MX2010012811A - Proteinas de union al receptor de interleucina-21. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee proteínas de unión y fragmentos de unión a un antígeno de las mismas que se unen específicamente al receptor de interleucina-21 humana (IL-21R); las proteínas de unión pueden actuar como, por ejemplo, antagonistas de la actividad del IL-21R, modulando así las respuestas inmunes en general, y esas mediadas por IL-21 R en particular; las composiciones y métodos descritos pueden ser usados, por ejemplo, en el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos asociados con el IL-21R, por ejemplo, trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunes, alergias, rechazo de trasplante, cáncer, y otros trastornos del sistema inmunológico.

Description

i PROTEINAS DE UNIÓN AL RECEPTOR DE INTERLEUCINA-21 i ' REFERENCIA CRUZADA I i Esta solicitud reclama el beneficio de la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 61/055,500, presentada el 23 de Mayo de 2008, cuyo contenido se incorpora para referencia en la presente en su i totalidad. i ! CAMPO TÉCNICO I La presente invención se refiere a las proteínas de unión y i fragmentos de unión a un antígeno de las mismas que se unen al receptor de la interleucina-21 (IL-21 R), en particular, IL-21 R humano, y su uso en la regulación de las actividades asociadas con la IL-21 R. Las proteínas de unión descritas en la presente son útiles en el tratamiento y/o el diagnóstico de trastornos asociados con la IL-21 R, por ejemplo, trastornos inflamatorios, i enfermedades autoinmunes, alergias, rechazo de trasplantes, trastornos I hiperproliferativos de la sangre y otros trastornos del sistema inmunológico.

I i I i I ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ¡ Técnica Antecedente Relacionada i I Los antígenos inician respuestas inmunes y activan las dos principales poblaciones de linfocitos: las células T y las células B. Después de I encontrarse con el antígeno, los linfocitos T proliferan y se diferencian en células efectoras, mientras que las células B proliferan y se diferencian en células plasmáticas secretoras de anticuerpos. Estas células efectoras i secretan y/o responden a las citocinas, que son proteínas pequeñas (menores I qué aproximadamente 30 kDa), secretadas por los linfocitos y otros tipos de células.

| La IL-21 humana es una citocina que muestra una homología de secuencia a la IL-2, IL-4 e IL-15 (Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408:57- 63). A pesar de la baja homología de secuencia entre las citocinas intérleucina, las citocinas comparten un pliegue común en una estructura de í "paquete de cuatro hélices" que es representativa de la familia. La mayoría de las citocinas se unen ya sea a los receptores de citocina de clase I o de clase j II. Los receptores de citocina de clase II incluyen los receptores para IL-10 y los interferones, mientras que los receptores de citocina de clase I incluyen los receptores para IL-2 a través de IL-7, IL-9, IL-1 , IL-12, IL-13, e IL-15, así como los factores de crecimiento hematopoyéticos, leptina y hormona del crecimiento (Cosman (1993) Cytokine 5:95-106).

I ' El IL-21 R humano es un receptor de citocina de clase I. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos que codifican la IL-21 humana y su receptor (IL-21 R) se describen en la Publicación de la Solicitud Internacional No'. WO 00/053761 y WO 01/085792; Parrish-Novak et al. (2000), supra, y Ozaki et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 1 1439-44. El IL-21 R tiene la homología de secuencia más alta a la cadena ß del receptor IL-2 y la cadena a del receptor IL-4 (Ozaki et al. (2000), supra). Con la unión del ligando, el IL- I 21 R se asocia con la cadena (ye) del receptor de citocina gamma común que es compartida por los complejos del receptor para IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, 1L-13 e IL- 15 (Ozaki et al;. (2000), supra; Asao et al. (2001) J. Immunol 167:1- I 5). ! El IL-21 R se expresa en los tejidos linfoides, particularmente en i las' células T, células B, células asesinas naturales (NK), células dendríticas i (DC) y macrófagos (Parrish-Novak et al. (2000), supra), que permiten a estas células responder a la IL-21 (Leonard y Spolski (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:688-98). La amplia distribución del linfoide del IL-21 R indica que la IL-21 desempeña un papel importante en la regulación inmune. Estudios in vitro han derrostrado que la IL-21 significativamente modula la función de las células B, células T CD4+ y CD8+ y células NK (Parrish-Novak et al (2000), supra; Kasaian et al (2002): Immunity 16:559-69). Evidencias recientes sugieren que la IL-21 mediada por la señalización puede tener actividad antitumoral i ¦ (Siyakumar et al. (2004) Immunology 112:177-82), y que la IL-21 puede i i prevenir el asma inducido por antígenos en ratones (Shang et al. (2006) Cell.

Immunol. 241 :66-74). j En la autoinmunidad, la interrupción del gen IL-21 y la inyección de IL-21 recombinante ha demostrado modular la progresión de la miastenia i gravis autoinmune experimental (EAMG) y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), respectivamente (King et al. (2004) Cell 117:265-77; Ozaki et al. (2004) J. Immunol. 173:5361-71 ; Vollmer et al. (2005) J. Immunol 174:2696-2701 ; Lui et al. (2006) J. Immunol. 176:5247-54). En estos sistemas experimentales, se ha sugerido que la manipulación de la señalización medida i po'r la IL-21 alteró directamente la función de las células CD8+, las células B, i I las células asistentes T y las células NK. j BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ; La presente invención se describe el aislamiento y la caracterización de proteínas de unión, por ejemplo, anticuerpos humanos y i fragmentos de los mismos, que se unen específicamente al IL-21 R de humano y murino. Las proteínas de unión descritas en la presente se derivan de los anticuerpos 18A5, que se describen en la patente de E.U.A. No. 7,495,085, la totalidad de la cual se incorpora para referencia en la presente. Las proteínas de: unión de la presente invención tienen un grado de afinidad mucho mayor al IL-21 R humanos y/o murino que el anticuerpo 18A5 parental.

I I j I i La invención provee, por lo menos en parte, los agentes de unión al jlL-2 R (tales como las proteínas de unión y fragmentos de unión a un antígeno de las mismas) que se unen al IL-21 R, en particular, al IL-21 R humano, con alta afinidad y especificidad. Las proteínas de unión, y los fragmentos de unión a un antígeno de las mismas, de la presente invención también son referidas aquí como "proteínas de unión anti-IL-21 R" y i "fragmentos de las mismas", respectivamente. En una modalidad, la proteína de unión o fragmento de la misma reduce, inhibe o antagoniza la actividad del IL-21 R. Dichas proteínas de unión se pueden usar para regular las respuestas inmunes o trastornos asociados con la IL-21 R al antagonizar la actividad del IL-21 R. En otras modalidades, la proteína de unión anti-IL-21 R se puede usar para el diagnóstico, o como una proteína de unión objetivo para suministrar un agente terapéutico o cítotóxico para una célula que expresa el IL-21 R. Por lo tanto, las proteínas de unión al anti-IL-21 R de la invención son útiles en el diagnóstico y tratamiento de trastornos asociados al IL-21 R, por ejemplo, trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunes, alergias, rechazo de trasplantes, trastornos hiperproliferativos, y otros trastornos del sistema inmunológico.

En consecuencia, en un aspecto, las proteínas de unión de la invención incorporan una proteína de unión aislada (por ejemplo, un I anticuerpo aislado) o fragmento de unión a un antígeno del mismo que se une al IL-21 R, en particular, el IL-21 R humano. En ciertas modalidades, la proteína I d unión a anti-IL-21 R (por ejemplo, anticuerpos) puede tener una o más de I las siguientes características: (1) es una proteína de unión monoclonal o de especificidad simple; (2) es una proteína de unión humana; (3) es una proteína de unión generada ¡n vitro; (4) es una proteína de unión generada in vtto (por ejemplo, un sistema de ratón transgénico); (5) inhibe la unión de la al IL-2 R; (6) es un lgG1 ; (7) se une al IL-21 R humano con una constante de asociación de por lo menos aproximadamente 105 M"V1; (8) se une al IL-21 R de murino con una constante de asociación de por lo menos aproximadamente 5x104 M'V1, (9) se une al IL-21 R humano con una constante de disociación de aproximadamente 10"V1 o menor; (10) se une al I L 21 R de murino con una constante de disociación de aproximadamente 10" o menor; (11) inhibe la proliferación mediada por el IL-21R humano de células BaF3 que expresan el IL-21 R humano con un IC50 de aproximadamente 1.75 nM o menor; (12) inhibe la proliferación mediada por el i IL--21 R de murino de células BaF3 que expresan el IL-21-R de murino con un IC50 de 0.5 nM o menor; (13) inhibe la proliferación mediada por el IL-21 R humano de células TF1 que expresan el IL-21 R humano con un IC50 de aproximadamente 14.0 nM o menor; (14) inhibe la proliferación mediada por la IL-21 de células B primarias humanas con un IC50 de aproximadamente 1.9 nM o menor; (15) inhibe la proliferación mediada por la IL-21 de células CD4+ i T primarias humanas con un IC50 de aproximadamente 1.5 nM o menor, y (16) inhibe la proliferación mediada por la IL-21 de células CD4+ T primarias de murino con un IC50 de aproximadamente 5.0 nM o menor.

Modalidades ilustrativas no limitantes de las proteínas de unión dé la invención (el término "proteínas de unión", también incluye y se refiere a los fragmentos de unión a un antígeno de las mismas, según el caso) aquí se refieren como AbA-AbZ, y la correlación de estos términos con los términos usados en la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 61/055,500 se presenta en el Cuadro 2A. Otras modalidades ilustrativas de las proteínas de unión de la presente invención, es decir, scFv, son referidas aquí como H3- H6, L1-L6, L8- L21 , y L23-L25, según se detalla en el Cuadro 2B. j Una modalidad de la presente invención es una proteína de unión aislada o de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-2 R, en dojnde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma I comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95| % idéntica a una secuencia de aminoácidos(s) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42| 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, I 244, 246 y 248. La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un scFv, un VH, un VL, o un i CDR. i Otra modalidad de la presente invención es una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antigeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la ¡misma comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia(s) de nucleótidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 1 13, 1 15, 1 17, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 239, 241 , 243, 245 y 247.

Una modalidad más de la presente invención es una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, i 481, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 112, 114, 1 16, 1 18, 120, 122, i 12^, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248. i Aún otra modalidad de la presente invención es una proteína de unión aislada o un fragmento de unión a un antigeno de la misma que se une I al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia(s) de i i i aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 , 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 , 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 , 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, I 154, 156, 158, 160, 162-195, 213-229, 240, 242, 244, 246, y 248, y en donde, si la próteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende por lo í menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente I I 95% idéntica a la secuencia(s) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID! NOS: 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169, 170, 194, y 195, la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno también debe comprender por lo menos i una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, I 84;, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 1 14, 1 16, I 11^, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, i 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, 24j4, 246 y 248.

! Aún otra modalidad de la presente invención es una proteína de i unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada i i por una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia(s) de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 , 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ¡ 7 , 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, i 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 y 247, y n donde, si la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica I á la secuencia(s) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 7, 9 y! 11, entonces la proteina de unión o fragmento de unión a un antígeno también debe comprender por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es por lo menos i aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 2.5, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 y 247.

Aún otra modalidad de la presente invención es una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 8 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 1 14, 116, j 1 fl 8, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162-195, 213-229, 240, 242, 244, 246, y 248, en donde, si la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la sécuencia(s) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169, 170, 194, y 195, i entonces la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno también debe comprender por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, I 6Í8, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, i i;06, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248.

Otra modalidad de la presente invención es una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al 11.-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende una cadena ligera y una cadena pesada, y en donde la cadena pesada comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 68, 70, 72, 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240, y 242, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia sustancialmente idéntica a la misma incluye una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma), o un secuencia sustancialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia sustancialmente homologa a la misma incluye una secuencia de por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma). En otra modalidad, la proteína de unión o de fragmento de unión a un antígeno comprende un dominio VL y un dominio VH, y el dominio VH comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18 y 20, o una secuencia sustancialmente idéntica u homologa a la misma. Otra modalidad de la presente invención es una p oteína de unión aislad o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende una cadena ligera y una cadena pesada, y en donde la cadena ligera comprende por lo menos una secuencia de i aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 , 58, 60, 62, 64, 66, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214-217, 220-229, 244, 246 , y 248, o una secuencia sustancialmente idéntica u homologa a la misma. En otra modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un I antígeno comprende un dominio VL y un dominio VH, y el dominio VL comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del i grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 215, 217, 221 , 223, 225, 227, y 229, o una secuencia sustancialmente idéntica u homologa a la misma. En otra modalidad, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 88, 90, 92, 94, 213, 218, ? 219, 240, y 242, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214, 216, 220, 222, 224, 226, 228, 244, 246, y 248, o una secuencia sustancialmente idéntica u homologa a la misma. j Las proteínas de unión de la presente invención, por ejemplo, los anticuerpos, pueden ser o no de línea germinal. Se pueden unir específicamente al mismo epítope de IL-21 R o un epitope similar (por ejemplo, un epitope superpuesto) al que se une AbA-AbZ, H3-H6, L1-L6, L8- L21 , L23-L25. En otras modalidades, las proteínas de unión se unen específicamente a un fragmento del IL-21 R, por ejemplo, un fragmento de por i lo menos 10, 20, 50, 75, 100, 150, o 200 aminoácidos contiguos a la ! secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NOs: 2 o 4, o una secuencia que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma.

Otra modalidad de la presente invención es una proteína de ! unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une a i I ! un epítope de IL-21 R que es reconocido por una proteina de unión seleccionada del grupo que consiste de AbA-AbZ, H3- H6, L1-L6, L8- L21 , y I L¿3-L25, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno in ibe competitivamente la unión de una proteína de unión seleccionada del grupo que consiste de AbA-AbZ, H3- H6, L1-L6, L8- L21 , y L23-L25, al IL-21 R humano. En otra modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende una cadena pesada, una cadena ligera, o un fragmento F que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que I consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22 , 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 , 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 1 18, 120, 122 , 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213 -229, 240, 242, i 244, 246, y 248, o una secuencia sustancialmente idéntica u homologa a la i misma. En otra modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende una cadena pesada, una cadena ligera, o un fragmento I Fv que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 13, 15 , 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 5l', 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65 , 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 1 11 , 113, 1 15 , 1 17, 1 19, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 239, 241 , 243, 245 y 247, o una secuencia sustancialmente idéntica u homologa a la misma, En aún otras modalidades, la proteínade unión comprende por menos una región determinante de complementariedad (CDR) de estos dominios VH y VL (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más de los CDR contiguos (por ejemplo, dos o más CDR separados por regiones de estructura (FR) o un enlazador) o CDR no contiguos (por ejemplo, dos o más CDR separados por lo menos por otro CDR i y, por ejemplo, FR(s)). Por ejemplo, la proteína de unión puede incluir uno, dos, tres o más CDR del dominio VH y/o del dominio VL.

; La descripción provee secuencias de ácido nucleico de los dominios VH y VL de Aba-AbZ, H3-H6, L1-L6, L8-L21, y L23-L25. También se contemplan las secuencias de ácido nucleico que comprenden por lo menos urji CDR de AbA-AbZ, H3-H6, L1-L6, L8-L21 , y L23-L25. La descripción también provee vectores y células hospederas que comprenden dichos ácidos i nucleicos.

Las proteínas de unión de la invención puede ser de longitud completa (por ejemplo, incluye por lo menos una cadena pesada completa y por lo menos una cadena ligera completa), o puede incluir sólo un fragmento de unión a un antigeno (por ejemplo, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un i fragmento Fv de una sola cadena, un fragmento Fd, un fragmento dAb, un CDR u otro fragmento de una proteína de unión de longitud completa que conserva la capacidad de unirse específicamente a un antígeno). La proteína I I de unión puede incluir una región constante, o una porción de la misma, elegida de cualquiera de los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, I gama, delta, epsilon y mu. Por ejemplo, se pueden usar las regiones constantes de cadena pesada de los diversos isotipos, incluyendo: IgGI, lgG2, lg(33, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgD, e IgE. La región constante de la cadena ligera puede ser elegida de kappa o lambda. La proteína de unión puede ser una IgG, o también puede ser lgG1K o IgGIA.

La proteína de unión anti-IL-21 R descrita en la presente puede ser derivatizada o enlazada a otra molécula funcional (tal como otro péptido o proteína, por ejemplo, un fragmento Fab). Por ejemplo, una proteína de unión dé la invención puede estar funcionalmente enlazada (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra) por lo menos a otra entidad molecular, tal como a otra proteína de unión (por i ejemplo, una proteína de unión biespecífica o multiespecífica), toxina, radioisótopo, agente citotóxico o citostático, entre otros.

En una modalidad de la invención, la asociación constante de la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno para IL-21 R humano es por lo menos aproximadamente 105 M'V1. En otra modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un antigeno inhibe la proliferación mediada por la IL-21- de las células BaF3 con un IC50 de aproximadamente 1.75 nM o menor, y las células BaF3 comprenden un IL-21 R humano. En otra modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la proliferación mediada por la IL-21 de células TF1 con un IC50 de aproximadamente 14.0 nM í menor, y las células TFL comprenden un IL-21 R humano. En otra modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la I proliferación mediada la IL-21 de las células B primarías humanas con un IC50 ¡ de aproximadamente 1.9 nM o menor, y las células B comprenden un IL-21 R humano. En aún otra modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la proliferación mediada por la IL-21 de células CD4+ primarias humanas con un IC50 de aproximadamente 1.5 nM o menor, y las células CD4+ comprenden un IL-21 R humano.

! En una modalidad, la presente invención provee una proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a cualquier secuencia de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2. Otra modalidad provee una proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno que inhibe la unión de la IL-21 al IL-21 R. Por lo menos en una modalidad, la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es Ig01. Por lo menos en una modalidad, la proteína de unión o fragmento de i unión a un antígeno es humano.

! En otro aspecto, la invención incorpora una composición farmacéutica que contiene por lo menos una proteína de unión anti-IL-21 R y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede incluir además una combinación de por lo menos una proteína de unión ar ti-IL-21 R y por lo menos otro agente terapéutico (por ejemplo, citocina e inhibidores del factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes anti- ¡ ? inflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores de enzimas, agentes citotóxicos , agentes citostáticos o combinaciones de los mismos, tal como se describe con más detalle aquí). Las combinaciones de la proteína de unión anti-IL-21 R y agente(s) terapéutico están también dentro del alcance de la invención. Las composiciones y las combinaciones de la invención pueden ser usadas para regular los trastornos inmunes asociados al IL-21R, por ejemplo, mediante la modulación de la señalización del IL-21 R.

En una modalidad, las proteínas de unión de la invención son anticuerpos. En otras modalidades, los anticuerpos son policlonales, mbnoclonales, monoespecíficos, poliespecificos, no específicos, humanizados, humanos, monocatenados, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutantes, injertados, generados in vitro y/o multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos formados de por lo menos dos anticuerpos intactos).

! Otras modalidades de la invención incluyen un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de unión anti-IL-21 R, un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, y una célula hospedera transformada con el vector. La célula hospedera puede ser una bacteria, una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de planta, o una célula de insecto.

La proteína de unión puede ser directa o indirectamente marcada con una sustancia detectable para facilitar la detección de la proteína de unión enlazada o no enlazada. Las sustancias detectables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos.

¡ En otro aspecto, la invención provee un método para suministrar o dirigir un agente, por ejemplo, un agente terapéutico o citotóxico, a una célula que expresa un IL-21 R in vivo. El método incluye la administración de una proteína de unión anti-IL-21 R a un sujeto bajo condiciones que permiten la unión de la proteína de unión al IL-21 R. La proteina de unión puede estar acoplada a una segunda porción terapéutica, por ejemplo, una toxina.

En otra modalidad, la invención provee un kit de diagnóstico que comprende una proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la presente invención. i Otros aspectos de la descripción se establecerán, en parte, en la descripción, y en parte serán evidentes de la descripción, o se pueden aprender por la práctica de la invención. La invención se establece y se señala en particular en las reivindicaciones y la descripción no debe considerarse i ¦ como limitativa del alcance de las . reivindicaciones. La siguiente descripción detallada incluye representaciones de ejemplo de varias modalidades de la inyención, que no son restrictivas de la invención como se reclama. Las figuras anexas forman parte de esta especificación y, junto con la descripción, I I sólo sirven para ilustrar modalidades y no para limitar la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS j Las FIGs. 1A-1C representan la neutralización de la proliferación dé células IL-21 R-BaF3 humanas por scFv. Las células se mezclaron con el scFv indicado y luego se incubaron con 100 pg/ml de IL-21 humana. La proliferación se midió mediante un CELLTITER-GLO® (Promega Corporation, Madison, Wl) después de 48 horas.

Las FIGs. 2A-2C representan la neutralización de la proliferación i dé células IL-21 R-TF1 por scFv. Las células se mezclaron con el scFv i indicado y luego se incubaron con 100 pg/ml de IL-21 humana. La proliferación se midió mediante un CELLTITER-GLO® después de 48 horas.

Las FIGs. 3A-3C representan la neutralización de la proliferación de células IL-21 R-BaF3 de murino por scFv. Las células se mezclaron con el scFv indicado y luego se incubaron con 400 pg/ml de IL-21 de murino. La i i proliferación se midió mediante un CELLTITER-GLO® después de 48 horas.

I Las FIGs. 4A-4C representa la competencia del scFv con el anticuerpo 18A5 IgG parental para unirse al IL-21 R de murino. El scFv se mezcló con IL-21 R-H/F biotinilado de murino, y las mezclas se añadieron al anticuerpo 18A5 inmovilizado sobre una placa de ELISA. La captura de mlL- 2|1 R fue detectada con HRP-estreptavidina, y la competencia por la unión al I nrjlL-21 R fue indicada por una reducción en la señal de A450.

! Las FIGs. 5A-5I representan la neutralización de la proliferación dependiente de la IL-21 por los pares 21 de la cadena pesada/cadena ligera.

I Los anticuerpos, como se indica en la figura, fueron añadidos a las células.

Subsiguientemente se añadió IL-21 , y se midió la proliferación con CELLTITER-GLO® después de 48 horas. Los ensayos se llevaron a cabo en células IL-21 R-BaF3 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humano (Las FIGs. 5A- 5C)¡, células IL-21 R-TF1 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humana (FIGs. 5D- 5F) o células IL-21 R-BaF3 de murino con 400 pg/ml de IL-21 (FIGs. 5G-5I).

| Las FIGs. 6A-6L representan la unión de 21 IgG anti-IL-21 R a i células CHO que expresan de forma transitoria el IL-21 R humano (FIGs. 6A- 6C), IL-21 R de rata (FIGs. 6D-6F), IL-21 R de mono cynomolgus (FIGs. 6G-6I), y la cadena gamma común humana (FIGs. 6J-6L). Las células CHO fueron transfectadas transitoriamente con IL-21 R o la cadena gamma común de control, y la unión se detectó con IgG anti-humano conjugado a HRP en una ELISA basada en células.

| Las FIGs. 7A-7C representan la especificidad de unión de determinados anticuerpos anti-IL-21 R (FIG. 7A, AbS; FIG. 7B, AbQ, AbT, I Abó; FIG 7C, AbR, AbP, y AbU), medido por resonancia de plasmón superficial. Los anticuerpos anti-IL-21 R fueron capturados en IgG anti- humano, y la unión subsiguiente a cualquiera de IL-21 R-H/F de murino, IL-13- H/F, IL-2R humana, o IL-4R soluble humana, se midió en un instrumento BIACORE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). La FIG. 7D muestra que el IL- 2R(3 humano e IL-4R soluble humano son capturados por anticuerpos I específicos anti-IL-2R y anti-IL-4R, respectivamente (control).

Las FIGs. 8A-8D representan la unión de los anticuerpos anti-IL- 21 R a IL-21 R de humano y murino. Los anticuerpos anti-IL-21 R humanos indicads fueron capturados en un IgG anti-humano e inmovilizados en una microplaqueta BIACORE™. Se dejaron fluir concentraciones variables de IL- 2 R-His/FLAG humano (FIGs. 8A-8B) y IL-21 R-His/FLAG de murino (FIGs. 8C-8D) sobre la microplaqueta, y se monitoreó la unión y la disociación.

Las FIGs. 9A-9D representan la unión de anticuerpos anti-IL-21 R IL-21 R humano y de mono cynomolgus. Los anticuerpos anti-IL-21 R humanos AbS y AbT fueron capturados en un IgG anti-humano e inmovilizados en una microplaqueta BIACORE™. Se dejaron fluir i concentraciones variables de IL-21 R-His/FLAG humano y de mono i cynomolgus sobre la microplaqueta, y se monitoreó la unión y la disociación. i La FIG. 9A muestra el IL-21 R-His/FLAG de mono cynomolgus unido a AbS. La FIG. 9B muestra el IL-21 R-His/FLAG humano unido a AbS. La FIG 9C muestra el IL-21 R-His/FLAG de mono cynomolgus unido a AbT. La FIG. 9D muestra el IL-21 R-His/FLAG humano unido a AbT.

Las FIGs. 10A-10B representan una evaluación de epítope de anticuerpos IL-21 R. En el experimento representado en la FIG. 10A (véase también la ilustración a la izquierda del eje Y), IL-21 R-H/F de murino (proteína de fusión His-Flag) fue capturado por anticuerpos anti-IL-21 R Abs e i inmovilizado en una microplaqueta BIACORE™. Anticuerpos adicionales anti- I ILr21 R (AbS, AbT, D5 (D5-20, un anticuerpo neutralizante IL-21 R anti-murino) y 7C2 (un anticuerpo de control de IL-21 R anti-murino no neutralizante)) fluyeron sobre la microplaqueta y se monitoreó su unión al IL-21 R-H/F i i capturado. En el experimento representado en la FIG. 10B, el IL-21 R-H/F humano fue capturado por anticuerpos anti-IL-21 R AbS e inmovilizado en una microplaqueta BIACORE™. Anticuerpos adicionales anti-IL-21 R (AbS, AbT, y 9D2 (un anticuerpo de control de IL-21 R anti-humano no neutralizante)) fluyó sobre la microplaqueta y se monitoreó su unión al IL-21 R-H/F capturado.

Las FIGs. 11A-11C representan la neutralización de la proliferación de células IL-21 R-BaF3 humanas y células IL-21 R-BaF3 de s murino por los anticuerpos indicados. Los anticuerpos fueron añadidos a las células. Subsiguientemente se añadió IL-21 y se midió la proliferación con CELLTITER-GLO® después de 48 horas. Los ensayos se llevaron a cabo en células IL-21 R-BaF3 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humano (FIG. 11A), células IL-21 R-BaF3 de murino con 200 pg/ml de IL-21 de murino (FIG. 11 B), y células IL-21 R-TF1 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humano (FIG 1 1C).

Las FIGs. 12A-12B representan la neutralización de la proliferación dependiente de IL-21 de células B primarias humanas. Los anticuerpos indicados se añadieron a las células B primarias humanas junto con los anticuerpos anti-CD40 y la IL-21 humana. La incorporación de 3H-timidina se midió después de tres días. La FIG. 12A representa la comparación entre lo anticuerpos AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, IL-13 mutante triple, y 18A5 parentales; la FIG. 12B representa la comparación entre el AbT, AbV, AbW, AbU, y control de lgG1 humano (hlg1 ). j i La FIG. 13 representa la neutralización de la proliferación dependiente de IL-21 de células CD4+ T primarias humanas. Los anticuerpos indicados se añadieron a las células CD4+ T primarias humanas activadas, junto con la IL-21 humana, y la incorporación de 3H-timidina se midió después dé tres días.

La FIG. 14 representa la neutralización de la proliferación dependiente de IL-21 de células CD8+ T primarias de murino. Los anticuerpos indicados se añadieron a las células CD8+ T primarias de murino activadas, junto con la IL-21 , y la incorporación de 3H-timidina se midió después de tres días.

La FIG. 15 representa la medición de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) inducida por los anticuerpos anti-IL-21R.

La eliminación dependiente de PBMC de células BJAB marcadas con CFSE revestidas con los anticuerpos anti-IL-21 R indicados se midió mediante la incorporación de yoduro de propidio. El anticuerpo anti-CD20 rituximab (RlTUXAN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) se incluyó como control positivo, y un anticuerpo anti-IL-13 se incluyó como control negativo.

La FIG. 16 representa la unión a C1q complemento por los anticuerpos anti-IL-21 R. Los anticuerpos anti-IL-21 R indicados fueron inmovilizados sobre una placa de ELISA y, después de la incubación con i suero humano, se midió la unión C1q con C1q pollo anti-humano y un anticuerpo IgY anti-pollo conjugado de HRP. El anticuerpo anti-CD20 rituximab contra (RITUXAN®) se incluyó como control positivo, y un anticuerpo anti-IL-13 se incluyó como control negativo.

Las FIGs. 17A-17C representan secuencias de aminoácidos para AbQ, incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, H3, Ll, L2 y L3), y las regiones constantes.

Las FIGs. 18A-18C representan secuencias de aminoácidos para i AbR, incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2 y L3), y las regiones constantes.

. Las FIGs. 19A-19C representan secuencias de aminoácidos para AbW, incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2 y L3), y las regiones constantes.

Las FIGs. 20A-20C representan secuencias de aminoácidos para AbS, incluyendo dominios VH y VL> los CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2 y L3), y las regiones constantes.

Las FIGs. 21A-21 C representan secuencias de aminoácidos para AbT, incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, ?3, L1 , L2 y L3), y las regiones constantes.

Las FIGs. 22A-22C representan secuencias de aminoácidos para la A' bO, incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2 y L3), y las regiones constantes.

Las FIGs. 23A-23C representan secuencias de aminoácidos para AbP incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2 y L3), y conístante regiones CDR.

| Las FIGs. 24A-24C representa secuencias de aminoácidos para AbU, incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2 y L3), y las regiones constantes.

Las FIGs. 25A-25C representan secuencias de aminoácidos para AbV, incluyendo dominios VH y VL, los CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2 y L3), y las regiones constantes.

! Las FIGs. 26A-26G representan los resultados generados de estudios adicionales que se realizaron de manera similar a esos realizados para' generar los resultados mostrados en las FIGs. 5A-5I, 11 , 12, 13 y 14 (descritos anteriormente).

La FIG. 27A representan la competencia de citocinas de IL-21 con el anticuerpo AbT para unirse a IL-21 R de murino. Se mezcló vehículo o cantidades crecientes de IL-21 con IL-21 R-His/FLAG biotinilado de murino, y las mezclas se añadieron a AbT inmovilizado en una placa de ELISA. La captúra de mlL-21R fue detectada con HRP-estreptavidina, y la competencia i por la unión con mlL-21 R fue indicada por una reducción en la señal de A450. i .

La FIG. 27B representa la competencia de AbS e IL-21 para unirse a IL-21 R de murino. Se mezcló AbS y mlL-21 y se aplicaron a mlL-21 R-Fc en placas de ELISA, y se monitoreó la unión de AbS (rombos rellenos), anticuerpo de control de isotipo (triángulos abiertos), o mlL-21 (cuadrados).

La FIG. 28 representa la incorporación de 3H timidina dependiente de IL-21 en células T de rata CD3 en presencia de anticuerpos I i i anti-IL-21 R AbS AbU, AbV o AbW, o un anticuerpo de control de isotipo, i hlgp1-TM.

| DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN i 1 ( Las proteínas de unión de la presente invención se derivaron inicialmente de anticuerpos 18A5 parentales, pero difieren de 18A5 en las secuencias de aminoácidos de las porciones de la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada y/o la cadena ligera (CDR3).

Además, las proteínas de unión presentes demostraron una potencia mejorada en la unión y neutralización de IL-21 R tanto de humano como de murjino, en comparación con 18A5 en el formato equivalente (por ejemplo, scFy o IgG). La neutralización de alta potencia de IL-21R de ambas especies (humana y de ratón) por una sola proteína de unión no ha sido reportada previamente. Las proteínas de unión presentes que tienen una mayor potencia de neutralización que su anticuerpo parental puede traducirse en una mayor eficacia en comparación a los agentes descritos anteriormente. Además, la secuencia de aminoácidos de las regiones de estructura VH y VL se han í modificado para que coincidan con las secuencias codificadas por la secuencia genómica humana, reduciendo así el potencial de respuestas anti- hunrjano de anticuerpos humanos en los pacientes tratados con las proteínas de unión presentes.

Definiciones Con el fin de que la presente invención pueda comprenderse fácilmente, primero se definen algunos términos. Definiciones adicionales se establecen a lo largo de la descripción detallada y en otras partes de la especificación.

El término "proteína de unión" como se usa en la presente incluye cualquier proteína de origen natural, recombinante, sintética, o I diséñada genéticamente, o una combinación de las mismas, que se une a un ant geno, proteína diana, o péptido, o un fragmento(s) de la misma. Las proteínas de unión de la invención pueden incluir anticuerpos, o derivarse de al menos un fragmento de anticuerpos. Las proteínas de unión pueden incluir proteínas de origen natural y/o proteínas que son diseñadas sintéticamente. Las' proteínas de unión de la invención se pueden unir a un antígeno o un fragmento del mismo para formar un complejo y provocar una respuesta biológica (por ejemplo, agonizar o antagonizar la actividad biológica en particular). Las proteínas de unión pueden incluir fragmentos de anticuerpos aislados, fragmentos "Fv", que consisten de las regiones variables de las j cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, moléculas de polipéptidos i ¡ mohocatenadas recombinantes en las que las regiones variables de cadena ligera y pesada están conectadas por un enlazador de péptido ("proteínas ¡ scF|V"), y las unidades de reconocimiento mínimo que consisten de los i I residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable. Los fragmentos de las ¡proteínas de unión también pueden incluir fragmentos funcionales de un anticuerpo, tal como, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab)2, Fe, Fd, Fd', Fv, y un i dominio de una sola variable de un anticuerpo (dAb). Las proteínas de unión pueden ser de cadena doble o simple, y pueden comprender un solo dominio i de unión o múltiples dominios de unión. j Las proteínas de unión también pueden incluir proteínas de unión de fusión del dominio de inmunoglobulina, incluyendo un polipéptido de donjiinio de unión que se funde o en contrario se conecta a una articulación de inmunoglobulina o polipéptido de región que actúa como articulación, que a su vezi se fusiona o en contrario se conecta a una región que comprende una o más regiones constantes nativas o diseñadas de una cadena pesada de inm'unoglobulina diferentes de CH1 , por ejemplo, las regiones CH2 y CH3 de IgG e IgA, o las regiones CH3 y CH4 de IgE (véase, por ejemplo, Ledbetter et al, Publicación de Patente de E.U.A. 2005/0136049, para una descripción más completa). La proteína de unión de fusión al dominio de inmunoglobulina puede incluir además una región que incluye un polipéptido de región constante de CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina nativa o diseñada (o CH3 en el caso de una construcción derivada en su totalidad o en parte de la IgE) que se fusiona o en contrario se conecta al polipéptido de la región articulada, y un polipéptido de región constante de CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina nativa o diseñada (o CH4 en el caso de una construcción derivada en su totalidad o en parte de la IgE) que se fusiona o en contrario se conecta con el polipéptido de región constante de CH2 (o CH3 en el caso de i una construcción derivada en su totalidad o en parte de la IgE). Por lo general, i dichas proteínas de unión de fusión al dominio de ¡nmunoglobulina son capaces de por lo menos una actividad inmunológica seleccionada del grupo que consiste de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fijación del complemento, y/o unión a una diana, por ejemplo, un antígeno diana. Las proteínas de unión de la invención se pueden derivar de cualquier especie, incluyendo pero no limitada a, ratón, humano, camello, llama, peces, tiburón, cabra, conejo, pollo y bovina.

El término "anticuerpo" como se usa en la presente se refiere a una ¡nmunoglobulina que es reactiva a una proteína o péptido diseñado o fragmento de la misma. Anticuerpos adecuados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos policlonales, anticuerpos poliespecíficos, anticuerpos no específicos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos i humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantes, anticuerpos híbridos, anticuerpos mutantes, anticuerpos conjugados injertados (es decir, anticuerpos conjugados o fusionados a otras proteínas, radiomarcas, i citotoxinas), y anticuerpos generados in vitro. El anticuerpo puede ser de cualquier clase de anticuerpos, incluyendo pero no limitado a, IgG, IgA, IgM, IgD, e IgE, y de cualquier subclase (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 y lgG4) de anticuerpos. El anticuerpo puede tener una región constante de cadena elegida de, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. Los anticuerpos también pueden tener una cadena ligera elegida de, por ejemplo, kappa (k) o lambda í (?). Los anticuerpos de la invención se pueden derivar de cualquier especie, incluyendo pero no limitado a, ratón, humano, camello, llama, peces, tiburón, cabra, conejo, pollo y bovino. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden ser alteradas, por ejemplo, mutadas, para modificar las propiedades de los anticuerpos (por ejemplo, para aumentar o disminuir uno o más de: unión al receptor Fe, glicosilación de anticuerpos, el número de residuos de cisteína, función de las células efectoras, o la función del complemento). Típicamente, el anticuerpo se une específicamente a un antígeno predeterminado, por ejemplo, un antígeno asociado a un trastorno, por i ejemplo, un trastorno inflamatorio, inmune, autoinmune, neurodegenerativo, metabólico y/o maligno.

; El término "proteína de unión de dominio simple" como se usa i aquí incluye cualquier andamio de unión de dominio simple que se une a un antígeno, proteína o polipéptido. Las proteínas de unión de dominio simple pueden incluir cualquier andamio de proteína natural, recombinante, sintética o diseñada genéticamente, o una combinación de los mismos, que se une a un antígeno o fragmento del mismo para formar un complejo y provocar una respuesta biológica (por ejemplo, agonizar, o antagonizar una actividad biológica particular). Las proteínas de unión de dominio simple pueden ser derivadas de proteínas o anticuerpos de origen natural, o pueden ser diseñados sintéticamente o producidos por tecnología recombinante. Las proteínas de unión de dominio simple puede ser cualquiera en la técnica o cualquier proteína de unión de dominio simple futura, y puede ser derivada de í cualquier especie, incluyendo pero no limitado a, ratón, humano, camello, llama, peces, tiburón, cabra, conejo, pollo y bovina. En algunas modalidades de ¡la invención, un andamio de proteína de unión de dominio simple se pueden derivar de una región variable de la inmunoglobulina que se encuentran en el pescado, tal como, por ejemplo, esa que se deriva del isotipo de inmunoglobulina conocido como Receptor del Antígeno Novel (NAR) que se encuentra en el suero de tiburón. Los métodos de producción de andamios de unión de dominio simple derivada de una región variable de NAR i ("IgNARs") se describen en la Publicación de la Solicitud Internacional No. WÓ 03/014161 y Streltsov (2005) Protein Sci 14 (1 1):2901-09. j En otras modalidades, una proteína de unión de dominio simple es una proteína de unión de dominio simple de origen natural que se ha descrito en la técnica como un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Dichas proteínas de unión de dominio simple se describen en,| por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Internacional No. WO 94/004678. Por razones de claridad, una proteína de unión de dominio ! variable que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadenas ligeras se conoce aquí como VHH o "nanocuerpos" para distinguirla del VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas.

Dicha molécula VHH se puede derivar de anticuerpos producidos en las especies Camelidae, por ejemplo, en camellos, llamas, dromedarios, alpacas y guanacos. También se pueden usar otras familias además de las Camelidae para producir proteínas de unión de cadena pesada naturalmente desprovistas de cadenas ligeras. Las moléculas VHH son aproximadamente diez veces más pequeñas que las moléculas IgG tradicionales. Son I polipéptidos simples y son muy estables, resisten condiciones de pH y temperatura extremas. Más aún, son resistentes a la acción de las proteasas, i que no es el caso de los anticuerpos convencionales. Además, la expresión in vitro de los VHH puede producir VHH de alto rendimiento, funcionales i plegados adecuadamente. Además, las proteínas de unión generadas en los Camélidos pueden reconocer epítopes distintos de esos reconocidos por los anticuerpos generados ¡n vitro a través de genotecas de anticuerpos a través I de j la inmunización de mamíferos distintos de los Camélidos (véase, por ejemplo, las Publicaciones de la Solicitud Internacional Nos. WO 97/049805 y I WÓ 94/004678, ambas se incorporan para referencia en la presente).

I Los términos "dominio de unión a un antígeno" y "fragmento de unión a un antigeno" se refieren a una parte de una proteína de unión que comprende los aminoácidos responsables de la unión específica entre la proteína de unión y un antígeno. La parte del antígeno que es reconocida específicamente, y unida por la proteína de unión es referida como el "estope". Un dominio de unión a un antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH) de un ¡anticuerpo, no obstante, no tiene que comprender ambas. Por ejemplo, los fragmentos Fd, tienen dos regiones VH y, a menudo conservan la función de unión a un antígeno del dominio intacto de unión a un antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión a un antígeno de una proteína de unión incluyen, pero no i i se limitan a: (1 ) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene dominios VL, VH, CL y CH1 ; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente qud tiene dos fragmentos Fab enlazados por un puente bisulfuro en la región I de articulación, (3) un fragmento Fd, que tiene dos dominios VH y un dominio CH1 ; (4) un fragmento Fv, que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (véase, por ejemplo, Ward et al (1989) Nature 341 :544-46, que tiene un dominio VH; (6) un dominio CDR aislado; y (7) un fragmento variable monocatenado (scFv). Aunque los dos dominios de i un fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, que pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite formarse como una cadena de proteína simple en la que las regiones L y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como i scFv) (véase, por ejemplo, Bird et al (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Estos fragmentos de dominio de unión pueden ser obtenidos mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se evalúan por su función de la misma manera que las proteínas de unión intactas, tales como, por ejemplo, los anticuerpos.

El término "neutralizar" se refiere a una proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma (por ejemplo, un anticuerpo) que, reduce o bloquea la actividad de una trayectoria de señalización o un antígeno, por ejemplo, la trayectoria de señalización IL-21/IL-21 R o antígeno IL-2 R. i i I I El término "cantidad efectiva" se refiere a una dosis o cantidad qu es suficiente para regular la actividad del IL-21 R para mejorar o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos o lograr un resultado biológico deseado, i por| ejemplo, una actividad disminuida de células T y/o de células B, la supresión de la autoinmunidad, la supresión del rechazo del trasplante.

¡ El término "proteína de unión humana" incluye las proteínas de unión que tienen regiones variables y constantes que corresponden sustancialmente a las secuencias de la inmunoglobulina de la linea germinal humana conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, esas descritas por Kabat et al. (5th ed. 1991) Sequences of Proteins of Inmmunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir los residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, las mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitios específicos in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en los CDR, y, en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones sustituidas por un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de la inmunoglobulina de la línea germinal humana.

Las frases "inhibir", "antagonizar", "bloquear" o "neutralizar" la actividad del IL-21 R y sus cognados se refieren a una reducción, inhibición, o en contrario la disminución de por lo menos una actividad del IL-21 R debido a la unión con un anticuerpo anti-IL-21 R, en donde la reducción es relativa a la actividad del IL-21 R en ausencia del mismo anticuerpo. La actividad del IL-21 R puede medirse usando cualquier técnica conocida en la técnica. La inhibición o el antagonismo no indica necesariamente una eliminación total de la jactividad biológica del IL-21 R. Una reducción en la actividad puede ser aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más.

Los términos "receptor de interleucina-21" o "IL-21 R" o similares se refieren a un receptor de la familia citocina clase I, también conocido como j MU-1 (véase, por ejemplo, La Solicitud de Patente de E.U.A. No. 09/569, 384 y las Publicaciones de las Solicitudes de E.U.A. Nos. 2004/0265960; 2006/0159655; 2006/0024268; y 2008/0241098), NILR o zalphal l (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Internacional No. WO 01/085792; Parrish-Novak et al (2000) supra; Ozaki et al (2000), supra), que se une a un ligando de la IL-21. El IL-21 R es homólogo a la cadena ß compartida de los I receptores IL-2 e IL-15, e IL-4a (Ozaki et al. (2000), supra). Con la unión del ligando, el IL-21 R es capaz de interactuar con una cadena del receptor de citócina gamma común (ye) y de inducir la fosforilación de STAT1 y STAT3 (Asao et al. (2001), supra) o STAT5 (Ozaki et al. (2000), supra). El IL-21 R muestra la distribución generalizada del tejido linfoide. Los términos "receptor de; la interleucina-21" o "IL-21 R" o similares se refieren también a un polipéptido (preferiblemente de origen mamífero, por ejemplo, IL-21 R murino o i humano) o, como lo requiera el contexto, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, que es capaz de interactuar con la IL-21 (preferiblemente la IL-21 de origen mamífero, por ejemplo, IL-21 de murino o humano) y tiene por lo menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido del IL-21 R mamífero de origen natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 2 (humano - que corresponde al Número de Acceso de GENBANK® (U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD) NP_068570) o SEQ ID NO:4 (murino - que corresponde al Número de Acceso de GENBANK® NP_068687), o un fragmento de la misma, (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a, por ejemplo, por lo menos 85%, 90% 95%, 98% o 99% de homología con, una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o un fragmento de la misma, (3) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos de IL-21 de mamíferos de origen natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 (humano - que i corresponde al Número de Acceso de GENBANK® NMJD21798) o SEQ ID NO: 3 (murino - que corresponde al Número de Acceso de GENBANK® NMi_021887) o un fragmento de la misma), (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente homologa a, por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de homología con una secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos i codificada por una secuencia de nucleótidos degenerada a una secuencia de nucleótidos de IL-21 R de origen natural o un fragmento de la misma, por i ejemplo, la SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 3, o un fragmento de la misma, o (6) una secuencia de nucleótidos que híbrida con una de las secuencias de nucíeótidos anteriores bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas. Además, están contemplados otros IL-21 R no humanos y no mamíferos como útiles en los métodos descritos.

El término "interleucina-2 " o "IL-21 " se refiere a una citocina que muestra una homología de secuencia a la IL-2, IL-4 e IL-15 (Parrish-Novak et al. (2000), supra), y se une a un IL-21 R. Estas citocinas comparten un pliegue conriún en una estructura de "paquete de cuatro hélices" que es representativa de lia familia. La IL-21 se expresa principalmente en las células CD4+ T activadas, y se ha informado que tiene efectos sobre células NK, B y T (Parrish-Novak et al. (2000), supra; Kasaian et al. (2002) supra). Con la unión de la IL-21 al IL-21 R, la activación del IL-21 R lleva a, por ejemplo, la señalización STAT5 o STAT3 (Ozaki et al. (2000), supra). El término "interleucina-21" o "IL-21" también se refiere a un polipéptido (preferiblemente de iorigen mamífero, por ejemplo, IL-21 de murino o humano), o según el contexto lo requiera, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, que es capaz de interactuar con el IL-21 R (preferiblemente de origen mamífero, por ejemplo, IL-21 R de murino o humano) y tiene por lo menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de una IL-21 de mamíferos de origen natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 212 (humano), o un fragmento de la misma, (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente I homologa a, por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de homología con una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 212, o un fragmento de la misma, (3) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos de IL-21 de mamíferos de origen natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 211 (humano), I o un fragmento de la misma), (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente homologa a, por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de homología con una seóuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 211 o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos degenerada de una secuencia de nucleótidos de IL-21 de origen natural o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que i híbrida con una de las secuencias de nucleótidos anteriores bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas.

¡ Los términos "actividad del IL-21 R" y similares (por ejemplo, i "actividad del IL-21 R", "actividad IL-21/IL-21R") se refieren a por lo menos un proceso celular iniciado o interrumpido como resultado de la unión al IL-21 R. Las actividades del IL-21 R incluyen, pero no se limitan a: (1) la interacción con, por ejemplo, la unión a un ligando, por ejemplo, un polipéptido de IL-21 , (2), o asociarse con, o activar la transducción de señales (también llamado i "señalización," que se refiere a la cascada intracelular que ocurre en respuesta a un estímulo particular) y moléculas de transducción de señal (por ejemplo, la cadena gamma (ye) y JAK1), y/o estimular la fosforilación y/o activación de las proteínas STAT, por ejemplo, STAT5 y/o STAT3, y (3) la modulación de la proliferación, diferenciación, la función de células efectoras, actividad citolítica, la secreción de citocinas y/o la supervivencia de las células i inmunes, por ejemplo, células T, células NK, células B, macrófagos, células T reguladoras (Tregs) y megacariocitos.

' Como se usa aquí, "anticuerpos generados in vitro" se refiere a un ¡anticuerpo en el que toda o parte de la región variable (por ejemplo, por lo I menos un CDR) se genera en una selección de células no inmunes (por ejemplo, un despliegue de fagos in vitro, microplaqueta de proteína, o cualquier otro método en el que las secuencias candidatas puedan probarse por su capacidad para unirse a un antígeno). i El término "aislado" se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas de la fuente de , células o tejido de la que se derivó. El término también se refiere a las preparaciones en donde la proteína aislada es lo suficientemente pura para las composiciones farmacéuticas, o por lo menos 70-80% (p/p) pura, por lo menos 80-90% (p/p) pura, por lo menos 90 a 95 % (p/p) pura, o por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% (p/p) pura.

La frase "por ciento idéntico" o "porcentaje de identidad" se refiere a la similitud entre por lo menos dos secuencias diferentes. Este porcentaje de identidad puede ser determinado por algoritmos de alineación estándar, por ejemplo, la Basic Local Alignment Search Tool (herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST-por sus siglas en inglés) descrita por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403-10); el algoritmo de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-53.), o el algoritmo de Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17). Un conjunto de parámetros puede ser la matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización de brecha de 12, una I penalización de brecha extendida de 4, y una penalización de brecha por cambio en el marco de lectura de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos también se puede determinar mediante el algoritmo de Meyers y Miller ((1989) CABIOS 4:11-17), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), con un cuadro de residuos de !peso PAM120, una penalización por longitud de la brecha de 12, y una penalización de brecha de 4. El porcentaje de identidad suele calcularse mecliante la comparación de secuencias de longitud similar.

El término "repertorio" se refiere a por lo menos una secuencia de ¡nucleótidos derivada total o parcialmente de una secuencia que codifica por lo menos una por lo menos una ¡nmunoglobulina. La secuencia(s) puede I ' ser! generada por reordenamiento in vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas, y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Como alternativa, la secuencia(s) puede ser generada a partir de una célula en respuesta a lo cual se produce la reorganización, por ejemplo, estimulación in vitrb. Como alternativa, una parte o la totalidad de la secuencia(s) puede ser i obtenida por corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis, u otros métodos (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,565,332). Un repertorio puede incluir sólo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo unas en una colección genéticamente diversa.

' Los términos "unión específica", "se une específicamente," y similares se refieren a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una moderada a baja capacidad a diferencia de la unión no específica, que generalmente tiene una baja afinidad con una capacidad moderada a alta. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de asociación Ka es mayor que aproximadamente 106 M'V1. Si es necesario, la unión no específica se puede reducir sin afectar sustancialmente a la unión específica al variar las condiciones de unión. La condiciones de unión adecuadas, tales como la concentración de la proteína de unión, la fuerza iónica de la solución, la temperatura, el tiempo permitido para la unión, la concentración de un agente de s bloqueo (por ejemplo, albúmina de suero o caseína de leche), etc, se pueden mejorar por un experto usando técnicas de rutina. En la presente se establecen condiciones ilustrativas, pero otras condiciones conocidas por la persona con conocimientos ordinarios en la técnica can dentro del alcance de esta invención.

Como se usa aquí, los términos "riguroso," "rigurosidad," y similares describen las condiciones para la hibridación y el lavado. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden ser usados como ¡ sondas y cebadores de hibridación para identificar y aislar ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas o similares a ésas que codifican los polinucleótidos descritos. Por lo tanto, los polinucleótidos aislados de este modo pueden ser usados producir proteínas de unión contra IL-21 R o identificar a células que expresan dichas proteínas de unión. Los métodos de hibridación para identificar y aislar los ácidos nucleicos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las hibridaciones Southern, hibridación in situ e hibridación Northern, y son bien conocidas por los expertos en la técnica.

! Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de rigurosidad diferente. La rigurosidad de una reacción de í hibridación incluye la dificultad con la cual cualesquiera dos moléculas de ácido nucleico se hibridarán a otra y las condiciones bajo las cuales i permanecerán hibridadas. Preferiblemente, cada polinucleótido de hibridación híbrida a su polinucleótido correspondiente bajo condiciones de rigurosidad i reducida, más preferiblemente condiciones rigurosas, y más preferiblemente condiciones altamente rigurosas. Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, Current Prdjtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989) 6.3.1-6.3.6.

En esta referencia se describen tanto los métodos acuosos como no acuosos, y cualquiera puede ser usado. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) I aproximadamente a 45 °C, seguido por lo menos por un lavado en SSC0.2X /SdS al 0.1 % a 50 °C. Las condiciones de hibridación rigurosas también se consiguen con lavado(s) en, por ejemplo, SSC0.2X /SDS al 0.1 % a 55 °C, 60 i I °C, p 65 °C. Las condiciones altamente rigurosas incluyen, por ejemplo, la hibridación en fosfato de sodio 0.5M/ SDS al 7% a 65 °C, seguido por lo menos por un lavado en SSC 0.2X/SDS al 1% a 65 °C. Otros ejemplos de condiciones rigurosas se muestran en el Cuadro 1 siguiente: las condiciones altamente rigurosas son esas que son por lo menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones rigurosas son por lo menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de rigurosidad reducida son por lo menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones M-R.

CUADRO 1 Condiciones de Hibridación Condición Híbrido Longitud Temperatura y temperatura del Híbrido amortiguador de y (bp)1 hibridación2 amortiguador de lavado A | ADN:ADN >50 65 °C: SSC 1X ó 42 65 °C¡ SSC °C; 1X SSC, 0.3X formamida 50% B I ADN:ADN <50 TB*; SSC 1X TB*; SSC 1X C ! ADN:ARN >50 65 °C: SSC 1X ó 42 65 °C; SSC °C; 1X SSC, 0.3X formamida 50% D ¡ ADN:ARN <50 TD*¡ SSC 1X TD*; SSC 1X E ARN:ARN <50 70 °C: SSC 1X ó 50 70 °C; SSC °C; 1X SSC, 0.3X formamida 50% F ARN:ARN <50 TF*; SSC 1X TF*; SSC 1X G ADN:ADN >50 65 °C: SSC 4X ó 42 65 °C; SSC °C; 4X SSC, 1X formamida 50% H ADN:ADN <50 TH*; SSC 4X TH*; SSC 4X I i ADN:ARN >50 67 °C: SSC 4X ó 45 67 °C; SSC °C; 4X SSC, 1X I formamida 50% J ! ADN:ARN <50 T ; SSC 4X Tj*; SSC 4X ARN:ARN >50 70 °C: SSC 4X ó 50 67 °C; SSC í I °C; 4X SSC, 1X formamida 50% L ARN:ARN <50 T|_*; SSC 2X TL*; SSC 2X M ADN:ADN >50 50 °C: SSC 4X ó 40 50 °C; SSC j °C; 6X SSC, 2X formamida 50% N ADN:ADN <50 TN*; SSC 6X TV; SSC 6X O ADN:ARN >50 55 °C: SSC 4X ó 42 55 °C; SSC °C; 6X SSC, 2X formamida 50% P ADN:ARN <50 TP*; SSC 6X TP*; SSC 6X Q ARN:ARN >50 60 °C: SSC 4X ó 45 60 °C; SSC °C; 6X SSC, 2X formamida 50% R : ARN:ARN <50 TR*; SSC 4X TR*; SSC 4X ; 1La longitud híbrida es ésa anticipada para la región(es) hibridada de los polinucleótidos hibridantes. Al hibridar un polinucleótido a un polinucleótido diana de secuencia desconocida, la longitud híbrida se asume siendo esa del polinucleótido hibridante. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida son hibridados, la longitud híbrida puede ser determinada por! alineación de las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o las regiones de complementariedad de la secuencia óptima. ! 2SSPE (IxSSPE es NaCI 0.15M, NaH2P04 10mM, y EDTA 1.25mM, pH 7.4) puede ser sustituido por SSC (IxSSC es NaCI 0.15M y citrato de ¡sodio 15mM) en los amortiguadores de hibridación y lavado; los lavados son realizados por 15 minutos después de completar la hibridación.

! TB* - TR*: La temperatura de hibridación para los híbridos anticipados siendo menores de 50 pares de bases en longitud debe ser 5-10 °C ¡ menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para los híbridos menores de 18 pares de bases en longitud, Tm (°C) = 2 (# de bases A + T) + 4 (# de bases G + C). Para los híbridos entre 18 y 49 pares de bases en longitud, Tm (°C) = 81.5 + 16.6 (log10Na+) + 0.41 (%G + C) - (600/N), donde N es él número de bases en el híbrido, y Na+ es la concentración de iones sodio en el amortiguador de la hibridación (Na+ para IX SSC = 0.165 M).

Ejemplos adicionales de las condiciones rigurosas para la hibridación del polinucleótido se proveen en Sambrook el al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 & 1 1 , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995), incorporados aquí para referencia.

! Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden ser i usados como sondas y cebadores de hibridación para identificar y para aislar ADN que tiene secuencias que codifican variantes alélicas de los polinucleótidos descritos. Las variantes alélicas son formas alternativas de j origen natural de los polinucleótidos descritos que codifican a polipéptidos que son idénticos o que tienen una similitud significativa con los polipéptidos codificados por los polinucleótidos descritos. Preferiblemente, las variantes alélicas tienen por lo menos aproximadamente 90% de identidad de la I secuencia (preferiblemente, por lo menos aproximadamente 95% de identidad; más preferiblemente por lo menos aproximadamente 99% de identidad) con los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden también ser usados como las sondas y cebadores de hibridación para identificar y para aislar ADN que tiene secuencias que codifican polipéptidos homólogos a los polinucleótidos descritos. Estos homólogos son polinucleótidos y polipéptidos aislados de una especie diferente que esa de los polipéptidos y polinucleótidos descritos, o dentro de la misma especie, pero con similitud significativa de la secuencia a los polinucleótidos y polipéptidos descritos. Preferiblemente, los homólogos del polinucleótido tienen por lo menos aproximadamente 50% de identidad de secuencia (preferiblemente, por lo menos aproximadamente 75% de i identidad; más preferiblemente, por lo menos aproximadamente 90% de identidad) con los polinucleótidos descritos, mientras que los homólogos del polipéptido tienen por lo menos aproximadamente 30% de identidad de i secuencia (preferiblemente, por lo menos aproximadamente 45% de identidad; más preferiblemente, por lo menos aproximadamente 60% de identidad) con las proteínas de unión/polipéptidos descritos. Preferiblemente, los homólogos de los polinucleótidos y polipéptidos descritos son ésos aislados de especies de mamíferos. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden además ser usados como sondas y cebadores de hibridación para identificar las células y los tejidos que expresan las proteínas de¦ unión de la presente invención y las condiciones bajo las cuales se expresan. i ; Las frases "substancialmente como se establece," "substancialmente idéntico," y "substancialmente homólogo" significan que la i secuencia de aminoácidos o nucleótidos relevante (por ejemplo, los CDR, los dominios VH, o VL) serán idénticas a, o tendrán diferencias no substanciales (por ejemplo, a través de sustituciones de aminoácidos conservados) en corhparación con las secuencias que se establecen. Las diferencias no substanciales incluyen pequeños cambios de aminoácidos, tales como una o dos sustituciones en una secuencia de cinco aminoácidos de una región especificada. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene por lo menos aproximadamente 50% de la afinidad del primer anticuerpo.

I Las secuencias substancialmente idénticas u homologas a las i secuencias descritas aquí también son parte de esta solicitud. En algunas modalidades, la identidad de la secuencia puede ser aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor. Como alternativa, la identidad sustancial u homología existe cuando los segmentos del ácido nucleico se hibridarán bajo condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente rigurosas), al complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o substancialmente pura.

El término "agente terapéutico" o similares es una sustancia que trata o ayuda en el tratamiento de un trastorno médico o los síntomas del mismo. Los agentes terapéuticos pueden incluir, pero no se limitan a, las sustancias que modulan las células inmunes o las respuestas inmunes de una forma que complementa el uso de las proteínas de unión anti-IL-21 R. En una modalidad de la invención, un agente terapéutico es un anticuerpo terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 R. En otra modalidad de la invención, un agente terapéutico es una proteína de unión terapéutica, por ejemplo, un nanocuerpo anti-IL-21 R. Ejemplos no limitativos y usos de los agentes terapéuticos se describen aquí.

Como se usa aquí, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una proteína de unión anti-IL-21 R (por ejemplo, un anticuerpo) se refiere a una cantidad de la proteína de unión que es efectiva, con la administración de una o varias dosis a un sujeto (tal como un paciente humano) para trunión, prevenir, curar, retardar, reducir la gravedad de, y/o mejorar por lo menos un síntoma de un trastorno o de un trastorno que se repite, o prolongar la supervivencia del sujeto más allá de lo esperado en la ausencia de dicho tratamiento.

, Proteínas de Unión Anti-IL-2 R La descripción de la presente solicitud provee proteínas de unión anti-IL-21 R novedosas que comprenden fragmentos novedosos de unión a un ¡ antígeno. Numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica están disponibles para obtener las proteínas de unión o fragmentos de unión a un antígeno de las mismas. Por ejemplo, las proteínas de unión anti-IL-21 R que comprenden anticuerpos pueden producirse usando métodos recombinantes de i ADN (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir por la generación de hibridomas de acuerdo con métodos conocidos (véase, por ejemplo, Kohler y Milsteín (1975) Nature 256:495-99). Los hibridomas formados de esta manera luego se examinan usando métodos estándar, tales como ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzima (ELISA) y análisis de resonancia del plasmón de superficie (BIACORE™) para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno particular. Cualquier forma del antígeno especificado puede ser usado como el inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas de origen natural, j I cualesquiera variantes o fragmentos de los mismos, y péptidos antigénicos de los mismos. i Un método de ejemplo para formar las proteínas de unión que i comprenden anticuerpos incluye examinar las genotecas de expresión de la proteína, por ejemplo, genotecas de despliegue de fagos o ribosomas. El despliegue del fago se describe, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-17; Clackson et al., (1991) Nature 352:624-28; Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581 - 97; y las Publicaciones de | las Solicitudes Internacionales No. WO 92/018619; WO 91/017271 ; WO 92/020791 ; WO 92/015679; WO 93/001288; WO 92/001047; WO 92/009690; y WÓ 90/002809.

I Además del uso de las genotecas de despliegue, el antígeno i especificado puede ser usado para inmunizar un animal no humano, por ejemplo, un mono cynomolgus, un pollo, o un roedor (por ejemplo, un ratón, un jhámster, o una rata). En una modalidad, el animal no humano incluye por lo menos una parte de un gen de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos del ratón con grandes fragmentos de loci Ig humano. Usando la tecnología del ! hibridoma, las proteínas de unión monoclonales específicas del antígeno, tales como anticuerpos, derivados de los genes con la especificidad deseada i pueden ser producidos y seleccionados (véase, por ejemplo, XENOMOUSE™ i (Arhgen Inc., Thousand Oaks, CA); Green et al., (1994) Nat. Genet. 7:13-21 ; ? Patente de E.U.A. No. 7,064,244; y la Publicación de la Solicitud Internacional No: WO 96/034096 y WO 96/033735). j En una modalidad de la invención, las proteínas de unión son un anticuerpo monoclonal que se obtiene de un animal no humano, y luego se modifican (por ejemplo, humanizado, desinmunizado, o quimérico) usando las técnicas recombinantes de ADN conocidas en la técnica. Ha sido descrita una variedad de aproximaciones para formar anticuerpos quiméricos (véase, por ejemplo, Morrison et al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 (21): 6851-55; Takeda et al., (1985) Nature 314(6010): 452-54; Patente de E.U.A. No. i 4,816,567 y 4,816,397; Publicación de la Solicitud Europea No. EP 0 171 496 y EP 0 173 494; y Patente del Reino Unido No. GB 2 177 096). Las proteínas de j unión humanizadas también se pueden producir, por ejemplo, con los ratones transgénicos que expresan los genes de cadena pesada y ligera humanos, pero no son capaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina endógena del ratón. Winter (Patente de E.U.A. i No: 5,225,539) describe un método para injertar CDR de ejemplo que puede ser usado para preparar las proteínas de unión humanizadas descritas aquí. i Tocios los CDR de una proteína de unión humana particular se pueden sustituir con por lo menos una porción de un CDR no humano, o solamente algunos CDR se pueden sustituir con CDR no humanos. Es solamente necesario sustituir al número de CDR requerido para la unión de la proteína de unión humanizada a un antígeno predeterminado.

Las proteínas de unión humanizadas o fragmentos de las mismas se pueden generar por secuencias de reemplazo del dominio variable Fv que no están directamente implicadas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de los dominios variables Fv humanos. Métodos de i ejemplo para generar proteínas de unión humanizadas o fragmentos de las mismas se proveen por, por ejemplo, Morrison (1985) Science 229:1202-07; Oi et al., (1986) BioTechniques 4:214; y la Patente de E.U.A. No. 5,585,089; 5,6^93,761 ; 5,693,762; 5,859,205; y 6,407,213. Esos métodos incluyen aislar, manipular, y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todos o parjte de los dominios variables Fv de la inmunoglobulina desde por lo menos una de la cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos se pueden obtener de ¡un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se describió anteriormente, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizada puede entonces ser clonada en un vector de expresión apropiado.

En ciertas modalidades, una proteína de unión humanizada es mejorada por la introducción de sustituciones conservadoras, de sustituciones de la secuencia de consenso, de sustituciones de la línea germinal y/o de contra-mutaciones. Dichas moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden formarse por cualesquiera de numerosas técnicas conocidas en la técnica, (véase, por ejemplo, Teng et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:7308-73 Kozbor et al., (1983) Immunol. Today 4:7279; Olsson et al., (1982) Meth. i Enzymol. 92:3-16); Publicación de la Solicitud Internacional No. WO 92/006193; y Patente Europea No. EP 0 239 400).

Una proteína de unión o un fragmento de la misma se puede también modificar por la deleción específica de los epítopes de las células T humanas o "desinmunización" por los métodos descritos en, por ejemplo, las Publicaciones de las Solicitudes Internacionales No. WO 98/052976 y WO 00/?34317. Brevemente, los dominios variables de la cadena pesada y ligera de una proteína de unión (tal como, por ejemplo, una proteína de unión derivada de un anticuerpo) se pueden analizar para los péptidos que se unen a la MHC clase II; estos péptidos representan epítopes potenciales de las células T (como se define en, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Internacional No. WO 98/052976 y WO 00/034317). Para la detección de epítopes potenciales de las células T, puede aplicarse una aproximación modelada por computadora denominada "enroscamiento de péptido" y además puede buscarse en las bases de datos de los péptidos de unión de MGH clase II humano para los motifs presentes en las secuencias de VH y V|_, como se describe en las Publicaciones de las Solicitudes Internacionales No.

WO 98/052976 y WO 00/034317. Estos motifs se unen a cualquiera de los 18 principales alotipos DR Clase II de MHC y por lo tanto, constituyen epítopes potenciales de las células T. Los epítopes potenciales de las células T pueden eliminarse al sustituir pequeños números de residuos de aminoácidos en los dominios variables o por sustituciones de un solo aminoácido. Típicamente, se hacen sustituciones conservadoras. A menudo, pero no exclusivamente, i i puéde usarse un aminoácido común a una posición en secuencias de anticuerpo de línea germinal humana. Las secuencias de línea germinal i humana se describen, por ejemplo, en Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:776-98; Cook et al., (1995) Immunol. Today 16(5): 237-42; Chothia et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al., (1995) EMBO J. 14:4628 -38.j El directorio V BASE provee un directorio completo de las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana (compiladas por Tomlinson et al., | MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, UK). Estas secuencias vanantes alélicas y las formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores de Fe son revisados en, por ejemplo, Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-92; Capel et al. (1994) Immunomethods 4:25 - 34; y de Haas et al., (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330 - 41 Para las técnicas adicionales de producción de la proteína de i unión/anticuerpo, véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Harlow et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory. La presente invención no es necesariamente limitada a ninguna fuente particular, método de producción, u otra característica especial de una proteína de unión o de un anticuerpo.

Las proteínas de unión que comprenden anticuerpos i (inmúnoglobulinas) son típicamente proteínas glicosiladas tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. En los anticuerpos pueden encontrarse dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda (?) y kappa (?). Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmúnoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales: A, D, E, G, y M, y muchas de éstas pueden ser divididas además en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 , e lgA2. Cada cadena ligera incluye un dominio variable (V) de la N-terminal (VL) y un dominio constante (C) (C|_).

Cada cadena pesada incluye un dominio V de la N-terminal (VH), tres o cuatro domihios C (CHs), y una región de articulación. El dominio CH más próximo a VH se designa como CH1. LOS dominios VH y VL consisten en cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas denomindas regiones estructurales (FR1 , FR2, FR3, y FR4) esa forman un andamio para tres regiones de secuencias hipervariables, denominadas CDR. Los CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Los CDR son referidos como CDR1 , CDR2, y CDR3. Los CDR constituyentes en la cadena pesada son referidos como H1 , H2, y H3 (tarjnbién referidos aquí como CDR H1 , CDR H2, y CDR H3, respectivamente), mientras que los CDR constituyentes en la cadena ligera son referidos como Ll, lL2, y L3 (también referidos aquí como CDR L1 , CDR L2, y CDR L3, respectivamente). i El CDR3 es típicamente la fuente más grande de diversidad molecular dentro del sitio de unión a un antígeno. El CDR H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácidos o mayor que 26 aminoácidos. Las estructuras de la subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase, por ejemplo, a Harlow et al., (1988) supra. Un experto en la técnica reconocerá que cada estructura de la subunidad, por ejemplo, una estructura CHÍ VH, CL, VL, CDR, y/o FR, comprende fragmentos activos, por ejemplo, la porción de la subunidad de VH, VL, o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento de unión a un antígeno, o, por ejemplo, la porción de la subunidad CH que se une a, y/o activa, por ejemplo, un receptor y/o un complemento de ¡ i I Fe. El CDR se refiere típicamente a los CDR de Kabat (como se describió en Kabat et al., (1991) supra). Otro estándar para la caracterización del sitio de unión a un antígeno es referirse a los bucles hipervariables como se describe en, por ejemplo, Chothia et al., (1992) supra y Tomlinson et al., (1995) supra.

Aún otro estándar es la definición del "AbM" usada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (véase, generalmente, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains in: Antibody Engineering (2001 ) Duebel and Kontermann eds., Springer-Verlag, Heidelberg). Las modalidades descritas con respecto a los CDR de Kabat se pueden implementar alternativamente usando relaciones descritas similares con respecto a los bucles hipervariables de Chothia o a los bucles definidos de AbM.

El fragmento de Fab consiste en los dominios VH-CH1 y dominios VL-C|_ enlazados covalentemente por un enlace bisulfuro entre las regiones constantes. El fragmento Fv es más pequeño y consiste en los dominios VH y VL no covalentemente enlazados. Para superar la tendencia de disociación de los dominios no covalentemente enlazados, puede construirse un scFv. El scFy contiene un polipéptido flexible que enlaza (1) el C-terminal del VH al N- terminal del VL, o (2) el C-terminal del VL al N-terminal del VH. Un péptido 15- mer (Gly4Ser)3, por ejemplo, puedan ser usado como enlazador, pero se conocen otros enlazadores en la técnica.

! La secuencia de genes del anticuerpo después del ensamble y I de ¡a mutación somática varía en gran medida, y se estima que éstos genes variados codifican 1010 diferentes moléculas de anticuerpo (Immunoglobulin Genes (2nd ed. 1995) Jonio et al., eds. Academic Press, San Diego, CA).

| En ciertas modalidades de la invención, la proteína de unión es una proteína de unión de un solo dominio. Las proteínas de unión de un solo dominio incluyen las proteínas de unión en donde los CDR son parte de un polipéptido de un solo dominio. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, las proteínas de unión de cadena pesada, las proteínas de unión que están naturalmente desprovistas de cadenas ligeras, proteínas de unión de un solo dominio derivadas de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas, proteínas de unión diseñadas, y andamios de proteína de unión de un solo dominio diferentes de ésas derivadas de anticuerpos. Las proteínas de unión de 'un solo dominio incluyen cualquiera conocida en la técnica, así como cualesquiera proteínas de unión de un solo dominio por determinar o conocer en el futuro.

Las proteínas de unión de un solo dominio se pueden derivar de cualquier especie incluyendo, pero no limitada a, ratón, humano, camello, llama, pez, tiburón, cabra, conejo, pollo, y bovino. En un aspecto de la invención, la proteína de unión de un solo dominio puede derivarse de una región variable de la inmunoglobulina encontrada en peces, tal como, por ejemplo, esa que se deriva del isotipo de la inmunoglobulina conocido como Receptor del Antígeno Novel (NAR) encontrado en el suero del tiburón. Los métodos para producir proteínas de unión de un solo dominio derivadas de uná región variable de NAR (las IgNAR) se describen en, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Internacional. WO 03/014161 y Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-09. Las proteínas de unión de un solo dominio también incluyen las proteínas de unión de un solo dominio de origen natural conocidas en la técnica como anticuerpos de cadena pesada desprovistos de cadenas ligeras. El dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovista de una cadena ligera se conoce aquí como un VHH, o un nanocuerpo, para distinguirlo del VH convencional de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula de VHH se puede derivar de los anticuerpos cultivados en las especies de Camelidae, por ejemplo, en camellos, llamas, dromedarios, alpacas, y guanacos, y es a veces llamado un dominio variable de camélido o camelizado (véase, por ejemplo, MuyJdermans (2001) J. Biotechnol. 74(4): 277-302, incorporado aquí para referencia). Otras especies además de ésas en la familia de Camelidae i pueden también producir las proteínas de unión de cadena pesada naturalmente desprovistas de cadenas ligeras. Las moléculas de VHH son aproximadamente diez vez más pequeñas que las moléculas de IgG. Son polipéptidos simples y son muy estables, resistiendo condiciones extremas de pH y temperatura. Más aún, son resistentes a las acciones de las proteasas, lo que no es el caso para los anticuerpos convencionales. Además, la expresión in vitro de los VHH puede producir VHH de alto rendimiento, funcionales correctamente plegados. Además, las proteínas de unión generadas en los camélidos reconocen epítopes diferentes de ésos reconocidos por los anticuerpos generados in vitro vía las genotecas de i anticuerpos o vía inmunización de mamíferos diferentes de camélidos (véase, por¡ ejemplo, las Publicaciones de las Solicitudes Internacionales No. WO 97/049805 y WO 94/004678, que son incorporadas aquí para referencia).

: Una proteína de unión "biespecífica" o "bifuncional" es una proteína de unión híbrida artificial que tiene dos diferentes pares de cadenas pesadas/ligeras y dos diferentes sitios de unión. Las proteínas de unión i biespecíficas pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo la fusión de hibridomas o el enlace de los fragmentos Fab (véase, por ejemplo, a So gsivilai and Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:3 5-21 ; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148:1547-53). En una modalidad, la proteína de unión biespecífica comprende un primer polipéptido del dominio de unión, tal como un fragmento Fab', enlazado vía una región constante de la inmunoglobulína a un segundo polipéptido del dominio de unión.

' Otra proteína de unión de acuerdo con la invención puede comprender, por ejemplo, una proteína de unión de fusión al dominio de la inmunoglobulína que incluye un polipéptido del dominio de unión que se fusiona o de otra manera se conecta a una polipéptido de la región de articulación de la inmunoglobulína o que actúa como articulación, que a su vez se fusiona o de otra manera se conecta a una región que comprende una o más regiones constantes nativas o diseñadas de una cadena pesada de inmunoglobulína, diferente de CH , por ejemplo, las regiones CH2 y CH3 de IgG e lgA1 o las regiones de CH3 y CH4 de IgE (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2005/0136049, que se incorpora aquí I I para referencia, para una descripción más completa). La proteína de unión de fusión al dominio de la inmunoglobulina puede incluir además una región que incluye un polipéptido de la región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina nativa o diseñada (o CH3 en el caso de una construcción derivada total o parcialmente de IgE) que se fusiona o de otra manera se conecta al polipéptido de la región constante CR3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina nativa o diseñada (o a CH4 en el caso de una construcción derivada total o parcialmente de IgE) que se fusiona o de otra manera se conecta al polipéptido de la región constante CH2 (o CH3 en el caso de una construcción derivada total o parcialmente de IgE). Típicamente, dichas proteínas de unión de fusión al dominio de la inmunoglobulina son capaces de por lo menos una actividad inmunologica seleccionada del grupo que consiste Í de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), la fijación del complemento, y/o la unión a una diana, por ejemplo, un antígeno diana, tal como IL-21 R humano. i Las proteínas de unión de la invención también pueden comprenden imitaciones del péptido. Las imitaciones del péptido son moléculas que contienen péptidos que imitan elementos de la estructura secúndaria de la proteína (véase, por ejemplo, Johnson et al., Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy (1993) Pezzuto et al., Chapman and Hall,! New York, incorporada aquí para referencia en su totalidad). La razón subyacente al uso del imitaciones del péptido es que la cadena principal del péptjdo de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas i i laterales de los aminoácido a fin de facilitar las interacciones moleculares, tales como ésas entre anticuerpos y antígenos. Se espera que una imitación de péptido permita interacciones moleculares similares a la molécula natural.

Estbs principios pueden ser usados para diseñar moléculas de segunda generación que tienen muchas de las propiedades naturales de los péptidos dirigidos descritos aquí, pero con características alteradas y potencialmente mejoradas.

Otras modalidades de las proteínas de unión útiles para practicar I la j invención incluyen las proteínas de fusión. Estas moléculas tienen generalmente todo o un parte sustancial de un péptido dirigido, por ejemplo, IL-21R o un anticuerpo anti-IL-21 R, enlazado a N- o C-terminal, a todo o una porción del segundo polipéptido o proteína. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden emplear secuencias líder (o señal) de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un huésped heterólogo. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, o las secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos, de las proteínas de unión y fragmentos de unión a un antígeno de las mismas de la presente invención qué comprenden una secuencia líder (o señal) se pueden seleccionar SEQ ID NOs: 87-109 y 239-248. Otra fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítope de la proteína de unión, para fadilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de disociación en o próximo al punto de unión de la fusión facilitará la eliminación del polipéptido extraño después de la purificación. Otras fusiones útiles i incluyen el enlace de dominios funcionales, tales como sitios activos de las i enzimas, dominios del glicosilación, señales celulares dirigidas, o regiones de tranismembrana. Ejemplos de proteínas o péptidos que se pueden incorporar en una proteína de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas cito^státicas, proteínas citocidales, agentes pro-apoptosis, agentes anti- angiogénicos, hormonas, citocinas, factores de crecimiento, fármacos de péptido, anticuerpos, fragmentos Fab de anticuerpos, antígenos, proteínas receptoras, enzimas, lectinas, proteínas de MHC, proteínas de la adhesión celular, y las proteínas de unión. Los métodos para generar las proteínas de fusijón son bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichas proteínas pueden producirse, por ejemplo, por fijación química usando reactivos bifujncionales de entrelazamiento, por la síntesis de "de novo" de la proteína de fusión completa, o por la fijación de una secuencia de ADN que codifica al péptido dirigido a una secuencia de ADN que codifica al segundo péptido o proteína, seguido por la expresión de la proteína de fusión intacta.

En una modalidad, el péptido dirigido, por ejemplo, IL-21 R, es i fusibnado con una región constante de la cadena pesada de la inm'unoglobulina, tal como un fragmento Fe, que contiene dos dominios de la región constante y una región de articulación, pero carece de la región í variable (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 6,018,026 y 5,750,375, incorporadas aquí para referencia). La región de Fe puede ser una región de Fe de origen natural, o se puede alterar para mejorar determinadas cualidades, por ejemplo, cualidades terapéuticas, tiempo de circulación, agregación reducida. Los péptidos y las proteínas fusionados a una región Fe exhiben típicamente una vida media mayor in vivo en comparación con la contrapartida sin fusionar. Además, una fusión a una región Fe permite la dimerización/multimehzación del polipéptido de fusión.

Un aspecto de la presente invención comprende las proteínas de unión y los fragmentos de unión a un antígeno de las mismas que se unen al IL-21R. La descripción provee CDR novedosos que han sido derivados de las i genotecas de la inmunoglobulina humana. La estructura de la proteína que es generalmente usada para portar un CDR es una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una porción del mismo, en donde el CDR se localiza en una región asociada con un CDR de origen natural. Las estructuras y posiciones dé los dominios variables se pueden determinar como se describe en Kabat et al.,; ((1991) supra).

Modalidades ilustrativas de las proteínas de unión (y de los fragmentos de unión a un antígeno de las mismas) de la invención son identificadas como AbA-AbZ, H3-H6, L1-L6, L8-L21 , y L23-L25. El ADN y las secuencias de aminoácidos de las modalidades ilustrativas no limitativas de i las proteínas de unión anti-IL-21 R de la invención se establecen en SEQ ID Nos.: 5-195, 213-229, y 239-248. El ADN y las secuencias de aminoácidos de algunas modalidades ilustrativas de las proteínas de unión anti-IL-21 R de la invención, incluyendo sus fragmentos scFv, los dominios VH y V|_, y los CDR, así como sus códigos presentes y designaciones previas, se establecen en las FIGs. 17A-25C, y los Cuadros 2A y 2B.

CUADRO 2A Correlación de los Códigos Presentes del Anticuerpo y de las Designaciones Previas , CUADRO 2B Secuencias de Aminoácidos v Nucleotidos de Dominios de VH v VL. de scFv. y de CDR de las Proteínas de Unión Ilustrativas de la Invención CUADRO 2B (Continuación) REGIÓN TIPO L2 SEQ L3 SEQ L4 SEQ L5 SEQ L6 SEQ ID ID ID ID ID VH AA NO:6 NO:6 NO:6 NO:6 NO:6 VL AA NO:24 NO:26 NO:28 NO:30 NO:32 scFv AA NO:120 NO:122 NO: 124 NO:126 NO:128 CDR H1 AA NO:163 NO:163 NO:163 NO:163 NO:163 CDR H2 AA NO:164 NO: 164 NO: 164 NO: 164 NO:164 CDR H3 AA NO:169 NO:169 NO:169 NO:169 NO:169 CDR L1 AA NO: 194 NO: 194 NO: 194 NO: 194 NO:194 CDR L2 AA NO:195 NO:195 NO:195 NO:195 NO:195 CDR L3 AA NO:172 NO:173 NO: 174 NO:175 NO:176 VH ADN NO:5 NO:5 NO:5 NO:5 NO:5 VL ADN NO: 23 NO: 25 NO: 27 NO: 29 NO: 31 scFv ADN NO: 1 19 NO: 121 NO: 123 NO: 125 NO: 127 CUADRO 2B (Continuación) CUADRO 2B (Continuación) REGIÓN TIPO L13 L14 L15 L16 L17 I SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID VH AA NO:6 NO:6 NO:6 NO:6 NO:6 VL AA NO:44 NO:46 NO:48 NO:50 NO:52 scFv AA NO:140 NO:142 NO:144 NO:146 NO:148 CDR H1 AA NO:163 NO:163 NO:163 NO:163 NO:163 CDR H2 AA NO: 164 NO:164 NO:164 NO:164 NO: 164 CDR H3 AA NO:169 NO:169 NO:169 NO:169 NO:169 CDR L1 AA NO: 194 NO: 194 NO: 194 NO: 194 NO: 194 CDR L2 AA NO:195 NO:195 NO:195 NO:195 NO:195 CDR L3 AA NO:182 NO:183 NO: 184 NO: 185 NO: 186 VH ADN NO:5 NO:5 NO:5 NO:5 NO:5 VL ADN NO: 43 NO: 45 NO: 47 NO: 49 NO: 51 scFv ADN NO: 139 NO: 141 NO: 143 NO: 145 NO: 147 CUADRO 2B (Continuación) CUADRO 2B i (Continuación) ¡ Las proteínas de unión anti-IL-21 R de la presente invención i pueden comprender regiones constantes del anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio V|_ se puede unir en su extremo C-terminal a un dominio constante de cadena ligera similar a CK o CX. De manera similar, un dominio VH, o una porción del mismo, se puede fijar a todo o a una parte de una cadena pesada como IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y cualquier subclase del ¡isotipo. Las regiones constantes son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat et al. (1991) supra). Por lo tanto, las proteínas de unión dentro del alcance de esta invención incluyen los dominios VH y VL) o porciones de los mismos, combinados con las regiones constantes conocidas en la técnica. j Ciertas modalidades comprenden un dominio VH, un dominio VL, i o una combinación de los mismos, del fragmento Fv de AbA-AbZ, H3-H6, L1 -L6,J L8-L21 , y/o L23-L25. Otras modalidades comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de los dominios VH y VL. Proteínas de unión cuya secuencia(s) de los CDR son iguales a, o similares a (es decir, no difieren sustancialmente de), una o más secuencias de los CDR presentes- dentro de I lasjsecuencias establecidas en SEQ ID NOs: 5-195, 213-229, y 239-248 están comprendidas dentro del alcance de la invención. j En ciertas modalidades, los dominios VH y/o VL pueden ser de línea germinal, es decir, el FR de esos dominios son mutados usando técnicas convencionales de la biología molecular para igualar ésos producidos por las células de la línea germinal. En otras modalidades, las secuencias FR permanecen divergidas de las secuencias de la línea germinal del consenso.

En una modalidad, la mutagénesis es usada hacer una proteína de unión más similar a una o más secuencias de la línea germinal. Esto puede ser| deseable cuando se introducen mutaciones en el FR de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con mutagénesis somática o a través de PCR propenso a error. Las secuencias de la línea germinal para los dominios H y VL pueden identificarse realizando alineaciones de aminoácidos y ácidos nucleicos contra la base de datos de VBASE (MRC Center for Protein Engineering, UK). La VBASE es un directorio completo de todas las secuencias humanas de región variable de la línea germinal compiladas de cerca de un millar de secuencias publicadas, incluyendo ésas en las liberaciones actuales de las genotecas de datos de GENBANK® y EMBL. En algunas modalidades, los FR de los scFvs son mutados conforme a las coincidencias más cercanas de las bases de datos de VBASE y las porciones de los CDR se mantienen intactas.

; En ciertas modalidades, las proteínas de unión de la invención reaccionan específicamente con un epítope que es igual que el epítope reconocido por AbA-AbZ, H3-H6, L1-L6, L8-L21 , o L23-L25, de manera que inhiben competitivamente la unión de AbA-AbZ, H3-H6, L1-L6, L8-L21 , o L23-L25 al IL-21 R humano. Dichas proteínas de unión pueden ser determinadas en ensayos de unión competitivos. En una modalidad, la constante de asociación (KA) de estas proteínas de unión para IL-21 R humano es por lo menos 105 M"V1. La afinidad de unión se puede determinar usando las técnicas conocidas en la técnica, tal como ELISA, tecnología del bíosensor (tal como análisis de interacción biospecifíca) u otras técnicas, incluyendo ésas descritas en esta solicitud.

Se contempla que las proteínas de unión de la invención puedan I unirle a otras proteínas, tal como, por ejemplo, proteínas recombinantes que comprenden todo o una porción del IL-21 R.

Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica reconocerá que las proteínas de unión descritas pueden ser usadas para detectar, medir, y/o inhibir las proteínas que difieren en parte del IL-21 R. Por ejemplo, estas proteínas pueden ser homologas del IL-21 R. Se espera que las proteínas de unión anti-IL-21 R se unan a proteínas que comprenden una secuencia que es por lo menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más Idéntica a cualquier secuencia de por lo menos 100, 80, 60, 40, o 20 aminoácidos contiguos en la secuencia establecida SEQ ID NOs.: 2 o 4.

Además del análisis de homología de secuencia, pueden i realizarse mapeo de epitope (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols (1996) Morris ed., Human Press), y análisis de estructura secundaria y terciaria para identificar estructuras específicas en 3D asumidas por las proteínas de unión descritas actualmente y sus complejos con los antígenos. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol. 11 :7-13) y el modelar por computadora las ¡representaciones virtuales de las proteínas de unión presentes (Fletterick et al. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

La descripción provee un método para obtener proteínas de unión anti-IL-21 R. El método comprende crear proteínas de unión con secuencias VH y/o Vi. que ese son alteradas de esas secuencias aquí descritas. Dichas proteínas de unión pueden ser derivadas por un técnico experto usando las técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, deleciones, o adiciones que se pueden introducir en las regiones FR y/o CDR. Los cambios del FR generalmente se diseñan para mejorar la estabilidad y la inmunogenicidad de la proteína de unión, mientras que los cambios del CDR típicamente se diseñan para I aumentar una afinidad de una proteína de unión a su antígeno. Los cambios qué aumentan la afinidad pueden ser probados alterando unas o más secuencias del CDR y midiendo la afinidad de la proteína de unión para su diana (véase, por ejemplo, Antibody Engineering (2nd ed. 1995) Borrebaeck ed., Oxford University Press).

Las proteínas de unión cuyas secuencias CDR no difieren sustancialmente de esas establecidas o inbcluidas dentro de las secuencias SEQ ID NOs.: 5-195, 213-229, y 239-248 están comprendidas dentro del alcance de esta invención. Típicamente, dicha diferencia(s) no sustancial implica la sustitución de un aminoácido con un aminoácido que tiene carga, hidrofobicidad, o características estereoquímicas similares. Sustituciones más drásticas en las regiones FR, en contraste con las regiones CDR, pueden I también ser realizadas mientras no afecten adversamente (por ejemplo, reduzcan la afinidad por más de 50% en comparación con la proteína de unión no , sustituida) las propiedades de unión de la proteína de unión. Las sustituciones pueden también ser realizadas para obtener una linea germinal de la proteína de unión o estabilizar su sitio de unión al antígeno.

La modificaciones conservadoras producirán moléculas que tienen características funcionales y químicas similares a esas de la molécula a partir de la cual se realizan dichas modificaciones. En cambio, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las! moléculas pueden efectuarse seleccionando las sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento (1) la estructura de la cadena principal molecular en la área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (2) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, y/o (3) el tamaño de I la molécula.

Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede implicar una sustitución de residuos de aminoácidos nativos con residuos normativos de manera que hay poco o nada de efecto en la polaridad o la carga de los residuos de aminoácidos en esa posición (véase, por ejemplo, MacLennan et al. (1998) Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al. (1998) Adv. Biophys. 35:1-24).

Las sustituciones deseadas de aminoácidos (ya sea conservadoras o no conservadoras) pueden ser determinadas por los expertos en la técnica al momento en que se deseen dichas sustituciones. Por i ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden ser usadas para identificar los; residuos importantes de la secuencia de la molécula, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas aquí. Las sustituciones de aminoácidos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ésas establecidas en el Cuadro 3.

CUADRO 3 Ejemplos de Sustituciones de Aminoácidos j En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan residuos de aminoácidos que no existen naturalmente que son incorporados típicamente por síntesis química de péptidos más que por síntesis en los sistemas biológicos.

En una modalidad, el método para formar un dominio VH variante comprende añadir, suprimir, o substituir por lo menos un aminoácido en los dominios VH descritos, o combinar a los dominios VH descritos con por lo VL, y probar el dominio VH variante para la unión al IL-21 R la actividad IL-21 R/IL-21.

I Un método análogo para formar un dominio VL variante comprende añadir, suprimir, o substituir por lo menos un aminoácido en los i I dominios VL descritos, o combinar los dominios VL descritos con por lo menos un !dominio VH, y probar el dominio VL variante VL para la unión al IL-21 R o la i modulación de la actividad del IL-21 R. ! i En algunas modalidades alternativas, las proteínas de unión anti- j I IL-21 R pueden ser enlazadas a una proteína (por ejemplo, albúmina) por '¦ j entrelazamiento químico o métodos recombinantes. Las proteínas de unión descritas pueden también ser enlazadas a una variedad de polímeros no pro'teínicos (por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglícol, o polioxialquilenos) en i las maneras establecidas en las Patentes de E.U.A. No. 4,640,835; i 4,496,689; 4,301 ,144; 4,670,417; 4,791 ,192; y 4,179,337. Las proteínas de j unión pueden ser modificadas químicamente por la conjugación covalente a i ' un ' polímero, por ejemplo, para aumentar su vida media en la circulación sanguínea. Polímeros de ejemplo y métodos de fijación se muestran en las Patentes de E.U.A. No. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; y 4,609,546.

Las proteínas de unión descritas pueden ser modificadas para alterar su glicosilación; es decir, por lo menos una porción del carbohidrato se puede suprimir o añadir a la proteína de unión. La deleción o la adición de los sitios de glicosilación puede efectuarse al cambiar la secuencia de aminoácidos para suprimir o para crear sitios del consenso de la glicosilación, que son bien conocidos en la técnica. Otro medio para añadir porciones de carbohidratos es el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a los residuos de aminoácidos de la proteína de unión, por ejemplo, anticuerpo (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Internacional No. WO 87/05330 y Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 22:259-306). La eliminación de las porciones del carbohidrato también puede efectuarse químicamente o enzimáticamente (véase, por ejemplo, Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 1 18:131 ; y Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350). La modificación de las estructuras del carbohidrato pueden ser preferibles porque los aminoácidos que cambian en el dominio Fe pueden mejorar la inmunogenicidad de una composición farmacéutica (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Internacional. WO 2008/052030). Ha sido demostrado para las moléculas de inmunoglobulina que la fijación del carbohidrato enlazado a N con Asn-297 del dominio CH2 es crítica para la actividad del ADCC. Su eliminación enzimática o por mutación del sitio de consenso enlazado a N resulta en poca o ninguna actividad del ADCC. En las glicoproteínas, los carbohidratos pueden fijarse al átomo de nitrógeno de la amida en la cadena secundaria de una asparagina en un motif tripeptídico Asn-X-Thr/Ser. Este tipo de glicosilación, denominada glicosilación enlazada a N, comienza en el retículo endoplasmático (ER) con la adición de múltiples monosacáridos a un fosfato de dolichol para formar un carbohidrato complejo ramificado de 14 residuos. Este carbohidrato complejo es entonces transferido I a lá proteina por el complejo oligosacariltransferasa (OST). Antes de que la glicoproteína deje el lumen del ER, se eliminan tres moléculas de glucosa del oligosacárido de 14 residuos. Las enzimas ER glucosidasa I, ER glucosidasa II y ER monosidasa están implicadas en el tratamiento de ER. j Subsiguientemente, los polipéptidos son transportados al complejo de Golgi, donde las cadenas de azúcar enlazadas a N son modificadas de muchas maneras diferentes. En los compartimientos cis y mediales del complejo de Golgi, el complejo enlazado a N original de 14 sacáridos se pueden recortar a través de la eliminación de los residuos mañosa (Man) y alargarse a través de la adición de residuos de N-acetilglucosamina (GIcNac) y/o fucosa (Fue). Las diversas formas de los carbohidratos enlazados a N generalmente tienen en común un núcleo pentasacárido que consiste de tres mañosas y dos residuos N-acetilglucosamina. Finalmente, en el trans Golgi, pueden añadirse otros residuos GIcNac, seguido por galactosa (Gal) y un ácido siálico terminal (Sial).

El ¡procesamiento del carbohidrato en el complejo de Golgi es denominado "glicosilación terminal" para distinguirlo de la "glicosilación del núcleo," que I ocurre en el ER. Las unidades del carbohidrato complejas finales tienen numerosas formas y estructuras, algunas de las cuales tienen dos, tres o cuatro ramificaciones (denominadas biantenarias, triantenarias o I tetrantenarias). Un número de enzimas están implicadas en el procesamiento de Golgi, incluyendo las manosidasas IA, IB e IC de Gblgi, GIcNAc-transferasa I, manosidasa II de Golgi, GIcNAc-transferasa II, galactosiltransferasa y sialiltransferasa.

I Los métodos para alterar la región constante de una proteína de unión (tal como, por ejemplo, la región constante de un anticuerpo) son conocidos en la técnica. Las proteínas de unión con la función alterada (por ejemplo, afinidad alterada para un ligando efector tal como FcR en una célula o el componente Cl del complemento) pueden ser producidas sustituyendo por lo menos un residuo de aminoácidos en la porción constante con un residuo diferente (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Europea No. EP 0 388 151 y las Patentes de E.U.A. No. 5,624,821 y 5,648,260). Podría decirse que tipos similares de alteraciones, si se aplicaran a un murino u otra especie de proteína de unión, reducirían o eliminarían funciones similares.

I Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fe de una proteína de unión (por ejemplo, un IgG, tal como un IgG humano) por FcR (por ejemplo, Fe gamma R1) o C1q. La afinidad puede ser alterada sustituyendo por lo menos un residuo especificado con por lo menos un residuo que tienen una funcionalidad apropiada en su cadena secundaria, o introduciendo un grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartato, o quizás un residuo no polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptófano o alanina (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,624,821 ).

Por ejemplo, sustituir al residuo 297 (asparagina) con alanina en la región constante de IgG inhibe significativamente el reclutamiento de las células efectoras, mientras que solo reduce levemente (aproximadamente tres veces más débil) la afinidad por C1q (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No.¡ 5,624,821). La enumeración de los residuos en la cadena pesada es esa del índice de la EU (véase Kabat et al. (1991) supra). Esta alteración destruye el sitio de glicosilación, y se cree que se requiere la presencia del carbohidrato para la unión del receptor Fe. Cualquier otra sustitución en este sitio que destruya el sitio de glicosilación se cree que causa una disminución similar en la actividad lítica. Otras sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, el cambio de 'cualquiera de los residuos 318 (Glu), 320 (lys) y 322 (lys), a Ala, son también conocidos por suprimir la unión de C1q a la región Fe de anticuerpos de IgG (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,624,821).

Las proteínas de unión modificadas pueden ser producidas teniendo una interacción reducida con un receptor Fe. Por ejemplo, ha sido mostrado que en el lgG3 humano, que se une al receptor humano Fe gama R1 , el cambio de Leu 235 a Glu destruye su interacción con el receptor. Las mutaciones en sitios adyacentes o cercanos en la región de enlace de la articulación de una proteína de unión (por ejemplo, sustituyendo a los residuos 234, 235 y 237 con Ala) también pueden ser usadas para afectar la afinidad de la proteína de unión para el receptor FC gema R1. La enumeración de los í residuos en la cadena pesada está basada en el índice de la EU (véase Kabat et al. (1991) supra). Por lo tanto, en algunas modalidades de la invención, la región Fe de las proteínas de unión de la invención contiene por lo menos una mutación de la región constante, tal como, por ejemplo, el cambio de Leu a Ala1 en la posición 234 (L234A), el cambio de Leu a Ala en la posición 235 (L235A), y/o el cambio de Gly a Ala en la posición 237 (G237A). En una modalidad, la región Fe de la proteína de unión contiene dos mutaciones de la región constante, L234A y G237A (es decir, "doble-mutante" o "DM"). En otra modalidad, la región Fe de la proteína de unión contiene tres mutaciones de la región constante, L234A, L235A, y G237A (es decir, "triple-mutante" o "TM").

Po ejemplo, una región constante del IgG humano triple-mutante se establece en ß??. ID NO: 196.

Métodos adicionales para alterar la actividad lítica de una proteina de unión, por ejemplo, alterando por lo menos un aminoácido en la región N-terminal del dominio CH2, se describen en la Publicación de la Solicitud Internacional No. WO 94/029351 y la Patente de E.U.A. No. 5,624,821.

Las proteínas de unión de la invención pueden ser etiquetadas con una marca detectable o funcional. Estas marcas incluyen las radiomarcas (por ejemplo, 1311 y 99Tc), las marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina), y otras porciones químicas (por ejemplo, biotina). i La invención también puede incorporar una proteína de unión aislada o un fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL- 21 R, particularmente, al IL-21 R humano. En ciertas modalidades, la proteína de unión anti-IL-21 R puede tener por lo menos una de las siguientes características: (1) es una proteína de unión monoclonal o de especificidad simple; (2) es una proteína de unión humana; (3) es una proteína de unión generada ¡n vitro; (4) es una proteína de unión generada ¡n vivo (por ejemplo, i sistema de ratón transgénico); (5) inhibe la unión de la IL-21 al IL-21 R; (6) es un lgG1 ; (7) se une al IL-21 R humano con una constante de asociación de por lo menos aproximadamente 105 M V1; (8) se une al IL-21 R de murino con una constante de asociación por lo menos aproximadamente de 5 x 104 M"1s"1; (9) se ¡ une al IL-21 R humano con un constante de disociación de i aproximadamente 10"3 (1/s) o menor; (10) se une al IL-21 R de murino con una constante de disociación de aproximadamente 10"2 (1/s) o menor; (1 1) inhibe la proliferación mediada por el IL-21 R humano de las células BaF3 que expresan el IL-21 R humano con un IC50 de aproximadamente 1.75 nM o mehor; (12) inhibe la proliferación mediada por IL-21 R de murino de las células BaF3 que expresan el IL-21 R de murino con un IC50 de aproximadamente 0.5 nM o menor; (13) inhibe la proliferación mediada por el IL-21 R humano de las células TF1 que expresan el IL-21 R humano con un IC50 de aproximadamente 14.0 nM o menor; (14) inhibe la proliferación médiada por IL-21 de las células B primarias con un IC50 de aproximadamente 1.9 nM o menor; (15) inhibe la proliferación mediada por IL-21 de las células CD4+ T primarias con un IC5o de aproximadamente 1.5 nM o menor; y (16) inhibe la proliferación mediada por IL-21 de las células CD4+ T primarias con un C5o de aproximadamente 5.0 nM o menor.

Un experto en la técnica apreciará que las modificaciones descritas anteriormente no son todas, y que muchas otras modificaciones serán obvias para un técnico experto a la luz de las enseñanzas de la presente descripción. i Ácidos nucleicos, Clonación y Sistemas de expresión ! La descripción provee ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas de unión descritas. Los ácidos nucleicos pueden comprender el ADN o el ARN, y pueden ser sintéticos (totalmente o parcialmente) o recombinantes (totalmente o parcialmente). La referencia a una secuencia de nucleótidos como se establece aquí abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la cual U es sustituido por T. 1 También se contemplan los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de codificación para uno, dos, o tres CDR, un dominio VH, un dominio V|_, o combinaciones de los mismos, según se describe aquí, o una secuencia substancíalmente idéntica al mismo (por ejemplo, una secuencia por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o i más idéntica a la misma, o que es capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas a las secuencias).

' En una modalidad, los ácidos nucleicos aislados tienen secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables de cadena pesada y ligera de una proteína de unión anti-IL-21 R que comprende por lo menos un CDR elegido de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs.: 163-195, o una secuencia que codifica un CDR que difiere por uno o dos o tres o cuatro i aminoácidos de las secuencias aquí descritas.

¡ El ácido nucleico puede codificar solamente la región variable de cadena ligera o de cadena pesada, o puede codificar una región constante de cadena ligera o pesada de la proteína e unión, enlazada operativamente a la región variable correspondiente. En una modalidad, la región variable de cadena ligera es enlazada a una región constante elegida de una región constante kappa p lambda. La región constante de cadena ligera puede también ser un tipo kappa o lambda humano. En otra modalidad, la región variable de cadena pesada está enlazada a una región constante de cadena pesada de un isotipo de proteína de unión elegido de IgG (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4), IgM, lgA1 , lgA2, IgD, e IgE. La región constante de cadena pesada puede ser un isotipo de IgG (por ejemplo, un lgG1).

Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, mientras que a menudo están en la secuencia nativa (de ADNco de ADN genómico o mezclas de los mismos), a excepción de los sitios de restricción i modificados y similares, pueden ser mutada de acuerdo con las técnicas estándar para proveer secuencias génicas. Para las secuencias codificantes, j estas mutaciones, pueden afectar a las secuencias de aminoácidos según se desee. Particularmente, se contemplan las secuencias de nucleótidos substancialmente idénticas o derivadas de secuencias nativas, V, D, J, constantes, conmutadas y otras aquí descritas (donde "derivada" indica que I una secuencia es idéntica o modificada de otra secuencia).

En una modalidad, el ácido nucleico difiere (por ejemplo, difiere 1 por, la sustitución, la inserción, o la deleción) de ese de las secuencias prosistas (por ejemplo, por lo menos por uno pero menos de 10, 20, 30, o 40 nucleótidos; por lo menos uno pero menos 1%, 5%, 10% o 20% de los i nucleótidos en el ácido nucleico objeto). En caso de ser necesario para este análisis, las secuencias se deben alinear para una homología máxima. Las secuencias "en bucles" de deleciones o de inserciones, o las desadaptaciones, se consideran diferencias. La diferencia puede estar en un nucleótido(s) que codifica un residuo(s) no esencial, o la diferencia puede ser una sustitución conservadora.

La descripción también provee construcciones de ácido nucleico en la forma de plásmidos, vectores, y casetes de transcripción o de expresión, que; comprenden por lo menos un ácido nucleico como aquí se describe.

La descripción provee además una célula hospedera que comprende por lo menos una construcción de ácido nucleico descrita aquí.

También se provee un método de fabricación de una proteína(s) codificada de un ácido(s) nucleico(s) que comprende la secuencia(s) descrita aquí. El método comprende cultivar células hospederas bajo condiciones apropiadas para que expresen la proteína a partir del ácido nucleico. Después I de la expresión y la producción, el dominio VH o VL, o el miembro de unión específica, puede ser aislado y/o purificado usando cualquier técnica apropiada, y luego usarse según sea apropiado. El método también puede incluir las etapas de fusionar un ácido nucleico que codifica un scFv con los ácidos nucleicos que codifican una porción Fe de una proteína de unión, y expresando el ácido nucleico fusionado en una célula. El método también puede incluir una etapa de formación de línea germinal.

I Los fragmentos de unión a un antígeno, los dominios VH y/o VL, y las moléculas de ácido nucleico y los vectores de codificación se pueden aislar y/o purificar de su entorno natural, en una forma substancialmente pura u homogénea, o, en el caso de los ácidos nucleicos, libres o substancialmente libres de ácidos nucleicos o de genes de origen diferente de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida.

Los sistemas para la clonación y expresión de polipéptidos en una variedad de células hospederas son conocidos en la técnica. Las células adecuadas para producir las proteínas de unión se describen, por ejemplo, en Fernandez et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press. En resumen, las células hospederas adecuadas incluyen a las células de i mamíferos, a las células de insectos, a las células vegetales, a las células de levadura, o a células procariotas, por ejemplo, E. coli. Las células de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión del polipéptido heterólogo incluyen a las líneas celulares linfocíticas (por ejemplo, NSO), a las células HEK293, a las células de ovario de hámster chinos (CHO), a las células de COS, a las células HeLa, a las células de riñon de hámster bebé, a las células del oocito, y a células de un animal transgénico, por ejemplo, células epiteliales mamarias. En otras modalidades, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión se colocan bajo el control de un promotor específico de tejido (por ejemplo, promotor específico mamario) y las proteínas de unión son producidas en animales transgénicos. Por ejemplo, las proteínas de unión son secretadas en la leche del animal transgénico, tal como una vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, o roedor transgénico.

I Los vectores adecuados se pueden elegir o construir para I contener las secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias del terminador, secuencias de la poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadores, y otras secuencias. Los i vectores pueden también contener un plásmido o una cadena principal viral. Para los detalles, véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Léboratory Manual (2nd ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Numerosas técnicas establecidas usadas con los vectores, incluyendo la manipulación, la preparación, la mutagénesis, la secuenciación, y la transfección del ADN, se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (2nd ed. 1992) Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons.

Otro aspecto de la descripción provee un método para introducir i el ácido nucleico en una célula hospedera. Para las células eucarióticas, las técnicas adecuadas de la transfección pueden incluir el fosfato de calcio, el DEAE-Dextrano, la electroporación, la transfección mediada por liposoma, y la i transducción usando un retrovirus u otro virus, por ejemplo, vacuna o baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas apropiadas pueden incluir la transformación con cloruro de calcio, la electroporación, y la transfección usando un bacteriófago. La introducción del ADN se puede seguir por un método de selección (por ejemplo, resistencia al fármaco) para seleccionar a las células que contienen el ácido nucleico.

Usos de las Proteínas de Unión Anti-IL-21R I Las proteínas de unión anti-IL-21R que actúan como antagonistas para IL-21R pueden ser usadas para regular por lo menos una respuesta inmune mediada por el IL-21R, tal como una o más de proliferación celular, expresión o secreción de la citocina, secreción de la quimiocina, y actividad citolítica, de las células T, de las células B, de las células NK, de los macrófagos, o de las células sinoviales. Por consiguiente, las proteínas de unión de la invención pueden ser usadas para inhibir la actividad (por ejemplo, proliferación, diferenciación, y/o supervivencia) de una célula inmune o hematopoyética (por ejemplo, célula de linaje mieloide, linfoide, o eritroide, o de ¡células precursoras del mismo), y, por lo tanto se pueden usar para trunión una variedad de trastornos inmunes y de trastornos hiperproliferativos de la i sangre. Ejemplos de los trastornos inmunes que se pueden trunión incluyen, pero no se limitan a, rechazo del trasplante, enfermedad del injerto-contrahuésped (GVHD), alergias (por ejemplo, alergia atópica), y las enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes incluyen diabetes mellitus, los trastornos artríticos (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática, y espondilitis anquilosante), espondiloartropatía, esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo la dermatitis atópica y la dermatitis eczemosa), psoriasis, el síndrome de Sjógren, IBD (incluyendo la enfermedad de Crohny la colitis ulcerativa), asma (incluyendo asma intrínseco y asma alérgico), escleroderma y vasculitis. ! i ' Terapia de combinación En una modalidad, una composición farmacéutica que comprende por lo menos a una proteína de unión anti-IL-21 R y por lo menos a un agente terapéutico se administra en terapia de combinación. La terapia es útil para trunión condiciones patológicas o trastornos, tales como trastornos inmunes e inflamatorios. El término "en combinación" en este contexto significa que la composición de la proteína de unión y el agente terapéutico se dan substancialmente contemporáneamente, ya sea simultáneamente o secuencialmente. Si se da secuencialmente, en el comienzo de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos puede todavía ser detectable en las concentraciones efectivas en el sitio del tratamiento.

Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir por lo menos una proteína de unión anti-IL-21 R, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 R, co-formulado con, y/o co-administered con, por lo menos un agente terapéutico adicional. Los agentes adicionales pueden incluir por lo menos un inhibidor de la citocina, un inhibidor del factor de crecimiento, un inmunosupresor, un agente antiinflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor de la enzima, un agente citotóxico, y/o un agente citoestático. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente menores dosificaciones de los agentes terapéuticos administrados, evitando asi evitando las posibles toxicidades o las complicaciones asociadas con las diversas monoterapias. Más aún, los agentes terapéuticos descritos aquí actúan en trayectorias que difieren de la trayectoria de IL-21/IL-21R, y por lo tanto se espera que mejoren y/o hagan sinergia con los efectos de las proteínas de unión anti-IL-21 R.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a los kits para realizar la administración combinada de las proteínas de unión anti-IL-21 R con otros agentes terapéuticos. En una modalidad, el kit comprende por lo menos una proteína de unión anti-IL-21 R formulada en un portador farmacéutico, y por lo menos un agente terapéutico, formulado según sea apropiado en una o más preparaciones farmacéuticas separadas.

Usos de diagnóstico Las proteínas de unión de la invención también pueden ser usadas para detectar la presencia de IL-21R en muestras biológicas. Correlacionando la presencia o el nivel de estas proteínas con una condición médica, un experto en la técnica puede diagnosticar la condición médica asociada. Por ejemplo, las células T estimuladas aumentan su expresión de IL-21 R, y una alta concentración no usual de IL-21 R que expresa a células T en los puntos de unión puede indicar inflamación de la articulación y la posible artritis. Las condiciones médicas ilustrativas que se pueden diagnosticar por las proteínas de unión de esta invención incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, y rechazo del trasplante.

Los métodos de detección a base de proteínas de unión, tales como ésos de uso general para los anticuerpos, son bien conocidos en la técnica, e incluyen ELISA, radioinmunoensayos, inmunotransferencias, transferencias Western, citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmünoprecipitación, y otras técnicas relacionadas. Las proteínas de unión se pueden proveer en un kit de diagnóstico que incorpore por lo menos uno de estos procedimientos para detectar IL-21 R. El kit puede contener otros componentes, empaquetamiento, instrucciones, reactivos y/u otro material para ayudar a la detección de la proteína y uso del kit.

Las proteínas de unión se pueden modificar con los marcadores detectables, incluyendo los grupos del ligando (por ejemplo, biotina), fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, reactivos densos de electrón, o enzimas. Las enzimas son detectadas por su actividad. Por ejemplo, la per xidasa de rábano picante es detectada por su capacidad de convertir la tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azules, cuantificable con un espectrofotómetro. Otras parejas de unión adecuadas incluyen biotina y avidina, IgG y la proteína A, y otros pares de receptor-ligando conocidos en la técnica.

Las proteínas de unión también pueden enlazarse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera) por lo menos a otra entidad molecular, tal como otra proteína de unión (por ejemplo, una proteína de unión Í biespecífica o multiespecífica), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citoestáticos, entre otras. Otras permutaciones y posibilidades serán evidentes I para las personas con conocimientos ordinarios en la técnica, y se consideran I equivalentes dentro del alcance de esta invención.

Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Administración Ciertas modalidades de la invención incluyen composiciones que comprenden las proteínas de unión descritas. Las composiciones pueden ser adecuadas para uso farmacéutico y la administración a los pacientes. Las composiciones comprenden una proteína de unión de la presente invención y un excipiente farmacéutico. Como se usa aquí, "excipiente farmacéutico" incluye los disolventes, medio de dispersión, revestimientos, agentes antib'acterianos y antifúngicos, agentes retardantes isotónicos y de absorción, etc., ¡que son compatible con la administración farmacéutica. El uso de estos agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técniba. Las composiciones pueden también contener otros compuestos activos que proveen funciones terapéuticas suplementarias, adicionales, o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas se pueden también incluir en un recipiente, un paquete, o un dispensador, junto con las instrucciones para la administración.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración destinada. Los métodos para efectuar la administración son conocidos por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar tópicamente u oralmente, o son capaces de la transmisión a través de I las membranas mucosas. Ejemplos de la administración de una composición farmacéutica incluyen la ingestión oral o la inhalación. La administración puede también ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, ¡ntracavidad, subcutánea, cutánea, o transdérmica.

Las soluciones o las suspensiones usadas para la aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente por lo menos uno de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol, u otro disolvente sintético; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o parabenos metílicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); amortiguadores tales como acetato, citrato, o fosfato; y agentes tonificantes tales como cloruro Í sódico o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases por métodos conocidos en la técnica. Dichas preparaciones se pueden encerrar en ampolletas, jeringas desechables, o frascos de varias dosis.

Las soluciones o las suspensiones usadas para la administración intravenosa incluyen un portador tal como solución salina fisiológica, agua bacteriostática, CREMOPHOR EL® (BASF Corp., Ludwigshafen, Alemania), etahol, o poliol. En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida para una inyección fácil. La fluidez apropiada a menudo se obtiene usando lecitina o surfactantes. La composición debe también ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. La prevención de los microorganismos se puede lograr con agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc. En muchos casos, los agentes isotónicos (azúcar), polialcoholes (por ejemplo, mahitol y sorbitol), o el cloruro de sodio pueden ser incluidos en la composición. La prolongada absorción de la composición puede lograrse añadiendo un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o un porjtador comestible. Con el fin de la administración oral, las proteínas de unión pueden ser incorporadas con excipientes y ser colocadas, por ejemplo, en ¡ tabletas, trociscos, cápsulas, o gelatina. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles o materiales adyuvantes en la composición. Las composiciones pueden contener (1) un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; (2) un excipiente tal como almidón o lactosa, (3) un agente disgregante tal como ácido algínico, j Primogel, o almidón de maíz; (4) un lubrificante tal como estearato de magnesio; (5) un glidante tal como dióxido de silicio coloidal; y/o (6) un agente edulcorante o saborizante.

¡ La composición se puede también administrar por una vía transmucosal o transdérmica. Por ejemplo, las proteínas de unión que comprenden una porción Fe (por ejemplo, un anticuerpo) pueden ser capaces de cruzar las membranas mucosas en el intestino, la boca, o los pulmones (vía los receptores de Fe). La administración transmucosal puede lograrse mediante tabletas, rociadores nasales, inhaladores, o supositorios. La administración transdérmica puede lograrse con una composición que contiene pomadas, salves, geles, o cremas conocidas en la técnica. Para la administración transmucosal o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Para la administración por inhalación, las proteínas de unión se pueden suministrar en un aerosol rociado desde un recipiente o un dispensador presurizado, que contienen un propelente (por ejemplo, líquido o gas), o un nebulizador.

En determinadas modalidades, las proteínas de unión de esta invención se preparan con portadores para proteger las proteínas de unión Í contra la eliminación rápida del cuerpo. A menudo se usan los polímeros biodegradables (por ejemplo, etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico). Los métodos para la preparación de dichas formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica. Las suspensiones liposomales también pueden ser usadas como portadores farmacéuticamente aceptables. Los liposomas pueden ser I preparados de acuerdo con los métodos establecidos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de E.UA No. 4,522,811).

' Las proteínas de unión o las composiciones de las proteínas de unión de la invención son administradas en cantidades terapéuticamente efectivas como se describió. Las cantidades terapéuticamente efectivas pueden variar con la edad, la condición, el sexo, y la gravedad de la condición médica del sujeto. Las dosificaciones apropiadas pueden ser determinadas por un médico con base en las indicaciones clínicas. Las proteínas de unión o las| composiciones se pueden dar como dosis de bolo para maximizar los niveles de circulación de las proteínas de unión por el mayor período de tiempo. También puede ser usada la infusión continua.

Como se usa aquí, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos. Los sujetos pueden incluir a un paciente humano que tiene un trastorno caracterizado por las células que expresan el IL-21 R, por ejemplo, una célula cancerosa o una célula inmune. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, tales como primates nolhumanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Ejemplos de los intervalos de dosificación que se pueden administrar a un sujeto se pueden seleccionar de: 1 µg/kg a 20 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µ9^ a 100 µ9^, 100 µg/kg a 1 mg/kg, 250 µ9^ a 2 mg/kg, 250 µ9^ a 1 mg/kg, 500 µglkg a 2 mg/kg, 500 µ9^ a 1 mg/kg, 1 mg/kg a 2 mg/kg, 1 mg/kg a 5 mg/kg, 5 mg/kg a 10 mg/kg, 10 mg/kg a 20 mg/kg, 15 mg/kg a 20 mg/kg, 10 mg/kg a 25 mg/kg, 15 mg/kg a 25 mg/kg, 20 mg/kg a 25 mg/kg, y 20 mg/kg a 30 mg/kg (o mayor). Estas dosificaciones pueden administrarse diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, o con menos frecuencia, por ejemplo, dos veces al año, dependiendo de la dosificación, método de administración, trastorno o los síntomas a ser tratados, y las características del sujeto individual.

En ciertas circunstancias, puede ser ventajoso formular composiciones en la forma unitaria de dosificación para la facilidad de la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa aquí se refiere a las unidades físicamente discretas adecuadas para el paciente. Cada unidad de dosificación contiene una cantidad predeterminada de proteína de unión calculada para producir un efecto terapéutico en asociación con el portador. La unidad de dosificación depende en las características de la proteína de unión y del efecto terapéutico particular a ser logrado. i ! La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéutica efectiva en el 50% de la población). La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50- Las proteínas de unión de que exhiben grandes índices I terapéuticos pueden ser menos tóxicas y/o más terapéuticamente más i efectivas.

Los datos obtenidos de los ensayos del cultivo celular y de los estudios animales puede ser usado para formular un intervalo de dosificación en humanos. La dosificación de estos compuestos puede caer dentro del intervalo de las concentraciones de la proteína de unión que circula en la sangre, que incluye un ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de la I dosificación de la composición empleada y la vía de administración. Para cualquier proteína de unión usada en la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente usando ensayos i de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de la concentración en plasma circulante que incluye el IC50 (es, decir, la concentración de la proteína de unión que logra una inhibición de la mitad máxima de los síntomas). Los efectos de cualquier dosificación particular pueden ser monitoreados mediante un bioensayo adecuado.

Ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en la transcripción, ensayos de la expresión génica, ensayos de unión de IL-21/IL-21 R, y otros ensayos inmunológicos. El contenido completo de todas las referencias, solicitudes de patente, y patentes citadas a través de ésta solicitud se incorporan aquí para referencia.

EJEMPLOS La invención será ilustrada además en los siguientes ejemplos no limitativos. Estos ejemplos se establecen para ayudar en la comprensión de |la invención pero no están destinados a, y no deberán ser considerados, como limitantes de su alcance en ningún modo. Los ejemplos no incluyen las descripciones detalladas de los métodos convencionales que serían bien conocidos por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica.

EJEMPLO 1 ! Generación de proteínas de unión Por Despliegue de Fago i El clon parental 18A5 del scFv, descrito en la Patente de E.U.A.

No 7,495,085 (incorporada aquí para referencia), fue obtenido de la genoteca dejscFv humano del CS por métodos estándar de despliegue de fago, usando células BaF3 que expresan IL-21 R humano como diana en las rondas 1 y 3 y la proteína de fusión IL-21 R-Fc biotinilada diana en la ronda 2.

EJEMPLO 2 Construcción de la genoteca I Las genotecas de despliegue de fago se basaron en el scFv 18A5 parental, usando un vector pCANTAB6 en el cual el scFv se fusionó en su; extremo 3' al gen III intacto. Las diferentes secuencias CDR3 fueron derivadas usando técnicas bien conocidas en la técnica. Dos bloques solapados de seis codones consecutivos fueron aleatorizados en el CDR3 del VH y del VL, produciendo un total de cuatro genotecas: H3B1 , H3B2, L3B1 , y L3B2. Lo siguiente identifica las secuencias de nucleótido y aminoácidos, respectivamente: IL-21 R: 18A5 VHCDR3 [SEQ ID NOs.: 199 y 200]; H3B1 (ta imaño de genoteca s 1.40x109) [SEQ ID NOs.: 201 y 202]; H3B2 (tamaño de genoteca 1.00x109) [SEQ ID NOs.: 203 y 204]; IL-21 R: 18A5 VLCDR3 [SEQ ID NOs.: 205 y 206]; L3B1 (tamaño de genoteca 9.00x109) [SEQ ID NOs.: 207 y 208]; L3B2 (tamaños de genoteca 6.40x109) [SEQ ID NOs.: 209 y 210].

EJEMPLO 3 ¡ Selección del fago Todos los derivados de 18A5 fueron aislados de las genotecas scFv anteriores por la selección de fago capaz de unirse en fase de solución a las proteínas de fusión biotiniladas de His-Flag de domino extracelular IL-21 R humano ("biotin-hlL-21 R-H/F") y a proteínas de fusión biotiniladas de His-Flag de domino extracelular IL-21 R de murino ("biotin- mlL-21 R-H/F"); todos los procedimientos y técnicas relacionados con la selección son bien conocidos por el experto en la técnica. Se aisló un total de veintisiete anti-IL-21 R scFv por procedimientos de la selección del fago. i EJEMPLO 4 I Selección de la genoteca i i Las proteínas de unión resultantes en formato scFv fueron i seleccionadas con base en su capacidad de competir con el 18A5 parental en el formato lgG1 humano para unirse a biotin-hlL-21 R-H/F y biotin-mlL-21 R-H/Ft, para prevenir la proliferación dependiente de hlL-21 de las líneas celulares diseñadas genéticamente que expresan la proliferación dependiente de IL-21 R humano y la proliferación dependiente de mlL-21 de las líneas celulares diseñadas genéticamente que expresan la proliferación dependiente de¡IL-21 R de murino. i I EJEMPLO 4.1 I Preparación de Material Periplásmico bruto ("peri-preparaciones") para | el uso en los Ensayos de Selección Dependiendo de las condiciones de crecimiento usadas, el scFv se puede expresar en la solución en el espacio periplásmico bacteriano. Para inducir la liberación del scFv en el periplasma, placas de 96 pozos profundos que contenían 990 µ? 2??? de medio con 0.1% de glucosa/100 µg/ml de ampicilina fueron inoculadas de reservas de glicerol descongeladas (un clon por pozo) usando el recolector QPix2 Colony (Genetix, New Milton, Inglaterra) y cultivando a 37 °C (999 rpm) por aproximadamente 4 hr. Los cultivos fueron I i inducidos con IPTG a una concentración final de 0.02 mM y cultivados durante la noche a 30 °C (999 rpm). El contenido del periplasma bacteriano (peri- preparaciones) fue liberado por choque osmótico. Brevemente, las placas i fueron centrifugadas y las perlas fueron resuspendidas en 150 µ? de amortiguador periplásmico de TES (tris/HCI 50 mM (pH 8.0)/ EDTA 1 mM (pH 8.0)/ sacarosa al 20%), seguido por la adición de 150 µ? TES:agua 1 :5, y fue incubado en hielo por 30 min. Las placas fueron centrifugadas y se recolectó el sobrenadante que contenía scFv.

I EJEMPLO 4.2 Ensayo de Competencia de Epítope para la Selección de la Genoteca Esos scFv capaces de competir con el anticuerpo 18A5 parental para unirse a un IL-21R de humano o de murino fueron identificados de fagos seleccionados por un ensayo de fluorescencia resuelto en el tiempo homogéneo (HTRF®). El anticuerpo 8A5parental purificado fue modificado covalentemente con criptato, un derivado del europio, según las instrucciones en un Kit de Marcado con Criptato HTRF® (Cisbio, Bedfórd, MA). Las peri- preparaciones de scFv fueron preparadas como se describió anteriormente y diluidas a 0.25% en PBS/fluoruro de potasio 0.4 M/ BSA al 0.1% (amprtiguador HTRF®); entonces se transfirieron 10 µ? de la mezcla a los pozos de las placas negras de 384 pozos poco profundos (Nunc, Rochester, NY). Cinco µ? del anticuerpo 18A5 conjugado con criptato fueron entonces añadidos a cada pozo, seguido por 5 µ? de una mezcla de una dilución 1 :800 de conjugado estreptavidina-XL665 (Cisbio), y ya sea biotin-hlL-21 R-H/F 4.8 nM o biotin-mlL-21R-H/F 40 nM. La mezcla fue incubada por 2 hr a TA, y se realizaron las mediciones de fluorescencia resueltas en el tiempo (excitación de 340 nanómetros, emisión de 615 nanómetros y 665 nanómetros). La i competencia con el anticuerpo 18A5 fue indicada por una reducción en la relación de corrección por el fondo de la emisión a 665 nm a la emisión a 615 nm.

Un total de 8280 scFv independientemente aislados fueron seleccionados en el ensayo HTRF® usando IL-21R-H/F humano, y 376 clones capaces de competir con el anticuerpo 18A5 parental para unirse a biotin-hIL- 21 R-H/F fueron elegidos para análisis posterior.

EJEMPLO 5 Análisis de la Secuencia de ADN de la Amplificación de scFv por PCR derivada de la Genoteca de las regiones del scFv para el Análisis de la ¡ Secuenciación Se determinaron las secuencias de 287 variantes del scFv derivadas de 18A5 con unión mejorada al IL-21R sobre esa de la molécula de scFv de 18A5 parental, y fueron determinadas las frecuencias de los aminoácidos encontrados en cada posición. Entre los clones de VH, solamente dos ; (1.7%) fueron derivados de una genoteca que mutó los últimos seis aminoácidos, por ejemplo, la SEQ ID NO: 169 (en el C-terminal del VH CDR3), mientras que los restantes fueron derivados de una genoteca que mutó los primeros seis aminoácidos, por ejemplo, SEQ ID NO: 169. Entre los clones de V|_, solamente un clon (0.6%) fue derivado de una genoteca en la cual los últimos seis aminoácidos, por ejemplo, SEQ ID NO: 170 (en el C-terminal del VL CDR3) fueron mutados, mientras que la mayoría fue derivada de alteraciones en los primeros seis aminoácidos de, por ejemplo, SEQ ID NO: 170 (en el N-termínal de VL CDR3).

' La amplificación por PCR de los scFv se realizó usando VENT® ADr>l Polimerasa (New England Biolabs, Ispwich, MA) en el amortiguador de H : (Epicenter Biotechnologies, Madison, Wl) según las instrucciones del fabricante. Cinco µ? de una dilución 1:10 de un cultivo bacteriano de fase estacionaria fueron usados como el modelo para un volumen de reacción final de 20 µL·. Las condiciones del ciclo usadas fueron 2 min de comienzo en caliente a 94 °C, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C (1 min), fijación del cebador a 55 °C (2 min) y extensión a 72 °C (1 min), seguido por una extensión final a 72 °C (5 min). Los productos del PCR fueron verificados por electroforesis en gel de agarosa y limpiados con Exol/SAP (fosfatasa alcalina de camarón) antes de secuenciación con el cebador M13rev.

Las SEQ ID NO. para las secuencias del CDR3 de veintisiete scFv son listadas en el Cuadro 4. Estos scFv fueron seleccionados para análisis adicional con base en los ensayos descritos en el Ejemplo 6.

CUADRO 4 SEQ ID No. De CDR de scFv meiorado derivado de 18A5 scFv CDR3 pesado CDR3 ligero i H3 165 170 1 H4 166 170 i H5 167 170 H6 168 170 L1 169 171 L2 169 172 L3 169 173 ! L4 169 174 L5 169 175 L6 169 176 L8 169 177 i L9 169 178 L10 169 179 : L11 169 180 L12 169 181 L13 169 182 L14 169 183 L15 169 184 ! L16 169 185 L17 169 186 L 8 169 187 L19 169 188 ¡ L20 169 189 ; L21 169 190 L23 169 191 L24 169 192 L25 169 193 EJEMPLO 6 Caracterización del scFv derivado de genoteca EJEMPLO 6.1 Preparación de scFv Purificado por Análisis Cuantitativo Los clones individuales del scFv fueron purificados a una pequeña escala por la purificación Ni-NTA en columnas PHYTIP® (PhyNexüs, Inc., ¡ Santo José, CA). Se cultivaron colonias individuales en 20 mi 2xTY de medio con glucosa al 0.1 %/ 100 µg/ml de ampicilina en tubos cónicos de 50 mi a la fase medio-logarítmica a 37 °C con sacudimiento a 250 rpm. La expresión del scFv fue inducida con IPTG a una concentración final de 0.02 mM, y los cultivos fueron cultivados durante la noche a 30 °C. Las células fueron recolectadas por centrifugación y resuspendidas en 1 mi de amortiguador periplásmico de TES, seguido por la adición de 1 mi de TES:agua 1 :5 e i incubación en hielo por 30 Min. Los lisados fueron centrifugados a 3200 rpm por 10 min a 4 °C, y los sobrenadantes fueron puestos en MgCI2 2 mM. Los scFv fueron capturados en Ni-NTA PHYTIPs® (PhyNexüs) por el paso repetido del sobrenadante sobre el PHYTIPs® en un Robot de manejo de líquidos Perkin Elmer (Waltham, MA) MINITRAK™ IX, seguido por unlavado en amortiguador de lavado IMAC y elución con ¡midazol a 200 mM, tris a 50 mM, NaCI a 300 mM (pH 8.0). El amortiguador fue intercambiado a PBS por tres ciclos de dilución 1 :10 a PBS, seguido por concentración en una placa de filtro de corte de pesos moleculares de 10,000 (placa de ultrafiltración de 96 pozós, Millipore MULTISCREEN® ULTRACEL™, Millipore, Billerica, MA). Las muestras fueron cuantificadas usando un kit Micro BCA™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) usando la albúmina de suero bovino estándar del fabricante.

EJEMPLO 6.2 Ensayos para la proliferación dependiente de IL-21 de Células que Sobre- ! expresan IL-21 R humano o de murino ! Los ensayos de inhibición fueron realizados con las proteínas de unión derivadas de 18A5 (scFv e IgG) para medir su bloqueo de la proliferación dependiente de IL-21 de las líneas celulares transfectadas con IL-21 R humano o de murino. Las células BaF3, una línea celular pre-B de murino, y las células TF1 , una línea celular eritroide humana, fueron transducidas retroviralmente con IL-21 R y proteína fluorescente verde (GFP). Las | células se cultivaron rutinariamente en RPMI 1640 con FBS al 10%, L-glutamina a 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µ9/?t»? de estreptomicina, y ß-mercaptoetanol al 0.00036%. Los cultivos celulares de IL-21 R-BaF3 humano fueron suplementados con 50 ng/ml de IL-21 humano; los cultivos celulares de IL-2j1 R-BaF3 de murino fueron suplementados con 10 U/ml de IL-3; Los cultivos celulares de TFI fueron suplementados con 50 ?a/ml de GM-CSF, Antes del ensayo, las células fueron lavadas 3X en medio de ensayo que i carecía de factores de crecimiento suplementarios, se resuspendieron en medio de ensayo, y se incubaron a 37 °C/C02 al 5% por 6 hr. Para preparar las placas de ensayo, se añadieron 5000 células a los 60 pozos centrales de una ; placa de cultivo de tejido blanca de fondo plano de 96 pozos (Thermo Scientific, Waltham, MA) en un volumen de 55 µ?/????. Las muestras de prueba de scFv o IgG fueron preparadas diluyendo la muestra de reserva en medio de ensayo y diluyendo serialmente tres veces. Veinticinco µ? de las muestras de la proteína de unión fueron añadidos a las células y incubados por 30 min a 37 °C/ C02 al 5%. Veinte µ? de medio de ensayo que contenía 100-400 pg/ml de IL-21 de humano o de murino fueron añadidos a cada pozo, y se; incubaron las células por 48 hr adicionales. La proliferación fue medida llevando a las placas a la TA, añadiendo 15 µ?/???? de CELLTITER-GLO®, incubando por 10 minutos a TA, y midiendo la luminiscencia con un lector de placa Perkin Elmer ENVISION™. Después de la purificación con las puntas de PhyNexus IMAC, 108 scFv fueron probados para la neutralización de la proliferación dependiente de IL-21 de las tres líneas celulares. Todas mostraron la neutralización de las células IL-21 R-BaF3 humanas, con IC50S menor que o igual a esa del 18A5 scFv parental. Un subconjunto demostró i una fuerte neutralización de la proliferación de las células IL-21 R-BaF3 de murino y de las células IL-21 R-TF1 humanas. Los datos de los 27 clones más potentes se muestran en las FIGS. 1A-3C, y se resumen en el Cuadro 5.

Las FIGs. 1A-3C muestran la neutralización de la proliferación por el scFv de las células IL-21 R-BaF3 humanas (FIGs. 1A-1 C); células IL- 21 R-TF1 humanas (FIGS. 2A-2C); y células IL-21 R-BaF3 de murino (FIGs. 3A-3C). Las células se mezclaron con el scFv indicado y fueron incubadas con 100 ;pg/ml (FIG. 1A-2C) o 400 pg/ml (FIGs. 3A-3C) de IL-21 humano.

EJEMPLO 6.3 Ensayo Cuantitativo de la Competencia del Epítope I Los scFv purificados fueron analizados cuantitativamente por su capacidad de competir con el anticuerpo 18A5 parental para unirse a un IL-21 R de murino en un ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA). El anticuerpo 18A5 parental fue revestido durante la noche a 4 °C en placas de 96 pozos Nunc MAXISORP® a una concentración de 0.75 µg/p^] en PBS. Las placas fueron lavadas 3X usando PBS, y luego bloqueadas por 3 hr a TA en i PBS/BSA al 1 %/Tween-20 al 0.05%. Los scFv fueron mezclados con mlL- 21 R-H/F biotinilado a 36 nM e incubados por 10 min a TA. Las placas bloqueadas fueron lavadas 3X con PBS, y 50 µ?/???? de las mezclas scFv/IL- 21 R l fueron transferidos a las placas apropiadas e incubados por 1 hr a TA.

Las placas fueron lavadas 5X con PBS antes de la adición de una dilución de 1 :6000 de anticuerpo secundario peroxidasa de rábano-conjugado de estreptavidina (Southern Biotech, Birmingham, AL) para detectar mlL-2 R-H/F biotinilado unido. Las placas entonces fueron incubadas por 1 hr a TA y lavadas 7X con PBS. La señal fue desarrollada usando 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), la reacción se detuvo con H2S04, y la absorbancia fue leída a 450 nm en un lector de placas ENVISION™ (Perkin Elmer). 108 scFv purificados por las puntas de PhyNexus IMAC fueron probados en este ensayo, y la mayoría compitió con el anticuerpo 18A5 parental para unirse al IL-21 R-H/F biotinilado de murino con IC50S menor que ese del 18A5 scFv paréntal. Los datos de la competencia del epítope para los 27 clones con las potencias más altas de los ensayos de neutralización basados en células se muestran en las FIGs. 4A-4C y se resumen en el Cuadro 5.

CUADRO 5 Neutralización de IL-21R de Humano y de Murino en Ensayos A base de Células i I L9 2.8 27.7 3.61 7 L10 15.1 7 nd 40 L11 4.2 38.3 10.03 6 L12 2.6 54.9 87.77 8 L13 11.0 257.4 1.25 7 L14 3.2 33.5 6.49 6 L15 3.3 30.3 53.49 14 L16 3.7 67.4 4.71 6 L17 1.6 60.3 2.66 12 LÍ8 3.7 54.4 8.34 8 L19 4.5 35.3 13.59 15 L20 3.1 57.5 15.39 5 L21 9.4 100 (estimado) 162.27 28 L23 1.5 15.3 nd 12 L24 2.4 18.7 3.73 6 L25 3.7 33.1 15.55 9 EJEMPLO 7 Conversión de 18A5 IgG parental a la Secuencia de línea Germinal I I Los siguientes quince scFv con las regiones VL modificadas, juntó con el 18A5 VL parental de línea germinal (véase lo siguiente), fueron seleccionados para la conversión a IgG lamda humano de longitud completa: L2, L3, L6, L9, L11 , L13, L14, L16, L17, L18, L19, L20, L23, L24, y L25. Cuatro scFv con las regiones VH modificadas, H3, H4, H5, y H6, junto con el 18A5 VH parental de línea germinal (véase lo siguiente) fueron seleccionados para la conversión a lgG1 humano de longitud completa.

Las secuencias de amino de VH y VL del anticuerpo 18A5 parental fueron modificadas de manera que las secuencias al exterior de las regiones de los CDR igualaron las secuencias humanas más cercanas de la línea germinal: DP67 VH4B+ (VBASE_AA: WAP00CEAZ_1) y JH1/JH4/JH5 en el caso de VH, y DPL16A/L3.1 (VBASE AA: WAPOOCEMM) en el caso de VL. Las modificaciones fueron realizadas por una combinación de síntesis de genes en GENEART (Regensburg, Alemania) y cambios dirigidos al sitio introducidos por PCR. Además, las secuencias fueron optimizadas en el codón para la expresión en células de mamífero por GENEART usando sus métodos propios. Una alineación de las secuencias 18A5 parentales y de las secúencias 8A5 corregidas de la línea germinal se muestra en lo siguiente: | 1 Comparación de Cadena Pesada de 18A5 18A5 VH parental CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGA-AGACTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCT GTCTCTGGTTACTCCATCAGCAGTGGTTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGTTG GAGTGGATTGGGAGTATCTCTCATACTGGGAACACCTACTACAACCCGCCCCTCAAGAGTCGCGTCACC ATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCC GTGTATTACTGTGCGCGAGGTGGGGGAATTAGCAGGCCGGAGTACTGGGGCAAAGGCACCCTGGTCACC GTGTCGAGT ( SEQ ID NO : 5 ) 8A5 VH de linea Germinal CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCC GTGTCCGGCTACTCCATCTCCTCCGGCTACTACTGGGGCTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAGGGCCTG GAGTGGATCGGCTCCATCTCTCACACCGGCAACACCTACTACAACCCCCCTCTGAAGTCCAGAGTGACC ATCTCCGTGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCTGTGACCGCTGCCGATACCGCC GTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGGAATCTCCAGACCTGAGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACC GTGTCCTCT (SEQ ID NO : 7 ) 8A5 VH de línea Germinal x 18A5 VH parental 1 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCTTCCGAGAC 5O MMiMiimimim mu n iiiiniii mi mu 1 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGACTTCGGAGAC 50 51 CCTGTCTCTGACCTGTGCCGTGTCCGGCTACTCCATCTCCTCCGGCTACT 100 lililí II lllli II II II II I II INI 51 CCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCAGCAGTGGTTACT 100 01 ACTGGGGCTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGC 150 11111111111111 I 11111 11 II 11111 II 01 ACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGTTGGAGTGGATTGGG 150 51 TCCATCTCTCACACCGGCAACACCTACTACAACCCCCCTCTGAAGTCCAG 200 II II II II III I 51 AGTATCTCTCATACTGGGAACACCTACTACAACCCGCCCCTCAAGAGTCG 200 01 AGTGACCATCTCCGTGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGT 250 II MUI II II MUI 11 II 11 II II II II 1111 II 111 III 01 CGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGA 250 51 CCTCTGTGACCGCTGCCGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGC 300 IMIIIMIMI 11 II II MMMil IMI II 51 GCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGAGGTGGG 300 01 GGAATCTCCAGACCTGAGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTC 350 II I II III II IMIIIMIMI I MUI II 01 GGAATTAGCAGGCCGGAGTACTGGGGCAAAGGCACCCTGGTCACCGTCTC 350 51 CTCT 354 (SEQ ID NO : 7 ) 51 GAGT 354 (SEQ ID NO: 5) Comparación de Cadena Ligera de 18A5 18A5 VL parental TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTCCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCACGCTCACATGCCAA GGAGACAGCCTCAGAACCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGTCAGGACAGGCCCCTATACTTCTC CTCTATGGTAAACACAAACGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGCTTCTCTGGCTCCACCTCAGGAGACACA GCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACTCC AGTGGCAACCCCCATGTTCTGT"TCGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTTTTA (SEQ ID NO : 9 ) 18A5 Vi de línea Germinal TCCTCTGAGCTGACCCAGGATCCTGCTGTGTCT6TGGCCCTGGGCCAGACCGTCAGGATCACCTGCCAG GGCGATAGCCTGAGAACCTACTACGCCTCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTGTGCTGGTG ATCTACGGCAAGCACAAGAGGCCATCCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCCTCCTCTGGCAATACC GCCTCCCTGACCATCACCGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTAACTCCCGGGACTCT TCCGGCAACCCTCACGTGCTGTTTGGCGGCGGAACCCAGCTGACCGTGCTA (SEQ ID NO: 11) 18A5 VL de línea Germinal x 18A5 VL parental 1 TCCTCTGAGCTGACCCAGGATCCTGCTGTGTCTGTGGCCCTGGGCCAGAC 50 II III II II II II MUI III III II III III MI MU IMM 1 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTCCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGAC 5 O 51 CGTCAGGATCACCTGCCAGGGCGATAGCCTGAGAACCTACTACGCCTCCT 100 MM I Mil MUI M II Mili IIIIIMI M 11 II 51 AGTCACGCTCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAACCTATTATGCAAGCT 100 101 GGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTGTGCTGGTGATCTACGGCAAG 150 MU UIMIIM I M MMMMII I U I UM U U 101 GGTACCAGCAGAAGTCAGGACAGGCCCCTATACTTCTCCTCTATGGTAAA 150 151 CACAAGAGGCCATCCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCCTCCTCTGG 200 MUI Mil II 11 IMM MI I MUI IIM M MM M 151 CACAAACGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGCTTCTCTGGCTCCACCTCAGG 200 201 CAATACCGCCTCCCTGACCATCACCGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCCG 250 I M II III IIIIIMIM M IIIIIMI II MIMIM I 201 AGACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGACGAGGCTG 250 251 ACTACTACTGTAACTCCCGGGACTCTTCCGGCAACCCTCACGTGCTGTTT 300 MU II II M M M II M I II I II II M IMM 251 ACTATTACTGTAACTCCCGGGACTCCAGTGGCAACCCCCATGTTCTGTTC 300 301 GGCGGCGGAACCCAGCTGACCGTGCTA 327 (SEQ ID NO: 11) MUI II IIIIIMI MUI II 301 GGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTTTTA 327 (SEQ ID NO: 9) ! Secuencia VH corregida de la línea germinal (los cambios de la secuencia parental están en negritas y subrayados) Parental (SEQ ID N0:6) QVQLQESGPGLVKTSETLSLTCAVSGYSISSGYY GWIRQPPGKG Línea germinal (SEQ ID NO: 8) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKG Parental LEWIGSISHTGNTYYNPPLKSRVTISVDTS NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGIS P Línea Germinal LE IGSISHTGNTYYNPPL SRVTISVDTS NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGISRP Parental EYWGKGTLVTVSS Línea Germinal EYWGQGTLVTVSS Secuencia VL corregida de la línea germinal (los cambios de la parental están en negritas y subrayados) Parental (SEQ ID NO: 10) SSELTQDPPVSVALGQTVTLTCQGDSLRTYYASWYQQKSGQAPIL Línea Germinal (SEQ ID NO:12) SSELTQDPAVSVALGQTVR1TCQGDSLRTYYASWYQQKPGQAPVL Parental LLYGKHKRPSGIPDRFSGSTSGDTASLTITGAQAEDEADYYC SRDSSGNPHVLFGGGTQ Línea Germinal VIYGKHKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGMPHVLFGGGTO Parental LTVL Línea Germinal LTVL EJEMPLO 8 ; Conversión del scFv Derivado de Genoteca a IgG Las regiones CDR3 de los dominios VL y VH de los derivados mejorados de 18A5 scFv fueron amplificadas por PCR y subclonadas en las estructuras VL y VH de corregidas de la ínea germinal del 8A5 parental por el siguiente método. Un fragmento de PCR que comprende la porción 5' de un i gen 8A5 VH de línea germinal fue generado por la amplificación del plásmido I pSMÉD2_OP18A5G_hulgG1 con cebadores BssHII_ll_VH_F (5'- GCTTGGCGCGCACTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAG-3') [SEQ ID NO: 230] y GVH_R_para_BssHII (S'-TCAGGGAGAACTGGnCnGG-S") [SEQ ID NO: 231]. Un fragmento de PCR comprendiendo la porción 3' del gen VH del VH3 del clon scFv mejorado fue amplificado con los siguientes cebadores: G_VH_F_para_Sall (5'- TCCAAGAACCAGTTCTCCCTG-3') [SEQ ID NO: 232] y scFv_Sall_VH_R (5'- GCGACGTCGACAGGACTCACCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3') [SEQ ID NO: 233]. Los fragmentos fueron purificados en gel, y después los dos fueron mezclados y amplificados con los conjuntos de cebadores externos BssHII_ G_VH_F y el Sall_VH_R para generar un fragmento génico de VH completo. Esteo fue digerido con BssHIl y Salí y ligado a un vector que contenía las regiones constantes de lgG1 humano con una región de articulación triple-mutante. El inserto fue re-amplificado con el BssHII_VH_F y un I cebador nuevo (Sal_VH_R_RJ (5 - GCGACGTCGACAGGACTCACCACTCGAGACGG-3')) [SEQ ID NO: 234] para alterar la secuencia codificante del segmento de VH J para conformar a la secuencia de línea germinal de JH1 , y ligado a un vector de región constante triple-mutante de lgG1 humano.

' Los genes de VL del scFv mejorado fueron subclonados por un método similar. Un fragmento de PCR que comprendiendo la porción 5' del gen 18A5 VL fue generado por la amplificación del plásmido pSMEN2_OP18A5G_hu Lambda con los cebadores BssHII_ll_VL_F (5'-GCTTGGCGCGCACTCTTCCTCTGAGCTGACCCAG-3') [SEQ ID NO: 235] y scFv_VL_R_para_BssHII (5' - GCCTGAGCCCCAGTGATGGTCA-3') [SEQ ID NO: 236]. Los fragmentos de PCR comprendiendo la porción 3' de los genes VL de los clones scFv mejqrados fueron amplificados con los cebadores GVL_F_para_Xbal (5'-ACCGCCTCCCTGACCATCAC-3') [SEQ ID NO: 237] y scFv_Xbal_VL_R (5'-GCGCCGTCTAGAGTTATTCTACTCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC TC-3') [SEQ ID NO: 238]. Los fragmentos fueron purificados en gel, y entopces los fragmentos correspondientes a las porciones 5' y 3' de cada gen fueron mezclados y amplificados con el cebador exterbo BssHII_ll_V|_F y el scFv_Xbal_V|__R para generar fragmentos génicos completos de V|_. Estos fueron digeridos con BssHIl y Xbal, y ligados en un vector que contenía las I regiones constantes del gen lambda humano.

EJEMPLO 9 Caracterización del IgG Mejorado In Vítro I EJEMPLO 9.1 i Expresión Transitoria a Pequeña Escala de las Proteínas de Unión ; Los clones fueron probados para su función en el formato IgG después de la expresión transitoria en células cos-7. Cada cadena ligera en el conjunto de dieciséis secuencias de prueba (18A5 VL parental de línea germinal y VL y L2, L3, L6, L9, L11 I, L13, L14, L16, L17, L18, L19, L20, L23, i L24 y L25) fue apareada con cada cadena pesada en el conjunto de cinco secuencias de prueba (H3, H4, H5, y H6, junto con VH_P, el dominio 18A5 VH parental de línea germinal). Cada plásmido en el pares (1.4 µg) fue combinado con ! el reactivo de trasnfección TRANSIT® (Mirus, Madison, Wl) según las instrucciones del fabricante, y se añadieron reactivos complejos de ADN: TRANSIT® a monocapas de células cos-7 cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/ suero bovino fetal inactivado por calor al 10%/penicilina/estreptomicina/L-glutamina 2 mM en placas de cultivo de tejido de 6 pozos. Después de 24 hr, el medio cambió a un medio sin suero (R1CD1), y después fue recolectado 48 horas después. Las proteínas de I unión, ahora comprendiendo anticuerpos de longitud completa, fueron cuantificadas por ELISA IgG anti-humano.

EJEMPLO 9.2 Actividad de Anti-IL-21 R IgG en la Neutralización de la Proliferación | Celular Los 80 IgG expresados transitoriamente en medio acondicionado libré de suero fueron probados para actividad en ensayos de proliferación dependientes de IL-21 en tres líneas celulares como se describió anteriormente: (1) células IL-21 R-BaF3 humanas, (2) células IL-21 R-BaF3 de murino, y (3) células IL-21 R-TFI humanas. Los 80 pares demostraron neutralización de la proliferación de las células BaF3 que expresan IL-21 R humano, y todos los pares excepto ésos que implican a VH4 demostraron la neutralización de las células TFI que expresan el IL-21 R humano (datos no mostrados). Los 80 pares también demostraron la neutralización de la proliferación de las células BaF3 que expresan el IL-21 R de murino, con la neutralización más fuerte generalmente asociada con las cadenas ligeras apareadas con la cadena pesada parental y la neutralización más débil generalmente asociada con la cadena pesada VH4 (datos no mostrados) . Los datos de la neutralización de las 21 combinaciones más potentes de IgG (AbA-AbU) se muestran en las FIGs. 5A-5I, y los datos de IC50 se resumen en el Cuadro 6.

Los ensayos fueron conducidos en las células IL-21 R-BaF3 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humano (FIGs. 5A-5C), células IL-21 R-TF1 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humano (FIGs. 5D-5F), o células IL-21 R-BaF3 de murino con 400 pg/ml de IL-21 de murino (FIGs. 5G-5I). Se añadió IL-21 a las células después de los anticuerpos indicados; la proliferación fue medida con CELLTITER-GLO® después de 48 horas. Las FIGs. 26A-26C muestran estudios adicionales que demuestran una inhibición similar en las mismas tres líneas celulares. i EJEMPLO 9.3 Unión anti-IL-21R IgG de IL-21 R de Mono Cynomolgus y de Rata Expresado Transitoriamente Un subconjunto de proteínas de unión fue ensayado para unión a una;subunidad común de rata, mono cynomolgus, IL-21 R humano, o IL-2R- ? humano expresada transitoriamente en las superficies de células de CHO-PA--Dukx. Las células fueron transfectadas 48 hr antes del ensayo. En el día del ensayo, las células fueron suavemente lavadas 5X en PBS que contenía CaCI2 0.9 mM y MgCI2 0.45 mM (PBS/CaMg) en una lavadora de placas automatizada (Titertek, Huntsville, AL), y bloqueado por 1 hr a TA en PBS/CaMg/leche seca sin grasa al 5%. El medio acondicionado de IgG anti- IL-21 R transitoriamente expresados fue diluido en serie en amortiguador de bloqueo y añadido a las células en las placas bloqueadas por 1 hora a TA. Las células fueron lavadas 5X con PBS/CaMg y entonces incubadas con peroxidasa de rábano-conjugado de IgG anti-humano por 1 hr a TA. Las células entonces fueron lavadas 10X en PBS/CaMg y todo el amortiguador de lavado fue eliminado. Las células fueron incubadas con 100 µ? de TMB hasta que ¡el color de la reacción alcanzó la saturación, se detuvo con 100 µ? de H2SO y se leyó a A450 en un lector de placa Perkin Elmer ENVISION™.

! Todos los veintiuno IgG unidos a células CHO expresaron transitoriamente IL-21 R humano (FIGs. 6A-6C), rata (FIGs. 6D-6F), o mono cynómolgus (FIGs. 6G-6I). La mayoría no mostró unión de fondo a una proteína del control (cadena común gamma (?) humana) expresada transitoriamente en células CHO, pero un subconjunto de IgG (AbD, AbE, AbF¡ AbH, AbL, y AbM) se unió sobre el fondo a 13 nM o más (FIGs. 6J-6I). Los datos se resumen en el Cuadro 6.

CUADRO 6 Resumen de Neutralización de Actividad IL-21R Humana y de Murino en Ensayos de Proliferación Celular y Unión a IL-21 R de Humano, Rata, y Mono Cynomolgus Expresado en Células de CHO EJEMPLO 9.4 Análisis BIACORE™ de la Selectividad de la unión IgG anti-lL-21R a IL- 21 R humano La especificidad del unión de un subconjunto de proteínas de j unión transitoriamente expresadas anti-IL-21 R (aquí anticuerpos) fue probada en un instrumento de resonancia de plasmón de superficie BIACORE™ 2000.

Los anticuerpos de ¡mnumoglobulina anti-humano-lgG, anti-murino, y el IL- 21R†H/F de murino fueron inmovilizados sobre una microplaqueta de carboximetil-dextrano grado investigación (CM5) usando el acoplamiento de amina estándar. La superficie de al microplaqueta del sensor fue activada con EDC/NHS por 7 minutos a un caudal de 20 µ?./min. La primera celda de flujo fue usada como superficie de referencia para corregir el índice de refracción de masa, los efectos de la matriz, y la unión no específica. Los anticuerpos de captura (7.150 unidades de resonancia (RU) de anticuerpo anti-humano-Fc (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) en la celda de flujo 2 y 7,500 RU del anticuerpo anti-murino-Fc en la celda de flujo 3) fueron diluidos a 10 µ?/??? en amortiguador de acetato de sodio (pH 5.0) y inyectado sobre la superficie activada. Los grupos activados remanentes fueron bloqueados con etanolamina 1.0 M (pH 8.0). Los pesos moleculares del IgG anti-humano y del IgG anti-murino fueron ambos 150 kD, y el peso molecular del monómero de IL-21 R fue 27 kD. í El medio acondicionado que contiene los anticuerpos IL-21 R y los controles del anticuerpo (murino anti-humano ??_-2? y murino anti-humano IL-4R (R&D Systems, Minneapolis, MN) humano anti-humano IL-13 (Wyeth, Cambridge, MA)) fueron diluidos en amortiguador de HBS/ EP suplementado con Ó.2% de suero bovino e inyectado sobre las cuatro celdas de flujo de la micro-plaqueta BIACORE™, capturando 500-700 (RU) del anticuerpo en el anticuerpo de captura de la especie apropiada. Siguiendo un período de lavado de 5 seg, soluciones 50 nM de una proteína de control positivo (IL-21R-H/F de murino), dos proteínas humanas relacionadas a IL-21R (??-2?ß y slL-4R humano (R&D Systems)), o una proteína etiquetada His/FLAG no relacionada (IL-13-H/F humano), fueron inyectadas sobre los anticuerpos capturados en la micorplaqueta. Las fases de asociación y disociación fueron controladas por 120 y 180 seg, respectivamente, seguido por dos inyecciones de 5 µ? de glicina (pH 1.5) para regenerar una superficie de captura completamente activa. Todos los experimentos de unión fueron realizados a 25 °C en amortiguador de HBS/EP. Los efectos del modelo y del amortiguador fueron restados para cada sensograma usando una doble referencia.

Todos los anticuerpos anti-IL-21 R probados (anticuerpo 18A5 y AbA-AbU) demostraron una clara unión al IL-21R de murino, pero ninguna unión al IL-2RP de las proteínas humanas relacionadas con IL-21 R- y al IL-4R soluble humano, o al IL-13-His/FLAG de la proteína humana IL-13-His/FLAG etiquetada no relacionada (FIGs. 7A-7C). Los controles indicaron que el IL- i I 2Rp ¡y el IL-4R soluble humano podrían ser capturados por anticuerpos específicos anti-IL-2R y anti-IL-4R (FIG. 7D).

EJEMPLO 9.5 Purificación de Anticuerpos Transitoriamente Expresados Siete anticuerpos (versiones triple-mutantes del lgG1 humano: AbS, AbT, AbO, AbP, y AbU; y versiones doble-mutantes: AbQ y AbR) fueron exprésados transitorimente en células cos-7 y purificados para análisis postérior. Además, tres versiones de AbT con extremos de IgG humano con diferentes niveles esperados de unión al receptor Fe (lgG1 , lgG4 del tipo silvestre, y doble-mutantes de lgG1) también fueron preparados. Fue seguido el protocolo TRANSIT® descrito anteriormente, excepto que 25 µg de cada plásmido fueron usados para transfectar a células en cada uno de ocho matraces T-175. Siguiendo a la primera recolección del medio acondicionado, se añadió R1CD1 fresco y después se recolectó después de 72 hr adicionales. El medio acondicionado fue combinado y filtrado en un filtro de 0.22, µ??. Los anticuerpos fueron cargados sobre resina de proteína A, eluidos con ácido cítrico 20 mM/ cloruro de sodio 150 mM (pH 2.5), neutralizados con tris (pH 8.5), y dializados en PBS.

EJEMPLO 9.6 Análisis Bl ACORE™ del Unión de Anticuerpo a IL-21R de Humano y de Murino La cinética de la unión de los anticuerpos anti-IL-21 R a IL-21 R- H/F de humano y de murino fue probada en un instrumento de resonancia de plasmón de superficie BIACORE™. Los anticuerpos IgG anti-humano (Invitrogen Corporation) fueron inmovilizados sobre una microplaqueta de carboxi-metil-dextrano grado investigación (CM5) usando el acoplamiento de amina estándar. La superficie fue activada con EDC/NHS por 7 min a un flujo i de 20 µ?./min. La primera celda de flujo fue usada como superficie de referencia para corregir el índice de refracción de volumen, efectos de la matriz, y la unión no específica. El anticuerpo anti-humano-Fc fue diluido a 20 g/ml en amortiguador de acetato de sodio 10 mM (pH 5.0), y se capturaron 2950-3405 unidades de resonancia (RU) en cada una de las cuatro celdas de flujo Los grupos activados restantes fueron bloqueados con etanolamina-HCI 1 .0 M (pH 8.5).

! Los anticuerpos anti-IL-21 R fueron diluidos a 0.1 -0.2 µ /p en amortiguador de HBS/EP suplementado con 0.2% de albúmina de suero i bovino y cargado sobre la microplaqueta BIACORE™. Después de un breve período de lavado, las soluciones de 0-100 nM de IL-21 R-H/F humano o de 0-500 nM de IL-21 R-H/F de murino fueron inyectadas sobre la microplaqueta a un caudal de 50 µ?./min. La fase de la asociación fue operada por 3 min para i la cinética del IL-21 R de humano y de murino, y la fase de disociación fue monitoreada por 15 min para ML-21 R y por 5 min para mlL-21 R, seguido por dos inyecciones de 10 µ? y una inyección de 30 µ? de glicina (pH 1.5), para regenerar una superficie de captura completamente activa. Todos los experimentos de unión fueron realizados a 25 °C en amortiguador de HBS/EP, y el bastidor de muestras fue mantenido a 15 °C. Los efectos del modelo y del amortiguador fueron restados para cada sensograma usando doble referencia. Los sensogramas se muestran en las FIGs. 8A-8B (IL-21 R-His/FLAG humano) y 8C-8D (IL-21 R-His/FLAG de murino). Los parámetros cinéticos de unión se muestran en el Cuadro 7A, y datos adicionales de la cinética de un experimento de réplica se muestran en el Cuadro 7B.

Además, los AbS y AbT fueron probados para la cinética de unión al IL-21 R-H¡s/FLAG del mono cynomolgus por el protocolo descrito anteriormente. Los perfiles de unión al IL-21 R-H/F humano y del mono cynomolgus fueron similares para los AbS y AbT (FIGs. 9A-9D). Las FIGs. 9A-9D muestran IL-21 R-His/FLAG del mono cynomolgus unido a AbS (FIG. 9A); y a AbT (FIG. 9C); y IL-21 R-His/FLAG humano unidos a AbS (FIG. 9B); y AbT (FIG. 9D).

CUADRO 7A Parámetros de la Cinética de Unión del Anticuerpo Anti-IL-21R a IL-21R- His/FLAG de Humano y de Murino CUADRO 7B Parámetros de la Cinética de Unión del Anticuerpo Anti-IL-1 R a I L-21 R-H is/F LAG de Humano IL-21 R humano Anticuerpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) 18A5 3.04E+05 1.34E-03 4.40E-09 AbP 2.33E+05 1.02E-04 4.36E-10 AbQ 4.39E+05 9.34E-05 2.13E-10 AbR 2.48E+05 9.76E-05 3.94E-10 AbS 2.02E+05 3.05E-04 1.51 E-09 AbT 2.73E+05 7.24E-05 2.72E-10 AbU 2.38E+05 7.83E-05 3.29E-10 EJEMPLO 9.7 Ensayo de la Competencia de Epítope de BIACORE™ i Los anticuerpos AbS y AbT y el anticuerpo 18A5 parental fueron inmovilizados directamente sobre una microplaqueta CM5 BIACORE™. Se dejó fluir IL-21 R-H/F de murino (100 nM) sobre la microplaqueta por 300 seg, seguido por un lavado (100 seg), y luego una solución de 5 µ9/Gp? de cualquiera de AbS, AbT, D5, o un anticuerpo anti-mlL-21 R no neutralizante (7C2) se dejó fluir sobre la superficie. No se observó unión adicional con los AbSj AbT, y D5, indicando que su sitio de unión en mlL-21 R-H/F fue bloqueado por la unión simultánea a AbS, AbT, o al anticuerpo 18A5 (FIG. 10A);. En cambio, el anticuerpo anti-IL-21 R de control no neutralizante 7C2 fue capaz de unirse al mlL-21 R-H/F capturado en AbS, AbT, o el anticuerpo 8A5, indicando que este anticuerpo de control se unió en un epítope diferente del que está unido por los anticuerpos de captura. í De manera similar, el AbS y AbT no se unieron a IL-21 R-H/F humano capturado por AbS o AbT inmovilizado en una microplaqueta CM5 BIACORE™, mientras que el anticuerpo de control anti-humano IL-21 R (9D2) fue capaz de unirse al IL-21 R-H/F humano capturado por AbS o AbT (FIG. 10B). Esta observación sugirió que el sitio de unión para el AbS fue bloqueado i por la unión simultánea del AbT, y viceversa.

EJEMPLO 9.8 Ensayos de Proliferación a Base de Células Los IgG purificados fueron probados para la actividad en ensayos de proliferación dependientes de IL-21 en tres lineas celulares como se describió anteriormente: células IL-21 R-BaF3 humanas, células IL-21 R-BaF3 de murino, y células IL-21 R-TF-1 humanas. Todas mostraron una fuerte inhibición de la proliferación dependiente de IL-21 R tanto humana y como de murino con una potencia mayor que esa del 18A5 IgG parental (FIGs. 11A-11 C, Cuadro 8). Los ensayos fueron conducidos en células IL-21 R-BaF3 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humano (FIG. 11 A), células IL-21 R-BaF3 de murino con 200 pg/ml de IL-21 de murino (FIG. 11 B), y células IL-21 R-TF-1 humanas con 100 pg/ml de IL-21 humano (FIG. 11 C). La FIG. 26D representa los resultados de un estudio adicional de los efectos de estos anticuerpos en las células IL-21 R-BaF3 humanas.

CUADRO 8 Neutralización de la Proliferación de Células IL-21 R-BaF3 Humanas. Células IL-21 R-BaF3 de Murino. y de Células IL-21 R-TF-1 humanas I EJEMPLO 9.9 Ensayos de Proliferación de Células B Primarias Humanas Los anticuerpos anti-IL-21R fueron probados para su capacidad de inhibir la proliferación dependiente de IL-21 de las células B primarias humanas. Células de la capa leucocitaria de donadores humanos sanos fueron obtenidas del Hospital General de Massachusetts (Boston, MA). Las células fueron incubadas con un cóctel de enriquecimiento de células B ROSETTESEP™ (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá), y las células B aisladas según las instrucciones del fabricante. La población resultante (60-80% de células CD19+ B) fueron cultivadas en RPMI que contenía FBS al 10%, 50 U/ml de penicilina, 50 µ9/??? estreptomicina, y L-glutamina 2 mM a 1x105/pozo en placas de fondo plano de 96 pozos. Las células B fueron pretratadas con anticuerpos anti-humanos IL-21 R diluidos en serie en una incubadora a 27 °C ajustada a 5% de CO2 por 30 min. Entonces las células B tratadas fueron estimuladas con 0.5 µ?/??? de mAb anti-CD40 (BD Biosciences, Santo José, CA) y 10 ng/ml de citocina IL-21 por 3 días en una incubadora a 37 °C ajustada a 5% de C02. En el día 3, los cultivos fueron pulsados con 0.5 µ /???? de 3H-timidina (Perkin Elmer (NEN)) y se recolectaron 5 horas después sobre esteras de filtro de fibra de vidrio. La incorporación de la 3H-t¡midina fue determinada por recuento de centelleo líquido. Todos los anticuerpos mejorados neutralizaron la proliferación dependiente de IL-21 con una potencia mayor que el anticuerpo 8A5 parental (FIGs. 12A-12B, Cuadro 9; también véase la FIG. 26E). j i CUADRO 9 Neutralización de la Proliferación de Células B Primarias Humanas ? EJEMPLO 9.10 Ensayos de Proliferación de Células T Primarias Humanas Los anticuerpos anti-IL-21 R fueron probados para su capacidad de inhibir la proliferación dependiente de IL-21 de células CD4+ T primarias humanas. Células de la capa leucocítica de donadores humanos sanos fueron obtenidas de Hospital General de Massachusetts. Las células CD4+ T fueron aisladas por selección negativa usando un cóctel de enriquecimiento de células CD4+ T ROSETTESEP™ (StemCell Technologies), según las instrucciones del fabricante. La población resultante fue ~80-90% de células CD4+/ CD3* T. Las células CD4+ T humanas enriquecidas fueron activadas por 3 días con microesferas revestidas con anti-CD3/anti-CD28 en RPMI que contenía FBS al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, L- glutamina 2 mM, y HEPES en una incubadora a 37 °C ajustada a 5% de C02.

Después de la activación, las microesferas fueron eliminadas y lavadas y reposadas durante la noche a aproximadamente 1x10 células/ml en medio de cultivo. Las células reposadas fueron luego lavadas de nuevo antes de la adición a las placas de ensayo. Se realizaron diluciones seriales de los i anticuerpos del receptor IL-21 anti-humano en medio de cultivo en placas de 96 pozos de fondo plano, seguido por la adición secuencial de IL-21 humano (concentración final de 20 ng/ml) y de las células CD4+ T activadas y reposadas ( 05 células/pozo). Las placas entonces fueron incubadas por 3 días, adicionales y pulsadas con 1 µ??/???? de 3H-timid¡na (Perkin Elmer I I (NEN)) durante las 6 horas finales del ensayo. Las células fueron recolectadas sobre esteras de filtro de fibra de vidrio y se determinó la incorporación de 3H- timidina por recuento de centelleo líquido. Todos los anticuerpos mejorados neutralizaron la proliferación dependiente de IL-21 con una potencia mayor que el anticuerpo 18A5 parental (FIG. 13, Cuadro 10A; también véase la FIG. 26F).

CUADRO 10A Neutralización de la Proliferación de Células T Primarias Humanas EJEMPLO 9.11 ¡ Ensayos de Proliferación de Células T Primarias de Murino Los anticuerpos anti-IL-21 R fueron probados para su capacidad de inhibir la proliferación dependiente de IL-21 de células CD8+ T primarias de murino. Se recolectaron los nodulos linfáticos popliteales, axilares, braquiales, I e inguinales y los bazos de ratones hembra BALB/C de 12 semanas de edad. Una suspensión unicelular de las células de bazo fue agotada de glóbulos rojos usando NH4CI 0.16 M en tris 0.017 M (pH 7.4). Las células del bazo y del nodulo linfático fueron combinadas y enriquecidas para las células CD8+ T usando un kit de la Columna del Subconjunto CD8 de Células T de murino (R&D Systems). Las células CD8+ de murino (3x104; suspendidas en DMEM que contenía el suero de ternera fetal al 10% y suplementado con ß-mercaptoetanol 0.05 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estréptomicina y 50 µg/ml de gentamicina) fueron colocadas en placas de activación ant-mCD3 de 96 pozos (BD Biosciences); se añadió mlL-21 (50 ng/ml) a todos los pozos. Los anticuerpos de prueba fueron valorados por triplicado comenzando en 20 g/ml. Se cultivaron las células por 3 días en una incubadora a 37 °C/ 10% de C02. Durante las últimas 5 hr de cultivo, las células fueron marcadas con 0.5 µ?\ de metil-3H-timidina/pozos (GE Healthcare). Las células fueron recolectadas usando un recolector de células Mach III (TomTec, Hamden, CT) y contadas usando un contador de microbeta Trilux (Perkin Elmer). Además de AbP, todos los anticuerpos mejorados neutralizaron la proliferación dependiente de IL-21 con una potencia mayor que lel anticuerpo 18A5 parental (FIG. 14, Cuadro 10B; también véase la FIG. 26G).

CUADRO 10B Neutralización de la Proliferación de Células T Primarias de Murino EJEMPLO 9.12 Ensayo de ADCC ! Los anticuerpos anti-IL-21 R fueron probados para que su capacidad para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) cuando son unidos a las células diana. El día antes del experimento, PBMC fueron aisladas de la capa leucocítica diluyendo la capa leucocítica 1 : 1 en RBS, estratificándolas sobre FICOLL® (GE Healthcare), y centrifugándolas a 1200 g por 20 Min. Las PBMC fueron eliminadas del parte superior de la capa FICOLL®, lavadas, y estimuladas durante la noche con 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL- 12 (R&D Systems). El día del experimento, las PBMC estimuladas fueron recogidas por centrifugación y resuspendidas en medio a 1 x108 células/ml. Las células BJAB fueron marcadas con 0.5 µ? de CFSE (MOLECULAR PROBES®, Invitrogen Corporation) por 10 min a 37 °C, y luego lavadas con suero bovino fetal una vez y con PBS dos veces. Las células fueron entonces colocadas en placas de fondo plano de 96 pozos a 2x105 células/pozo en 100 µ? de medio. Cincuenta µ? de los anticuerpos 4x fueron añadidos a las células BJAB, seguido por 5x106 de PBMC en 50 µ?, dando una relación final de 1 :25 de diana:célula efectora. Las células fueron incubadas a 37 °C por 6 hr y teñidas con yoduro de propidio (Pl) para marcar las células muertas y muriendo. La destrucción de células diana (CFSE+) fue evaluada al medir la tinción de Pl en un citómetro de flujo FACSCALIBUR™ (BD Biosciences). Solamente un anticuerpo anti-lL-21 R, AbZ, que tiene una región constante de IgGI humana del tipo silvestre, demostró ADCC sobre el nivel de fondo presentado por un anticuerpo de control anti-IL-13 que no se unió a las células diana. Todos los anticuerpos con los mismos dominios variables que AbZ, incluyendo las formas con lgG4 humano (AbY), y ésos con las formas doble-mutantes (AbX) y triple-mutantes (AbT) de IgGI humano, demostraron solamente niveles de fondo de ADCC (FIG. 15). Todos los otros anticuerpos anti-IL-21 R probados contuvieron la forma triple-mutante de IgGI humano y demostraron ADCC del fondo. Un anticuerpo de control positivo, rituximab (RITUXAN®), indujo ADCC en todos los experimentos.

EJEMPLO 9.13 ELISA de C1q Para determinar si la unión a la superficie celular por los anticuerpos anti-IL-21 R puede conducir a la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), los anticuerpos fueron probados para su capacidad de unirse al componente C1q del complemento en un ELISA. Los anticuerpos de IL-21 R y rituximb (RITUXAN®) fueron diluidos en PBS a 5 µg ml. Los anticuerpos diluidos (100 µ?) fueron revestidos sobre un placa de ELISA de alta-unión COSTAR® (Corning Life Sciences, Lowell, MA) durante la noche a 4 °C. Las placas fueron lavadas 3X con PBS/Tween-20 y bloqueadas con 200 µ? de amortiguador de bloqueo (NaPO4 0.1 M, NaCI 0.1 M, 0.1 % de gelatina, 0.01 % de Tween) por 1 hr a TA. El suero humano previamente determinado como conteniendo C1q (Quidel, San Diego, CA) fue diluido 1 :50 en PBS. Después de 1 hr de bloqueo, las placas fueron lavadas y se añadieron 100 µ? de suero diluido a cada pozo y se incubaron por 2 hr a TA en un sacudidor. i Después de tres lavados, 100 µ? de anticuerpos C1q anti-humano policlonales de pollo a 0.1 µg/ml (AbCam, Cambridge, mA) fueron añadidos a cada pozo e incubados por 1 hr a TA. Las placas fueron lavadas de nuevo e incubadas con 100 µ? de un anticuerpo policlonal de conejo a Ig-Y-HRP de pollo diluido 1 :4000 (AbCam) por 1 hr a TA. Las placas fueron lavadas y desarrolladas con TMB por 5 min, seguido por 50 µ? de H2SO4 1 M para detener la reacción, y entonces se leyó a 450 nm. Solamente un anticuerpo anti-IL-21 R, AbZ, que tiene una región constante de lgG1 humana del tipo silvestre, demostró unión a C1q sobre el nivel del fondo desplegado por un anticuerpo de control con una ¡región constante triple-mutante de lgG1 humana que previamente no había mostrado unión al C1q. Todos los anticuerpos con los mismos dominios variables que AbZ, incluyendo las formas con lgG4 humano (AbY), y ésas con las formas doble-mutantes (AbX) y triple-mutantes (AbT) de IgGI humano, i demostraron solamente niveles de fondo de unión de C1q (FIG. 16). Todos los otros anticuerpos anti-IL-21 R probados contuvieron la forma triple-mutante de IgGI'humano y demostraron unión de C1q del fondo.

¡ EJEMPLO 9.14 Ensayo de Competencia de Citocina i Para demostrar que el anticuerpo AbT se une al IL-2 R de murino de una forma que compite con la citocina IL-21 , se realizó un ensayo de competencia de citocina. El anticuerpo AbT fue revestido en 1 µg/ml sobre placas de ELISA, que fueron entonces bloqueadas con BSA al 1 % en PBS/Tween al .05%. El IL-21 R- His/FLAG biotinilado de murino (1.5 ng/ml) fue añadido a los pozos, ya sea solo o en presencia de concentraciones en aumento de IL-21 de murino, y la unión del receptor al anticuerpo inmovilizado fue detectada con HRP-estreptavidina conjugada y la incubación subsiguiente con¡ el reactivo de detección TMB. La IL-21 de ratón fue capaz de bloquear la unión del mlL-21 R al AbT casi totalmente sobre 4 ng/ml, indicando que el anticuerpo y la citocina compiten por la unión al IL-21 R de murino (FIG. 27A).

Se realizó un segundo ensayo para demostrar que el anticuerpo AbS se une a IL-21R de murino de una manera que compite con la citocina IL-21. lL-21 R-Fc de murino se capturó en placas de ELISA revestidas con un -anticuerpo anti-ratón lgG2a. Las placas se bloquearon con BSA al 1 % en PBS y servaron, y se añadieron diversas concentraciones de AbS a la placa en presencia de 10 pg/ml de mlL-21. La unión de mlL-2 al receptor se detectó a I través de un anticuerpo anti-HiS6 conjugado a HRP, y la unión de AbS al receptor se detectó por un anticuerpo Ig anti-humano. Las concentraciones de AbSi por arriba aproximadamente de 2 pg/ml evitaron completamente la unión de nhlL-21 a mlL-21 R-Fc, indicando que el anticuerpo y la citocina compiten por la unión a IL-21 R de murino (FIG. 27B).

I EJEMPLO 9.15 Inhibición de proliferación de células T de rata por anticuerpos anti-IL- 21R Células T esplénicas de rata hembra de Lewis se purificaron a 95% de CD3+ usando Columnas de Enriquecimiento de Células T de Rata (RTCC-25; R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se i realizaron diluciones en serie de los anticuerpos IL-21 R anti-humano y proteina de control de isotipo en medio de cultivo (medio de Eagle modificado de Dulbecco que contiene FCS al 10%, L-glutamina, beta-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina y gentamicina) en placas de cultivo de tejido de 96 pozos de fondo plano que habían sido revestidas con 1 pg de anticuerpo CD3 anti-rata(BD Pharmingen Cat# 554829), seguido de la adición de 5 ng/ml de IL-21 de rata y 20,000 células T de CD3 por pozo. Las células crecieron durante 3 días en una incubadora humidificada con C02 al 10%, 37°C. Durante las últimas 5 horas de cultivo, las células se marcaron con 0.5 pCi de 3H-timidina (GE Amersham i Cat#! TRA-120). Las placas se cosecharon sobre esteras de filtro de fibra de vidrió mediante un cosechador de placas Tomtec Mach III y se contaron en un Contador Microbeta Perkin Elmer 1 50.

La respuesta de las células T de rata a 5 ng/ml de IL-21 de rata fue 6 veces superior a la respuesta de fondo para 1 pg de anti-CD3 solo. Los anticuerpos AbS, AbU, AbV y AbW fueron capaces de inhibir la incorporación de ^H-timidina estimulada por 5 ng/ml de IL-21 de rata (57,000 cpm en ausencia de tratamiento de anticuerpo; FIG. 28):· Los valores de IC50 para neutralización en dos experimentos independientes se muestran en el Cuadro 1 1. i CUADRO 11 Bloqueo de proliferación de células T de rata dependientes de IL-2 mediante anticuerpos anti-IL-21R í Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar con no más que experimentación de rutina, muchos de equivalentes de las modalidades específicas de la invención aquí descrita. Dichos equivalentes pretenden estar comprendidos por las siguientes reivindicaciones.

Claims (49)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia(s) de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, ;86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 112, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148; 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248.

2.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antigeno es un anticuerpo.

3.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un scFv.

4. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un VH.

5. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un VL.

, 6.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un CDR.

! 7.- Una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que i es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia(s) de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 1 13, 1 15, 1 17, 1 19, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 ; 239, 241 , 243, 245 y 247.

8.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un anticuerpo.

9. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un scFv.

10. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un VH .

! 1 1.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un VL.

12.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un CDR.

13.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además I porque comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 , 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 114, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 , 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171 -193, 213- 229, 240, 242, 244, 246, y 248.

? 14.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un anticuerpo.

15.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un í antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además

I porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un scFv. i 16.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un VH-

17. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un VL.

18. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además i porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un CDR. i i

19.- Una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia(s) de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, i 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, , 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162-195, 213-229, 240, 242, 244, 246, y 248, y en donde, si la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169, 170, 1 94, y 195, . entonces la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno también debe comprender por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96 , 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160,' 162, 165-168, 171 -193, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248.

20.- Una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia(s) de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, ? 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 239, 241 , 243, 245 y 247, y en donde, si la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 7, 9 y 11 , entonces la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno debe también comprender por lo menos una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) de nucléótídos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 11 1 , 113, 1 15, 1 17, 1 19, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 /239, 241 , 243, 245 y 247.

' 21.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, I 108,: n o, 1 12, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162-195, 213-229, 240, 242, 244, 246, y 248, en donde, si la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169 , 170, 194, y 195, entonces la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno también debe comprender por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia(s) de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 114, 1 16, 118, 120, 122, 124, 126; 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248.

22. - Una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende una cadena ligera y una cadena pesada, y en donde la cadena pesada comprendé por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 68, 70, 72, 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240 y 242.

23. - Una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une al IL-21 R, en donde la proteína de unión o j 151 fragmento de unión a un antígeno de la misma comprende una cadena ligera i y una cadena pesada, y en donde la cadena ligera comprende por lo menos una! secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214Í-217, 220-229, 244, 246 y 248. i

24.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende un dominio VL y un dominio VH, y en donde el dominio VH comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs. 14, 16, 18 y 20.

25.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno comprende un dominio i VL y un dominio VH, y en donde el dominio VL comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 215, 217, 221, 223, 225, 227 y 229.

26.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de ¡ conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizada además porque la cadéna pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240, y 242, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del i grupo que consiste de SEQ ID NOs: 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214, 216, 220, 222, 224, 226, 228, 244 , 246 y 248.

27.- Una proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de la misma que se une a un epítope de IL-21 R que es reconocido por una proteína de unión seleccionada del grupo que consiste de AbA-AbW, H3-H6, L1-L6, L8-L21 , y L23-L25, en donde la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe competitivamente la unión de una proteína de unión |seleccionada del grupo que consiste de AbA-AbW, H3-H6, L1-L6, L8-L21 , yÍ L23-L25, al IL-21 R humano.

| 28.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque comprende una cadena pesada, una cadena ligera, o un fragmento Fv que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14, 16, 8, 20, 22 , 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 , 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 1 16, 118, 120, 122 , 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 1-50, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213 -229, 240, 242, 244, 246 y 248.

; 29.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque comprende una cadena pesada, una cadena ligera, o un fragmento Fv que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucléótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 6;3, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 , 99, i 101 , 'l 03, 105, 107, 109, 1 11 , 113, 1 15, 1 17, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , ¡133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 239, 241 , 243, 245 y 247.

30.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la constante de asociación de la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno para el IL-21 R humano es por lo menos aproximadamente 10 M s .

' 31.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la proliferación mediada por IL-21 de células BaF3 con un IC50

I de aproximadamente 1.75 nM o menor, y en donde las células BaF3 comprenden un IL-21 R humano. 1 32.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la proliferación mediada por IL-21 de células TF1 con un IC50 de aproximadamente 14.0 nM o menor, y en donde las células TF1 comprenden un IL-21 R humano.

33.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la proliferación mediada por IL-21 de células B primaria humanas con un IC5o de aproximadamente 1.9 nM o menor, y en donde las células B comprenden un IL-21 R humano.

' 34.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la proliferación mediada por IL-21 de células CD4+ primarias humanas con un IC50 de aproximadamente 1.5 nM o menor, y en donde las células CD4+ comprenden un IL-21 R humano.

\ 35.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno se une específicamente a una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a cualquier secuencia de por lo merlos 00 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2. i

36.- La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno inhibe la unión de la IL-21 al IL-21 R.

37. - La proteína de unión o fragmento de unión a un antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es lgG1.

38. - La proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es humano.

39. - Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20. i

40.- Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, ó 20.

41 . - Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 40.

42. - Una célula hospedera transformada con el vector de la reivindicación 41.

43. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la célula hospedera es una bacteria, célula de mamífero, célula de levadura, célula de planta, o célula de insecto.

44. - Un kit de diagnóstico que comprende la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 19, o 20.

45. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 9-38, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un anticuerpo.

46. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 9-38, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un scFv.

47. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 9-38, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un VH.

48. - La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 9-38, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un Vi_.

49.- La proteína de unión aislada o fragmento de unión a un antjgeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 9-38, caracterizada además porque la proteína de unión o fragmento de unión a un antígeno es un CDR.