia CDR1 , una CDR2 y una CDR3 como se muestra en la Tabla 2. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una de las secuencias CDR mostradas en la Tabla 2. Las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende: cualquiera de una secuencia CDR1 , una CDR2 o una CDR3 como se muestra en la Tabla 2. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende dos de las secuencias CDR mostradas en la Tabla 2. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 como se muestra en la Tabla 2. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 deuna secuencia de cadena pesada variable o una secuencia de cadena ligera variable como se muestra en la Tabla 2. En algunas modalidades, el agente de unión identificado es un anticuerpo. En ciertas modalidades, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad, el agente de unión identificado comprende una VH CDR1 como se muestra en la Tabla 2, en donde la secuencia de la VH CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la VH CDR1 como se muestra en la Tabla 2; una VH CDR2 como se muestra en la Tabla 2 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la VH CDR2 como se muestra en la Tabla 2; una VH CDR3 como se muestra en la Tabla 2 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la VH CDR3 como se muestra en la Tabla 2; una VL CDRl como se muestra en la Tabla 2 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la VL CDRl como se muestra en la Tabla 2 ; una VL CDR2 como se muestra en la Tabla 2 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la VL CDR2 como se muestra en la Tabla 2; y una VL CDR3 como se muestra en la Tabla 2 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a la VL CDR3 como se muestra en la Tabla 2.

En una modalidad, el agente de unión identificado comprende una VH CDRl, CDR2 y CDR3 como se muestra en la Tabla 2 y una VL CDRl, CDR2 y CDR3 como se muestra en la Tabla 2.

En aún otra modalidad, el agente de unión identificado se une inmunoespecíficamente a DLL4 y comprende un dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 2 que tiene al menos 90% identidad al aminoácido como se muestra en la Tabla 2 y comprende un dominio variable de cadena ligera como se muestra en la Tabla 2 que tiene al menos 90% identidad a la secuencia de aminoácido como se muestra en la Tabla 2, en donde el anticuerpo tiene la actividad de unirse a DLL4.

En otra modalidad el agente de unión identificado puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de la CDR1, CDR2 o CDR3 de las secuencias de cadena pesada variable codificada por un polinucleótido en un plásmido designado Mab2H10VHOP, Mab9G8VH, Mab21H3VH, y Mab4B4VH los cuales se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC, por sus siglas en inglés) bajo los números PTA-9502, PTA-9517, PTA-9501, o PTA-9508 el 17 de septiembre de 2008. En otra modalidad el agente de unión identificado puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de la CDR1, CDR2 o CDR3 de las secuencias de cadena ligera variable codificadas por un polinucleótido en un plásmido designado Mab9G8VLOPTl, Mab21H3VLOP, y Mab4B4VL los cuales se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo los números PTA-9516, PTA-9500 o PTA-9520 el 17 de septiembre de 2008 y Mab2H10VLOP fue depositado el 7 de julio de 2009, bajo el número PTA-10181.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9502 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9502 el 17 de septiembre de 7 y una secuencia de aminoácidos ^de cadena ligera variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-10181 el 7 de julio de 2009.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9502 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-10181 el 7 de julio de 2009.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-PTA- 9502 el 17 de septiembre de 7 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-PTA- 10181 el 7 de julio de 2009.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9517.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9517 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VLOPTl la cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9516 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9517 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VL0PTl el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9516 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9517 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VLOPTl el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9516 el 17 de septiembre de 2008.

E una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9501 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9501 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9500 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9501 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9500 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-PTA-9501 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-PTA-9500 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9508 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una .· CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9508 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9520 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9508 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9520 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-PTA-9508 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-PTA-9520 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9502 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9517 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9501 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9508 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena ligera variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-10181 el 7 de julio de 2009.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena ligera variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VLOPTl el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9516 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena ligera variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9500 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena ligera variable de un anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9520 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada variable de un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9502 el 17 de septiembre de 2008 y una cadena ligera variable de un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-10181 el 7 de julio de 2009.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada variable de un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VLOPTl el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9516 el 17 de septiembre de 2008 y una cadena ligera variable de un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9517 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada variable de Un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9501 el 17 de septiembre de 2008 y una cadena ligera variable de un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9500 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una cadena ligera variable de un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9520 el 17 de septiembre de 2008 y una cadena ligera variable de un anticuerpo codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab4B4VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9520 el 17 de septiembre de 2008.

Debe destacarse que aquellos de conocimientos ordinarios en la materia pueden realizar fácilmente las determinaciones CDR. Ver por ejemplo, Kabat y otros, Sequences f Proteins of Im unological Interest, Quinta edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda D (1991), vols. 1-3. Kabat proporciona múltiples alineamientos de secuencia de cadenas de inmunoglobulinas de numerosas especies isotipos de anticuerpos . Las secuencias alineadas se numeran de conformidad con un sistema de numeración sencillo, el sistema de numeración de Kabat . Las secuencias de Kabat se han actualizado desde la publicación en 1991 y están disponibles como una base de datos electrónica de secuencia (última versión descargable 1997) . Cualquier secuencia de inmunoglobulina se puede numerar de conformidad . con Kabat realizando un alineamiento con la secuencia de referencia de Kabat. En consecuencia, el sistema de numeración de Kabat proporciona un sistema uniforme para numerar las cadenas de inmunoglobulinas .

En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada mostradas en la Tabla 2·. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada de los anticuerpos 20G8, 21H3, 14B1, 18B7, 17B6, 17F3, 12A1, 17G12 , 19G9, 21F7, 20D6, 1D4 , 4B4, 2H10, o 21H3RK, o cualquier versión optimizada dé las secuencias de cadena pesada de estos anticuerpos como se muestra en la Tabla 5, 7, 9, 11 ó 13. La promiscuidad de la cadena ligera está bien establecida en la técnica, así, un agente de unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena ligera de los anticuerpos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 , o 21H3RK, o cualquier versión optimizada de las secuencias de cadena ligera de éstos anticuerpos como se muestra en la Tabla 6, 8, 10, 12 ó 13, o cualquier otro anticuerpo descrito en la presente. En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada mostradas en la Tabla 2, o cualquier versión optimizada de las secuencias de cadena pesada de estos anticuerpos como se muestra en la Tabla S, 7, 9, 11 ó 13, y puede comprender además cualquiera de las secuencias de cadena ligera mostradas en la Tabla 6, 8, 10, 12 ó 13 u otro anticuerpo descrito en la presente. Én algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En algunas modalidades, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste de: 4B4 , 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 , o 21H3RK. En una modalidad, el agente de unión identificado comprende uno o más de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 , o 21H3RK. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 4B4. En ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 21H3. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 9G8.

En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo raonoclonal 21H3RK.

En una modalidad un agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 2.

En una modalidad un agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 2. En una modalidad un agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las CDR de los anticuerpos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7, 4B3, 1D4 , o 21H3RK. En una modalidad un agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las CDR de los anticuerpos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 , o 21H3RK.

En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de una CDR1, una CDR2 o una CDR3 de una secuencia de cadena pesada variable de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4 o 21H3, 2H10, 9G8 , o 21H3RK, como se muestra en la Tabla 2. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de una CDR1, una CDR2 o una CDR3 de una secuencia de cadena ligera variable de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4 o 21H3, 2H10, 9G8, o 21H3RK, como se muestra en la Tabla 2. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4 o 21H3, 2H10, 9G8 , o 21H3RK, como se muestra en la Tabla 2, y una secuencia CDR1 , una CDR2 y una CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4 o 21H3, 2H10, 9G8 , o 21H3RK, como se muestra en la Tabla 2. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano .

En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4 como se muestra en la Tabla 2 y la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4 como se muestra en la Tabla 2. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia CDR1 , CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 21H3 como se muestra en la Tabla 2 y la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 21H3 como se muestra en la Tabla 2. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia CDRl, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente ¦humano 2H10 como se muestra en la Tabla 2 y la secuencia CDRl, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2H10 como se muestra en la Tabla 2. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende la secuencia contigua que abarca las regiones marco y CDR, específicamente de FR1 a FR4 o CDRl a CDR3 , de cualquiera de las secuencias como se muestra en la Tabla 2 o Tabla 13. En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende las secuencias contiguas que abarcan las regiones marco y CDR, específicamente de FR1 a FR4 o CDRl a CDR3 , de cualquiera de las secuencias de los anticuerpos monoclonales 4B4 o 21H3, 2H10, 9G8, o 21H3RK, como se muestra en la Tabla 2 o Tabla 13. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la sec . con núm. de ident.:2. En una modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además,1 un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident.:4. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

Una modalidad proporciona un agente de unión identificado o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, en donde el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident.:6. En una modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la sec. con núm. de , ident.: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident . : 22. En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident. :24. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident.:30. En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident.:32. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident. : 30. En otra modalidad, el agente o" anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la sec. con núm. de ident. :50. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En una modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo comprende tanto como veinte, deciseis, diez, nueve o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o cinco, adiciones, sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos dentro de las CDR descritas o secuencias de cadena pesada o ligera. Tales modificaciones se pueden realizar potencialmente en cualquier residuo dentro de las CDR. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano .

En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende variantes o derivados de las CDR descritas en la presente, las secuencias contiguas que abarcan las regiones marco y CDR (específicamente de FRl a FR4 o CDRl a CDR3) , las secuencias de cadena pesada o ligera descrita en la presente, o los anticuerpos descritos en la presente. Las variantes incluyen agentes de unión identificados o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen tanto como veinte, deciseis, diez, nueve o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis adiciones, sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en cualquiera de las CDRl, CDR2 o CDR3 como se muestra en la Tabla 2 o Tabla 13, las secuencias contiguas que abarca las regiones marco y CDR (específicamente de FRl a FR4 o CDRl a CDR3 ) como se muestra en la Tabla 2 o Tabla 13, las secuencias de cadena pesada o ligera descritas en la presente, o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. Las variantes incluyen agentes de unión identificados o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen al menos aproximadamente 60, 70, 80 ¡ 85, 90, 95, 98 o aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con cualquiera de las CDRl, CDR2 o CDR3 como se muestra en la Tabla 2 o Tabla 13, las secuencias contiguas que abarcan las regiones marco y CDR (específicamente de FRl a FR4 o CDRl a CDR3) como las mostradas en la Tabla 2 o Tabla 13, las secuencias de cadena pesada o ligera descritas en la presente, o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por cualquier método conocido por una persona con experiencia en la materia, que incluye, pero no se limita a, alineamiento de proteína por pares. En una modalidad, las variantes comprenden cambios en las secuencias CDR o polipéptidos de cadena pesada o ligera descritos en la presente que son de origen natural o se introducen por modificación in vitro de secuencias nativas usando técnicas de ADN recombinante o técnicas de mutagenesis. Las variantes de origen natural incluyen aquellas que se generan in vivo en las secuencias de nucleótidos de línea germinal correspondientes durante la generación de un anticuerpo a un antígeno externo. En una modalidad el derivado puede ser un heteroanticuerpo, que es un anticuerpo en el cual dos o más anticuerpos están enlazados. Los derivados incluyen los anticuerpos que han sido químicamente modificados. Los ejemplos incluyen la nión covalente de uno o más polímeros, tales como los polímeros solubles en agua, carbohidratos con enlace N, o con enlace 0, azúcares, fosfatos, y/u otras moléculas de este tipo. Los derivados se modifican de una manera que es diferente del anticuerpo de partida o de origen natural, en el tipo o localización de las moléculas unidas. Los derivados incluyen, además, la deleción de uno o más grupos químicos que están naturalmente presentes en el anticuerpo .

En una modalidad, el agente de unión identificado es un anticuerpo biespecífico .. Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo que tiene especificidad de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los métodos para preparar los. anticuerpos biespecíficos se conocen en la materia. (Ver, por ejemplo, Millstein y otros, Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker y otros, EMBO J, 10:3655-3659 (1991); Suresh y otros, Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelny y otros, J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992); Hollinger y otros, Proc . Nati Acad. Sci. Estados Unidos, 90:6444-6448 (1993); Gruber y otros, J. Immunol., 152:5368 (1994); las patentes de los Estados Unidos núms. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; y 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; y EP 03089.) En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado o anticuerpo tiene su secuencia optimizada por mutación de sus residuos de línea no germinal a residuos de línea germinal, y/o por eliminación de las complicaciones estructurales. En una modalidad la invención incluye una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident : 6. En ciertas modalidades, la sec. con núm. de ident: 6 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 7. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 6 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, o los seis residuos de la línea germinal, como se indica en la Tabla 7. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident : 6 comprende cualquiera de una de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 7.

En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se derivan de una secuencia de la línea germinal con dominios VH3-33, 6-13 y JH4, donde uno o más residuos, mutaron para producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición. En ciertas modalidades, la sec. con núm. de ident.: 24 puede comprender otras modificaciones que incluyen eliminar las complicaciones estructurales. Por ejemplo, además de la alineación germinal, el C33 puede mutar a un S. Así, la sec. con núm. de ident. : 24 puede comprender cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de la línea germinal y línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 10 y además incluyen la mutación de C33 a un S.

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión identificado o anticuerpo que compite para unirse a DLL4. En otra modalidad, la invención se dirige a un agente de unión identificado o anticuerpo que compite con DLL4 nativa para unirse al receptor de Notch 1 o Notch 4. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo compite para unirse a Notch 1 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4 o 21H3, 2H10, 9G8, o 21H3RK. "Compite" indica que el agente de unión identificado o anticuerpo compite para unirse a Notch 1 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7, 4B3 , 1D4 , o 21H3RK,es decir la competencia es unidireccional.

Las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo que compite de manera cruzada con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7, 4B3, 1D4 , o 21H3RK para unirse a DLL4. Que "compite de manera cruzada" indica que el agente de unión identificado o anticuerpo compite para unirse a Notch 1 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 , o 21H3RK, y vice versa,. es decir, la competencia es bidireccional .

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión identificado o anticuerpo que se une al mismo epítopo en DLL4 como el agente de unión identificado o anticuerpos de la invención. Las modalidades de la invención también incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo que se une al mismo epítopo en DLL4 como cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 , o 21H3RK. A partir de los análisis de competencia cruzada queda claro que los anticuerpos de la invención tienen epítopos diferentes o parcialmente superpuestos. Por ejemplo, 4B4 compite de manera cruzada con 21H3RK y 21H3. Además, 4B4 y 21H3 no se unen a DLL4 bajo condiciones reductoras y desnaturalizantes mientras que 9G8 y 2H10 si sugiere la unión a epítopos diferentes.

En ciertas modalidades, el epítopo está compuesto de al menos una porción extracelular de DLL4. El al menos un epítopo especificado (por ejemplo, para 21H3 o 21H3RK o 4B4) puede comprender cualquier combinación de al menos una secuencia de aminoácido de al menos 3 residuos de aminoácidos a la porción entera especificada de aminoácidos contiguos que están presentes en la DLL4 entre los aminoácidos 147-224, es decir, ICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQ NGYCSKPAECLCRPGWQGRLC (sec. con núm. de ident.:90). En una modalidad, el epítopo es al menos 4 residuos de aminoácidos, al menos 5 residuos de aminoácidos, al menos 6 residuos de aminoácidos, al menos 7 residuos de aminoácidos, al menos 8 residuos de aminoácidos o al menos 9 residuos de aminoácidos, al menos 10 residuos de aminoácidos, al menos 15 residuos de aminoácidos, al menos 20 residuos de aminoácidos, al menos 25 residuos de aminoácidos, al menos 30 residuos de aminoácidos, al menos 40 residuos de aminoácidos o al menos 50 residuos de aminoácidos, al menos 60 residuos de aminoácidos, al menos 70 residuos de aminoácidos, al menos 75 residuos de aminoácidos, al menos 76 residuos de aminoácidos, o 77 residuos de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:90. En otra modalidad, el epítopo está presente en el aminoácido 187-201 día DLL4 humana, TGEYCQQPICLSGCH (sec. con núm. de ident.:91). En una modalidad, el epítopo es al menos 4 residuos de aminoácidos, al menos 5 residuos de aminoácidos, al menos 6 residuos de aminoácidos, al menos 7 residuos de aminoácidos, al menos 8 residuos de aminoácidos o al menos 9 residuos de aminoácidos, al menos 10 residuos de aminoácidos, al menos 11 residuos de aminoácidos, al menos 12 residuos de aminoácidos, al menos 13 residuos de aminoácidos, al menos 14 residuos de aminoácidos, o 15 residuos de aminoácidos de la sec. con núm. de ident . : 91.

En una modalidad, la invención incluye anticuerpos con reactividad cruzada de ratón de los anticuerpos descritos en la presente. En una modalidad, las regiones variables de los anticuerpos se alteran de manera que los anticuerpos se puedan unir a la DLL4 de ratón. Típicamente, los anticuerpos de reactividad cruzada de ratón tienen propiedades similares a los anticuerpos descritos en la presente, por ejemplo, se pueden unir a DLL4 y pueden inhibir la unión de DLL4 a un receptor Notch. En un ejemplo, la región variable del anticuerpo 21H3RK se altera de manera que pueda unirse a la DLL4 de ratón, por ejemplo, la cadena pesada tiene las siguientes alternaciones: H31 Asn a Lys, H52a Ala a Pro, H97 Val a Thr, HlOOb Val a Trp y HlOOe Glu a Ala (ver la sec. con núm. de ident.:84) y la cadena ligera tiene las siguientes alteraciones: L30 Ser a Asn y L93 Asp a Ser (ver la sec . con núm. de ident. :85) . En otra modalidad, la cadena pesada tiene las siguientes alternaciones: H30Thr a lie, H31Asn a Met, H52a Ala a Pro, HlOOb Val a Trp y HlOOe Glu a Ala (ver la sec. con núm. de ident.:86) y la cadena ligera tiene las siguientes alteraciones: L93 Asp a Ser (ver la sec. con núm. de ident . : 87) . En aún otra modalidad, la cadena pesada tiene las siguientes alternaciones: H30 Thr a lie, H31 Asn a His, HlOOb Val a Trp y HlOOe Glu a Ala (ver la sec. con núm. de ident. :88) . y la cadena ligera tiene las siguientes alteraciones: L30 Ser a Asn y L93 Asp a Ser. (ver la sec. con núm. de ident. :89) .

Otras modalidades de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera de los agentes de unión identificados o anticuerpos descritos en la presente, vectores que tienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los agentes de unión identificados o anticuerpos descritos en la presente o una célula hospedera transformada con cualquiera de esas moléculas de ácido nucleico. Las modalidades de la invención incluyen una molécula de ácido nucleico que codifica un agente de unión identificado aislado completamente humano que se une específicamente a DLL4 e inhibe la unión de DLL4 a un receptor Notch. La invención también abarca los polinucleótidos que hibridan bajo condiciones de hibridación rigurosas o de menos rigor, como se define en la presente, a los polinucleótidos que codifican para cualquiera de los agentes de unión identificados o anticuerpos descritos en la presente. Las modalidades de la invención también incluyen un vector: que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el agente de unión. Las modalidades adicionales incluyen una célula hospedera que comprende el vector que comprende la molécula de ácido nucleico.

Como se conoce en la materia, los anticuerpos pueden ser ventajosamente, por ejemplo, anticuerpos policlonales , oligoclonales , monoclonales, quiméricos, humanizados, y/o completamente humanos .

Se apréciará que las modalidades de la invención no se limitan a alguna forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Por ejemplo, el agente de unión identificado puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una región Fe humana intacta) o un fragmento de unión al anticuerpo (por ejemplo, a Fab, Fab' o F{áb')2r FV o dAb) . Adicionalmente , los anticuerpos pueden ser anticuerpos de un solo dominio tales como dominios VH o VL simples humanos o de camélidos que se unen a DLL4, tales como un fragmento dAb.

Las modalidades de la invención descritas en la presente también proporcionan células para producir esos anticuerpos. Los ejemplos de células incluyen hibridomas, o células creadas recombinatemente , tales como células de ovario de hámster chino (CHO) , variantes de células CHO (por ejemplo DG44) y células NSO que producen anticuerpos contra DLL4. Información adicional con relación a las variantes de células CHO se puede encotrar en Andersen y Reilly (2004) Current Opinión in Biotechnology 15, 456-462, el cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. El anticuerpo se puede preparar a partir de un hibridoma que segrega el anticuerpo, o a partir de una célula recombinantemente modificada que ha sido transformada o transfectada con un gen o genes que codifican el anticuerpo.

Además, una modalidad de la invención es un método para producir uñ anticuerpo de la invención mediante el cultivo de las células hospederas bajo las condiciones donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo, seguido por la recuperación del anticuerpo. Debe destacarse que las modalidades de la invención también incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo de la invención incluyendo las secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para aumentar los rendimientos de los anticuerpos o fragmentos de éstos cuando se transfectan en células hospederas para la producción del anticuerpo .

Una modalidad adicional en la presente incluye un método de producir anticuerpos que se unen específicamente a DLL4 e inhiben la actividad biológica de DLL4 , inmunizando un mamífero que expresa DLL4 humana, membranas celulares aisladas que contiene DLL4 humana, DLL4 humana purificado, o un fragmento de éstos, y/o una o más fragmentos o secuencias ortólogas de éstos.

En otras modalidades la invención proporciona composiciones, que incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención o fragmento de unión de éstos, y un diluente o portador farmacéuticamente aceptable.

Aún adicionalmente las modalidades de la invención incluyen los métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad proliferativa angiogénica al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a DLL4. En ciertas modalidades, el método comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de un tumor, cáncer, y/o un trastorno proliferativo celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de- unión identificado que se une específicamente a DLL4.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad neoplásica al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a DLL4. En ciertas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad neoplásica, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a DLL4.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de un tumor maligno al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un. agente de unión identificado que se une específicamente a DLL4. En ciertas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de un tumor maligno, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a DLL4.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de DLL4 al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a DLL4. En ciertas modalidades, el método comprende además seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la expresión de DLL4 , y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a DLL4.

Un tumor maligno se puede seleccionar del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de células pequeñas, cáncer de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor de las tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma) , adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas y carcinoma epidermoide.

Las enfermedades angiogénicas o proliferativas tratables incluyen enfermedades neoplásicas, tales como, melanoma, cáncer de células pequeñas cáncer de células no pequeñas glioma, carcinoma hepatocelular (hígado) , tumor de las tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma), adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas, carcinoma epidermoide y leucemia incluyendo leucemia mielógena crónica.

En una modalidad, la presente invención es adecuada para su uso en la inhibición de DLL4 , en pacientes con un tumor que es sólo dependiente, o en parte, de DLL4.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad proliferativa o angiogénica relacionada. En ciertas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad proliferativa o angiogénica relacionada.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad neoplásica. En ciertas modalidades el uso comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad neoplásica.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad no neoplásica. En ciertas modalidades el uso comprende además seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad no neoplásica.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de un tumor maligno. En ciertas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de un tumor maligno.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de DLL4. En ciertas modalidades el uso comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la expresión de DLL4.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad relacionada con la angiogénesis o proliferativa .

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad neoplásica.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de un tumor maligno.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de DLL4.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre una enfermedad inducida por DLL .

En una modalidad tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis o proliférativa; una enfermedad neoplásica; un tumor maligno; o una enfermedad o afección asociada con la expresión de DLL4; o · comprende gestionar, mejorar, prevenir, cualquiera de las afecciones o enfermedades antes mencionadas.

En una modalidad, el tratamiento de una enfermedad neoplásica comprende la inhibición del crecimiento del tumor, retardo del crecimiento del tumor, regresión del tumor, encogimiento de tumor, incremento en el tiempo de recrecimiento tumoral en el cese del tratamiento, incremento en el tiempo de recurrencia tumoral, relentecer el progreso de la enfermedad.

En algunas modalidades de la invención, el animal a ser tratado es un humano.

En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano .

En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado es seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D , o 21H3RK.

Las modalidades de la invención incluyen un conjugado que comprende el agente de unión identificado como los descritos en la presente, y un agente terapéutico. En algunas modalidades de la invención, el agente terapéutico es una toxina. En otras modalidades, el agente terapéutico es un radioisótopo. En aún otras modalidades, el agente terapéutico es una composición farmacéutica. - En otro aspecto, se proporciona un método para matar selectivamente una célula cancerosa en un paciente. El método comprende administrar un anticuerpo conjugado completamente humanos a un paciente. El anticuerpo conjugado completamente humano comprende un anticuerpo que puede unirse a DLL4 y un agente. El agente es una toxina, un radioisótopo, u otra sustancia que mata una célula cancerosa. El anticuerpo conjugado, de este modo, mata selectivamente las células cancerosas .

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo conjugado completamente humano que se une específicamente a DLL . Unido al anticuerpo está un agente, y la unión del anticuerpo a una célula resulta en la entrega del agente a la célula. En una modalidad, el e anticuerpo conjugado completamente humano anterior se une a un dominio extracelular de DLL4. En otra modalidad, el anticuerpo y toxina conjugada se internalizan por una célula que expresa DLL4. En otra modalidad, el agente es un agente citotóxico. En otra modalidad, el agente es, por ejemplo saporina, o auristatina, pseudomonas exotoxina, gelonina, riciná, caliqueamicina o inmunoconjugados basados en maitnasina, y similares. En aún otra modalidad, el agente es un radioisótopo.

El agente de unión identificado o anticuerpo de la invención se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación. Por ejemplo, una mezcla de anticuerpos monoclonales , oligoclonales o policlonales DLL4 que bloquean la proliferación, invasión, angiogénesis o adhesión celular se pueden administrar en combinación con un fármaco que inhiba la proliferación de células tumorales.

Otra modalidad de la invención incluye un método de diagnosticar enfermedades o afecciones en los cuales un anticuerpo como el descrito en la presente se utiliza para detectar el nivel de DLL4 en un paciente o muestra de un paciente. En una modalidad, la muestra de un paciente es sangre o suero sanguíneo u orina. En modalidades adicionales, se presentan los métodos para la identificación de factores de riesgo, diagnóstico de enfermedades, y establecimiento de la enfermedad que incluyen la identificación de la expresión y/o sobreexpresión de DLL4 usando anticuerpos anti- DLL4. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar a un paciente un anticuerpo conjugado completamente humano que se une selectivamente a DLL4 en una célula. El anticuerpo conjugado comprende un anticuerpo que se une específicamente a DLL4 y un marcador. Los métodos comprenden además observar la presencia del marcador en el paciente. Una cantidad relativamente alta del marcador indicará un riesgo relativamente alto de la enfermedad y una cantidad relativamente baja del marcador indicará un riesgo relativamente bajo de la enfermedad. En una modalidad, el marcador es una proteína fluorescente verde.

La invención proporciona, además, métodos para evaluar el nivel de DLL4 en una muestra de un paciente, que comprende contactar un anticuerpo como el descrito en la presente con una muestra biológica de un paciente, y detectar el nivel de unión entre el anticuerpo y DLL4 en la muestra. En modalidades más específicas, la muestra biológica es sangre, plasma o suero.

Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnosticar una afección asociada con la expresión de DLL4 en una célula al contactar el suero o una célula con un anticuerpo como el descrito en la presente, y posteriormente detectar la presencia de DLL4. En una modalidad, la afección puede ser una enfermedad relacionada con la invasión o adhesión celular, angiogénica o proliferativa que incluye, pero no se limita a, una enfermedad neoplásica.

En otra modalidad, la invención incluye un kit de ensayo para detectar la DLL4 en los tejidos de los mamíferos, las células o fluidos corporales para detectar . las enfermedades relacionadas con la DLL4. El kit incluye un anticuerpo como el descrito en la presente y un medio para indicar la reacción del anticuerpo con DLL4 , si está presente. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, el anticuerpo que se une a la DLL4 es marcado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo primario sin marcar y el kit incluye, además, medios para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, los medios para detectar incluyen un segundo anticuerpo marcado que es una anti-inmunoglobulina . El anticuerpo puede ser marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un material radio-opaco .

En algunas modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos se pueden modificar para mejorar su capacidad de activar las células efectoras y participar en citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) . En aún otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para mejorar su capacidad de activar las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) y para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En algunas modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para reducir su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos se pueden modificar para reducir su capacidad de activar las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) . En aún otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para reducir su capacidad de activar las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) y para reducir su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En ciertas modalidades, la media vida de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente y de las composiciones de la invención es al menos aproximadamente 4 a 7 días. En ciertas modalidades, la vida media promedio de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente y de las composiciones de la invención es al menos aproximadamente 2 a 5 días, 3 a 6 días, 4 a 7 días, 5 a 8 días, 6 a 9 días, 7 a 10 días, 8 a 11 días, 8 a 12, 9 a 13, 10 a 14, 11 a 15, 12 a 16, 13 a 17, 14 a 18, 15 a 19, ó 16 a 20 días. En otras modalidades, la vida media promedio de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente y de las composiciones de la invención es al menos aproximadamente 17 a 21 días, 18 a 22 días, 19 a 23 días, 20 a 24 días, 21 a 25 días, 22 a 26 días, 23 a 27 días, 24 a 28 días, 25 a 29 días, ó 26 a 30 días. En aún otras modalidades la vida media de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente y de las composiciones de la invención puede ser de hasta aproximadamente 50 días. En ciertas modalidades, la vida media de los anticuerpos y de las composiciones de la invención pueden ser prolongadas por métodos conocidos en la técnica. Tal prolongación puede reducir a su vez la cantidad y/o frecuencia de la dosificación de las composiciones , del anticuerpo. Los anticuerpos con vida media mejorada in vivo y los métodos para prepararlos se describen en patente de los Estados Unidos núm. 6,277,375; y la publicación internacional núm. WO 98/23289 y WO 97/3461.

En otra modalidad, la invención proporciona un artículo de fabricación que incluye un contenedor. El contenedor incluye una composición que contiene un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente, y un inserto del paquete o etiqueta indicando que la composición se puede usar para tratar la enfermedades relacionadas con la adhesión, invasión, angiogénesis , y/o proliferación celular, que incluyen, pero no se limitan a, N enfermedades caracterizadas por la expresión o sobreexpresion de DLL4.

En otras modalidades, la invención proporciona un kit que comprende una composición que contiene un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente, e instrucciones para administrar la composición a un sujeto con necesidad de tratamiento.

La presente invención proporciona una formulación de proteínas que comprende una región Fe variante. 0 sea, una región Fe de origen no natural, por ejemplo una región Fe que comprende uno o más residuos de aminoácidos de origen no natural . Las regiones Fe variantes de la presente invención también abarcan las regiones Fe que comprenden deleciones, adiciones y/o modificaciones de aminoácidos.

La vida media en suero de las proteínas que comprenden regiones Fe se puede aumentar al aumentar la afinidad de unión de la región Fe por FcRn. En una modalidad, la proteína variante Fe tiene vida media aumentada en suero con relación a la molécula comparable.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 239, 330 y 332, como se enumeró por el índice EU que se exponen en Kabat . En una modalidad específica, la presente invención proporciona, una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 330L y 332E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. Opcionalmente , la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de- origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo, que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 330L y 332E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252Y, 254T y 256E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat .

En otra modalidad, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 234, 235 y 331, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica adicional, una variante Fe de la invención comprende los residuos de aminoácidos de origen no natural 234F, 235F, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En otra modalidad específica, una variante Fe de la invención comprende residuos de aminoácidos de origen no natural 234F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. Opcionalmente, la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat; y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252Y, 254T y 256E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 239, 330 y 332, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 33.0L y 332E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. Opcionalmente, la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat . En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 330L y 332E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252Y, 254T y 256E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat .

En otra modalidad, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 234, 235 y 331, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. Opcionalmente , la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat ; y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252Y, 254T y 256E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat .

Los métodos para generar regiones Fe de origen no natural se conocen en la técnica. Por ejemplo, las sustituciones y/o deleciones de aminoácidos se pueden generar por métodos de mutagénesis, que incluyen, pero no se limita a, mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 82:488-492 (1985)), PCR mutagénesis (Higuchi, en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, p . 177-183 (1990)), y mutagénesis por inserción de un cásete (Wells y otros, Gene 34:315-323 (1985)) . Preferentemente, la mutagénesis dirigida al sitio se realizó por el método PCR de extensión con traslape (Higuchi, en "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification' ' , Stockton Press, Nueva York, pp . 61-70 (1989)) . La técnica de PCR de extensión con traslape (Higuchi, ibid.) también puede usarse para introducir cualquier mutación (es) deseadas en una secuencia objetivo (el ADN de partida) . Por ejemplo, la primera ronda de PCR en los métodos de extensión del traslape incluye amplificar la secuencia objetivo con un cebador externo (cebador 1) y un cebador de mutagénesis interno (cebador 3) , y separadamente con un segundo cebador externo (cebador 4) y un cebador interno (cebador 2) , provocando dos segmentos PCR (segmentos A y B) . El cebador de mutagénesis interno (cebador 3) se designa para contener desapareamientos con la secuencia objetivo, especificando la(s) mutación (es) deseadas. En la segunda ronda de PCR, los productos de la primera ronda de PCR (segmentos A y B) se amplifican por PCR usando los dos cebadores externos (cebadores 1 y 4) . El segmento PCR de longitud completa resultante (segmento C) se digiere con enzimas de restricción y el fragmento de restricción resultante se clona en un vector adecuado. Como primera etapa de mutagénesis, el ADN de partida (por ejemplo, que codifica una proteína de fusión Fe, un anticuerpo o simplemente una región Fe) , está operablemente clonada en un vector de mutagénesis. Los cebadores se designan para reflejar la sustitución de aminoácidos deseada. Otros métodos útiles para la generación de regiones Fe variantes se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms .5 , 624 , 821 ; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; publicación de patente de los Estados Unidos núms. 2004/0002587 y publicaciones PCT WO 94/29351; O 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinka a y otros, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) patente de los Estados Unidos núm. 6,602,684; serie de los Estados Unidos núm. 10/277,370; serie de los Estados Unidos núm. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación por glicosilación GlyjcoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza) . Ver, por ejjemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki y ¡otros, 2004, JMB, 336: 1239-49.

También se conoce en la técnica que la glicosilaqión de la región Fe se pueden modificar para aumentar o disminuir una función efectora (ver por ejemplo, Umana y otros, 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies y otros, 2001 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields y otros, 2002, J Biol Chem 277:26733- 26740; Shinkawa y otros, 2003, J Biol Chem 278:3466,-3473) I patente de los Estados Unidos núm. 6,602,684; serie de los Estados Unidos núm. 10/277,370; serie de los Estados Unidos núm. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1 ; PCT O 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificac on por glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza) . En consecuencia, en una modalidad las regiones Fe de los anticuerpos de la invención comprenden una glicosilación ! alterada de los residuos de aminoácidos. En otra modalidad, la glicosilación alterada de lios residuos de aminoácidos resulta j en una función efectora disminuida. En otra modalidad, la glicosilación alterada de los residuos de aminoácidos resulta en una función efectora aumentada. En una modalidad específica, la región Fe tiene fucosilación reducida. En otra modalidad, la región Fe es fucosilada (ver, por ejjemplo, I publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005/0226867) .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Fig. 1 representa un gráfico de barras que mjuestra los efectos de los anticuerpos IgGl DLL4 en la inhibición estimulada por DLL4 de la proliferación de HUVEC . El dato es representativo de n>2 experimentos independientes. | La Fig. 2 representa un gráfico de barras que muestra los efectos de los anticuerpos IgG2/4 DLL4 en la formación del tubo de HUVEC in vitro cómo se evaluó por medición de la i longitud del vaso (mm) y # bifurcaciones.

La Fig. 3 representa un gráfico de barras que muestra los efectos de anticuerpos anti-DLL4 no marcados) para i desplazar la unión de 21H3RK marcado Alexa-647 a O.lj mg/ml como se determinó por análisis FACS.

La Fig.4. representa una representación lineal gráfica de doce variantes de DLL4/DLL1 quiméricas. Todas las variantes codifican los dominios extracelulares de DLL4 humana con DLL1 humana reemplazando los subdominios individuales o segmentos de dominios combinados como es representado.

La Fig.5. representa gráficos de línea que muestran la unión de 21H3RK a variantes knock out quiméricas ("KO") que codifican para DLL4 con segmentos del dominio extracelular sustituido con los dominios DLLl correspondientes.

La Fig. 6 representa la línea que muestra la unión de 21H3RK a variantes knock out quiméricas ("KO") que codifican para DLL4 con segmentos del dominio extracelular sustituido con los dominios DLLl correspondientes y variantes knock en quiméricas ("KI") que codifican para DLLl con regiones sustituidas con las contrapartes de DLL4.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención se relacionan con un nuevo conjunto de moléculas de bloqueo DLL4 , tales como, por ejemplo, anticuerpos, que inhiben la señalización del receptor de Notch. Esas moléculas se pueden usar como agentes únicos, o alternativamente, en conjunto con otros anticuerpos/agentes de unión. Ellos se pueden usar también en combinación con algún estándar o nuevos agentes anti -cáncer.

Las modalidades de la invención se relacionan con agentes de unión identificados que se unen a DLL4. En algunas modalidades, los agentes de unión identificados se unen a DLL4 e inhiben la unión deDLL4 a un receptor Notch (tal como Notch 1, Notch 2, Notch 3, y/o Notch 4). En algunas modalidades, esta unión puede neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, o interferir con uno o más aspectos de los efectos asociados a la DLL4. En una modalidad, los agentes predefinidos son anticuerpos monoclonales , o fragmentos de unión de estos. Tales anticuerpos monoclonales se pueden referir a los 5 anticuerpos anti-DLL4 en la presente.

Otras modalidades de la invención incluyen los anticuerpos anti-DLL4 completamente humanos, y las preparaciones del anticuerpo que son terapéuticamente útiles. En una modalidad, las preparaciones del anticuerpo anti-DLL4 ]_0 de la invención tienen propiedades terapéuticas deseables, que incluyen fuerte afinidad de unión por DLL4 , capacidad de bloquear las interacciones ligando-receptor DLL4 , capacidad de bloquear la señalización mediada por DLL4 , la capacidad de promover la proliferación celular endotelial y la formación de 3_5 vasos sanguíneos no funcionales, capacidad de modular el reclutamiento de pericito a los vasos, capacidad para inhibir el crecimiento tumoral, capacidad de aumentar la hipoxia/necrosis del tumor, capacidad para alterar el destino celular de la punta/tallo endotelial, y capacidad para modular 20 supervivencia de las células tumorales o supervivencia de las células madre del cáncer y la auto renovación.

Además, las modalidades de la invención incluyen métodos de usar los anticuerpos descritos en la presente para tratar enfermedades. Los anticuerpos anti-DLL4 de la invención 25 son útiles para prevenir la tumorigénesis e invasión del tumor mediada por DLL4 de tejidos sanos. Adicionalmente, los anticuerpos DLL4 pueden ser útiles para tratar enfermedades asociadas con la angiogénesis tal como la enfermedad ocular como AMD, trastornos inflamatorios tales como artritis reumatoide, y enfermedad cardiovascular y sepsias así como enfermedades neoplásicas. Cualquier enfermedad que se caracterice por un tipo de tumor maligno, incluyendo los cánceres metastásicos , los tumores linfáticos, y cánceres de la sangre, se pueden tratar también por este mecanismo de inhibición. Los cánceres ejemplares en seres humanos incluyen un tumor de vejiga; un tumor de mama; un tumor de próstata; un carcinoma celular basal; un cáncer del tracto biliar; un cáncer de vejiga; un cáncer de hueso; un cáncer de cerebro y SNC (por ejemplo, el tumor glioma) ; un cáncer cervical; un coriocarcinoma ; un cáncer de colon y recto; un cáncer de tejido conjuntivo; un cáncer del sistema digestivo; un cáncer de endometrio; un cáncer de esófago; un cáncer de ojo; un cáncer de cabeza y cuello; un cáncer gástrico; una neoplasia intraepitelial ; un cáncer de riñon; un cáncer de laringe; una leucemia; un cáncer de hígado; un pulmón cáncer (por ejemplo, de células pequeñas y de células no pequeñas) ; un linfoma que incluye un linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, labio, lengua, boca y faringe) ; un cáncer de ovario; un cáncer pancreático; un retinoblastoma; un rabdomiosarcoma ; un cáncer de recto; un cáncer ; un cáncer del sistema respiratorio; un sarcoma; un cáncer de piel; un cáncer de estómago; un cáncer testicular; un cáncer de tiroides; un cáncer uterino; un cáncer del sistema urinario; así como otros carcinomas y sarcomas. Los trastornos malignos se diagnostican comúnmente en perros, gatos y otros animales domésticos que incluyen, pero no se limitan a, el linfosarcoma, el osteosarcoma, los tumores mamarios, el mastocitoma, el tumor cerebral, el melanoma, el carcinoma adenoescamoso, el tumor de pulmón carcinoide, el tumor de la glándula bronquial, el adenocarcinoma bronquiolar, el fibroma, el mixocondroma , el sarcoma pulmonar, el neurosarcoma, el osteoma, el papiloma, el retinoblastoma, el sarcoma de Ewing, el tumor de ilms, el linforna de Burkitt, el microglioma, el neuroblastoma, el osteoclastoma, la neoplasia oral, el fibrosarcoma, el osteosarcoma y el rabdomiosarcoma , el carcinoma genital dé célula escamosa, el tumor venéreo transmisible, el tumor testicular, el seminoma , el tumor celular de Sertoli, el hemangiopericitoma, el histiocitoma , el cloroma (por ejemplo, el sarcoma granulocítxco) , el papiloma de córnea, el carcinoma de córnea de célula escamosa, el hemangiosarcoma, el mesotelioma pleural, el tumor celular basal, el timoma, el tumor de estómago, el carcinoma de la glándula suprarrenal, la papilomatosis oral, el hemangioendotelioma y el cistoadenoma , el linforna folicular, el linfosarcoma intestinal, el fibrosarcoraa y el carcinoma pulmonar de célula escamosa. En los roedores, tales como un hurón, los cánceres ejemplares incluyen el insulinoma, el linfoma, el sarcoma, el neurona, el tumor de la célula de islote pancreático, el linfoma de MALT gástrico y el adenocarcinoma gástrico. Las neoplasias que afectan al ganado agrícola incluyen la leucemia, el hemangiopericitoma y la neoplasia ocular bovina (en el ganado) ; f ibrosarcoma del prepucio, el carcinoma ulceroso de célula escamosa, el carcinoma de prepucio, la neoplasia del tejido conjuntivo y el mastocitoma (en los caballos) ; el carcinoma hepatocelular (en los cerdos) ; el linfoma y la adenomatosis pulmonar (en la oveja) ; el sarcoma pulmonar, el linfoma, el sarcoma de Rous, la retículo-endoteliosis , el f ibrosarcoma, el nefroblastoma, el linfoma de célula B y la leucosis linfoide (en las especies de aves) ; el retinoblastoma, la neoplasia hepática, el linfosarcoma (linfoma linfoblástico) , la leucemia plasmocitoide y el sarcoma de vejiga natatoria (en el pescado), la linfadenitis caseosa (CLA) : enfermedad crónica, infecciosa, contagiosa de la oveja y los carneros causada por la bacteria Corynebacterium pseudotuberculosis , y el tumor pulmonar contagioso de la oveja causada por jaagsiekte.

Otras modalidades de la invención incluyen los ensayos de diagnóstico para determinar específicamente la cantidad de DLL4 en una muestra biológica. El kit de ensayo puede incluir un agente o anticuerpo de unión identificado como se divulga en la presente junto con los marcadores necesarios para la detectar tales anticuerpos. Estos ensayos diagnósticos son útiles para seleccionar las enfermedades relacionadas con la proliferación, invasión, angiogénesis o adhesión celular que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neoplásicas.

Otro aspecto de la invención es un antagonista de la actividad biológica de DLL4 en donde el antagonista se une a la DLL4. En una modalidad, el antagonista es un agente de unión identificado, tal como un anticuerpo. El antagonista se puede seleccionar de un anticuerpo descrito en la presente, por ejemplo, el anticuerpo 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3, 1D4 , o 21H3RK.

En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLL4 se puede unir a DLL4 y, de esta forma, inhibir o suprimir l unión dé DLL4 a Notch, inhibiendo dé esta manera la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular.

Una modalidad es un agente de unión identificado el cual se une al mismo epítopo o epítopos como anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3, 1D4 , o 21H3RK.

Una modalidad es un anticuerpo el cual se une al mismo epítopo o epítopos como anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3 , 1D4 , o 21H3RK.

Una modalidad es un hibridoma que produce el agente de unión identificado como es descrito en la presente anteriormente. En una modalidad está un hibridoma que produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de los anticuerpos como los descritos en la presente anteriormente. En una modalidad, el hibridoma produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otra modalidad el hibridoma produce lá cadena ligera y/o la cadena pesada del anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4 , 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 , o 21H3RK. Alternativamente, el hibridoma puede producir un anticuerpo el cual se une al mismo epítopo o epítopos como anticuerpo monoclonal completamente humano 4B4 , 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 , o 21H3RK.

Otra modalidad es una molécula de ácido nucleico que codifica al agente de unión identificado según lo descrito anteriormente en la presente. En una modalidad es una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo según lo descrito anteriormente en la presente. En una modalidad la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Aún otra modalidad es una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano seleccionado de los anticuerpos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3 , 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 , o 21H3R .

Otra modalidad de la invención es un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico según lo descrito anteriormente en la presente, donde el vector codifica un agente de unión identificado según lo define anteriormente este documento. En una modalidad de la invención es un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico según lo descrito anteriormente en la presente, donde el vector codifica una cadena ligera y/o una cadena pesada de un anticuerpo según lo define anteriormente este documento.

Todavía otra modalidad de la invención es una célula hospedera que comprende un vector según lo descrito anteriormente en la presente. Por otra parte, la célula hospedera podría comprender más de un vector.

Además, una modalidad de la invención es üñ método para producir un agente de unión identificado de la invención mediante el cultivo de las células hospederas bajo las condiciones donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el agente de unión identificado, seguido por la recuperación del agente de unión identificado. En una modalidad de la invención está un método para producir un anticuerpo de la invención mediante el cultivo de las células hospederas bajo las condiciones donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo, seguido por la recuperación del anticuerpo.

En una modalidad, la invención incluye un método para preparar un agente de unión identificado mediante la transfección de al menos una célula hospedera con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica el agente de unión identificado según lo descrito anteriormente en la presente, para expresar la molécula de ácido nucleico en la célula hospedera y aislar el agente de unión identificado. En una modalidad, la invención incluye un método para preparar un anticuerpo mediante la transfección de al menos una célula hospedera con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo según lo descrito anteriormente en la presente, para expresar la molécula de ácido nucleico en la célula hospedera y aislar el anticuerpo.

De acuerdo con otro aspecto, la invención incluye un método de antagonizar la actividad biológica de DLL4 al administrar un antagonista como el descrito en la presente. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de DLL4.

Otro aspecto de la invención incluye un método de antagonizar la actividad biológica de DLL4 al administrar un agente de unión identificado como es descrito en la presente anteriormente. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de DLL4.

Otro aspecto de la invención incluye un método de antagonizar la actividad biológica de DLL4 al administrar un anticuerpo como el descrito en la presente anteriormente. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de DLL4. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de DLL4.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El agente de unión identificado se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL . El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administraradministrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratamiento de cáncer en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de DLL4. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para el cáncer, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista que antagoniza la actividad biológica de DLL . El antagonista se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratamiento de cáncer en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para el cáncer, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El agente de unión identificado se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento de cáncer en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para el cáncer, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de reducir o inhibir la proliferación, adhesión, invasión y/o angiogénesis de células tumorales, en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de una reducción o inhibición de la proliferación, invasión, angiogénesis y/o adhesión celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4. El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de reducir el crecimiento de un tumor y/o metástasis, en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL . El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de una reducción del crecimiento de un tumor y/o metástasis, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL . El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de un antagonista de la actividad biológica de DLL4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLI.4 es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLL4 es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un antagonista de la actividad biológica de DLL4 para el uso como un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión' y/o angiogénesis y/o adhesión celular. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLL4 es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLL4 es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para su uso como un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para su uso como un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación y/o invasión y/o angiogénesis y/o adhesión celular.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un antagonista de la actividad biológica de DLL4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLL4 es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLL4 es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un antagonista de la actividad biológica de DLL4 para el uso como un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero. En una modalidad, el antagonista dé la actividad biológica de DLL4 es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de DLL4 es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero .

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para el uso como un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para el uso como un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona el uso de un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para la preparación de un medicamento para la reducción o inhibición de la proliferación, invasión, angiogénesis y/o adhesión celular en un animal.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para su uso como un medicamento para la reducción o inhibición de la proliferación, invasión, angiogénesis y/o adhesión celular en un animal.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona el uso de un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para la preparación de un medicamento para reducir el crecimiento del tumor y/o metástasis, en un animal.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de DLL4 para el uso como un medicamento para reducir el crecimiento del tumor y/o metástasis, en un animal.

En una modalidad la presente invención es particularmente adecuada para el uso en antagonizar DLL4, en pacientes con un tumor que es sólo dependiente, o en parte, de DLL4.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona allí una composición farmacéutica que comprende un antagonista de la actividad biológica de DLL4 , y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad el antagonista comprende un anticuerpo. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona allí una composición farmacéutica que comprende un antagonista de la actividad biológica de DLL4 , y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad el antagonista comprende un anticuerpo.

En algunas modalidades, a continuación de la administración del anticuerpo que se une específicamente a DLL4 , se administra un agente de compensación, para eliminar el exceso de anticuerpos circulantes de la sangre.

Los anticuerpos anti-DLL4 son útiles en la detección de DLL4 en las muestras de pacientes y, en consecuencia son útiles como diagnosticadores de estados de la enfermedad según lo descrito en la presente. Además, en base a su capacidad para inhibir significativamente la actividad de señalización mediada por DLL4 (como se demuestra en los Ejemplos a continuación) , los anticuerpos anti-DLL4 tienen efectos terapéuticos en el tratamiento de los síntomas y las afecciones que resultan de la expresión de DLL4. En modalidades específicas, los anticuerpos y los métodos de este documento se refieren al tratamiento de los síntomas que resultan de la proliferación y/o señalización intracelular inducida por DLL4. Modalidades adicionales involucran usar los anticuerpos y los métodos descritos en la presente para tratar las enfermedades relacionadas con la adhesión, invasión, angiogénesis y/o proliferación celular, que incluyen las enfermedades neoplásicas, tales como, el melanoma, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el glioma, el carcinoma hepatocelular (hígado), el tumor de tiroides, el cáncer gástrico (estómago) , el cáncer de próstata, el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de vejiga, el cáncer de pulmón, el glioblastoma, el cáncer de endometrio, el cáncer de riñon, el cáncer de colon y el cáncer pancreático. Los anticuerpos pueden también ser útiles en tratar la invasión y/o adhesión celular en la artritis, aterosclerosis y enfermedades que involucren angiogénesis.

En una modalidad específica, los anticuerpos anti-DLL4 o los agentes de unión identificados pueden tener efectos terapéuticos para tratar tumores sólidos cuyo desarrollo descansa en una pequeña población de células madres con la capacidad de proliferar y originar eficientemente células madres tumorales adicionales, por ejemplo, tumores de mamas y leucemia mieloide aguda (AML) .

En otra modalidad, la invención incluye un kit de ensayo para detectar DLL4 en los tejidos, células o fluidos corporales de los mamíferos para detectar las enfermedades relacionadas con la proliferación, invasión, angiogénesis o adhesión celular. El kit incluye un agente de unión identificado que se une a la DLL4 y unos medios para indicar si está presente la reacción del agente de unión identificado con DLL4. En una modalidad, el agente de unión identificado que se une a la DLL4 es marcado. En otra modalidad, el agente de unión identificado es un agente sin marcar y el kit incluye además unos medios para detectar el agente de unión identificado. De preferencia, el agente de unión identificado es marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, radionúclidos y un material radio-opaco.

En otra modalidad, la invención incluye un kit de ensayo para detectar la DLL4 en los tejidos, células o fluidos corporales de los mamíferos para detectar las enfermedades relacionadas con proliferación, invasión, angiogénesis o adhesión celular. El kit incluye un anticuerpo que se une a la DLL4 y unos medios para indicar si está presente la reacción del anticuerpo con DLL . El anticuerpo podría ser un anticuerpo monoclonal . En una modalidad, el anticuerpo que se une a la DLL4 es marcado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo primario sin marcar y el kit incluye además unos medios para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, los medios incluyen un segundo anticuerpo marcado " que es una anti-inmunoglobul ina . De preferencia, el anticuerpo es marcado con un marcador seleccionado del grupo consistente de un fluorocromo, una enzima, radionúclidos y un material radio-opaco .

Modalidades adicionales, características, y similares con respecto a los anticuerpos según lo divulgado en la presente se proporcionan a continuación en los detalles adicionales .

Listado de Secuencia Las modalidades de la invención incluyen los anticuerpos específicos enumerados a continuación en la Tabla 1. Esta tabla reporta el número de identificación de cada anticuerpo anti-DLL4, conjuntamente con el número de ident . de la sec. del dominio de los polipéptidos y genes de cadena pesada y de cadena ligera correspondientes, respectivamente. A cada anticuerpo se le ha dado un número de identificación.

TABLA 1 mAb Secuencia sec. con con núm. núm. de de ident. : ident. : Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 1 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 2 4B4 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 3 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 4 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 5 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 6 2H10 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 7 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 8 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 9 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 10 21F7 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 12 mAb Secuencia sec. con con núm. núm. de de ident. : ident. : Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 13 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 14 12A1 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 15 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 16 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 17 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 18 17F3 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 19 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 20 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 21 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 22 9G8 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 23 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 24 Secuencia de nucleótidos que codifica la región 20G8 variable de la cadena pesada 25 mAb Secuencia sec. con con núm. núm. de de ident. : ident. : Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 26 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 27 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 28 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 29 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 30 21H3 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 31 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 32 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 33 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 34 1E4 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 35 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 36 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 37 3A7 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 38 mAb Secuencia sec. con con núm. núm. de de ident. : ident. : Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 39 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 0 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 41 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 42 4B3 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 43 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 44 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 45 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 46 1D4 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 47 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 48 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 29 21H3R Secuencia de aminoácidos que codifica la región K variable de la cadena pesada 30 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 49 mAb Secuencia sec. con con núm. núm. de de ident. : ident. : Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 50 La Tabla 2 es una tabla que compara las regiones de cadena pesada de los anticuerpos con su emparentada región de cadena pesada de la línea germinal y las regiones de cadena ligera kappa con su emparentada región de cadena ligera de la línea germinal .

Tabla 2 5 10 5 10 Definiciones A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos usados en la presente tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica. Además, a menos se requiera lo contrario por el contexto, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y técnicas de, cultivo celular y de tejido, biología molecular y proteína y química de oligo- o polinucleótido y la hibridación que se describen en la presente son aquellas bien conocidas y se usan comúnmente en la técnica.

Las técnicas estándares se usan para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se ejecutan normalmente en la técnica o según se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan en general de acuerdo a los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y según se describe en distintas referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a lo largo de la presente especificación. Véase por ejemplo, Sambrook y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001)), que se incorpora a este documento como referencia. Las nomenclaturas que se utilizan en conexión con, y los procedimientos y técnicas dé laboratorio de, la química analítica, la química orgánica sintética, y la química médica y farmacéutica que se describen en la presente son aquellas bien conocidas y que se usan comúnmente en la técnica. Las técnicas estándares se usan para la síntesis química, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación y la entrega, y el tratamiento de los pacientes.

Como se utiliza de acuerdo con la presente divulgación, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderán que tienen los siguientes significados: Un antagonista o un inhibidor podría ser un polipéptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido, un compuestos de peso molecular pequeño, un oligonucleótido, un oligopéptido, un ARN de interferencia (ARNi) , un antisentido, una proteína recombinante , un anticuerpo, o fragmentos de éstos o conjugados o proteínas de fusión de éstos. Para una revisión de ARNi véase Milhavet 0, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. 2003 Dic ; 55 (4 ) : 629-48. Revisión) y el antisentido (véase Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 2003 Oct 28;2003 (206):pe47.) Un compuesto se refiere a cualquier compuesto de peso molecular pequeño con un peso molecular menor que aproximadamente 2000 Dalton.

El término "DLL4" se refiere a la molécula que es proteína DLL4 , también conocido como precursor de la proteína 4 tipo Delta, homólogo 4 Delta de Drosophila, hdelta2, MGC126344, o UNQ1895/PR04341. Los términos "que neutraliza" o "inhibe" cuando se refieren a un agente de unión identificado, tal como un anticuerpo, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para eliminar, reducir, o reducir de forma significativa, la actividad de un antígeno objetivo. Por consiguiente, un anticuerpo anti-DLL4 de la invención "que neutraliza" es capaz de eliminar o reducir significativamente la actividad de DLL4. Un anticuerpo DLL4 neutralizante puede actuar, por ejemplo, bloqueando la unión de una DLL4 nativa a su receptor Notch, tal como, por ejemplo, Notch 1 o Notch 4. Al bloquear esta unión, la actividad mediada por la señal de DLL4 es significativamente, o completamente eliminada. Idealmente, un anticuerpo neutralizante contra el antagonismo de DLL4 promueve la proliferación de EC. Un anticuerpo DLL4 neutralizante puede aumentar, por ejemplo, la angiogénesis al promover la formación de vasos no funcionales.

Un "antagonista de la actividad biológica de DLL4" es capaz de eliminar, reducir o reducir significativamente la actividad de DLL4. Un "antagonista de la actividad biológica de DLL4" es capaz de eliminar, reducir o reducir significativamente la señalización de DLL4. Un "antagonista de la actividad biológica de DLL4" podría eliminar o reducir significativamente la proliferación y/o angiogénesis .

"Reducir la señalización DLL4" abarca una reducción de señalización por al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% en comparación con el nivel de señalización en ausencia de un agente de unión identificado, anticuerpo o antagonista de la invención.

Una secuencia "optimizada" es una secuencia (cadena pesada o ligera variable de cualquiera de los anticuerpos descrito en la presente) que se ha mutado de manera que la secuencia de línea no germinal muta nuevamente en uno o^ más residuos a la secuencia de línea germinal, y puede incluir, además, la eliminación de las complicaciones estructurales de la secuencia tal como los sitios de glicosilación o cisteína no apareada .

El término "polipéptido" se usa en la presente como un término genérico para referir a la proteína nativa, los fragmentos, o análogos de una secuencia polipeptídica . Por lo tanto, la proteína nativa, los fragmentos, y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina humana de cadena pesada y las moléculas de inmunoglobulina humana de cadena ligera kappa, así como las moléculas del anticuerpo se forman por las combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como, las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o lamda, y viceversa, así como los fragmentos y análogos de éstos. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención podrían comprender también únicamente las moléculas de inmunoglobulina humana de cadena pesada o fragmentos de éstas.

Los términos "nativos" o "de origen natural" se usan en la presente según se aplica a un objeto que refiere el hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (que incluyen a los virus)¦ que se pueden aislar de una fuente en la naturaleza y que no haya sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio o de lo contrario sea de origen natural .

El término "enlazado de manera conveniente" como se usa en la presente, se refiere a las posiciones de los componentes de modo que están descritos en una relación que les permite funcionar a la manera propuesta por estos. Por ejemplo, una secuencia de control "enlazada de manera conveniente" a una secuencia que codifica se conecta de tal manera que la expresión de la secuencia que codifica se alcanza bajo condiciones compatibles con las secuencias de control .

El término "polinucleótido" que se refiere en la presente significa una forma polimérica de nucleótidos dé al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, o los ARN-ADN-heterodúplex . El término incluye las formas de ADN simple o doble cadena.

El término "oligonucleótido" que refiere el presente documento incluye los nucleótidos de origen natural, que se enlazan entre sí mediante los enlaces de origen natural y los de origen no natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto del polinucleótido que en general comprende una longitud de 200 bases o menos. De preferencia, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y con máxima preferencia de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son a menudo de una cadena simple, por ejemplo, para las sondas, aunque los oligonucleótidos podrían ser de doble cadena, por ejemplo, para usar en la construcción de un gen mutante . Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos ya sea sentido o antisentido.

El término "nucleótidos de origen natural" que refiere este documento incluye los desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" que refiere este documento incluye los nucleótidos con los grupos de azúcar modificados o sustituidos y los similares El término "enlaces de oligonucleótidos" que refiere este documento incluye los enlaces de los oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y los similares. Veáse por ejemplo, LaPlanche y otros, Nucí. Acids Res . 14 : 9081 (1986); Stec y otros. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein y otros. Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon y otros. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y otros. Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp . 87-108 (F. Eckstein, Edición, Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec y otros, patente de los Estados Unidos núm. 5,151,510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), las divulgaciones de los cuales se incorporan a este documento como referencia. Un oligonucleótido puede incluir un mareaje para la detección, si se desea.

El término "hibridación selectiva" que refiere este documentó significa la unión de forma detectable y específica. Los polinucleótidos , oligonucleótidos y fragmentos de éstos se hibridan selectivamente a las cadenas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que minimicen en cantidades apreciables la unión detectable a .los ácidos nucleicos no específicos. Condiciones de alta rigurosidad se pueden usar para alcanzar las condiciones de hibridación selectiva como se conoce en la técnica y se discute en la presente. En general, la homología en la secuencia de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos , los oligonucleótidos , o los fragmentos de anticuerpos y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos 80%, y más típicamente con homologías que de preferencia aumenten al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%.

Las condiciones rigurosas de hibridación incluyen, pero no se limitan a, la hibridación con el ADN unido al filtro en el cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) (0.9 M de NaCl/90 mM de Citrato de Na, pH 7.0) a aproximadamente 45 °C seguido por uno o más lavados en SSC 0.2X/0.1% de SDS a aproximadamente 50-65 °C, condiciones altamente rigurosas, tales como la hibridación de ADN unido al filtro en SSC 6X a 45 °C seguido por uno o más lavados en SSC 0.1X/0,2% de SDS a aproximadamente 60 °C, o algunas otras condiciones rigurosas de hibridación conocidas por aquellas personas con conocimiento en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel , F.M. y otros, ediciones. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, Green Publishing Associates, Inc., y John iley and Sons, Inc, NY en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3). Dos secuencias de aminoácidos son "homologas" si existe una identidad parcial o total entre sus secuencias. Por ejemplo, el 85% de homología significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para la coincidencia máxima. Las brechas (en cualquiera de las dos secuencias que se coinciden) se permiten en la coincidencia máxima; longitudes de brecha de 5 o menos se prefieren siendo de mayor preferencia con 2 o menos. Por otra parte y de preferencia, dos secuencias de la proteína (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) son homologas, según se usa este término en la presente, si tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de la mutación de la matriz y una penalidad de brecha de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein secuencia and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y suplemento 2 de este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes de éstas son homologas con mayor preferencia si sus aminoácidos son mayores que o iguales 50% idénticos cuando se alinean de manera óptima mediante el programa ALIGN. Se debe apreciar que pueden existir diferentes regiones de homología en dos secuencias ortólogas . Por ejemplo, los sitios funcionales de ortólogos de ratón y humanos podrían tener un grado superior de homología que en las regiones no- funcionales .

El término "corresponde a" se usa en la presente para significar que una secuencia de polinucleótido es homologa (es decir, es idéntica, sin relación estrictamente evolutiva) a toda o a una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia.

En contraposición, el término "complementario a" se usa en la presente para significar que la secuencia complementaria es homologa a toda o a una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustrar, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" .

El término "identidad de la secuencia" significa que dos secuencias de polinucleó idos o de aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o de residuo por residuo) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula por la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, la determinación del número de posiciones en las cuales la base idéntica de ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) o residuo de aminoácido tiene lugar en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) , y la multiplicación del resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" según se usa en la presente denota una característica de una secuencia de polinucleótido o de aminoácidos, donde el polinucleótido o ácido amino comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, con mayor preferencia al menos 99 por ciento de identidad de secuencia, cuando se compara con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos) , a menudo sobre una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos) , donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula por la comparación de la secuencia de referencia con la secuencia que podría incluir supresiones o adiciones que suman en total 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia podría ser un subconjunto de una secuencia más grande.

Según se usa en la presente, los veinte amino ácidos convencionales y sus abreviaturas continúan el uso convencional. Veáse I munology - A Synthesis (2da Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Ediciones., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que se incorpora a este documento como referencia. Los esteréoisómeros (por ejemplo, los D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales tales como OÍ-, aminoácidos o¡-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales podrían ser también componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de los aminoácidos no convencionales incluyen: 4- hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e -N, N, N-trimetillisina , e- N-acetillisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N- formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?- metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la anotación de polipéptido que se usa ' en la presente, la dirección a la 0 izquierda es la dirección del amino terminal y la dirección a la derecha es la dirección carboxi-terminal , de acuerdo con el uso y convención estándar.

Del mismo modo, a menos que se especifique lo contrario, el extremo a la izquierda de las secuencias de 5 polinucleótidos de simple cadena es el extremo 5', la dirección a la izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble cadena se refiere como la dirección 5' . La dirección de adición 5' a 3' de transcriptos del ARN naciente se refiere como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia Q en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia del ARN y que son 5' al extremo 5' del transcripto de ARN se refieren como "secuencias de corriente arriba" ; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia del ARN y que son 3' al extremo 3' del transcripto de ARN se j- denominan "secuencias de corriente abajo".

Según se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT mediante los pesos de brecha por defecto, comparten al menos 80 por ciento de la identidad de secuencia, de preferencia al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, con mayor preferencia al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y con máxima preferencia al menos 99 por ciento de identidad de secuencia. De preferencia, las posiciones de residuos que no son idénticos difieren por las sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la capacidad de intercambio de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es la glicina, la alanina, la valina, la leucina e la isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo-alifáticas es la serina y la treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es la asparagina y la glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, la tirosina y el triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es la l sina, la arginina y la histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. De preferencia los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina , alanina-valina, glutámico-aspártico, y asparagina-glutamina .

Según, lo discutido en la presente, las variaciones pequeñas en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan según están incluidas por la presente invención, que proporciona que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 75%, con mayor preferencia al menos 80%, 90%, 95%, y con máxima preferencia el 99% de identidad de secuencia con los anticuerpos o las moléculas de inmunoglobulina que se describen en la presente. En particular, los reemplazos conservativos de aminoácidos se contemplan. Los reemplazos conservativos son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en las familias: (1) ácida=aspartato, glutamato; (2) básica= lisina, arginina, histidina; (3) no polar=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga=glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias de mayor preferencia son: serina y treonina son una familia hidroxi-alifáticos ; la asparagina y la glutamina son una familia que contiene amida; la alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia de alif ticos; y la fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia de aromáticos. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto mayor sobre la función o las propiedades de unión de la molécula resultante, en especial si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro de un sitio marco. Se puede determinar fácilmente al ensayar la actividad específica del polipéptido derivado si un cambio de aminoácido resulta en un péptido funcional. Los ensayos se describen en detalle en la presente. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar fácilmente por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica. Los terminales amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos tienen lugar cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante la comparación de los datos de la secuencia del nucleótido y/o aminoácido con la base de datos de secuencia pública o privada. De preferencia, los métodos automatizados de comparación se usan para identificar los motivos de secuencia o predecir los dominios de conformación de la proteína que tienen lugar en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar las secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida se conocen. Bowie y otros, Science 253:164 (1991). De este modo, los ejemplos anteriores demuestran que aquellas personas con conocimiento en la técnica pueden reconocer los motivos de secuencia y conformaciones estructurales que se podrían usar para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con los anticuerpos descritos en la presente.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo se desamidan a menudo a los residuos correspondientes glutamil y aspartil, respectivamente. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos se acepta dentro del alcance de esta invención.

En general, los residuos de cisteína en las proteínas están ya sea comprometido en los enlaces cisteína-cisteína del disulfuro o estéricamente protegidos de la formación de enlaces disulfuro cuando son una parte de la región de la proteína plegada. La formación del enlace disulfuro en las proteínas es un proceso complejo, que se determina por el potencial redox del medio ambiente y las enzimas especializadas que intercambian el tiol-disulfuro (Creighton, ethods Enzymol. 107, 305-329, 1984; Houee-Levin, Methods Enzymol . 353, 35-44,2002). Cuando un residuo de cisteína no tiene un par en la estructura de proteínas y no se protege estéricamente por el plegado, puede formar un enlace disulfuro con la cisteína libre de la solución en un proceso conocido como la reorganización del disulfuro. En otro proceso conocido como la mezcla del disulfuro, las cisteínas libres pueden interferir también con los enlaces disulfuros de origen natural (tales como los presentes en las estructuras de los anticuerpos) y conducir a una baja unión, baja actividad biológica y/o baja estabilidad.

Las sustituciones de los aminoácidos preferidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir distintas mutaciones de una secuencia a parte de la secuencia del péptido de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones únicas o múltiples de aminoácidos (de preferencia sustituciones conservativas de aminoácidos) se pueden generar en la secuencia de origen natural (de preferencia en la región del polipéptido fuera de los contactos intermoleculares que forman el dominio(s). Una sustitución conservativa del aminoácido no debería modificar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un reemplazo del aminoácido no debería tender a romper una hélice que tiene lugar en la secuencia parental, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia parental) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido que se reconocen en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, ediciones, Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)), y Thornton y otros. Nature 354:105 (1991), que se incorporan cada uno en la presente como referencia.

Además, tales métodos se podrían usar para generar sustituciones o supresiones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace de disulfuro intracatenario para generar moléculas de anticuerpos que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracatenarios .

El término "región CDR" o "CDR" se propone indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo que confieren al anticuerpo la especificidad- de unión al antígeno. Las CDR se podrían definir de acuerdo con el sistema de Kabat (Kabat, E.A. y otros (1991) secuencias of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición. ÉE.UU Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), y ediciones posteriores. Un anticuerpo contiene normalmente 3 regiones CDR de cadena pesada y 3 regiones CDR de cadena ligera. El término CDR o las CDR se usa aquí para indicar, de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad de los anticuerpos por el antígeno o el epítopo que reconoce.

La tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad en esencia debido a los mecanismos de arreglo de los genes que dan lugar a la misma) . Esta podría ser tan corta como 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es de, 26. La longitud de CDR podría variar también de acuerdo a la longitud en la que se puede acomodar por el marco subyacente en particular. Funcionalmente, la HCDR3 juega en parte un papel en la determinación de la especificidad de los anticuerpos (Segal y otros, PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit y otros, Science, 233:747-753, 1986, Chothia y otros, J. Mol. Biol . , 196:901-917, 1987, Chothia y otros, Nature, 342:877- 883, 1989, Catón y otros, J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon y otros, PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon y otros, J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat y otros, J. Immunol., 147:1709-1719, 1991) .

El término un "conjunto de las CDR" referido en este documento comprende CDR1, CDR2 y CDR3. De este modo, un conjunto de las HCDR se refiere a HCDR1 , HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de las LCDR se refiere a LCDRl, LCDR2 y LCDR3.

Las variantes de los dominios VH y VL y las CDR dé la presente invención, incluyen aquellas cuyas secuencias de aminoácidos se exponen en la presente, y que se pueden emplear en los agentes y anticuerpos identificados para DLL4 se pueden obtener por medio de métodos de alteración o mutación de la secuencia y la detección para identificar el antígeno con las características deseadas. Los ejemplos de las características deseadas incluyen pero no se limitan a: la afinidad de unión aumentada para el antígeno con relación a los anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno; la neutralización aumentada de una actividad del antígeno con relación a los anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno si la actividad se conoce; la capacidad competitiva especifica con un anticuerpo o ligando conocido para el antígeno en una proporción molar específica; la capacidad para inmunoprecipitar el complejo 1igando-receptor; la capacidad de unirse a un epítopo específico; un epítopo lineal, por ejemplo, la secuencia de péptido identificada mediante la detección del péptido de unión, por ejemplo, usando los péptidos detectados en la conformación lineal y/o restringida; el epítopo conformacional , formado por los residuos no continuos; la capacidad para modular una nueva actividad biológica de DLL4 , o molécula de corriente abajo; la capacidad para unir y/o neutralizar a DLL4 y/o alguna otra propiedad conveniente.

Las técnicas que se requieren para generar las sustituciones en las secuencias de aminoácidos de las CDR, los dominios VH o VL del anticuerpo y los sitios de unión al antígeno están disponibles en la técnica. Las variantes de las moléculas de anticuerpos divulgadas en la presente se podrían producir y usa en la presente invención. Continuando la iniciativa de la química automatizada en la aplicación de las técnicas de análisis multivariante de datos a las relaciones entre la actividad- estructura/propiedad (Wold, y otros, Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics athematics and Statistics in Chemistry (Ed. : B. Kowalski) , D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984) , las relaciones actividad cuantitativa-propiedad de los anticuerpos se pueden derivar mediante las técnicas matemáticas bien conocidas, tales como la regresión estadística, el reconocimiento y la clasificación del estándar (Norman y otros Applied Regression Analysis. Wiley- Interscience ; 3ra edición (abril 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (mayo 11, 1995); Krzanowski, Wojtek. Principies of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, Núm. 22 (manuscrito)). Oxford University Press; (diciembre 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations . Morgan Kaufmann; (Octubre 11, 1999); Denison David G . T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrián F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics) . John Wiley & Sons ; (julio 2002) ; Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principies, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery) . En algunos casos las propiedades de los anticuerpos se pueden derivar de los modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, el análisis de residuos similares de contacto o la propiedad fisicoquímica calculada) de la secuencia del anticuerpo, las estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar por separado y en combinación.

Un sitio del anticuerpo de unión al antígeno compuesto de un dominio VH y un dominio VL se forma normalmente por seis lazos del polipéptido: tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio · variable de cadena pesada (VH) . El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha aclarado las relaciones entre la secuencia y estructura tridimensional de los sitios de combinación del anticuerpo. Estas relaciones implican que, a excepción de la tercera región (lazo) en los dominios VH, los lazos del sitio de unión tienen uno con un pequeño número de conformaciones de la cadena principal: estructuras canónicas. La estructura canónica formada en un lazo en particular, se ha demostrado estar determinada por su tamaño y la presencia de determinados residuos en sitios claves tanto en el lazo como en las regiones marco.

Este estudio de la relación secuencia-estructura se puede usar para la predicción de aquellos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, los cuales son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus lazos CDR y por lo tanto mantienen la especificidad de unión. Estas predicciones se pueden respaldar a diferencia de las predicciones para el resultado de los experimentos de optimización conducidos. En un enfoque estructural, un modelo de la molécula del anticuerpo se puede crear mediante cualquier paquete libremente disponible o comercial, tales como WAM. Una visualización de la proteína y un paquete de programa de análisis, tales como Insight II (Accelrys, Inc.) o Deep View se podrían usar después para evaluar las posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Esta información se podría usar después para generar sustituciones probables que tengan un efecto mínimo o beneficioso en la actividad o conferir otras propiedades convenientes.

El término "fragmento del polipeptido" como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión del amino-terminal y/o carboxi-terminal , pero donde la secuencia de aminoácido remanente es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc completo. Los fragmentos normalmente son al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo, de preferencia al menos 14 aminoácidos de largo, con mayor preferencia al menos 20 aminoácidos de largo, por lo general al menos 50 aminoácidos de largo, y aún con mayor preferencia al menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" según se usa en la presente, se refiere a los polipéptidos que se comprenden de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácido deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a DLL4 , bajo las condiciones de unión adecuadas, (2) la capacidad para bloquear la unión apropiada VEGF/DLL4, o (3) la capacidad para inhibir la actividad tirosina cinasa del receptor de DLL4. Normalmente, los análogos del polipéptido comprenden una sustitución conservativa de aminoácido (o adición o supresión) con respecto a la secuencia de origen natural . Los análogos normalmente son al menos 20 aminoácidos de largo, de preferencia al menos 50 aminoácidos de largo o más largo, y puede ser a menudo tan largo como un polipéptido de origen natural completo. ,, · Los análogos del péptido se usan en común en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellos del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "péptidos miméticos" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J". Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans y otros J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que se incorporan a este documento como referencia) . Tales compuestos se han desarrollado a menudo con la ayuda del modelaje molecular automatizado. Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se podrían usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tales como los anticuerpos humanos, pero tiene uno o más enlaces peptídicos reemplazados de forma opcional por un enlace seleccionado del grupo consistente de: - -CH2NH- - , --CH2S--, --CH2-CH2--, - -CH=CH- - (cis y trans) , --C0CH2--, --CH(0H)CH2--, y -CH2SO-- mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de la L-lisina) se podría usar para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica se podrían generar por los métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), que se incorpora a este documento como referencia) ; por ejemplo, por la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclen el péptido .

Un anticuerpo podría ser oligoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo multi-específico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo catalítico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano , un anticuerpo anti-idiotipo y los anticuerpos que se pueden marcar en forma soluble o enlazada, así como fragmentos, variantes o derivados de éstos, ya sea solos o en combinación con otras secuencias de aminoácidos que se proporcionan por las técnicas conocidas. Un anticuerpo podría ser de cualquier especie.

Según se usa en la presente, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" ( inmunoglobulinas) incluyen los anticuerpos monoclonales (que incluyen los anticuerpos monoclonales completos) , los anticuerpos policlonales , . los anticuerpos camélidos y los anticuerpos quiméricos. Según se usa en la presente, el término "anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a un polipéptido o un grupo de polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión que se forma a partir del plegamiento de las cadenas del polipéptido que tienen espacios de unión tridimensional con las formas superficiales I internas y las distribuciones de carga complementarias con las propiedades de un determinante antigénico de un ant geno cadena. Los anticuerpos nativos son en general glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente de 150,000 dalton, compuestos por dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Cada cadena ligera se enlaza con una cadena pesada por un enlace covalente de disulfuro, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera tiene espaciado por lo regular también los puentes disulfuro intracatenarios . Cada cadena pesada tiene un dominio variable (VH) en un extremo, seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea en las cadenas lambda o cadenas kappa basado en la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena de ligera. El dominio variable de una cadena ligera kappa se podría denominar también como VK en la presente. El término "región variable" se puede usar también para describir el dominio variable de una cadena pesada o una cadena ligera. Los residuos de aminoácidos en particular se creen formar una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman un sitio de unión del anticuerpo. Tales anticuerpos se podrían derivar de cualquier mamífero, que incluye pero no se limita a, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc.

El término "anticuerpo" o "anticuerpos" incluye los fragmentos de unión de los anticuerpos de la invención, los fragmentos ejemplares incluyen Fvs de cadena simple (scFv) , los anticuerpos de cadena simple, los anticuerpos de dominio único, los anticuerpos de dominio, los fragmentos Fv, los fragmentos Fab, los fragmentos F(ab'), los fragmentos F(ab')2, los fragmentos de anticuerpos que presentan la actividad biológica conveniente, la región variable estabilizada por enlace disulfuro (dsFv) , la región variable dimérica (Diacuerpo) , los anticuerpos anti-idiotipo (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-Id para los anticuerpos de la invención), los intracuerpos , los anticuerpos lineales, las moléculas de anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpos y fragmentos de unión al epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen las moléculas de inmunoglobulinas y los fragmentos inmunológicamente activos de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al i | antígeno. Las moléculas de inmunoglobulinas pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl e IgA2) o subclase .

La digestión de los anticuerpos con la enzima, papaína, resulta en dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, conocidos también como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe", que no tiene actividad de unión al antígeno, pero tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, resulta en un fragmento F (ab' )2 fragmento en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen enlazados y comprenden dos sitios de unión al antígeno. El fragmento F(ab' )2 tiene la capacidad de entrecruzarse con el antígeno .

El "Fv" cuando se usa en la presente, se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que retiene tanto el reconocimiento al antígeno como los sitios de unión al antígeno. Esta región consiste de un dímero de dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha, asociación no covalente o covalente. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir al antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión completo.

El "Fab" cuando se usa en la presente, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

El "dAb" cuando se usa en la presente, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que es la unidad funcional de unión más pequeña de los anticuerpos humanos. Un "dAb" es un anticuerpo de dominio único y comprende tanto el dominio variable de una cadena pesada del anticuerpo (dominio VH) como el dominio variable de una cadena ligera del anticuerpo (dominio VL) . Cada dAb contiene tres de las seis CDR de origen natural (Ward y otros, Binding activities of a repertoire of singlé immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989); Holt, y otros, Domain antibodies : protein for therapy, Trends Biotechnol . 21, 484-49 (2003)) . Con pesos moleculares en el intervalo de 11 a 15 kDa, son cuatro veces más pequeñas que un fragmento de unión al antígeno (Fab) 2 y la mitad del tamaño de una molécula Fv de cadena simple (scFv) .

Cuando se usa "camélido" en la presente, se refiere a las moléculas de anticuerpos que se componen de dímeros de cadenas pesadas que están desprovistos de cadenas ligeras, I pero sin embargo tiene un amplio repertorio de unión al antígeno (Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R (1993) Naturally occurring anticuerpos devoid of light chains. Nature 363 :446-448) .

El término "diacuerpos" se refiere a los fragmentos pequeños del anticuerpo con dos sitios de unión antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-vL) . Al usar un ligando que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a parear con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios.de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404,097; W0 93/11161; y Hollinger y otros, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90 : 6444-6448 (1993) .

Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo puede realizar la función de unión a los antígenos. Los ejemplos de fragmentos de unión son (Ward, E.S. y otros, (1989) Nature 341, 544-546) el fragmento Fab consistente de VL, VH, CL y los dominios CH1 ; (McCafferty y otros (1990) Nature, 348, 552-554) el fragmento Fd consistente de los dominios VH y CH1 ; (Holt y otros (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) el fragmento Fv consistente de los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento de dAb (Ward, E.S. y otros, Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty y otros (1990) Nature, 348, 552-554, Holt y otros (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490] , que consiste de un dominio VH o un dominio VL; (v) las regiones CDR aisladas; (vi) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas de Fv de simple cadena (scFv) , donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un ligando de péptido que permite asociar a los dos dominios para formar un sitio de unión al antígeno (Bird y otros, (1988) Science, 242, 423-426, Huston y otros, (1988) PNAS EE.UU., 85, 5879-5883), (viii) los dímeros biespecíficos de Fv de simple cadena (PCT/US92/09965) y (ix) los "diacuerpos" , fragmentos multivalentes o multiespecífieos construidos por fusión genética (WO94/13804; Holliger, P. (1993) y otros, Proc . Nati. Ácad. Sci. ÉÉ.ÜU. 90 6444-6448,). El Fv, scFv o moléculas diacuerpo se podrían estabilizar por la incorporación de los puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter, Y. y otros, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Los minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 se podrían generar también (Hu, S. y otros, (1996) Cáncer Res, 56, 3055-3061) . Otros ejemplos de fragmentos de unión son el Fab' , que difiere de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el terminal carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo, y el Fab' -SH, que es un fragmento Fab' en el cual el residuo (s) de cisteína de los dominios constantes porta un grupo tiol libre.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y son responsables de la especificidad de unión de cada anticuerpo en particular por su antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniforme a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) , tanto en los dominios variables de la cadena ligera como los de la cadena pesada. Las regiones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas cada uno comprende cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida la configuración de hoja-ß, conectadas por tres CDR, que forman lazos que se conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja-ß. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas a corta distancia por las regiones FR y, con las CDR de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) ) . Los dominios constantes en general no se involucran directamente en la unión del antígeno, pero podrían influir en la afinidad de unión al antígeno y podrían presentar diversas funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la ADCC, CDC, y/o apoptosis.

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que se asocian con su unión al antígeno. Las regiones hipervariables incluyen los residuos de aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y los residuos 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) ) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada. Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Los residuos "marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable que flanquean las CDR. Los residuos FR están presentes en los anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos, anticuerpos de dominio, diacuerpos, vacicuerpos, anticuerpos lineales, y biespecíficos .

Según se usa en la presente, el agente de unión identificado, proteína de unión identificada, proteína de unión específica y los términos similares se refieren a un anticuerpo, o fragmento de unión de éste que de preferencia se une a un sitio objetivo. En una modalidad, el agente de unión identificado es específico para un único sitio objetivo. En otras modalidades, el agente de unión identificado es específico para más de un sitio objetivo. En una modalidad, el agente de unión identificado podría ser un anticuerpo monoclonal y el sitio objetivo podría ser un epítopo.

Los "fragmentos de unión" de un anticuerpo se producen por técnicas de ADN recombinante , o por escisión enzimática o química de los anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab' )2, Fv, dAb y anticuerpos de cadena simple. Un anticuerpo además de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" se entiende que tenga cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un receptor a un contra-receptor cuando un exceso de anticuerpos reduce la cantidad de receptor unido al contrareceptor por al menos aproximadamente 20%, 40%, 60% ó 80%, y más generalmente mayor que aproximadamente 85% (según se mide en un ensayo in vitro de unión competitiva) .

El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína con capacidad de unión específica a una inmunoglobulina o receptor celular T. Los determinantes epitópicos por lo general consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y podrían, pero no siempre, tener características específicas de estructura tridimensional, así como las características específicas de carga. Se dice que un anticuerpo une de manera específica a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 µ?, de preferencia = 100 nM y con máxima preferencia < 10 nM.

El término "agente" se usa en la presente para denominar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto generado de materiales biológicos.

"Activo" o "actividad" en cuanto a un polipéptido de DLL4 se refiere a una parte de un polipéptido de DLL4 que tiene una actividad biológica o inmunológica de un polipéptido de DLL4 nativa. Cuando se usa "biológico" en la presente,, se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido de DLL4 nativa. Una actividad biológica de DLL4 preferida incluye, por ejemplo, la proliferación, invasión, angiogénesis y/o la adhesión celular inducida por DLL4.

Cuando se usa "mamífero" en la presente se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. De preferencia, el mamífero es el humano.

Cuando se usa "animal" en la presente incluye los animales que se consideran un mamífero. De preferencia, el animal es el humano .

El término "mAb"- se refiere al anticuerpo monoclonal. Cuando se usa "liposoma" en la presente, se refiere a una pequeña vesícula que podría ser útil para entregar los fármacos que podrían incluir el polipéptido de DLL4 de la invención o los anticuerpos para tal un polipéptido DLL4 de un mamífero .

Como se usa "mareaje" o "marcado" en la presente, se refiere a la adición de una región detectable a un polipéptido, por ejemplo, un radiomarcado, un marcado fluorescente, un marcado con marcador enzimático quimioluminiscente o un grupo biotinilo. Los radioisótopos o radionúclidos podrían incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 112??, 125I, 131I, los marcadores fluorescentes podrían incluir rodamina, fósforos de lantánida o FITC y los marcadores enzimáticos podrán incluir la peroxidasa de rábano picante, b-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina.

Los marcadores adicionales incluyen, a modo de ilustración y no limitados a: las enzimas, tales como glucosa-e-fosfato dehidrogenasa ("G6PDH"), alfa-D-galactosídasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetileolinesterasa , lisozima, malato deshidrogenasa y peroxidasa, tintes; los mareajes fluorescentes adicionales o fluorescedores incluyen, la fluoresceína y sus derivados, el fluorocromo, GFP (GFP para "proteína fluorescente verde"), el dansilo, la umbeliferona, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina , el o-ftaldehído, y la fluorescamina; los fluoróforos tales como por ejemplo los criptatos y quelatos de lantánidos por ejemplo, Europio, etc. (Perkin Elmer y Cis Biointernational) , los mareajes quimioluminiscentes o quimioluminicedores , como isoluminol, luminol y la dioxetanos; sensibilizadores, coenzimas, sustratos enzimáticos, partículas, tales como partículas de látex o de carbono; metal sol; cristalito; liposomas; células, etc, que podrían ser marcadas además con un colorante, catalizador u otro grupo detectable; moléculas tales como la biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina; regiones de toxinas, como por ejemplo un región de toxina seleccionada de un grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE o una fragmento citotoxico o su mutante de éste) , toxina de Difteria o un fragmento citotoxico o mutante de éste, una toxina botulínica A, B, C, D, E o F, ricina o un fragmento citotoxico de ésta por ejemplo, ricina A, abrina o un fragmento citotoxico de ésta, saporina o un fragmento citotoxico de ésta, toxina antiviral de la hierba carmín o un fragmento citotoxico de ésta y citotóxicos de briodina 1 o un fragmento citotoxico de ésta.

El término "agente farmacéutico o fármaco" según se usa aquí, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico conveniente cuando se administra como es debido a un paciente. Otros términos químicos en la presente se usan de acuerdo con los usos convencionales en la técnica, como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary de Chemical Terms (Parker, S., Ed. , McGraw-Hill, San Francisco (1985)), (incorporado en la presente como referencia).

Como se usa en la presente, "sustancialmente pura", denota que una especie objeto es la especie presente predominante (es decir, en una base molar esta es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) , y, de preferencia, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composición sustancialmente pura comprenderá más que aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, con mayor preferencia más que aproximadamente 85%, 90%, 95% y 99%. Con máxima preferencia, la especie objeto se purifica para la homogeneidad fundamental (la especie contaminante no se puede detectar en la composición por los métodos de detección convencionales) donde la composición consta en esencia dé una única especie macromolecular .

El término "paciente" incluye los sujetos humanos y veterinarios .

"Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por célula en la que las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores de IgFc (Fc s) (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK) , monocitos, neutrófilos y macrófagos ) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y, posteriormente, causa la lisis de la célula objetivo. Las. células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan sólo FcgRIII, mientras que los monocitos expresan FcgRI, FcgRII y FcgRIII. La expresión de los FcRs en las células ematopoyéticas se resume en la Tabla 3 página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Imm nol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vi tro, tal como ese descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,500,362, ó 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PB C) y : las células citolíticas naturales (NK) . Por otra parte, o aún m s , la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como ese descrito en Clynes y otros PNAS (EE.UU.) 95:652-656 (1988). "Citotoxicidad dependiente de complemento" y "CDC" se refieren al mecanismo por el cual los anticuerpos llevan a cabo su función citolítica en la célula. Este se inicia por la unión de Clq, un constituyente del primer componente del complemento, para el dominio Fe de las Igs, IgG o IgM, que están en el complejo con el antígeno (Hughs-Jones , NC, y B. Gardner. 1979. Mol . Immunol . 16:697). El Clq es una gran, gl coproteína estructuralmente compleja de -410 kDa presente en el suero humano a una concentración de 70 pg/ml (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151). Junto con dos serina proteasas, Clr y Cls, el Clq forma el complejo Cl, el primer componente del complemento. Al menos dos de las cabezas globulares N-terminal de Clq deberían estar unidas a la Fe de las Igs por la activación de Cl, por lo tanto, para la iniciación de la cascada del complemento (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151).

El término "vida media del anticuerpo" como se usa en la presente denota una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo de supervivencia medio de las moléculas de anticuerpos a continuación de su administración. La vida media del anticuerpo se puede expresar como el tiempo requerido para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de la inmunoglobulina del cuerpo del paciente o de un compartimento específico de éste, por ejemplo, según lo medido en suero o plasma, es decir, la vida media de circulación, o en otros tejidos. La vida media puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otro. En general, un aumento en la vida media del anticuerpo resulta en un aumento del tiempo medio de residencia (MRT) en circulación para el anticuerpo administrado.

El término "isotipo" se refiere a la clasificación de una región constante de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Los dominios constantes de los anticuerpos no se involucran en la unión al antígeno, sino distintas funciones efectoras. En dependencia de la secuencia de aminoácido de la región constante de cadena pesada, un anticuerpo humano o inmunoglobulina dada se pueden asignar a una de las cinco clases principales de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varias de estas clases se pueden dividir además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl (gamma 1) , IgG2 (gamma 2), IgG3 (gamma 3), e IgG4 (gamma 4), e IgAl e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan , d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. De las distintas clases de inmunoglobulinas humanas, sólo las IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 e IgM humanas se conocen para activar el complemento. La IgGl e IgG3 humanas se conocen para mediar en los humanos . Las regiones constantes de la cadena ligera humana se podrían clasificar en dos clases principales, kappa y lambda.

Si conveniente, el isotipo de un anticuerpo que une específicamente a DLL4 se puede cambiar, por ejemplo, para sacar beneficio de una propiedad biológica de un isotipo diferente. Por ejemplo, en algunas circunstancias puede ser conveniente con relación a la generación de anticuerpos, como los anticuerpos terapéuticos contra DLL4 , que los anticuerpos sean capaces de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Existe un número de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, que incluyen, sin limitación, los siguientes: IgM murina, IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgM humana, IgA humana, IgGl humana, IgG3 humana. En otras modalidades que puede : ser conveniente con relación a la generación de anticuerpos como los anticuerpos terapéuticos contra DLL4 que los anticuerpos sean capaces de unirse a los receptores Fe en las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) . Existe un número de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, que incluyen, sin limitación, los siguientes: IgG2a murina, IgG2b murina, lgG3 murina, IgGl humana e IgG3 humana. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan de inicio que posean tal isotipo, sino, más bien, el anticuerpo según se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede ser cambiado de isotipo después mediante técnicas convencionales, que son bien conocidas en- la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes dirigidas (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 4,816,397), las técnicas de fusión célula-célula (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,916,771 y 6,207,418), entre otras.

A modo de ejemplo, los anticuerpos anti-DLL4 analizados en la presente son anticuerpos completamente humanos. Si un anticuerpo poseía la unión conveniente a DLL4, se podría fácilmente cambiar de isotipo para generar un isotipo de IgM humana, IgGl humana, o IgG3 humana, mientras que posea aún la región misma variable (que define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad) . Tal molécula sería capaz después de fijar el complemento y participar en la CDC y/o sería capaz de unirse a los receptores Fe en las células efectoras y participar en la ADCC.

Los "ensayos de sangre completa/total" usan la sangre sin fraccionar como fuente de efectores naturales. La sangre contiene el complemento en el plasma, junto con efectores celulares que , expresan FcR, tales como las células polimorfonucleares (PMN) y las células mononucleares (MNCs) . De este modo, los ensayos de sangre completa/total permiten la evaluación simultánea de la sinergia in vitro de ambos mecanismos efectores ADCC y CDC.

Una cantidad "terapéuticamente efectiva" según se usa en la presente es una cantidad que proporciona alguna mejoría o beneficio al sujeto. Dicho de otra manera, una cantidad "terapéuticamente efectiva" es una cantidad que proporciona algún alivio, mitigación y/o disminución de al menos un síntoma clínico. Los síntomas clínicos asociados con los trastornos que se pueden tratar mediante los métodos de la invención se conocen bien por aquellas personas con conocimiento en la técnica. Además, aquellas personas con conocimiento en la técnica apreciarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre y cuando se proporciona algún beneficio al sujeto.

El término "y/o" según se usa en la presente se debe tomar como la divulgación específica de cada una de las dos características específicas o componentes con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" se debe tomar como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, tal como si cada uno se expusiese de forma individual en la presente .

Estructura del Anticuerpo La unidad estructural básica del anticuerpo se conoce comprender un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas , cada pareja tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principales por el reconocimiento de antígeno. La parte carboxi -terminal de cada cadena define una región constante responsable principal de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y cadenas ligeras lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo de anticuerpos como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que incluye también una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase, en general, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed. , 2da ed. aven Press, N.Y. (1989)) (incorporado como referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo.

De este modo, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecífieos , los dos sitios de unión son los mismos.

Todas las cadenas presentan la misma estructura general de las regiones marco relativamente conservada (FR) unidas mediante tres regiones hipervariables , denominadas también las CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde la N- terminal a C- terminal, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FRl, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos de cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat secuencias of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia y otros. Nature 342 :878-883 (1989).

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecífieos se pueden producir por una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o enlace de los fragmentos Fab' . Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny y otros. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Los anticuerpos biespecífieos no existen en forma de fragmentos que tienen un único sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab ' , y Fv) .

Normalmente, un dominio VH está pareado con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión antígeno-anticuerpo , aunque un sólo dominio VH o VL se podría usar para unir al antígeno. El dominio VH (véase la Tabla 2) puede estar pareado con el dominio VL (véase la Tabla 2) , para que un sitio de unión antígeno-anticuerpo se forme comprendiendo ambos dominios VH y VL.

Anticuerpos Humanos y Humanización de los Anticuerpos.

Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes del ratón o la rata. La presencia de tales proteínas derivadas del ratón o la rata puede conducir a la compensación rápida de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente. Para evitar el uso de los anticuerpos derivados de ratón o rata, los anticuerpos humanos completos se pueden generar a través de la introducción del loci de anticuerpo humano funcional dentro de un roedor, otro mamífero o animal, de manera que el roedor, otro mamífero o animal produzca los anticuerpos humanos completos.

Un método para generar anticuerpos humanos completos es a través del uso de cepas de ratones XenoMouse® que se han diseñados para contener hastalOOO kb, pero menos que el tamaño de los fragmentos configurados de la línea germinal del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa. Veáse Méndez y otros Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) . , Las cepas XenoMouse® están disponibles de Amgen, Inc. (Fremont, California, EE.UU.).

Tales ratones, después, son capaces de producir las moléculas de inmunoglobulina y los anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos . Los métodos utilizados para el logro de los mismos se divulgan en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie 08/759, 620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las solicitudes internacionales de patente núm. WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, las divulgaciones de las cuales se incorporan por la presente como referencia. Véase también Méndez y otros Nature Genetics 15:146-156 (1997), la divulgación de la cual se incorpora por la presente como referencia.

La producción de cepas XenoMouse de ratón se discute adicionalmente y se delinea en la solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm. 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031,801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/246,145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430, 938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464,584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463,191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/234,145, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996, 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996, publicación de Estados. Unidos 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001 y las patentes de los Estados Unidos núms. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, y 5,939,598 y las patentes japonesas núms. 3 068 180 B2 , 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2. Ver también patente europea núm. EP 0 463 151 Bl, concesión publicada el 12 de junio de 1996, solicitud internacional de patente núm. WO 94/34096, publicada el 3 de febrero de 1994, solicitud internacional de patente núm. WO 96/46096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. La descripción de cada una de las referencias, solicitudes, y patentes antes citadas se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc, han utilizado un enfoque "minilocus". En la aproximación minilocus, un locus Ig exógeno se imita a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus Ig. Así, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y usualmente una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) se forman en un constructo por inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,545,807 de Surani y otros, y las patentes de los Estados Unidos núms. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 todas de Lonberg y Kay, las i patentes de los Estados Unidos núms . 5,591,669 y 6,023.010 de Krimpenfort y Berns, las patentes de los Estados Unidos núms. 5,612,205, 5,721,367, y 5,789,215 de Berns y otros, y la patente de los Estados Unidos núm. 5,643,763 de Choi y Dunn, y solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm. 07/574,748 de GenPharm International, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575,962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810,279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853,408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904,068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990,860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053,131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096,762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155,301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161,739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165,699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209,741, presentada el 9 de marzo dé 1994, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. Ver también la patente europea núm. 0 546 073 Bl, solicitudes internacionales de patente núms. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y la patente de los Estados Unidos núm. 5,981,175, las descripciones de las mismas se incorporan como referencia en su totalidad. Ver también Taylor y otros, 1992, Chen y otros, 1993, Tuaillon y otros, 1993, Choi y otros, 1993, Lonberg y otros, (1994) , Taylor y otros, (1994) , y Tuaillon y otros, (1995) , Fishwild y otros, (1996) , cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

Kirin ha demostrado también que la generación de anticuerpos humanos a partir de los ratones en los que, a través de la fusión microcelular, se han introducido grandes piezas de cromosomas, o cromosomas completos. Veáse solicitudes de patente europeas núms . 773 288 y 843 961, las divulgaciones de las cuales se incorporan por la presente como referencia. Además, los ratones- KM™, que son el resultado del mestizaje de los ratones Te de Kirin con ratones minilocus (Humab) de Medarex se han generado. Estos ratones poseen el transcromosoma de IgH humano de los ratones de Kirin y el transgen de cadena kappa de los ratones Genpharm (Ishida y otros, Cloning células madres, (2002) 4:91-102).

Los anticuerpos humanos se pueden obtener también por métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a la exposición del fago (Medimmune, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (antes Proliferon) , Affimed) exposición de ribosoma (Medimmune) , exposición de levadura, y similares.

Preparación de los anticuerpos Los anticuerpos, como lo describen en la presente, se prepararon a través del uso de la metodología de XenoMouse®, según se describe a continuación. Tales ratones son capaces de producir moléculas de i munoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos . Los métodos utilizados para lograr los mismos se divulgan en las patentes, solicitudes y referencias que se divulgan en la presente en la sección de antecedentes. En particular, sin embargo, una modalidad preferida de la producción transgénica de los ratones y anticuerpos de ellos se divulga en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie 08/759,620, presentada el 03 de diciembre, 1996 y las solicitudes internacionales de patente núms. O 98/24893, publicada el 11 de junio, 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre, 2000, las divulgaciones de las cuales se incorporan por las presentes como referencias. Véase también Méndez y otros, Nature Genetics 15:146-156 (1997), la divulgación de la cual se incorpora por la presente como referencia A través del uso dé tal método, se han producido los anticuerpos monoclonales humanos completos para una diversidad de antígenos. En lo esencial, las líneas XenoMouse® de ratones se inmunizan con un antígeno de líneas interés (por ejemplo DLL4) , las células linfáticas (tal como las células B) se recuperan de los ratones hiper- inmunizados , y los linfocitos recuperados se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares inmortales de hibridoma. Estas líneas celulares de hibridoma se detectan y seleccionan para identificar las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En la presente se proporcionan los métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos específicos para DLL4. Además, en la presente se proporciona la caracterización de los anticuerpos producidos por tales líneas celulares, que incluyen los análisis de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de tales anticuerpos.

Por otra parte, en lugar de ser fusionadas con células de mieloma para generar hibridomas, las células B se pueden ensayar de forma directa. Por ejemplo, las células B CD19+ se pueden aislar de los ratones hiperinmunes XenoMouse® y permitir para la proliferación y diferenciación en células plasmáticas que secretan el anticuerpo. Los anticuerpos de los sobrenadantes de célula se seleccionan después por, por ejemplo, ELISA, FACS o FMAT, para reactividad contra el inmunógeno DLL4. Los sobrenadantes se podrían detectar también por la inmunoreactividad contra los fragmentos de DLL4 para mapear, además, los diferentes anticuerpos por la unión a los dominios de interés funcional en DLL4. Los anticuerpos se podrían detectar también por otras DLL4 humanas relacionadas y en contra de los ortólogos de DLL4 de rata, ratón, y primates no humanos, tales como el mono Cynomolgus , el último para determinar las especies de reactividad cruzada. Las células B de los pocilios que contienen anticuerpos de interés podrían ser inmortalizadas por distintos métodos incluidos la fusión para generar los hibridomas ya sea de los pocilios individuales o de pocilios mezclados, o por la infección con EBV o la transfección de genes de inmortalización conocidos y se cultivaron después en un medio adecuado. Por otra parte, las · células plasmáticas únicas que secretan los anticuerpos con las especificidades convenientes se aislaron después mediante un ensayo de placa hemolítica específico a DLL4 (véase, por ejemplo Babcook y otros, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 93:7843-48 (1996)). Las células identificadas para la lisis son de preferencia los eritrocitos de carnero (SRBC) recubiertos con el antígeno DLL4.

En presencia de un cultivo celular de B que contiene las células plasmáticas que secretan la inmunoglobulina de interés y el complemento, la formación de una placa indica la lisis específica mediada por DLL4 dé los eritrocitos de carnero que rodean la célula plasmática de interés. La célula plasmática individual específica al antígeno en el centro de la placa se puede aislar y la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo se aisla de la célula plasmática individual. Mediante la transcripción inversa seguida de PCR (RT-PCR) , el ADN que codifica para las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo se puede clonar. Tal ADN clonado se puede insertar después además en un vector de expresión adecuado, de preferencia un cásete de vector tal como pcDNA, con mayor preferencia un vector tal como pcDNA que contiene los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina . El vector generado se puede transfectar después en las células hospederas, por ejemplo, en las células HEK293, las células CHO, y cultivarse en los medios convencionales de nutrientes modificado según lo apropiado para la inducción de la transcripción, la selección de transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias convenientes.

Según se apreciará, los anticuerpos que se unen específicamente DLL4 se pueden expresar en líneas celulares aparte de las líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican para los anticuerpos en particular se pueden usar para transformar una célula hospedera de mamífero adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para la introducción de los polinucleótidos en una célula hospedera, que incluyen, por ejemplo, el empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y la transducción de una célula hospedera con el virus (o vector) o por los procedimientos de transfeccion conocidos en la técnica, como lo ejemplifica la patente de los Estados Unidos núm. 4,39,9,216; 4,912,040; 4740461 y 4959455 (cuyas patentes en la presente se incorporan por la presente como referencia) . El procedimiento de transformación que se usa depende del hospedero que se transforma. Los métodos para la introducción de los polinucleótidos heterologos en las células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación de fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos , la electroporación, la encapsulación del polinucleótido (s) en liposomas, y la microinyección directa del ADN en los núcleos.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospederos para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) , que incluyen pero no se limitan a las células de ovario de hámster chino (CHO) , las células HeLa, riñon de cría de hámster (BHK) , las células de riñon de mono (COS) , las células humanas del carcinoma hepatocelular (por ejemplo, Hep G2) , células epiteliales dé riñon humano 293, y una serie de otras líneas celulares. Las líneas celulares de particular preferencia, se seleccionan a través de la determinación de las líneas celulares que tienen altos niveles de expresión y producción de anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a DLL4.

En la técnica de fusión célula-célula, un mieloma, la célula CHO u otra línea celular se prepara que posea una cadena pesada con cualquier isotipo conveniente y otro mieloma, la célula CHO u otra línea celular se prepara que posea la cadena ligera. Tales células se pueden fusionar después, y se puede aislar una línea celular que expresa un anticuerpo intacto.

En consecuencia, según se generan los candidatos de anticuerpos que reúnen los atributos "estructurales" convenientes como lo discutido anteriormente, se pueden proporcionar por lo general, con al menos determinados atributos "funcionales" convenientes a través del cambio de isotipo .

Administrac ón Terapéutica y Formulaciones Las modalidades de la invención incluyen las formulaciones farmacéuticas estériles de los anticuerpos anti-DLL4 que son útiles como tratamientos para las enfermedades. Tales formulaciones podrían inhibir la unión de una DLL4 nativa al receptor Notch 1 o Notch 4, por consiguiente el tratamiento eficaz de los trastornos patológicos donde, por ejemplo, la expresión de DLL4 en suero o tejido es anormalmente elevada. Los anticuerpos anti-DLL4 de preferencia poseen la afinidad adecuada para inhibir potentemente la unión de la DLL4 nativa al receptor Notch 1 o Notch 4 y, de preferencia, que tengan una duración adecuada de la acción a tener en cuenta la dosificación poco frecuente en los seres humanos. Una duración prolongada de la acción permitirá para los menos frecuentes y más convenientes regímenes de dosificación por las vías parenterales alternativas, tales como la inyección subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones estériles se pueden crear, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estéril, antes o después de la liofilización y la reconstitución del anticuerpo. El anticuerpo normalmente se almacenará en forma liofilizada o en solución. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo por lo general se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, como un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración del anticuerpo está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, la inyección o infusión por las vías intravenosa, intraperitoneal , intracerebral , intramuscular, intraocular, intraarterial , intratecal, inhalación o intralesional , inyección directa a un sitio del tumor, o por los sistemas de liberación sostenida según se indica a continuación. El anticuerpo se administra de preferencia por infusión continua o por inyección del bolo.

Una cantidad eficaz del anticuerpo que se emplea terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y el estado del paciente. En consecuencia, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la vía de administración según sea necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Normalmente, el médico administrará el anticuerpo hasta que se alcance una dosis que logre el efecto conveniente. El avance de esta terapia se controla fácilmente por los ensayos convencionales o por los ensayos descritos en la presente.

Los anticuerpos, según lo descrito en la presente, se pueden preparar en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica se puede administrar por vía intravenosa o a través de la nariz o el pulmón, de preferencia como un aerosol líquido o en polvo (liofilizado) . La composición se podría administrar también por vía parenteral o por vía subcutánea según sea conveniente. Cuando se administra de forma sistémica, la composición terapéutica debería ser estéril, libre de pirógenos y en una solución parenteral aceptable teniendo en cuenta el pH, la isotonicidad, y la estabilidad. Estas condiciones son conocidas por aquellas personas con conocimiento en la técnica. En resumen, las formulaciones de las dosis de los compuestos descritos en la presente se preparan para el almacenamiento o la administración por la mezcla del compuesto que tiene el grado de pureza conveniente con los vehículos, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables. Tales materiales no son tóxicos para los destinatarios a las dosis y las concentraciones empleadas, e incluyen los tampones tales como TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidinona ,· aminoácidos tales como la glicina, ácido glutámico, ácido aspártied, o arginina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen la celulosa o sus derivados, la glucosa; la mañosa, o dextrina; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como el manitol o sorbitol; contraiones tales como el sodio y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol .

Las composiciones estériles para inyección se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional según lo descrito en Remington: The Science and Practice de Pharmacy (20aVa edición, Lippincott Williams & Editores Wilkens (2003)). Por ejemplo, la disolución o suspensión: del compuesto activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como el agua o el aceite vegetal de origen natural similar al sésamo, maní, o aceite de semilla de algodón o de un vehículo graso sintético similar al oleato de etilo o los similares podrían convenientes. Los tampones, conservantes, antioxidantes y los similares se pueden incorporar de acuerdo con la práctica farmacéutica aceptada.

Los ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de los polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, cuyas matrices están en la forma de artículos, películas o microcápsulas configuradas. Los ejemplos de las matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) según lo descrito por Langer y otros, J. Biomed afcer. Res, (1981) 15:167-277 y Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (patente de los Estados Unidos, núm 3,773,919, EP 58,481), los copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y otros, Biopolymers, (1983) 22:547-556), acetato de etileno-vinilo no degradable de (Langer y otros, supra) , copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DepotTM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) , y poli-D- (-)- ácido 3-hidroxibutírico (EP 133,988).

Aunque los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de las moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más corto. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, ellas se podrían desnaturalizar o agregar como un resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que resulta en una pérdida de la actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales se pueden concebir para la estabilización de la proteína en función de los mecanismos involucrados. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre estando en la formación del enlace intermolecular S-S mediante el intercambio de disulfuro, la estabilización se podría lograr mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, mediante aditivos apropiados, y el desarrollo de las composiciones específicas de la matriz del polímero.

Las composiciones de liberación-sostenida incluyen también las preparaciones de los cristales del anticuerpo en suspensión en formulaciones adecuadas capaces de mantener los cristales en suspensión. Estas preparaciones cuando se inyectan por vía subcutánea o intraperitoneal pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones incluyen también los anticuerpos atrapados en liposomas. Los liposomas que contienen tales anticuerpos se preparan por los métodos conocidos per se : patente de los Estados Unidos núm DE 3,218,121; Epstein y otros, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; 36,676; EP 88,046; " EP 143 , 949 ; 142 , 641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patente de los Estados Unidos núms . 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324.

La dosis de la formulación de anticuerpo para un paciente dado se determinará por el médico que trata teniendo en consideración varios factores conocidos para modificar la acción de los fármacos que incluyen la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otros medicamentos y otros factores clínicos relevantes. Las dosis terapéuticamente eficaces se pueden determinar por métodos ya sea in vitro o in vivo.

Una cantidad efectiva de los anticuerpos, descritos en la presente, a ser empleados terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, el terapeuta prefiere valorar la dosificación y modificar la ruta de administración como sea necesario para obtener un óptimo efecto terapéutico. Una dosis típica diaria se puede encontrar en el intervalo de aproximadamente 0.0001mg/kg, O.OOlmg/kg, O.Olmg/kg, O.lmg/kg, lmg/kg, 10mg/kg hasta 100mg/kg, 1000mg/kg, 10000mg/kg o más, del peso corporal del paciente dependiendo de los factores mencionados anteriormente. La dosis puede estar entre 0.0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0.0001 y 2 mg/kg, 0.0001 y 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg a 0.25 mg/kg, 0.0001 a 0.15 mg/kg, 0.0001 a 0.10 mg/kg, 0.001 a 0.5 mg/kg, 0.01 a 0.25 mg/kg o 0.01 a 0.10 mg/kg del peso corporal del paciente dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

Típicamente, el clínico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se llegue a una dosis que alcance el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante ensayos convencionales o como se describe en la presente.

Las dosis de los anticuerpos de la invención se pueden repetir y las administraciones se pueden separar por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o al menos 6 meses.

Se apreciará que la administración de las entidades terapéuticas de acuerdo con las composiciones y los métodos en la presente se administrará con los vehículos adecuados, excipientes y otros agentes que se incorporan en las formulaciones para proporcionar mejor transferencia, entrega, tolerancia, y los similares. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, geles, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípido (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™) , los conjugados de ADN, pastas anhidras de absorción, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carboceras (glicoles de polietileno de distintos pesos moleculares) , geles semi-sólido, y mezclas semi-sólidas que contienen carbocera. Cualquiera de las mezclas anteriores podría ser apropiada en los tratamientos y las terapias de acuerdo con la presente invención, se proporciona que el ingrediente activo en la formulación no se inactiva por la formulación y la formulación es compatible fisiológicamente y tolerable con la vía de administración. Veáse también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development : the need for preclinical guidance." Regul . Toxicol . Pharmacol . (2):210-8 (2000), Wang . "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals . " Int. J. Pharm. 203 (l-2):l-60 (2000), Charman "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci .89 (8) :967-78 (2000), Powell y otros, "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol . 52:238-311 (1998) y en ese sentido las citas para la información adicional relacionada con las formulaciones, excipientes y los vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.

Diseño y Generación de Otra Terapéutica De acuerdo con la presente invención y basado en la actividad de los anticuerpos que se producen y se caracterizan en la presente con respecto a DLL4 , se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de las regiones del anticuerpo. Tales modalidades incluyen, sin limitación, la terapéutica avanzada de anticuerpo, tales como los anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas , y terapéutica radiomarcada, anticuerpos de dominio simple, fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab' , F(ah')2, Fv o dAb, generación de terapéutica de péptidos, dominios de unión a la DLL4 en andamios nuevos, terapias génicas, en particular intracuerpos , terapéutica antisentido, y moléculas pequeñas.

Un sitio de unión al antígeno se puede proporcionar por medio de los arreglos de las CDR en los andamios proteicos que no son anticuerpos, tales como la fibronectina o citocromo B, etc. (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12 (5): A1-A6; Koide y otros (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren y otros, (1997) Current Opinión in Structural Biology, 7: 463-469) o por selección al azar o mutación de los residuos de aminoácidos de un lazo dentro de un andamio proteico para conferir especificidad de unión por un objetivo conveniente. Los andamios para la ingeniería de los sitios nuevos de unión en las proteínas se han revisado en detalle por Nygrén y otros, (Nygren y otros (1997) Current Opinión in Structural Biology, 7: 463-469) . Los andamios de proteína para los mimetizadores del anticuerpo se describen en WO/0034784, que en la presente se incorporan como referencia en su totalidad, en las que los inventores describen las proteínas (mimetizadores del anticuerpo) que incluyen un dominio tipo III de fibronectina que tiene al menos un lazo al azar. Un andamio adecuado en cual injertar uno o más CDR, por ejemplo, un conjunto de las HCDR, se podría proporcionar por cualquier miembro del dominio de la superfamilia de genes de las inmunoglobulinas . El andamio podría ser una proteína humana o no humana. Una ventaja del andamio proteico que no es anticuerpo es que podría proporcionar un sitio de unión al antígeno en una molécula andamio que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas del anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como una capacidad para entrar en las células, penetrar profundo en los tejidos o alcanzar los objetivos dentro de otras estructuras, o para unirse dentro de las cavidades proteicas del antígeno objetivo. El uso de los sitios de unión del antígeno en los andamios proteicos que no son anticuerpo se revisa en Wess, 2004 (Wess, L. : In BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004). Típicas son las proteínas que tienen un esqueleto estable y uno o más lazos variables, en los que la secuencia de aminoácidos del lazo o lazos se muta de forma específica o al azar para crear un sitio de unión al antígeno que se une el antígeno objetivo. Tales proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de S. aureus, transíerrina, albúmina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, lOmo dominio de tipo III de fibronectina) , lipocalinas, así como la gamma-cristalina y otros andamios Affilin™ (Proteínas Scil) . Los ejemplos de otros enfoques incluyen "Microcuerpos " sintéticos, basado en pequeñas proteínas-ciclotidas que tienen enlaces disulfuro intra-moleculares ,. Microproteínas (Versabodies™, Amunix) y proteínas de repetición ankirina (DARPins, Molecular Partners) .

Además, para las secuencias de anticuerpos y/o un sitio de unión al antígeno, un agente de unión identificado de acuerdo con la presente invención podría comprender otros aminoácidos, por ejemplo, formar un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad para unir al antígeno. Los agentes de unión identificados de la invención podrían llevar una mareaje detectable, o se podrían conjugar con una toxina o una región o enzima identificada (por ejemplo, a través de un enlace peptidilo o ligando) . Por ejemplo, un agente de unión identificado podría comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio de la enzima) , así como un sitio de unión al antígeno, donde el sitio de unión al antígeno se une al antígeno y de este modo dirige el sitio catalítico para el antígeno. El sitio catalítico podría inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, por escisión.

Con respecto a la generación de terapéutica avanzada de anticuerpo, donde la fijación del complemento es un atributo conveniente, podría ser factible evitar la dependencia del complemento para la muerte celular mediante por ejemplo el uso de anticuerpos biespecíficos , inmunotoxinas o radiomarcadores .

Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden generar que comprendan (i) dos anticuerpos uno con una especificidad para DLL4 y otro a una segunda molécula que se conjugan juntos, (ii) un anticuerpo simple que tiene una cadena específica a DLL4 y una segunda cadena específica a una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de simple cadena que tiene especificidad a DLL4 y a la otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos se pueden generar mediante las técnicas que son bien conocidas; por ejemplo, con respecto a (i) y (ii) véase por ejemplo, Fanger y otros I munol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, supra. y con respecto a (iii) véase, por ejemplo, Traunecker y otros, Int. J. Cáncer (Suplemento) 7:51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad, se puede preparar con los receptores de la activación de la cadena pesada, que incluyen, sin limitación, CD16 o CD64 (véase, por ejemplo, Deo y otros Immunol. Today 18:127 (1997)) o CD89 (véase, por ejemplo, Valerio y otros, Blood 90:4485-4492 (1997)).

Los anticuerpos sé pueden modificar también para actuar como inmunoto inas , que utilizan métodos que son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también la patente de los Estados Unidos núm. 5,194,594. Con respecto a la preparación de anticuerpos radiomarcados , tales anticuerpos modificados se pueden preparar fácilmente también utilizando los métodos que son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Junghans y otros, en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2da edición, Chafner y Longo, ediciones, Lippincott Raven (1996))). Véase también las patentes de los Estados Unidos núms. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 y 5,697,902. Cada inmunotoxina o molécula radiomarcada podría ser similar a las células de muerte que expresan el dominio de oligomerización en la subunidad de la enzima multimérica conveniente.

Cuando un anticuerpo está enlazado a un agente (por ejemplo, radioisótopos, composición farmacéutica, o una toxina) , se contempla que el agente posee una propiedad farmacéutica seleccionada del grupo de agentes antimitóticos , alquilantes, antimetabolitos , anti ngiogénicos , apoptóticos, alcaloides, el COX-2, y antibióticos y combinaciones de éstos. El fármaco se puede seleccionar del grupo de las mostazas de nitrógeno, los derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas , Triacenos, análogos del ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inhibidores COX-2, análogos de pirimidina, análogos de la purina, antimetabolitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas , complejos de coordinación de platino, alcaloides de la vinca, ureas sustituidas, los derivados de metil hidracina, inhibidores adrenocorticales , los antagonistas, endostatina, taxoles, camptotecinas, oxaliplatino, doxorrubicinas y sus análogos, y una combinación de éstos .

Los ejemplos de toxinas incluyen además geloriina, exotoxina de Pseudomonas (PE) , PE40, PE38, toxina de la difteria, la ricina, abrina, la toxina alfa, saporina, ribonucleasa (RNasa) , DNasa I, enterotoxina-A estafilocócica, proteínas antivirales de la hierba carmín, gelonina, endotoxinas de Pseudomonas, los miembros de la familia de moléculas enediyna, tales como calicheamicina y esperamicina, así como los derivados, las combinaciones y modificaciones de éstos. Las toxinas químicas se pueden también tomar del grupo que consiste de duocarmicina (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm 5,703,080 y la patente de los Estados Unidos núm. 4,923,990), metotrexato, doxorrubicina, melfalán, clorambucil, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina y 5 -fluorouracilo . Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos incluyen también Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluorouracilo, Arabinósido de citosina (Ara-C) , Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel) , Busulfán, Citoxina, Taxol , Metotrexato, Cisplatino, Melfalán, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorelbina, Carboplatino, Teniposido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (véase, la patente de los Estados Unidos núm-. 4,675,187) Melfalán y otras mostazas relacionadas con el nitrógeno. Las toxinas adecuadas y los agentes quimioterapéuticos se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19na Edición. (Mack Publishing Co. 1995) , y en Goodman y Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7ma Edición. (MacMillan Publishing Co. 1985) . Otras toxinas adecuadas y/o agentes quimioterapéuticos son conocidos por aquellas personas con conocimientos en la técnica. 5 Los ejemplos de radioisótopos incluyen emisores-gamma, emisores de positrones, y los emisores de rayos X que se pueden usar para la localización y/o la terapia, y los emisores-beta y los emisores-alfa que se pueden usar para la terapia. Los radioisótopos descritos anteriormente como útiles -^Q para el diagnóstico, pronóstico y andamiaje son útiles también para la terapéutica.

Los ejemplos no limitativos de agentes anti -cáncer o anti-leucemia incluyen antraciclinas tales como la doxorrubicina (adriamicina) , daunorrubicina (daunomicina) , 15 idarrubicina , detorrubicin, carminomicina, epirrubicina, esorrubicina y morfolino y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de éstos. Los agentes farmacéuticos ejemplares incluyen cisplatino, taxol, calicheamicina , vincristina, citarabina (Ara-C) , 2Q ciclofosfamida, prednisona, daunorrubicina, idarrubicina, fludarabina, clorambucilo, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida, y bleomicina y derivádos, combinaciones y modificaciones de éstos. De preferencia, el agente anti-cáncer o anti-leucemia es doxorrubicina, 2? morfolinodoxorrubicina o morfolinodaunorrubicina .

Los anticuerpos de la invención también incluyen que tienen una vida media (por ejemplo, vida media en el suero) en un mamífero, de preferencia un humano, de mayor que la de un anticuerpo sin modificar. La vida media de el anticuerpo podría ser mayor que aproximadamente 15 días, mayor que aproximadamente 20 días, mayor que aproximadamente 25 días, mayor que aproximadamente 30 días, mayor que aproximadamente 35 días, mayor que aproximadamente 40 días, mayor que aproximadamente 45 días, mayor que aproximadamente 2 meses, mayor que aproximadamente 3 meses, mayor que aproximadamente 4 meses, mayor que aproximadamente 5 meses. El aumento de la vida media de los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de éstos en un mamífero, de preferencia un humano, resulta en un título de suero superior de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en el mamífero, y de este modo, reduce la frecuencia de la administración de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpos y/o reduce la concentración de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo que se administran. Los anticuerpos o fragmentos de éstos que tienen vida media in vivo aumentada se pueden generar mediante las técnicas conocidas por aquellas personas con conocimiento en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de éstos con vida media in vivo aumentada se pueden generar por la modificación de (por ejemplo, sustitución, supresión o adición) los residuos de aminoácidos identificados como involucrados en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, publicación internacional núms. WO 97/34631 y WO 02/060919, que en la presente se incorporan como referencia en su totalidad) . Los anticuerpos o fragmentos de éstos con la vida media in vivo aumentada se pueden generar por la fijación de las moléculas del polímero a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tales como polietilenglicol de alto peso molecular (PEG) . El PEG se puede fijar a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, con-o sin un ligando multifuncional ya sea a través de la conjugación sitio-específica del PEG con el N-terminal o C-terminal de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o por los grupos amino-épsilon presentes en los residuos de lisina. La derivación del polímero lineal o ramificado que resulta en la pérdida mínima de actividad biológica se usará. El grado de conjugación se supervisará estrechamente por SDS-PAGÉ y espectrometría de masas para garantizar la correcta conjugación de las moléculas PEG a los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, la cromatografía de exclusión molecular o la de intercambio- iónico .

Se apreciará por una persona con conocimiento en la técnica, que en las modalidades anteriores, mientras que los valores de afinidad pueden ser importantes, otros factores pueden ser tan importantes o más, dependiendo de la función particular del anticuerpo. Por ejemplo, para una inmunotoxina . (toxina asociada con un anticuerpo) , el acto de unión del anticuerpo al objetivo puede ser útil, sin embargo, en algunas modalidades, es la internalización de la toxina en la célula el resultado final que es conveniente. Como tal, los anticuerpos con un alto por ciento de internalización pueden ser convenientes en estas situaciones. De este modo, en una modalidad, los anticuerpos con una alta eficiencia en la internalización se contemplan. Una alta eficiencia en la internalización se puede medir como un por ciento de anticuerpo internalizado, y puede ser desde un valor bajo hasta 100%. Por ejemplo, en distintas modalidades, 0.1-5, 50-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99 y 99-100% pueden ser una eficacia alta. Como se apreciará por una persona con conocimiento en la técnica, la eficacia conveniente puede ser diferente en las diversas modalidades, dependiendo de, por ejemplo, el agente asociado, la cantidad de anticuerpo que se puede administrar a una zona, los efectos secundarios del complejo anticuerpo-agente, el tipo (por ejemplo, el tipo de cáncer) y la gravedad del problema que se trata.

En otras modalidades, los anticuerpos divulgados en la presente proporcionan un kit de ensayo para la detección de la expresión de DLL4 en los tejidos o células de mamífero para detectar una enfermedad o un trastorno asociado con cambios en la expresión de DLL4. El kit comprende un anticuerpo que se une a la DLL4 y los medios para indicar si está presente la reacción del anticuerpo con el antígeno.

Combinaciones El agente de unión identificado o anticuerpo definido en la presente puede aplicarse como una terapia única o puede involucrar, adicionalmente a los compuestos de la invención, cirugía convencional o radioterapia o quimioterapia. La quimioterapia puede incluir uno o más de las siguientes categorías de agentes antitumorales : (i) otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y las combinaciones de éstos, como se usa en oncología médica, tales como los agentes alquilatantes (por ejemplo cis-platino, oxaliplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalano, clorambucil, busulfán, temozolamide y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo gemcitabina y antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracil y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, e hidroxiurea) ; antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) ; agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotere e inhibidores de polocinasa) ; e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecan y camptotecina) ; (ii) agentes citostático tales como antioestrógenos (por ejemplo tamoxifen, fulvestrant, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno) , antiandrógenos (por ejemplo bicalutamia, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona) , antagonistas LHRH o agonistas LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina) , progestogenas (por ejemplo acetato de megestrol) , inhibidores de aromatasa (por ejemplo como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5-reductasa tales como finasteride ; (iii) agentes anti-invasión (por ejemplo, inhibidores de la familia de c-Src cinasa. como 4- (6-cloro-2 , 3-metilenodioxianilino) -7- [2- (4-metilpiperazin-l-il) etoxi] -5-tetrahidropiran-4-iloxiquinazolina (AZD0530; solicitud internacional de patente WO 01/94341) y N- (2-clóró-6-metilfenilo) -2- {6- [4- (2-hidroxietilo) piperazin-l-il] -2-metilpirimidin-4-ilamino}tiazol 5-carboxamida (dasatinib, BMS-354825; J. Med. Chem. , 2004, 47, 6658-6661), e inhibidores de la metaloproteinasa como marimastat, inhibidores de función del receptor activador de plasminógeno de urocinasa o, inhibidores de catepsinas, inhibidores de serina proteasas por ejemplo matriptasa, hepsina, urokinasa, inhibidores de heparanasa) ; (iv) agentes citotóxicos tales como fludarabina, 2- clorodeoxiadenosina, clorambucil o doxorrubicina y combinación de éstos tales como Fludarabina + ciclofosfamida , CVP: ciclofosfamida + vincristina + prednisona, ACVBP: doxorrubicina + ciclofosfamida + vindesina + bleomicina + prednisona, CHOP: ciclofosfamida + doxorrubicina + vincristina + prednisona, CNOP : ciclofosfamida + mitoxantrona + vincristina + prednisona, m-BACOD: metotrexato + bleomicina + doxorrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dexametasona + leucovorina, MACOP-B: metotrexato + doxorrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dosis fija de prednisona + bleomicina + leucovorina, o ProMACE CytaBOM: prednisona + doxorrubicina + ciclofosfamida + etoposido + citarabina + bleomicina + vincristina + metotrexato + leucovorina. (v) inhibidores de función del factor de crecimiento, por ejemplo tal como inhibidores incluyen anticuerpos del factor de crecimiento y anticuerpos del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo el anticuerpo anti-erbB2 trastuzumab [Herceptin™] , el anticuerpo anti-EGFR panitumumab, el anticuerpo anti-erbBl cetuximab [Erbitux, C225] y cualquier factor de crecimiento o anticuerpos del receptor del factor de crecimiento descrito por Stern y otros. Critical reviews in cncology/haematology, 2005, Vol . 54, ppll-29) ; tales inhibidores también incluyen inhibidores de tirosina cinasa, por ejemplo, inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo inhibidores de la familia EGFR de tirosina cinasa tales como N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxi-6- (3 -morfolinopropoxi) quinazolin-4 -amina (gefitinib, ZD1839) , N- (3-etinilfenil) -6, 7-bis (2-metoxietoxi) quinazolin-4 -amina (erlotinib, OSI-774) y 6 -acrilamido-.W- (3-cloro-4-fluorofenilo) -7- (3 -morfolinopropoxi) -quinazolin-4-amina (CI 1033), inhibidores de tirosina1 cinasa erbB2 tales como lapatinib, inhibidores del familia del factor de crecimiento de hapatocitos, inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas tal como imatinib, inhibidores de serina/treonina cinasa (por ejemplo Ras/Raf inhibidores de señalización tales como inhibidores de farnesil transferasa, por ejemplo sorafenib (BAY 43-9006)), inhibidores de señalización celular a través de cinasas MEK y/o AKT, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hapatocitos, inhibidores c-kit, inhibidores de cinasa abl, inhibidores de cinasa del receptor IGF (factor de crecimiento tipo insulina) , inhibidores de cinasa aurora (por ejemplo AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 y AX39459) , inhibidores de cinasa dependientes de ciclina tales como inhibidores CDK2 y/o CDK , e inhibidores de proteínas de señalización de supervivencia tales como Bcl-2, Bcl-XL, por ejemplo, ABT-737; (vi) agentes antiangiogénicos tales como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento vascular endotelial, [por ejemplo el anticuerpo del factor de crecimiento celular endotelial anti-vascular bevacizumab (Avastin™) , inhibidores de angiopoyetina- 2 , e inhibidores tirosina cinasa del receptor VEGF tales como 4- (4-bromo-2-fluoroanilino) -6-metoxi-7- (l-metilpiperidin-4 -ilmetoxi) quinazolina (ZD6474; Ejemplo 2 en WO 01/32651), 4- (4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi) -6-metoxi-7- (3-pirrolidin-l-ilpropoxi) quinazolina (AZD2171; Ejemplo 240 en WO 00/47212), vatalanib (PTK787; WO 98/35985) y SU11248 (sunitinib; WO 01/60814; Sutent™) , Sorafenib (Nexxavar™) , los compuestos tales como los descritos en las solicitudes internacionales de patente W097/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO00/47212 y WO01/32651 y los compuestos que funcionan por otros mecanismos (por ejemplo, linomide, inhibidores de la función de la integrina avb3 y angiostatina) ] o receptor CSF1 o del factor 1 estimulante de colonias (CSF1) ; (vii) agentes de daño vascular tales como Combretastatina A4 y los compuestos descritos en las solicitudes internacionales de patente WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213; (viii) terapias antisentido, por ejemplo los que se dirigen a los objetivos enumerados anteriormente, tales como G-3139 (Genasense) , un anti bcl2 antisentido; (ix) aproximaciones a la terapia de genes, incluyendo por ejemplo aproximaciones para reemplazar genes aberrantes tales como p53 aberrante o BRCA1 o BRCA2 aberrantes, GDEPT (terapia génica dirigida enzima-profármaco) aproximaciones tales como aquellas que usan citosina deaminasa, timidina cinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y aproximaciones para aumentar la tolerancia del paciente a la quimioterapia o radioterapia tales como terapia génica de resistencia a múltiples fármacos; y (x) aproximaciones de inmunoterapias , incluyendo por ejemplo el tratamiento con Alemtuzumab (campath- 1H™) , un anticuerpo monoclonal dirigido a CD52, o tratamiento con anticuerpos dirigidos a CD22, ex vivo e in vivo aproximaciones para aumentar la inmunogenicidad de células tumorales del paciente, transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de la colonia granulocito macrófago, aproximaciones para disminuir la anergia de células T tales como el tratamiento con anticuerpo monoclonales que inhiben la función de CTLA-4, aproximaciones usando células inmuno transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citocina, aproximaciones usando líneas celulares tumorales transfectadas con citocinas y aproximaciones usando anticuerpos anti-idiotípicos . (xi) inhibidores de degradación de proteínas tales como inhibidor del proteasoma tales como Velcade (bortezomib) . (xii) aproximaciones terapéuticas bioterapéuticas , por ejemplo, las que usan péptidos o proteínas (tales como anticuerpos o construcciones del dominio del receptor externo soluble) que secuestran los ligandos receptores, bloquean la unión del ligando al receptor o disminuyen la señalización del receptor (por ejemplo debido a la degradación del receptor aumentada o niveles de expresión disminuidos) .

En una modalidad, el tratamiento anti-tumoral definido en la presente puede incluir, adicionalmente a los compuestos de la invención, el tratamiento con otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de éstos, como se usa en oncología médica, tales como agentes alquilatantes (por ejemplo cis-platino, oxaliplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalano, clorambucil, busulfán, temozolamide y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo, gemcitabina y antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracil y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, e hidroxiurea) ; antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) ; agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotere e inhibidores de polocinasa) ; e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecan y camptotecina .

En una modalidad, el tratamiento anti-tumoral definido en la presente puede involucrar, adicionalmente a los compuestos de la invención, el tratamiento con gemcitabina.

Tal tratamiento conjunto se puede lograr por medio de dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de combinación emplean los compuestos de esta invención, o sales farmacéuticamente aceptables de éstos, dentro de los intervalos de dosificación descritos en la presente antes y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de sus intervalos de dosificación aprobados.

EJEMPLOS Los ejemplos a continuación, que incluyen los experimentos realizados y los resultados logrados se proporcionan solo para propósitos ilustrativos y no están para ser interpretados en la presente como limitativos de las enseñanzas.

Ej emplo 1 INMUNIZACIÓN Y TITULACIÓN Inmunógenos El dominio extracelular de DLL4 humana (aminoácidos 1-524) y la DLL4 humana recombinante expresado transitoriamente en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) se usaron como antígenos para las inmunizaciones. Para la generación de los transíectantes CHO, el ADNc DLL4 humana completo (Yoneya y otros., 2001, J. Biochem. , 129, 27-34) se insertó en el vector pcADN3.1 y se lipofectó en células CHO (Colección Americana de Cultivo Tipo, catálogo #CCL-61) . La expresión de DLL4 humana en la superficie celular en el nivel adecuado para el propósito de la inmunización se confirmó por el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . El dominio extracelular de DLL4 humana se subcloió a partir de la DLL4 completa usando los cebadores directo 5'-AAGCTGGCTAGCGCGAATGGCGGCAGCGTCCCGGAG y reverso 5 ' - CAGCCTCGAGCGGCCGCCCAGGGGAAGCTGGGCGGCAAGC . El producto del PCR se purificó y ligó en el vector de expresión pSecTag de Invitrogen. El clon se transfectó posteriormente en las células 293T usando el reactivo de transfección 293fectin. Después de 7 días, los sobrenadantes de células que contienen la proteína objetivo se cosecharon y corrieron sobre una columna HisTrap pre-equilibrada (GE Healthcare, catálogo #17-5247) durante toda la noche. La columna se lavó con un tampón de unión que contiene 20 mM de fosfato de sodio, 500 mM de cloruro de sodio y 5 mM de imidazol, pH 7.4 antes la proteína con etiqueta de His se eluyó en un tampón que contiene 20 mM de fosfato de sodio, 500 mM de cloruro de sodio y 500 mM de imidazol, pH 7.4. La muestra de la proteína se dializó en tampón de unión durante 1 hora a 4 °C antes que se dializara además en PBS, pH 7.4 durante 2 horas previo a la esterilización por filtro, cuantificación y evaluación de la pureza por SDS-PAGE seguido por la tinción con Gelcode (Pierce, catálogo # 24950 ) .

Inmunización Los anticuerpos monoclonales contra DLL4 se desarrollaron por la inmunización de forma secuencial de ratones XenoMouse® (cepas XenoMouse : XMG2 (IgG2kappa/lambda) y XMG4 (IgG4 kappa/lambda) Amgen, Inc., Vancouver, Columbia Británica, Canadá) , ya sea con el dominio extracelular de DLL4 o células CHO que sobreexpresan DLL4 humana recombinante como se describió en el Ejemplo 1. Los animales XenoMouse se inmunizaron a través de las rutas intraperitoneal y base de la cola para todas las inyecciones por los medios convencionales. Los adyuvantes incluyeron Titermax Gold™ (Sigma, catálogo #T2684) , adyuvante gel de fosfato de aluminio, HCL Biosector, (catálogo #1452-250) y adyuvante de ratón ImmuneEasy (qCpG, Qiagen catálogo #303105) . Para el inmunógeno soluble, la primera inyección de 10 dg del dominio extracelular de DLL4 se administró con Titermax Gold™ (Día 0) y refuerzos alternos se administraron usando ya sea el adyuvante gel de fosfato de aluminio y qCpG o Titremax Gold™ junto con 5 mg del dominio extracelular de DLL4. Para el inmunógeno basado en células, la primera inyección se administró con el adyuvante gel de fosfato de aluminio y las células 2E6. Durante los refuerzos posteriores las células 1E6 se administraron usando el mismo adyuvante. Para ambas campañas de inmunización, los refuerzos ocurrieron en los días 2, 6, 10, 16, 23, 30, 37, 44, 50, 64, 71, 75, 89, 104 y 108.

Selecciones de los animales por el título para la cosecha Los títulos de los anticuerpos contra DLL4 humana se probaron para la unión a DLL4 humana y de ratón expresada en las células 293T mediante un instrumento de detección celular con tecnología de análisis fluorométrico en microvolúmenes (FMAT) (Applied Biosystems) . Este análisis mostró que hubo algunos ratones que tuvieron títulos, que parecían ser específicos para DLL4. Por lo tanto, al final del programa de inmunización, 17 ratones se seleccionaron para la cosecha, y los linfocitos se aislaron de los bazos y los ganglios linfáticos de los ratones inmunizados como se describe en el ejemplo 2 a continuación.

Ej emplo 2 RECUPERACIÓN DE LOS LINFOCITOS, AISLAMIENTOS DE CÉLULAS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS Los ratones inmunizados se sacrificaron por dislocación cervical y los ganglios linfáticos de drenaje se cosecharon y se mezclaron de cada cohorte. Las células linfoides se disociaron por macerado en DMEM para liberar las células de los tejidos y las células se suspendieron en DMEM. Las células B se enriquecieron por la selección positiva mediante las perlas Dynal marcadas con CD19. Una fusión se realizó por la mezcla de las células B enriquecidas lavadas a partir de las células anteriores y no secretoras de mieloma P3X63Ag8.653 adquiridas de ATCC (catálogo #CRL 1580) (Kearney y otros, J. Iramunol . 123, 1979, 1548-1550) en una proporción de 1:1. La mezcla celular se sedimentó suavemente por centrifugación a 800 x g. Después de la eliminación completa del sobrenadante, las células se trataron con 2-4 mi de solución de Pronasa (Calbiochem, catálogo #53702; 0.5 mg/ml en PBS) durante no más de 2 minutos. De 3-5 mi de FBS se adicionó después para detener la actividad de la enzima y la suspensión se ajustó a 40 mi de volumen total usando la solución de electrofusión celular, ECFS (0.3 M de sacarosa, Sigma, catálogo # S7903, 0.1 mM de acetato de magnesio, Sigma, catálogo # M2545, 0.1 mM de acetato de calcio, Sigma, catálogo #C4705) . El sobrenadante se eliminó después de la centrifugación y las células se resuspendieron en 40 mi de ECFS. Este paso de lavado se repitió y las células se resuspendieron de nuevo en ECFS a una concentración de 2E6 células/ml . La electrofusión celular se realizó mediante un generador de fusión, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamaño de la cámara de fusión usada fue de 2.0 mi, mediante las configuraciones siguientes del instrumento: condición de la alineación: voltaje: 50 V, tiempo: 50 segundos, ruptura de la membrana a: voltaje: 3000 V, tiempo: 30 µseg.f· tiempo de espera posterior a la fusión: 3 segundos. Después de ECF, las suspensiones celulares se eliminaron cuidadosamente de la cámara de fusión bajo condiciones estériles y se transfirieron a un tubo estéril que contiene el mismo volumen de Medio de Cultivo de Hibridoma (DMEM (JRH Biosciences) , 15% de SFB (Hyclone) , suplementado con 2 ti de L-glutamina (Sigma, catálogo #G2150) , 10 U/ml penicilina/O .1 mg/ml de estreptomicina (Sigma, catálogo #P7539) , 1 vial/L de OPI (oxalacetato, piruvato, insulina bovina, catálogo de Sigma #05003) y 10 U/ml de IL-6 humana recombinante (Boehringer Mannheim, catálogo #1131567). Las células se incubaron durante 15-30 minutos a 37 °C, y se centrifugaron después a 400 x g durante 5 minutos. Las células se resuspendieron suavemente en un pequeño volumen de Medio de Selección de Hibridoma (Medio de Cultivo de Hibridoma suplementado con 0.5 x HA (Sigma, catálogo #A9666) ) , y el volumen se ajustó adecuadamente con más Medio de Selección de Hibridoma, en base a un recubrimiento final de un total de 5E6 células B por placa de 96 pocilios y 200 mi por pocilio. Las células se mezclaron suavemente y pipetearon en placas de 96 pocilios y permitieron crecer. Los sobrenadantes completos se recogieron de, las células que potencialmente producen anticuerpos anti-DLL4 y se sometieron a ensayos de detección posterior como se ejemplifica a continuación.

Ejemplo 3 UNIÓN A DLL4 HUMANA Y DE MONO CYNOMOLGUS Y JAGGED1 HUMANO UNIDO A LA CÉLULA Los sobrenadantes recogidos a partir de las células cosechadas se probaron para evaluar la capacidad de los anticuerpos secretados para unir a las células 293T que sobreexpresan transitoriamente ya sea la DLL4 humana completo o de mono cynomolgus o Jaggedlhumano . Una línea de células 293T transfectadas en falso se usó como un control negativo. Las células diluidas en PBS que contienen 2% de SFB se sembraron a una densidad de 3000 las células transfectadas que expresan y 15000 las transfectadas en falso por pocilio en placas de 384 pocilios (Corning Costar, catálogo #3712) . Inmediatamente después del recubrimiento, 15 ó 20 ml/pocillo del sobrenadantes de hibridomas y 10 ml/pocillo del anticuerpo secundario (anti Fe de IgG humana Cy5 en carnero, concentración final 750 ng/ml) se adicionaron y las placas se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente antes de leer la fluorescencia en el instrumento FMAT 8200 (Applied Biosystems) . La unión de la quimera humana Notchl/Fc (R&D systems, catálogo #3647-TK), diluida 1:2 a partir de 2.86 mg/ml se usó como un control positivo de DLL4 y la quimera humana Notch3/Fc diluida a partir de 10 mg/ml se usó como un control positivo para la unión a Jaggedl . Los resultados para los 12 sobrenadantes de hibridomas que muestran la unión de los sobrenadantes de hibridomas a DLL4 humana/mono cynomolgus y Jagged humano se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 EJEMPLO 4 INHIBICIÓN DE LA UNION LIGANDO-RECEPTOR NOTCH1-DLL4 Para determinar la potencia relativa de los sobrenadantes que contienen el anticuerpo, se evaluó su capacidad para inhibir la unión de Notchl/Fc humano a ' DLL4 humana sobreexpresada transitoriamente en las células 293T. Las células 239T transíectadas y sin transfectar se reconstituyeron en PBS que contiene 2% de SFB y 5000 células transfectadas y 17500 sin transfectar se sembraron en 20 mi en los pozos de una placa de cultivo de tejido de 384 pocilios (Corning Costar, catálogo #3712) . Posteriormente, 20 mi del sobrenadante del hibridoma se adicionó y las placas se incubaron a 4 °C durante 1 hora, al tiempo que se adicionó 20 mi de Notchl/Fc humano marcado con Alexa-647 a una concentración final de 6.7 ng/ml . Después de una incubación adicional de 3 horas a 4 °C, la cantidad de Notchl/Fc unida se determinó por la lectura de la fluorescencia en cada pocilio usando un instrumento FMAT 8200 (Applied Biosystems) . Los resultados para los 12 sobrenadantes de hibridomas se muestran en la Tabla 4. Los resultados se expresan como ¾ de inhibiciones con la inhibición mínima en el ensayo que se determina por los efectos de los sobrenadantes que no unen a la DLL4 preparados de una manera similar como se describió en el ejemplo 2, y la inhibición máxima que se define como la señal obtenida en presencia de una concentración de saturación de Notchl/Fc sin marcar. N.T. = No probado.

TABLA 4 Anticuerpo % % ID inhibición inhibición inhibición inhibición n=l n=2 n=3 promedio 1D4 105 71 146 107 1E4 98 99 113 110 4B4 105 109 148 121 2H10 107 150 124 127 3A7 105 120 142 122 4B3 106 145 147 133 9G8 112 98 143 118 12A1 103 147 144 131 17F3 N.T. 108 131 120 21F7 N.T. 93 140 117 20G8 N.T. 88 143 116 21H3 N.T. 131 140 136 EJEMPLO 5 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LOS ANTICUERPOS ANTI-DLL4 Las cadenas variables pesadas y las cadenas variables ligeras de los anticuerpos se secuenciaron para determinar sus secuencias de ADN. La información de la secuencia completa de los anticuerpos anti-DLL4 se proporciona en la lista de secuencias con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para cada combinación de la cadena kappa y gama. Las secuencias variables pesadas se analizaron para determinar la familia de VH, la secuencia de la región D y la secuencia de la región J. Las secuencias se tradujeron después para determinar la secuencia primaria de los aminoácidos y se compararon con las secuencias de las regiones VH, D y J de la línea germinal para evaluar las hipermutaciones somáticas.

La Tabla 2 es una tabla que compara las regiones de cadena pesada de los anticuerpos con su emparentada región de cadena pesada de la línea germinal y las regiones de cadena ligera kappa con su emparentada región de cadena ligera de la línea germinal. Las regiones variables (V) de las cadenas de inmunoglobulina se codifican por múltiples segmentos de ADN de línea germinal, los cuales se unen en regiones variables funcionales (VHDJH o VKJK) durante la ontogenia de células B. La diversidad molecular y genética de larespuesta del anticuerpo a DLL4 se estudió en detalles.

Se debe apreciar también que donde un anticuerpo particular difiere de su respectiva secuencia de la línea germinal en el nivel de aminoácidos la secuencia de anticuerpos se puede transformar de nuevo a la secuencia de la línea germinal. Tales mutaciones correctivas puede ocurrir en una, dos, tres o más posiciones, o una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, mediante técnicas de biología molecular. A modo de ejemplo no limitante, la Tabla 8 muestra que la secuencia de cadena ligera de 2H10 (sec. con núm. de ident. : 6) difiere de la secuencia de línea germinal correspondiente (ver la Tabla 2) en el paso, de un V a un A en la posición 18 (mutación 1) , un V a un A en la posición 32 (mutación 2) , un E a un D en la posición 50 (mutación 3) , un S a un N en la posición 65 (mutación 4) , un T a un A en la posición 89 (mutación 5) y un L a un T en la posición 94 (mutación 6) . Así, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos que codifican la cadena ligera de 2H10 se puede modificar en cualquiera o todos estos sitios. Las Tablas 2-9 a continuación ilustran las posiciones de tales variaciones de la línea germinal para los 2H10, 9G8 , 21H3 y 4B4 Cada fila representa una combinación única de los residuos de la línea germinal y la línea no germinal en la posición indicada por letra negrita .

En otra modalidad, la invención incluye el reemplazo de cualquier complicación estructural en la secuencia que podría afectar la heterogeneidad de los anticuerpos de la invención. Tales complicaciones incluyen los sitios de glicosilación, cisteínas sin parear, metinonas expuestas en la superficie, etc. Para reducir el riesgo de tal heterogeneidad se propone que los cambios se generen para eliminar uno o más de tales complicaciones estructurales.

En un ejemplo, las cisteínas sin parear se pueden remplazar solas o junto con otros cambios estructurales. Un ejemplo de una cisteína sin parear tiene lugar en la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo 2H10 o 9G8 en la posición 33. Esta cisteína sin parear se puede mutar con un aminoácido apropiado tal como una serina que tiene propiedades comparables de la cadena lateral. En otro ejemplo, una cisteína sin parear tiene lugar en la FR4 de la cadena pesada del anticuerpo 20G8 en la posición 203. Esta cisteína sin parear se puede mutar también con un aminoácido apropiado como una serina que tiene propiedades comparables de la cadena lateral.

Tabla 5. Mutaciones ilustrativas de la cadena pesada de 21H3 (sec. con núm. de ident . : 30) a la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident : 30. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 30 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 5. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 30 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, o todos los seis residuos de la línea germinal, como se indica en la Tabla 5. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 30 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 5. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se deriva de una secuencia de la línea germinal con los dominios VHl-18, D2-15 y JH3 , donde uno o más residuos, mutaron para producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición. Los ejemplos específicos del dominio pesado variable 21H3 que mutó a las secuencias de la línea germinal particular incluyen 21H3VHOP (optimizado donde la secuencia de línea no germinal mutó a un L en la posición 45 y un M en la posición 70) como se muestra en la Tabla 13.

Tabla 6. Mutaciones ilustrativas de la cadena ligera de 21H3 (sec. con núm. de ident . : 32) a la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident. : 32. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident.: 32 comprende cualquiera de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 6.. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident.: 32 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco o los cinco residuos de línea germinal como se indica en la Tabla 6. En otras modalidades, el agente de unión identificado o anticuerpo se deriva de una secuencia de línea germinal con dominios VL, lg, JL2 , en donde uno o más residuos mutaron para producir el residuo de la línea germinal correspondiente en esa posición. Los ejemplos específicos de dominio ligero variable 21H3 que mutó a las secuencias de línea germinal particulares incluyen 21H3 VL0P1 (optimizado donde la secuencia de línea no germinal mutó a una K en la posición 107) y 21H3 VL0P2 (optimizado donde lasecuencia de línea no germinal mutó a una K en la posicións 67 y 107) . Ver la Tablal3.

Tabla 7. Mutaciones ilustrativas de la cadena pesada de 4B4 (sec. con núm. de ident . : 2) a la línea germinal en el número de residuo indicado I En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec. con núm. de ident : 2. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 2 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 7. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 2 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, cualquiera de siete, cualquiera de ocho, cualquiera de nueve, cualquiera de diez, cualquiera de once, o los once residuos de la línea germinal, como se indica en la Tabla 7. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident : 2 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 7. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se deriva de una secuencia de la línea germinal con los dominios VH1-18, D7-27 y JH4 , donde uno o más residuos, mutaron para producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición.

Tabla 8. Mutaciones ilustrativas de la cadena ligera de 4B4 (sec. con núm. de ident.: 4) a la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident . : 4. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident. : 4 comprende cualquiera de las combinaciones de residuos de la línea germinal y la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 8. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident. : 4 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco o los cinco residuos de línea germinal como se indica en la Tabla 8. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident.: 4 comprende cualquiera de las combinaciones únicas residuos de la línea germinal y la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 8. En otras modalidades, el agente de unión identificado o anticuerpo se deriva de una secuencia de línea germinal con dominios VL, 3p y JL2 , en donde uno o más residuos mutaron para producir el residuo de la línea germinal correspondiente en esa posición.

Tabla 9. Las mutaciones ilustrativas de 2H10 de cadena pesada (sec. con núm. de ident . : 6) a la línea germinal én el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec. con núm. de ident : 6. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 6 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 9. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 6 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, o los seis residuos de la línea germinal, como se indica en la Tabla 9. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 6 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 9. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se deriva de una secuencia de la línea germinal con los dominios Vh3-33, D6-13 y JH4, donde uno o más residuos, mutaron para producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición. Un ejemplo de una secuencia que mutó es 2H10 VHOP donde la M en la posición 93 mutó a un V. Ver la Tablal3.

Tabla 10. Mutaciones ilustrativas de la cadena ligera de 2H10 (sec. con núm. de ident . : 8) a la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia qué comprende la sec. con núm. de ident : 8. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 8 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 10. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 8 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, o los seis residuos de la línea germinal, como se indica en la Tabla 10. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 8 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 10. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se deriva de una secuencia de la línea germinal con los dominios VL, 3r y JL2 , donde uno o más residuos, mutaron para producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición. En ciertas modalidades, la sec . con núm. de ident.: 8 puede comprender otras modificaciones que incluyen eliminar las complicaciones estructurales. Por ejemplo, ademas de la alineación germinal, C33 se puede mutar a un S - ver por ejemplo 2H10 VLOPl en la Tabla 13. De esta forma, la sec. con núm. de ident.: 8 puede comprender cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 10 e incluyen, además, la mutación de G33 a un S. Los ejemplos de una secuencia donde la cadena ligera mutó para eliminar la complicación estructural en C33 y mutó otra vez a la secuencia de línea germinal es 2H10 VL0P2 como se muestra en la Tabla 13 donde C33 mutó a un S y V en la posición 18 mutó a un A, y S en la posición 65 mutó a un N.

Tabla 11. Mutaciones ilustrativas de la cadena pesada de 9G8 (sec. con núm. de ident. : 22) a la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident : 22. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 22 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 11. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 22 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, cualquiera de siete, o los siete residuos de la línea germinal, como se indica en la Tabla 11. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 22 comprende cualquiera de las 3923combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 11. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se deriva de una secuencia de la línea germinal con los dominios VH4-39, D4-23 y JH3 , donde uno o más residuos, mutaron para producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición. Un ejemplo de una secuencia donde la cadena pesada mutó otra vez a la secuencia de línea germinal es 9G8 VH0P1 mostrada en la Tabla 13 donde L en la posición 38 mutó a un W. Otro ejemplo de una secuencia donde la cadena pesada mutó otra vez a la secuencia de línea germinal es 9G8 VH0P2 mostrada en la Tabla 13 donde S en la posición 21 mutó a un T, L en la posición 38 mutó a un W, S en la posición 70 mutó a un T, y F en la posición 96 mutó a un Y.

Tabla 12. Mutaciones ilustrativas de la cadena ligera de 9G8 (sec. con núm. de ident . : 24) a la línea germinal en el número de residuo indicado En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident : 8. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 24 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 12. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 24 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, cualquiera de siete, cualquiera de ocho, cualquiera de nueve, cualquiera de diez, cualquiera de once, o todos los once residuos de la línea germinal, como se indica en la Tabla 12. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 24 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 12. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se deriva de una secuencia de la línea germinal con los dominios VL, 3r y JL2, donde uno o más residuos, mutaron para producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición. En ciertas modalidades, la sec. con núm. de ident.: 24 puede comprender otras modificaciones que incluyen eliminar las complicaciones estructurales. Por ejemplo, la sec. con núm. de ident.: 24 puede comprender cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de la línea germinal y línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 12 y además incluyen la mutación de C33 a un S . Un ejemplo es 9G8 VLOP1 donde la cadena ligera mutó para eliminar la complicación estructural en C33 y mutó otra vez a la secuencia de línea germinal en la posición 7 donde S mutó a un P y V en la posición 79 mutó a un A. Otro ejemplo es 9G8 VLOP2 donde C33 mutó a S, S en la posición 2 mutó a un Y , S en la posición 7 mutó a un P, R en la posición 19 mutó a un S, T en la posición 39 mutó a un P , y V en la posición 79 mutó a un A. Ver específicamente la Tabla 13.

La persona con conocimiento estará consciente de que existen métodos alternativos para definir los límites de las CDR. Todos los límites de las CDR en la Tabla 2 y 13 se definen de acuerdo con la definición Kabat .

Tabla 13 Sea Cadena FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 ID núm 75 21H3VHOP QVQLVQSGAEV NYGIT WVRQAPG WISAYNGNTN RVTMTTDTSTST DRVPRIPV WGQGT KKPGASV VSC QGLEWMG YAQKLQD AYMELRSLRSDD TTEAFDI VTVSS KASGYTFT TAVYYCAR 50 21H3 VL0P1 QSVLTQPPSAS SGSSSNI WYQQLPGT RNNQRPS GVPDRFSGSES AAWDDSL FGGGT (corespordiente GTPGQRVTISC GSYFVY APKLUY GTSASLAISGLRS SGHWV LTVL a21H3RKVL) EDEADYYC 76 21H3VLOP2 QSVLTQPPSAS SGSSSNI WYQQLPGT RNNQRPS GVPDRFSGSKS AAWDDSL FGGGTK GTPGQRVTISC GSYFVY APKLUY GTSASLAISGLRS SGHWV LTVL EDEADYYC 77 2H10VHOP QVQLVESGGGV RHG H WVRQAPG WWFDGSNIY RFTISRDNSKNTL DSRIAAAD WGQGTL VQPGRSLRLSC KGLEWVA YADSVKG YLQMNSLRAEDT Y TVSS AASGFTFS AVYYCAR 78 2H10VLOP1 SYELTQPPSVSV SGDKLG WYQQKPG QESKRPS GIPERFSGSSSG QTWDSSL FGGGTK sPGQTVsrrc DKYVS QSPVLVIY NTATLTISGTQA W LTVL DEADYYC 79 2H10VLOP2 SYELTQPPSVSV SGDKLG WYQQKPG QESKRPS GIPERFSGSNSG QTWDSSL FGGGTK sPGQTAsrrc DKYVS QSPVLVIY NTATLTISGTQAM W LTVL DEADYYC Sec. Cadena FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 ID núm 80 9G8VHOP1 QLQLQESGPGL SSSSY WGWIRQPP SIYYSGSTYY RVSISVDTSKNQ QGYGGHP WGQGT VKPSETLSLSCT GKGLEWIG SPSLKS FSLKLSSVTAADT DVFDI MVTVSS VSGGSIS AVYFCAR 81 9G8VHOP2 QLQLQESGPGL SSSSY WGWIRQPP SIYYSGSTYY RVTISVDTSKNQF QGYGGHP WGQGT VKPSETLSLTCT GKGLEWIG SPSLKS SLKLSSVTAADTA DVFDI MVTVSS VSGGSIS VYYCAR 82 9G8 LOP1 SSELTQPPSVSV SGDKLG WYQQKTG EDTKRPS GIPERFSGSNSG QAWDSTT FGGGTK SPGQTARITC DVYVS QSPVLVIY NTATLTISGTQA AVI LTVL DEADYYC 83 9G8VLOP2 SYELTQSPSVSV SGDKLG WYQQKPG EDTKRPS GIPERFSGSNSG QAWDSTT FGGGTK sPGQTAsrrc DVYVAS QSPVLVIY NTATLTISGTQAM AVI LTVL DEADYYC EJEMPLO 6 DETERMINACIÓN DE LA POTENCIA DE LOS ANTICUERPOS DLL4 PARA INHIBIR LA UNIÓN LIGANDO RECEPTOR NOTCH1-DLL4.

Para discriminar entre los anticuerpos purificados en base a su capacidad para impedir la interacción entre la DLL4 recombinante completo y el Notchl/Fc soluble, se realizaron los siguientes ensayos. Las células 239T transfectadas y sin transfectar se reconstituyeron en PBS que contiene 2% de SFB y 5000 células transfectadas y 17500 sin transfectar se sembraron en 30 mi en los pocilios de una placa de cultivo de tejido de 384 pocilios (Corning Costar, catálogo #3712) . Posteriormente, 30 mi de los anticuerpos purificados, diluidos en serie a partir de 5 mg/ml de sobrenadante del hibridoma se adicionó y las placas se incubaron a 4°C durante 1 hora, al tiempo que se adicionó 20 mi de 100 ng/ml dé Notchl/Fc humana marcada con Alexa-647. Después de una incubación adicional de 3 horas a 4 °C, la cantidad de Notchl/Fc unida se determinó por la lectura de la fluorescencia en cada pocilio usando un instrumento FMAT 8200 (Applied Biosystems) . Los datos de los 12 anticuerpos purificados se muestran en la Tabla 14, que muestra la capacidad de los anticuerpos purificados para inhibir las interacciones entre la DLL4 humana recombinante completo y la quimera Notchl/Pc.

Además, se realizaron experimentos similares y se cuantificaron mediante un instrumento FACSCalibur (BD Biosciences) . Para estos experimentos, las células 293T parentales o las células transíectadas transitoriamente con DLL4 humana se reconstituyeron en PBS que contiene 2% de SFB y se adicionaron a una concentración de 25000 células/pocilio que contienen los anticuerpos purificados a una concentración final de 10 mg/ml, 1 mg/ml ó 0.1 mg/ml . Después de la incubación durante 1 hora a 4°C, Notchl/Fc humano marcado con Alexa-647 se adicionó a una concentración final de 227 ng/ml y las placas se incubaron durante 2 horas a 4°C. A continuación del lavado con PBS que contiene 2% de SFB, la cantidad de Notchl/Fc unida se determinó por la lectura de la fluorescencia en cada pocilio usando un instrumento FACSCalibur. Bajo estas condiciones, la capacidad de los 20 anticuerpos purificados para inhibir las interacciones DLL4-Notchl fue similar a la observada usando el instrumento FMAT (datos no mostrados) . Resultados similares se obtuvieron también cuando los experimentos se realizaron en un formato ELISA con DLL4 humana soluble y Notchl humana soluble (datos no mostrados) .

Experimentos adicionales se realizaron en anticuerpos seleccionados usando las células HEK293 que se transfectaron establemente con ya sea DLL4 humana, ratón o mono cynomolgus usando constructos retrovirales . En estos experimentos, los anticuerpos anti-DLL4 (concentración final: 10-0.01 mg/ml) diluido en PBS que contiene 2% de SFB se adicionaron a células HEK 293 que expresan DLL4 (50000 células/pocilio diluida en PBS. que contiene 2% de SFB) y se incubaron durante 1 hora a 4°C. Posteriormente, Notchl/Fc humana marcada con Alexa-647, rata o de ratón marcada con APC (por ejemplo R & D Systems, catálogo #3647-TK-050 , 1057-TK-050, 5267-TK-050, respectivamente) se adicionó a una concentración final de 0.01-0.5 mg/ml y las placas se incubaron durante 2 horas adicionales a 4°C antes del lavar y leer en un instrumento FACSCalibur. La tabla 15 muestra la capacidad de los anticuerpos purificados de diferentes isotipos para inhibir las interacciones entre DLL4 humana recombinante completo, mono cynomolgus y ratón y 0.1 ó 0.25 mg/ml de quimera Notchl/Fc humana, de rata, o 0.5 mg/ml de ratón como se determinó por análisis de FACS .

TABLA 14 Tabla 15. *concentración de Notchl/Fc humano µg//ml. N.T. = no probado EJEMPLO 7 REACTIVIDAD CRUZADA DE LOS ANTICUERPOS DLL4 A JAGGED1 Y DLL1 humana La capacidad de los anticuerpos purificados para unir Jaggedl y DLL1 humana se determinó por análisis FACS . En resumen, las células 293T se transíectaron ya sea en falso o transfectaron transitoriamente con Jaggedl humano (# de acceso: NM_000214) o DLL1 humana (# de acceso: NM_005618) usando Lipofectamina 2000. Las células se resuspendieron en PBS que contiene 2% ' de SFB y se sembraron a 50000 células/pocilio en placas de fondo V. Los anticuerpos anti-DLL4 diluidos en PBS que contiene 2% de SFB se adicionaron a una concentración final de 5 ó 15 mg/ml y las placas se incubaron durante 1 hora a 4°C. Después de lavar con 'PBS que contiene 2% de SFB, el anticuerpo secundario (anti-Fc humano en carnero con Cy5 , Jackson Immunoresearch, catálogo #109-175-098, 5 mg/ml) y 7-AAD (5 mg/ml) , se adicionaron y las placas se incubaron durante 15 minutos a 4°C antes que se lavaran de nuevo con PBS que contiene 2% de SFB y que se leyeran en un instrumento FACSCalibur. El anticuerpo de ratón anti-Jagged 1 humano (R&D systems, catálogo #mAB1277, detectado con el anticuerpo secundario anti-Fc de ratón con Cy5 (5 mg/ml) , Jackson catálogo Immunoresearch # 115-175-164), quimera humana Notch3/Fc (R&D systems, catálogo #1559-NT-050, detectado con anticuerpo anti-Fc humano en carnero con Cy5 descrito anteriormente) ) o anticuerpo anti-DLLl humana en carnero (R&D systems, catálogo # AF1818, detectado con anti-Fc de carnero con Cy5 , Jackson Immunoresearch, catálogo # 305-175-046 (5 mg/ml) ) se usaron como controles para confirmar la transfección . El dato se analizó comparando el cambio en la media geométrica de fluorescencia de las células transfectadas en falso de aquel observado en las células transfectadas con Jaggedl o DLL1 y se muestra en las Tablas 16 y 17. La Tabla 16 muestra la capacidad de los anticuerpos purificados (5 mg/ml) para unir a las células 293T transfectadas transitoriamente con Jaggedl humano. La Tabla 17 muestra la capacidad de los anticuerpos purificados (15 mg/ml) para unir a las células 293T transfectadas transitoriamente con DLL1 humana. Los estudios adicionales de unión FACS usando 21H3RK, 4B4, 9G8 o 2H10 a ' las concentraciones hasta 300 mg/ml mostraron unión mínima (<2.5 veces por encima del fondo) a las células HEK-293 que sobreexpresan de forma estable ya sea Jaggedl humano o DLL1 humana .

Tabla 16 Anticuerpo Jaggedl/293T Control/293T relación Jaggedl/control X Geo Media X Geo Media 1D4 16.8 15.8 1.01 1E4 16.9 14.9 1.13 4B4 16.8 15.4 1.09 2H10 9.28 7.36 1.26 3A7 16.4 15.0 1.10 4B3 18.7 18.1 1.04 9G8 17.4 16.2 1.07 12A1 14.4 12.9 1.11 17F3 16.3 15.2 1.08 21F7 13.8 13.7 1.01 20G8 16.0 14.3 1.12 Anticuerpo Jaggedl/293T Control/293T relación Jaggedl/control 21H3 15.5 13.8 1.12 N3 Fe 5 Hg/ml 51.0 13.2 3.87 N3 Fe 1 [Jg/ml 17.9 6.23 2.88 N3 Fe 0.2 8.60 4.39 1.96 Hg/ml N3 Fe 0 |ig/ml 4.13 3.78 1.09 Jaggedl Ab 5 196 45.6 4.29 Mg/ml Jaggedl Ab 1 119 30.2 3.94 Mg/ml Jaggedl Ab 50.7 15.0 3.38 0.2 g/ml Jagged 1 Ab 0 4.61 4.13 1.12 Hg/ml Tabla 17 Anticuerpo D111/293T Control/293T relación Dlll/control X Geo Media X Geo Media 1D4 35.3 32.2 1.09 1E4 31.7 27.7 1.15 4B4 25.9 21.1 1.23 2H10 44.1 40.1 1.10 3A7 36.8 34.6 1.06 4B3 30.6 26.0 1.17 9G8 32.3 26.3 1.23 12A1 47.0 42.1 1.12 17F3 47.0 41.3 1.14 21F7 30.2 26.8 1.13 20G8 40.0 30.0 1.34 21H3 32.4 27.9 1.16 Anticuerpo D111/293T Control/293T relación Di11/control Dlll Ab 5 µ9 /mi 1840 239 7.68 Dlll Ab 1 ug /mi 1240 197 6.33 Dlll Ab 0.2 ug /mi 565 81.4 6.94 EJEMPLO 8 DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS DE LOS ANTICUERPOS DLL4 SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE HUVEC MEDIADA POR DLL4 La capacidad de los anticuerpos DLL4 para bloquear la inhibición de la proliferación de HUVEC estimulada por DLL4 se evaluó. El dominio extracelular de DLL4 (R&D systems, catálogo #1506-D4/CF) se preparó como un concentrado 50mg/ml en PBS que contiene 0.1 % de BSA. A continuación la dilución a 1 mg/ml en tampón de bicarbonato (Sigma # C3041-50CAP) , 100 ml/pocillo se adicionó a las placas de 96 pocilios con paredes negras (Perkin Elmer, catálogo # 6005182) y las placas se incubaron durante toda la noche a 4°C. Los pocilios de control también se recubren en falso con PBS que contiene 0.1% de BSA. Después de lavar con PBS, 100 mi de células HUVEC a una concentración de 4E4 células/ml en MCDB 113 (Gibco Catálogo #10372) que contiene 10% de SFB y 2 mM de glutamina se adicionó a cada pocilio. Inmediatamente después, los anticuerpos anti-DLL4 diluidos en serie (20-0.027 mg/ml) se adicionaron a DLL4/pocillos recubiertos en falso por triplicado y las células se incubaron durante 96 horas a 37°C/5% de C02. Después de esta incubación, 15 mi del Kit 8 de Conteo celular (CCK8, NBS, catálogo # CK-04-11) se adicionó a cada pocilio y las placas se incubaron durante 4 horas a 37°C/5% de C02. Para determinar el número relativo celular en cada pocilio, la absorbancia a 450 nm se midió en un lector de placas (Tecan Ultra) . Los efectos de los anticuerpos ánti-DLL4 se detallan en la Tabla 18. Además, 4B4, 21H3 y 21H3RK fueron también inhibidores eficaces de los efectos mediados por DLL4 cuando se formateó como anticuerpos IgGl (Figura 1) .

Además, las capacidades de los anticuerpos anti-DLL4 (10 mg/ml) para inhibir la señalización de Notch se evaluaron a través de Western blot . En resumen, DLL4-His (R&D systems, catálogo #1506-D4-050/CF) se diluyó a 50 mg/ml en PBS que contiene 0.1% de BSA. Esta solución se diluyó después además a 1 mg/ml en 50 mM de tampón bicarbonato, pH 9.6 (catálogo de Sigma #03041) y 1 mi por pocilio se adicionó a placas de 12 pocilios y se incubó durante toda la noche a 4°C. Los pocilios adicionales que no contienen DLL4 se recubrieron en falso usando el mismo procedimiento. Después de lavar con PBS, las células HUVEC preparadas en medio MCDB131 se sembraron a 12000 células/pocilio. Inmediatamente después de la siembra, el tratamiento adecuado (por ejemplo, anticuerpos anti-DLL4, 10 mg/ml) se adicionó y las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C/5% de C02. Después que la incubación se completó, las células se cosecharon en tampón RIPA. El tampón de muestra 4X que contiene B-mercaptoetanol y azul de bromofenol se adicionó después y las muestras se hirvieron durante 5 min a 70°C antes de cargarlas en geles NuPAGE 4-12% en tampón MOPS (Catálogo de Invitrogen # NP0001) . A continuación de la transferencia electroforética a la nitrocelulosa, las manchas se bloquearon durante 1 hora en PBST que contiene 5% de leche seguido por la incubación ya sea con anticuerpos anti-Notchl escindido (Cell signaling technology, catálogo # 2421) o anticuerpos GAPDH (Advanced Immunochemical , clon 6C5, catálogo # 2-RGM2) en diluciones 1:1000 y 1:10,000, respectivamente en PBS que contiene 5% de leche. Después de la incubación en un agitador orbital durante toda la noche a 4 °C, las manchas se lavaron con PBST y se incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón-HRP (Cell Signáling Technology, catálogo # 7072) a una concentración de 1:2000 en PBST que contiene 5% de leche durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBST, las manchas se desarrollaron usando los reactivos de sustrato Pierce Pico (catálogo # 34080; GAPDH) o Femto (catálogo # 34075; Notchl escindido) y los resultados se analizaron en un instrumento ChemiGenius . Los resultados obtenidos de estos estudios demuestran que los anticuerpos anti-DLL4 pueden bloquear la señalización de Notch estimulada por DLL4 en las células HUVEC (datos no mostrados) .

Tabla 18. N/A = No aplicable. N.T. = no probado E j emplo 9 EFECTOS DE ANTICUERPOS DLL4 SOBRE LA FORMACIÓN IN VITRO DEL TUBO HUVEC Los anticuerpos inhibidores DLL4 se probaron para la capacidad de reducir la formación del tubo celular endotelial en un ensayo in vitro de co-cultivo (por ejemplo, TCS Cell Works Catálogo núm. ZHA-1000) . Las células endoteliales humanas de la vena umbilical (HUVEC) y los fibroblastos humanos diploides se obtuvieron, ya sea como co-cultivos en placas de 24 pocilios (TCS Cell works Catálogo núm ZHA-1000) o las placas se prepararon como sigue: placas de cultivo de tejidos de 24 pocilios se recubrieron con colágeno (dilución 1:10 en agua destilada, Sigma, catálogo #C8919) a 37°C/5% de C02 durante 4 horas. Después de lavar con PBS, los fibroblastos (por . ejemplo, Promocell # C-12300) se adicionaron a 15000 células/pocilio en FGM (Promocell # C-23010) . Después de la incubación durante 3 días a 37 °C/5% de C02, el medio se eliminó de la placa y se adicionaron las células HUVEC a 30,000 células/pocilio en EGM2 (Promocell # C-22111) . Después de incubar durante 4 días adicionales a 37 C/5% de C02, las placas se consideraron listas para el uso y esto se consideró día 1 para el ensayo. Los anticuerpos que bloquean DLL4 se introdujeron a los cultivos en el día 1 y en intervalos regulares durante un período de 11 días a concentraciones en el intervalo de 20 hasta 0.027 mg/ml . El medio se rellenó en los días 4, 7 y 9. El modelo de' co-cultivo se mantuvo ya sea en medio Optimizado TCS (suministrado con el ensayo de co-cultivo) o en medio MCDB131 suplementado con 2% de suero fetal bovino (SFB) , 1% de glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina (en lo sucesivo, referido como medio 2% de FS MCDB131) . El modelo de co-cultivo se mantuvo a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% C02/95% de aire. La formación de los túbulos se examinó el día 11 a continuación de la fijación y la tinción de los túbulos para CD31 mediante un kit de tinción de túbulo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (TCS Cell Works catálogo #ZHA-1225) . En resumen, las células se fijaron con 70% de etanol helado durante 30 minutos a temperatura ambiente (t.a). Las células se bloquearon después que se trataron con anti-CD31 humano durante 60 minutos a t.a. Las placas se lavaron y trataron con anti-IgG de ratón en carnero conjugado con fosfatasa alcalina (AP) durante 60 minutos a t.a. Después de la incubación con el anticuerpo secundario conjugado con AP, las placas se lavaron y el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/azul de nitro tetrazolio (BCIP/NBT) se adicionó durante aproximadamente 10 minutos. El desarrollo de un color púrpura oscuro en 10 minutos reflejó la formación de los túbulos . Las placas se lavaron posteriormente y dejaron secar al aire. La cuantificación del crecimiento de túbulo se realizó por la metodología de análisis de imágenes en pocilio-completo usando un analizador de imagen Zeiss KS400 3.0. El parámetro morfológico medido en la metodología de cuantificación fue la longitud total del túbulo. En algunos experimentos, se evaluó también el número de bifurcaciones en los tubos. Todas las formaciones de túbulo dentro de cada uno de los 24 pocilios se midieron excluyendo un cerco de 100 µp? de profundidad para evitar el artefacto de retracción de borde.

Como se ilustró en la Figura 2, se observó que los anticuerpos son eficaces en la inhibición de la formación in vitro del tubo endotelial celular. Además, se determinó la potencia de varios de los anticuerpos en este ensayo. Estos datos se resumen en la Tabla 19. En conjunto, los datos indican que los anticuerpos son activos en un análisis funcional que modela el proceso angiogénico.

Tabla 19 Ejemplo 10 DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE UNION DE LOS ANTICUERPOS PURIFICADOS Las afinidades de unión de los anticuerpos purificados de DLL4 se estimaron usando ambas técnicas FACS y BIAcore. Para la determinación de la afinidad por FACS, las células HEK293 que sobreexpresan ya sea DLL4 humana o de mono cynomolgus se sembraron en aproximadamente 85,000-104,000 células/pocilio y se incubaron con titulaciones del anticuerpo purificado durante 5 horas a 4 °C. Las células se lavaron después e incubaron con el anti-Fc-IgG humana en carnero-Cy5 + 5 mg/ml de 7 -amino-actinomicina (7AAD) durante 30 minutos a 4 °C. La DLL4 unida se detectó mediante el análisis de FACS y los datos se ajustaron a la ecuación siguiente (ver Drake & Klakamp, 2007, J. Immunol Methods, 318, 157-162 para la derivación.) ( (KD + LT+ n-M) - (Kd + LT + n-M)2 - 4n-M-Lx 2 En esta ecuación, F = fluorescencia media, LT = concentración total de mAb molecular, P'= constante de proporcionalidad que refiere unidades arbitrarias de fluorescencia para unir mAb, M = concentración celular en molaridad, n = número de receptores por célula, B = señal de fondo, y KD = constante de equilibrio de disociación. Para cada curva de titulación de mAb se obtiene un estimado para KD como P' , n, B, y KD se permiten flotar libremente en el análisis no lineal. La Tabla 20 resume los estimados de afinidad para los anticuerpos anti-DLL4 por derivados de DLL4 humana y mono cynomolgus usando la metodología descrita anteriormente.

Para el análisis de Biacore, cada anticuerpo anti-DLL4 purificado se inmovilizó en un chip sensor CM5 dentro de un T100 usando el acoplamiento estándar de la amina. Los niveles de inmovilización se mantuvieron por debajo de 200 RU . La concentración de DLL4 se determinó por espectroscopia UV-VIS, usando una absortividad molar a 280 nm de 110, 440 M"1 cm"1, que se calculó a partir de la secuencia de la proteína usando un método desarrollado por Pace y otros (G.R. Grimsley y C. N. Pace (2003) en Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), 3.1.1-3.1.9). El antígeno DLL4 (R&D systems; humano catálogo #1056-D4-050 o ratón, catálogo #1389-D4-050) se diluyó a una concentración inicial de 32-64 nM y se probó en una dilución en serie de 3 veces por triplicado. El tampón de corrida HBS-P con 0.1 mg/ml de BSA y las respuestas de unión se recogieron a 23 °C . Los complejos de enlaces se regeneraron con un pulso de 15 segundos de 10 mM de hidróxido de sodio. Los datos de respuesta se ajustaron globalmente con un modelo de interacción simple 1:1 y la Tabla 20 resume los estimados de ka, ka y D obtenidas para los anticuerpos anti-DLL4 cuando se evaluó la unión a DLL4 soluble humano. Además, los estimados de afinidad para DLL4 soluble de ratón se generaron también para 21H3, 21H3RK y 4B4 mediante BIAcore: todos los anticuerpos en formato de IgG tuvieron una afinidad de 360 nM o menos para DLL4 soluble de ratón.

Tabla 20. N.T. = no probado.

Tabla 21 Anticuerpo Isotipo Ka (M"1 s"1) ¾ (s'1) KD (pM) ID 21H3RK IgGl 3.37 X 105 1.66 X 10~4 493 21H3RK IgG2 2.22 X 105 1.60 X 10"4 721 21H3 IgGl 2.88 X 105 1.71 X 10"4 594 21H3 IgG2 2.59 X 105 1.55 X 10"4 598 21H3 IgG4 3.17 X 105 1.52 X 10"4 481 4B4 IgGl 1.18 x 105 2.01 X 10"b 170 4B4 IgG2 1.07 x 105 3.60 X 10"5 336 4B4 IgG4 1.18 X 105 3.33 X 10"5 283 9G8 IgG4 1.03 X 105 1.36 X 10"5 132 2H10 IgG4 4.09 X 104 4.02 X 10"5 981 Ejemplo 11 DETERMINACIÓN DE LA COMPETENCIA CRUZADA DE DLL4 POR LOS ANÁLISIS FACS .

La capacidad de los anticuerpos purificados DLL4 para inhibir la unión de otros anticuerpos DLL4 a DLL4 humana se evaluó mediante un ensayo FACS. En resumen, los anticuerpos se marcaron directamente con Alexa-647 mediante un kit de mareaje disponible en el comercio (por ejemplo, Molecular Probes catálogo #A30009, A-20186) como por las instrucciones del fabricante. Para determinar el nivel de competencia cruzada, los anticuerpos anti-DLL4 sin marcar (concentración final: 10-0.01 mg/ml) diluidos en PBS que contiene 2% dé SFB se adicionaron a las células HEK 293 que expresan DLL4 (como se describió en el ejemplo 6; 50000 células/pocilio diluidas en PBS que contiene 2% de SFB) y se incubaron durante 1 hora a 4°C. Posteriormente, los anticuerpos anti-DLL4 marcados con Alexa-647 se adicionaron a una concentración final de 0.1 mg/ml y las placas se incubaron durante 1 h adicional a 4 °C antes de lavar y leer en un instrumento FACSCalibur. Los datos que resumen la capacidad de los anticuerpos sin marcar (10, 1, 0.1 mg/ml) para competir con 21H3RK marcado por la unión a DLL4 humana se incluyen en la Figura 3. Los datos adicionales que resumen la capacidad de los anticuerpos sin marcar para competir con 21H3RK y 4B4 marcados por la unión a DLL4 humana se incluyen en la Tabla 22.

Además, la capacidad de los anticuerpos para detectar DLL4 recombinante (R&D systems, catálogo #1506-D4-050/CF) y DLL4 nativa expresadas en las células HEK293 (ver ejemplo 3) se determinó también a través de Western blot mediante las técnicas estándares. En resumen, las células HEK293; que expresan DLL4 se cosecharon en tampón RIPA (Thermo, catálogo #89900 que contiene una tableta cóctel de inhibidor de proteasa (Roche, catálogo #11873580001) y la proteína se cuantificó mediante un ensayo de proteína de BCA (Pierce, catálogo #23227) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el Western Blot, las muestras de proteína se descongelaron en hielo y se incubaron a 100°C durante 2 minutos antes de la adición del agente reductor de la muestra Nupage 10X (Invitrogen, catálogo #NP0004) y el tampón de muestra 4X antes de cargar en los geles prefabricados de NuPage Bis Tris 4-12 % (Invitrogen, catálogo #NP0321B0X) en tampón MES (Invitrogen, catálogo #NP0002) . A continuación de la transferencia electroforática a la nitrocelulosa, las manchas se bloquearon durante 1 h en salina tamponada con Tris (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5) que contiene 0.05% de Tween 20 (TBST) que contiene 5% de leche seguido por la incubación ya sea con 9G8 , 2S10, 21H3, 4B4 o 20G8 (todos 2 mg/ml) o los anticuerpos anti-DLL4 disponibles en el comercio (R&D Systems, catálogo #MAB1389; . Abcam, catálogo #ab7280, ambos a 1 mg/ml) en TBST que contiene 5% de leche. Después de la incubación en un agitador orbital durante toda la noche a 4°C, las manchas se lavaron con TBST y se incubaron ya sea con anticuerpos secundarios anti-rata, anti-conejo o antihumano conjugados con HRP (Jackson Immunochemicals , catálogo #112-035-003 y 111-035-003, dilución 1:20,000 o KPL, catálogo #074-1006, dilución 1:10,000) en TBST que contiene 5% de leche durante 1 hora a RT. El exceso de anticuerpo se eliminó por lavado como anteriormente y los inmunocomplejos se visualizaron a través de la detección de quimioluminiscencia mejorada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce, catálogo #34076) y se detectó en película de Hyperfilm ECL (Amersham, catálogo #28906839) o SR Biomax (Kodak, catálogo #8952855) . Los resultados muestran que bajo estas condiciones, tanto DLL4 recombinante como nativo se pueden detectar por los anticuerpos comerciales y 9G8/2H10, pero no por 21H3/20G8 o 4B4, lo que sugiere que estos anticuerpos podrían interactuar con epítopos diferentes en DLL4 (datos no mostrados) .

Tabla 22 Anticuerpo de competencia IC50 (Lg/ml) Anticuerpo 21H3RK 21H3 4B4 9G8 2H10 marcado 4B4 0.223 0.274 0.348 0.856 1.15 21H3RK 0.214 0.248 0.379 0.596 0.723 Ejemplo 12 MODIFICACIONES DE SECUENCIA PARA 9G8 Y 2S10 Los genes de la inmunoglobulina sufren distintas modificaciones durante la maduración de la respuesta inmune, que incluyen la recombinación entre los segmentos de genes V, D y J, cambio de isotipo e hipermutación en las regiones variables. La recombinación y la hipermutación somática son la base para la generación de la diversidad de los anticuerpos y la maduración de la afinidad, pero ellos pueden provocar también complicaciones en la secuencia que podrían generar la producción comercial de tales inmunoglobulinas como agentes terapéuticos difíciles, o aumentar el riesgo de inmunogenicidad del anticuerpo. En general, las mutaciones en las regiones CDR son probables para contribuir a mejorar la afinidad y la función, mientras que las mutaciones en las regiones marco podrían aumentar el riesgo de inmunogenicidad. Este riesgo se puede reducir por la regresión de las mutaciones del marco a la línea germinal, mientras que garantiza que la actividad de los anticuerpos no se afecte negativamente. Algunas complicaciones estructurales se podrían provocar por la diversificación de los procesos, o ellos podrían existir dentro de las secuencias de la línea germinal que contribuyen a los dominios variables de cadena pesada y ligera. A pesar de la fuente, podría ser conveniente para eliminar las posibles complicaciones estructurales que pueden resultar en la inestabilidad, la agregación, la heterogeneidad del producto, o aumento de la inmunogenicidad. Los ejemplos de las complicaciones no deseadas incluyen cisteínas desapareadas (que podría conducir a la mezcla de enlace disulfuro, o la formación de aductos variables sulfhidrilo) , sitios de glicosilación enlazados a N (dando lugar a la heterogeneidad de la estructura y la actividad) , así como la desamidación (por ejemplo, GN, NS) , isomerización (DG) , la oxidación (metionina expuestas) , y los sitios de hidrólisis (DP) . En un esfuerzo por reducir el riesgo de inmunogenicidad, y mejorar las propiedades farmacéuticas de los anticuerpos líderes, determinadas variantes se generaron y probaron para la unión y la actividad. La mutagénesis sitio dirigida se llevó a cabo mediante el kit de Stratagene-Quick Change II, como se describió por el fabricante. Las secuencias de la variante se expresaron en el sistema InVitrogen Freestyle por transfección transitoria (siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante) , y se purificaron por cromatografía de afinidad de Proteína A.

La actividad de los anticuerpos mutados se evaluó de dos maneras: en primer lugar, se determinó la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de Notchl/Fc soluble a DLL4 completa humana que se expresa de forma estable en las células HEK293 como se describió en el Ejemplo 3 y, en segundo lugar, se determinó la unión de los anticuerpos a la misma línea celular que se usó en los estudios de competencia receptor-ligando . Para los estudios de unión, las células HEK293 que sobreexpresan de forma estable DLL4 humana se resuspendieron en PBS que contiene 2% de SFB a : una concentración de 50,000 células/pocilio y se incubaron con las titulaciones de anticuerpos (concentración final de 0.01 a 10 mg/ml) durante 1 hora a 4°C. Las células se lavaron después e incubaron con 0.31 mg/ml de anti Fc-IgG humana-FITC (BD Pharmingen, catálogo #555786) durante 30 minutos a 4 °C. La DLL4 unida se detectó mediante el análisis de FACS .. Los resultados de estos estudios se resumen en la Tabla 23, que muestran los efectos de mutaciones específicas para las secuencias de 9G8 y 2H10 sobre la capacidad de los anticuerpos para competir con Notchl por la unión a DLL4 humana o para unir a DLL4 humana con respecto a los anticuerpos sin mutar.

Tabla 23 Clon Variante Actividad Actividad de comp RL (IC50 unión (EC50 Mg/ml) Mg/ml ) 9G8 IgG2 VH wt/VL wt 0.170 0.071 VH L38W/VL wt 0.133 0.070 VH wt/VL S7P 0.181 0.082 VH wt/VL C33S 0.136 0.067 VH wt/VL C33A 0.302 N.T.

VH wt/VL C33G 0.358 N.T.

Clon Variante Actividad Actividad de comp RL (IC50 unión (EC50 W/ml ) Hg/ml ) VH wt/VL C33D 0.345 N.T.

VH wt/VL C33R 0.201 N.T.

VH wt/VL C33Y 0.320 N.T.

VH wt/VL V79A 0.211 0.095 VH L38 /VL S7P 0.155 0.074 VH L38 /VL 0.107 0.051 C33S VH L38W/VL 0.240 N.T.

V98A 2H10 IgG2 VH wt/VL wt 0.224 0.043 VH M93V/VL wt 0.264 N.T.

VH wt/VL C33S 0.084 0.031 VH wt/VL C33A 0.174 N.T.

VH wt/VL C33G 0.314 N.T.

VH wt/VL C33D 0.178 N.T.

VH wt/VL C33R 2.97 N.T.

VH wt/VL C33Y >3.00 N.T.

VH M93V/VL 0.138 N.T.

C33S Ejemplo 13 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA ANTIANGIOGÉNICA EN UN ENSAYO IN VIVO DE ANGIOGENESIS BASADA EN ESFEROIDE Los esferoides de la célula endotelial humana de la vena umbilical (HUVEC) se prepararon como se describió anteriormente (Korff y Augustin: J. Cell Biol . 143: 1341-1352, 1998) por el pipeteo de 100 células endoteliales (EC) en una gota colgante sobre placas de plástico para permitir la formación del esferoide durante toda la noche. Al día siguiente, mediante el método descrito previamente (Alajati y otros. Nature ethods 5:439-445, 2008), los esferoides de EC se cosecharon y mezclaron en una solución de Matrigel/fibrina con los HUVEC simples para alcanzar un número final de 100,000 EC como esferoides y 200,000 EC simples por tapón inyectado. VEGF-A y FGF-2 se adicionaron a una concentración final de 1000 ng/ml . Los ratones SCID machos (5-8 semanas de edad) se inyectaron por vía subcutánea con 500 µ? de la suspensión célula/matriz. Al día siguiente (día 1) el tratamiento se inició. En el día 21, el estudio se terminó. Los tapones de matriz se eliminaron y fijaron en 4% de PFA. Todos los tapones de matriz se embebieron en parafina y cortaron a un espesor de 8 a 10 µp? para el examen histológico. Los vasos sanguíneos se visualizaron por tinción para CD34 humano y la actina de músculo liso (SMA) y se determinó la densidad del vaso y la cobertura por pericito. Ambos anticuerpos IgGl e IgG2 son eficaces en la modulación de la formación del vaso y la inhibición in vivo del reclutamiento de pericito. Los datos obtenidos sugieren que el tratamiento con los anticuerpos anti-DLL4 (21H3RK o 4B4) induce un aumento en la formación del vaso humano de al menos 100% por encima del control sin tratar a las concentraciones de anticuerpos tan bajas como 1 mg/kg. Además, estos aumentos de la formación del vaso humano se asociaron con una disminución en la cobertura por pericito (como se evaluó por el porcentaje de vasos humanos positivos a CD34 que se asociaron también con células positivas para la expresión de aSMA) de al menos 50% a la dosis de anticuerpo de 5 mg/kg. Los datos que resumen el efecto de 21H3RK IgGl dosificado dos veces por semana por vía intraperitoneal a 1, 0.2 y 0.04 mg/kg se muestran en la Tabla 24. En conjunto, los datos indican que los anticuerpos son activos en un ensayo in vivo de angiogénesis .

Ejemplo 14 MAPEO DE EPÍTOPO DEL 21H3RK El monoclonal 21H3RK se une específicamente a DLL4 humana, pero no reconoce a DLL1 humana. Esta especificidad se emplea para deducir el epítopo de unión del Mab 21H3RK a DLL4 humana. Las variantes quiméricas se diseñaron con las partes del dominio extracelular de DLL4 que se sustituye con los segmentos correspondientes de DLL1. La DLL4 humana (Yoneya y otros, 2001, J. Biochem. , 129, 27-34, clonado interno) y DLL1 humana (# de acceso NM_005618, Origene, MD) se usaron como patrones en la superposición de la extensión por PCR para construir una serie de variantes que incluyen el dominio de transmembrana DLL4 para la expresión en la superficie de las proteínas recombinantes . Las variantes resultantes se clonaron en un vector de expresión de mamífero que codifica para un promotor principal temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMVie) , el promotor y la región 5' sin traducir para la expresión transitoria de mamífero. Las variantes quiméricas se expresaron transitoriamente en las células HEK293F como proteínas enlazadas a la membrana para la caracterización citométrica de flujo con Mab 21H3RK. Posterior a las 48 horas de la transíección, los transíectantes de HEK293F se incubaron con 1 mg/ml de Mab 21H3RK durante 1 h sobre hielo en PBS, lavaron, incubaron después con la anti- IgG humana en carnero- FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) y se analizaron con un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences, CA) . Los niveles de expresión de todas las variantes quiméricas se monitorearon por la incubación con una mezcla de ambos anticuerpos policlonales anti-DLL4 de ratón en carnero (que también reconoce a DLL4 humana) y anti-DLLl humano en carnero (ambos de R&D Systems., MN) , se detectaron después con la anti- IgG de carnero en porcino- PE (Invitrogen, CA) .

Aunque el DLLl y DLL4 humana comparten el 53% de identidad al - nivel de aminoácidos, el Mab 21H3RK se une específicamente a DLL4 pero no reconoce a DLLl. Las variantes quiméricas de DLL4 humana que codifican para pequeñas partes del DLLl humana se construyeron para identificar la región responsable de esta especificidad. Doce variantes quiméricas knock-out se construyeron por la sustitución de los subdominios de la DLL4 humana con los residuos correspondientes de DLLl humana. La Figura 4 ilustra cómo la parte extracelular de DLL4 se dividió en los subdominios estructuralmente definidos. El gran amino-terminal (N-terminal) de la proteína DLL4 madura se dividió en dos segmentos más pequeños. La variante KO de N-ter 1 reemplaza a los primeros 86 aminoácidos (AA) de la proteína DLL4 madura con DLLl humana, y la variante KO de N-ter 2 reemplaza los aminoácidos 87-146 con DLLl humana. Otras variantes knockout representadas en la figura incluyen la sustitución en DLLl de: todo el dominio N-terminal (AA 1-146), el dominio DSL (AA 147-191) , el dominio EGF1 (AA 192-224) , ambos dominios EGF1 y 2 (AA 192-255) , ambos dominios EGF3 y 4 (AA 256-333) , y los cuatro dominios EGF5-8 (AA 334-503) . Además, las variantes combinadas de sustitución de dominio se diseñaron: ambos dominios N-terminal y DSL (AA 1-191) , los dominios N-terminal más DSL y EGF1-2 (AA 1-255) , los dominios DSL y EGF1-2 (AA 147-255) , y los dominios DSL y EGFl (AA 147-224) . Todas las proteínas recombinantes se expresaron bien en la superficie celular cuando se monitoreó con los anticuerpos policlonales anti-DLL4 y DLLl (Figura 5, paneles superiores de ambas filas) , sin embargo el Mab 21H3RK no reconoció ninguno de los constructos que comprenden ambos dominios DSL y EGFl de DLLl humana (Figura 5, panel inferior) . Además, el constructo de DLLl codificado con los dominios DSL y EGFl de DLL4 (mutantes knock-in) confirió la unión de Mab 21H3RK a DLLl (Figura 6) . Por consiguiente, el epítopo de unión de 21H3R se localiza dentro de los dominios DSL y EGFl .

Para perfeccionar además el epítopo de unión dentro de este segmento de la proteína, e identificar los residuos críticos responsables por la especificidad de unión de Mab 21H3R , se diseñaron tres variantes adicionales. Tres segmentos de quince aminoácidos dentro de los dominios DSL y/o EGFl de DLL4 se sustituyeron por los residuos correspondientes de DLLl: el fragmento A (AA 187-201), el fragmento B (AA 200-214), y el fragmento C (AA 210-224) que codifican sólo unas pocas sustituciones de aminoácidos donde no. están conservadas las secuencias de DLLl y DLL4. El fragmento A abarca los últimos cinco aminoácidos del dominio DSL, el enlazador de cuatro aminoácidos entre el dominio DSL y EGFl, y seis aminoácidos del dominio EGFl. La sustitución de estos 15 aminoácidos con residuos de DLL1 resultó en la pérdida de unión del ab 21H3RK. Ningún efecto se observó cuando los residuos de DLL4 en los fragmentos B y ,C se reemplazaron con DLL1. Estos datos identifican los 15 aminoácidos (AA 187-201) , incluyendo el C-terminal de DSL y el N-terminal de EGFl que son importantes para la unión, el epítopo para 21H3RK se mapeó para los dominios DSL y EGFl (AA 147-224) con la región crítica que localiza al C-terminal de DSL y al N-terminal de EGFl (AA187-201) .

EJEMPLO 15 DETERMINACION POR ANÁLISIS FACS DE ANTICUERPOS DLL4 QUE CAUSAN LA INTERNALIZACION DE DLL4 La capacidad de los anticuerpos purificados para inducir la internalización de DLL4 se investigó por análisis FACS. Las células HEK293 que sobreexpresan de forma estable DLL4 se disociaron y lavaron en tampón FACS (PBS + 2% de SFB) antes del recubrimiento a 50,000-100,000 células por pocilio en placas de fondo V. Los anticuerpos primarios (anti-DLL4 o control de isotipo adecuado) se diluyeron a una concentración final de 10 mg/ml en tampón FACS caliente a 37°C y se adicionó a las células durante 30, 60, 120 o 240 minutos en una incubadora de cultivo de tejidos (37 °C/5% C02) . En el intervalo de tiempo adecuado, las células se centrifugaron a 500 g en una centrífuga pre refrigerada a 4°C y lavaron en tampón FACS frío, antes de la incubación con un anticuerpo secundario de anti-IgG humana marcada con FITC (1 mg/ml, Jackson Labs, catálogo #109-096-098) durante 10 minutos en hielo. Después de la incubación, las células se centrifugaron nuevamente a 500 g en una centrífuga pre-refrigerada, lavaron con tampón FACS frío y fijaron con 2% de paraformaldehído durante 20 min. La internalización se evaluó mediante la lectura en un FACSCalibur. Bajo estas condiciones de ensayo, <10% de la internalización de 21H3RK ocurrió en los intervalos de tiempo anteriores. La internalización se puede determinar también por la incubación con un anticuerpo de competencia no cruzada para DLL4 en lugar de un anticuerpo secundario de anti-IgG humana. En algunos experimentos, el anticuerpo primario (10 mg/ml) diluido en tampón FACS se pre-incubó con las células que sobreexpresan DLL4 como se describió anteriormente durante 30 minutos en hielo antes de lavar en tampón FACS caliente a 37°C e incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos (37°C/5% C02) durante 30, 60, 120 ó 240 min. Después de estas incubaciones, las células se lavaron e incubaron con el anticuerpo secundario y fijaron como se describió anteriormente antes de leer en un FACSCalibur. Bajo estas condiciones, <15% y <35% de internalización se observó para 21H3RK y 4B4 a t=60 y 240 minutos, respectivamente con respecto al control t=0. La internalizacion bajo las condiciones del ensayo anteriores se puede determinar también por la incubación con un anticuerpo de competencia no cruzada para DLL4 en lugar de un anticuerpo secundario anti-IgG humana.

EJEMPLO 16 ACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS ANTI-DLL4 EN UN MODELO DE ANGIOGÉNESIS MATRIGEL PLUG EN RATÓN La capacidad de los anticuerpos anti-DLL4 para modular la angiogénesis se puede evaluar mediante un ensayo de Matrigel plug. En este ensayo, los compuestos que inducen la angiogénesis tales como bFGF, VEGF o las células tumorales se pueden introducir en el Matrigel líquido que, después de la inyección subcutánea, solidifica y permite la infiltración por las células endoteliales y vasculares de músculo liso y permite la formación de nuevos vasos sanguíneos. En resumen, el Matrigel en forma líquida a 4°C se puede mezclar con el vehículo (por ejemplo, PBS) o factores de crecimiento/células tumorales (por ejemplo, LL2, MCF7 , A431, Colo205, KNRK, Calu-6, SW620, Panel) e inyectar 0.5 mi por vía subcutánea en el área baja abdominal de ratones hembras 129sl/SvlmJ (6-8 semanas de edad, n=5 por grupo) . Los anticuerpos anti-DLL4 se pueden administrar dos veces por semana a través de la inyección intraperitoneal . Después de 5-10 días, los animales se pueden sacrificar humanitariamente y los tapones se pueden recuperar para la evaluación de la angiogénesis, la cuál se puede determinar por la puntuación histológica de la densidad de los vasos y la cobertura de la célula mural, mediante por ejemplo, la evaluación de la inmunotinción de CD31 y la actina alfa de músculo liso (aSMA) , la medición del contenido de hemoglobina, y la medición de la perfusión de vaso mediante, por ejemplo, FITC-dextrano . La capacidad de los anticuerpos anti-DLL4 para modular la angiogénesis se determina de este modo.

EJEMPLO 17 ACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS ANTI-DLL4 EN MODELOS DE XENOINJERTO TUMORAL HUMANO A PARTIR DE MUESTRAS PRIMARIAS TUMORALES DEL PACIENTE.

Este ejemplo describe el uso de los anticuerpos anti-DLL4 para inhibir o impedir el crecimiento de los tumores derivados de muestras primarias de pacientes cuando se crecen como xenoinjertos en los ratones. En resumen, el ratón receptor se puede anestesiar por la inhalación de isoflurano hasta que se haya logrado un nivel quirúrgico de anestesia. El tumor primario se puede lavar después con RPMI suplementado con antibióticos y el 10% de SFBi antes que se pique con bisturís para producir una "mezcla fangosa" y se divida en volúmenes adecuados para la implantación (por e emplo, un tumor de 300 mg se puede implantar en 4 ratones) . Las mezclas de tumor se pueden cargar en trocares de implante de cáncer calibre 13. El eje de los trocares se puede llenar completamente con las mezclas tumorales e introducir por vía subcutánea en el lado derecho y administrar los contenidos bajo la almohadilla de grasa dorsal. El ratón se puede retornar después a su jaula y monitorear durante la recuperación.

En el primer pase, se implantan de 3-5 ratones por lo general con la mezcla de tumor primario. Cuando los tumores alcanzan de 800-1000 mm3, se cortan en fragmentos de aproximadamente 3x3x3 mm y se subpasan en 5 ratones con 1 fragmento dentro de cada ratón. El material tumoral restante se conserva en el medio de Congelación de Cultivo Celular Recovery™ (Gibco, catálogo #12648-010) , además de la tinción de hematoxilina&eosina y la extracción de ADN/AR . Los tumores a partir del pase 2 se pueden usar para la implantación durante los estudios de eficacia. En los experimentos de eficacia, 1 fragmento de tumor se implanta en cada animal .

El crecimiento del tumor se sigue por la medición de dos diámetros perpendiculares . Las mediciones del tumor y los pesos corporales se pueden registrar dos veces por semana durante 2 semanas después del inicio del tratamiento. La fórmula para el cálculo de volumen tumoral es como sigue: (L x W2) /2.

Los anticuerpos antagonistas DLL4 se pueden dosificar como una solución. Los tratamientos se pueden iniciar cuando el volumen tumoral promedio alcanza aproximadamente de 100-200 rara3, o al mismo tiempo como implantación tumoral. El período de tratamiento puede constar de un total de 28 días. Los anticuerpos antagonistas DLL4 se pueden administrar a, por ejemplo, 5, 10 ó 20 mg/kg/ día (vía intraperitoneal , qd, 2 veces/semana) como agente único o en combinación con otros agentes. Las mediciones del tumor y los pesos corporales se registran dos veces por semana durante 4 semanas después del inicio del tratamiento. La capacidad de los anticuerpos DLL4 para inhibir el crecimiento de los xenoinjertos tumorales derivados de las muestras de pacientes, ya sean solos o en combinación, se determina de este modo.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión de éste, que se une específicamente a DLL4 , caracterizado porque exhibe una o más de las siguientes propiedades, comprendiendo : se une a la DLL4 humano con una KD de menos de 200 pM; reacciona de manera cruzada con la DLL4 de mono cinomolgo; reacciona de manera débilmente cruzada con la DLL4 de ratón; se une a la DLL4 de cinomolgo con afinidad casi equivalente ; no se une significativamente a DLL1 o Jagged 1; exhibe una inhibición de la proliferación de células HUVEC mediada por DLL4 inversa mayor que 85% en cultivos 2D comparado con un control; exhibe más de 50% de inhibición de la formación del tubo de células HUVEC en cultivos 2D a una concentración de 0.08 g/ml con relación al control; y exhibe menos de 50% de internalización a las cuatro horas con relación a un control t=0.

2. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado^jDorque inhibe el crecimiento del tumor y/o metástasis en un mamífero.

3. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se une a DLL4 con una Kd de menos de 100 pM.

4. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque se une a un epítopo que comprende cualquier combinación de al menos una' secuencia de aminoácido de al menos 3 residuos de aminoácidos a la porción entera especificada de aminoácidos contiguos de sec . con núm. de ident.: 90.

5. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es cualquiera de 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 ó 21H3RK.

6. Un anticuerpo aislado que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizado porque comprende: a) una secuencia CDR3 como se muestra en la Tabla 2 o 13; b) cualquiera de una secuencia CDR1, una CDR2 o una CDR3 como se muestra en la Tabla 2 o 13; c) una secuencia CDR1 , una CDR2 o una CDR3 de una secuencia variable de cadena ligera como se muestra en la Tabla 2; o d) una secuencia CDR1, una CDR2 o una CDR3 de una secuencia variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 2.

7. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste que se une inmunoespecíficamente a DLL4 y caracterizado porque comprende : (a) una VH CDR1 de la sec . con núm. de ident.: 6 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR1 de la sec. con núm. de ident . : 6 ; (b) una VH CDR2 de la sec. con núm. de ident. : 6 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR2 de la sec. con núm. de ident.: 6; (c) una VH CDR3 de la sec. con núm. de ident.: 30 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 6 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR3 de la sec. con núm. de ident. : 6; (d) un VL CDRl de sec. con núm. de ident.: 8 con una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones del residuo de aminoácido con relación a VL CDRl de sec. con núm. de ident.: 8 (e) una VL CDR2 de sec. con núm. de ident.: 8 con una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones del residuo de aminoácido con relación a la VL CDR2 de sec . con núm. de ident. : 8; y (f) una VL CDR3 de la sec. con núm. de ident. : 8 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR3 de la sec. con núm. de ident.: 8.

8. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende: (a) una VH CDR1, CDR2 y CDR3 de la sec. con núm. de ident . : 6 ; y (b) una VL CDR1, CDR2 y CDR3 de la sec. con núm. de ident . : 8.

9. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste, en donde el anticuerpo o el fragmento se une inmunoespecíficamente a DLL4 y caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad con el aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 6 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 8, en donde el anticuerpo tiene la actividad de unirse a DLL4.

10. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste que se une inmunoespecíficamente a DLL4 y caracterizado porque comprende : (a) una VH CDR1 de sec. con núm. de ident. :30 con una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprendel, 2, ó 3 sustituciones del residuo de aminoácido con relación a la VH CDR1 de sec . con núm. de ident.: 30; (b) una VH CDR2 de SEQ ID NO: 30 having una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprendel, 2, ó 3 sustituciones del residuo de aminoácido con relación a la VH CDR2 de sec. con núm. de ident.: 30; (c) una VH CDR3 de la sec. con núm. de ident . : 30 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR3 de la sec. con núm. de ident. : 30; (d) una VL CDR1 de la sec. con núm. de ident. : 32 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR1 de la sec. con núm. de ident. : 32; (e) una VL CDR2 de la sec. con núm. de ident. : 32 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR2 de la sec. con núm. de ident.: 32; y (f) una VL CDR3 de la sec. con núm. de ident.: 32 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR3 de la sec. con núm. de ident.: 32.

11. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende: (a) una VH CDR1, CDR2 y CDR3 de la sec. con núm. de ident . : 30 ; y (b) una VL CDR1, CDR2 y CDR3 de la sec . con núm. de ident . : 32.

12. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste que se une inmunoespecíficamente a DLL4 y caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad con el aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 30 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad con' la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. :32, en donde el anticuerpo tiene la actividad de unirse a DLL .

13. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste, caracterizado porque comprende una secuencia que comprende la sec. con núm. de ident. : 6, y en donde la sec. con núm. de ident.: 6 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de línea germinal y línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 9.

1 . Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste, caracterizado porque comprende una secuencia que comprende la sec. con núm. de ident.: 8, y en donde la sec. con núm. de ident.: 8 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de línea germinal y línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 10.

15. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste, caracterizado porque comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident . : 30, y en donde la sec . con núm. de ident.: 30 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de línea germinal y línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 5.

16. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste, caracterizado porque comprende una secuencia que comprende la sec. con núm. de ident.: 32, y en donde la sec. con núm. de ident.: 32 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de linea germinal y línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 6.

17. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .

18. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un fragmento de unión o un anticuerpo monoclonal completamente humano.

19. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste de un fragmento Fab, Fab', F(ab')2/ Fv y dAb.

20. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque compite con cualquiera de los anticuerpos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7 , 4B3 , 1D4 o 21H3RK para unirse a DLL4.

21. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se une al mismo epítopo en DLL4 como cualquiera de los anticuerpos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8 , 20G8, 21H3, 1E4; 3A7, 4B3, 1D4 o 21H3RK.

22. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que comprende : una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2H10VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-10181; una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2Hl OVHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9502; o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2Hl OVHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9502 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab2Hl OVLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-10181.

23. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste caracterizado porgue comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9517; una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8 VLOPTl el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9516; o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab9G8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9517 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera codificada por el polinucleótido en el plásmido designado ab9G8 VLOPTl el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9516.

24. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión de éste caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que comprende : una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH, el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9501; una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9500; o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-9501 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera del anticuerpo codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab21H3VXiOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) con el número PTA-95Q0.

25. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

26. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .

27. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .

28. Un método de tratar un tumor maligno en un animal, caracterizado porque comprende: seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de un tumor maligno,- y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el animal es un humano.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales completamente humanos 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4 , 3A7, 4B3, 1D4 O 21H3RK.

31. El método de conformidad con las reivindicaciones 22-30, caracterizado porque el tumor maligno se selecciona del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de células pequeñas cáncer de células no pequeñas glioma, carcinoma hepatocelular (hígado) , tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma) , adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas y carcinoma epidermoide.

32. Un método de tratar una enfermedad no neoplásica, caracterizado porque comprende: seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad no neoplásica; y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el animal es un humano.

34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de los anticuerpos 4B4 , 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7 , 4B3, 1D4 ó 21H3RK.

35. El método de conformidad con las reivindicaciones 32-34, caracterizado porque la enfermedad no neoplásica se selecciona del grupo consistente de enfermedad ocular, enfermedad inflamatoria, enfermedad cardiovascular y sepsis.

36. Uso de la composición de conformidad con la reivindicación 25 para tratar un tumor maligno. ~~

37. Uso de la composición de conformidad con la reivindicación 36, en donde el tumor maligno se selecciona del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de células pequeñas cáncer de células no pequeñas glioma, carcinoma hepatocelular (hígado) , tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma) , adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas y carcinoma epidermoide.

38. Uso de la composición de conformidad con la reivindicación 25 para tratar una enfermedad no neoplásica.

39. Uso de la composición de conformidad con la reivindicación 38, en donde la enfermedad no neoplásica se selecciona del grupo consistente de enfermedad ocular, enfermedad inflamatoria, enfermedad cardiovascular y sepsis.