MX2010010271A - Destruccion de productos microbianos a traves de digestion enzimatica. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento de componente de diálisis proveyendo un componente de diálisis y poniendo en contacto el componente de diálisis con una enzima. La enzima rompe contaminantes microbianos en el componente de diálisis. La enzima puede hacer que los contaminantes microbianos pierdan resistencia en el componente de diálisis para proporcionar un componente de diálisis purificado. El componente de diálisis purificado puede estar substancialmente libre de contaminantes microbianos que causan una respuesta a citocina en seres humanos.

Description

DESTRUCCION DE PRODUCTOS MICROBIANOS A TRAVES DE DIGESTION ENZI MATICA Antecedentes La presente descripción se refiere de manera general a métodos para remover contaminantes de componentes de diálisis. De manera más particular, la presente descripción se refiere a métodos para destruir productos microbianos en una solución de diálisis, o en los componentes usados para hacer una solución de diálisis, mediante digestión enzimática , y métodos para usar la solución de diálisis purificada o componente de la misma.

Se requiere que los productos farmacéuticos parenterales estén libres de substancias contaminantes, tales como aquéllos que pudieran causar peritonitis. La peritonitis, o inflamación del peritoneo, es una complicación mayor de la diálisis peritoneal. La peritonitis puede ser provocada por infecciones bacterianas intraperitoneales. De manera alternativa, la peritonitis provocada por un químico o un irritante de cuerpo extraño es conocida como peritonitis aséptica o estéril. La peritonitis estéril es acompañada con desarrollo de un dialisado nebuloso. A pesar de la prueba existente de soluciones de diálisis peritoneal, brotes de peritonitis aséptica todavía ocurren.

Breve descripción La presente descripción se refiere a métodos para remover contaminantes bacterianos a partir de componentes de diálisis y de usar soluciones de d iálisis hechas a partir de los componentes. En una modalidad general , la presente descripción proporciona un método para tratar un com ponente de diálisis. El método comprende proporcionar un componente de diál isis y contactar el componente de diálisis con uno o más enzi mas. La o las enzimas descom ponen contaminantes microbianos en el componente de diál isis. La o las enzimas pueden ser separadas del componente de diálisis para proporcionar un componente de diálisis purificado. El componente de diálisis purificado puede estar substancial mente libre de contaminantes microbianos que provocan una respuesta de citocina en humanos.

En una modalidad , el componente de diálisis es un agente osmótico. Por ejemplo, el agente osmótico puede ser glucosa , fructosa, pol ímeros de glucosa, derivados de pol ímeros de glucosa, polioles, aminoácidos, péptidos, proteínas, amino azúcares, N-acetil glucosamina (NAG) , glicerol o combi naciones de los mismos. En modalidades alternativas, el componente de diálisis es uno o más amortiguadores o electrolitos usados en tratamientos de diál isis.

En una modal idad , l a enzi ma puede ser una o más de lisozimas, amidasas, tri psinas, q uiti nasas, beta 1 -3 glucanasas, pronasas, proteasas, lipasas y endoglicosidasas. La enzi ma puede ser también N-acetilmuram il-L-a lani na a midasa. La enzima puede ser adicionada a una proporción de entre aproximadamente 0.005% y aproximadamente 0.05% en peso del componente de diálisis. El componente de diálisis y la enzima puede ser i ncubado durante un periodo. El periodo puede ser al menos 1 hora o más largo.

En una modalidad, el paso de contactar el componente de diálisis con una enzima incluye adicionar al componente de diálisis una solución de tratamiento conteniendo la enzima. El paso de separar la enzima del componente de diálisis puede incluir filtrar la enzima del componente de diálisis. La enzima puede ser ya sea más grande de manera natural que el corte de peso molecular del filtro, o la enzima puede modificarse para incrementar su peso molecular.

En otra modalidad, la enzima es fijada a un substrato. El substrato puede ser una perla o una membrana. El substrato puede ser parte de un cartucho o dializador usado en sistemas de diálisis y tratamientos.

En una modalidad , el paso de contactar el componente de diálisis con una enzima es realizado en un proceso por lotes. El paso de contactar el componente de diálisis con una enzima también puede ser realizado en un proceso continuo.

En una modalidad, el componente de diálisis es probado por la presencia de contaminantes microbianos después del paso de permitir que la enzima descomponga contaminantes microbianos en el componente de diálisis. La prueba puede ser prueba de interleucin-6.

En una modalidad, el componente de diálisis incluye peptidoglicano como un contaminante microbiano. El componente de diálisis puede ser icodextrina.

En una modalidad, la presente descripción proporciona un método para tratar una solución de diálisis peritoneal comprendiendo proporcionar una solución de diálisis peritoneal. La solución de diálisis peritoneal incluye un agente osmótico, tal como u n pol ímero de glucosa o un derivado de polímero de glucosa. La sol ución de diál isis peritoneal es contactada con una enzima. Se permite que la enzima descomponga contaminantes microbianos en la solución de diálisis peritoneal .

En otra modalidad , la presente descripción proporciona un método para proporcionar solución de diálisis peritoneal a un paciente. El método comprende proporcionar un componente de diálisis peritoneal y contactar el componente de diál isis peritoneal con una enzima . Se permite que la enzi ma descomponga contaminantes microbianos en el componente de diál isis peritoneal . La solución de diálisis peritoneal es usada en el tratamiento de diálisis de un paciente.

U na ventaja de la presente descri pción es proporcionar métodos mejorados para remover una substancia de sol uciones de diálisis y/o componentes de diál isis.

Otra ventaja de la presente descripción es proporcionar métodos mejorados para fabricar soluciones de diálisis o componentes usados para hacer soluciones de diálisis.

Todavía otra ventaja de la presente descripción es proporcionar soluciones de diálisis mejoradas.

Todavía otra ventaja de la presente descripción es proporcionar procedimientos de seguridad mejorados que pueden emplearse para prevenir peritonitis en pacientes que reciben terapia de diálisis peritoneal.

Otra ventaja de la presente descripción es proporcionar métodos mejorados pa ra admin istrar soluciones de diálisis a un paciente.

Características y ventajas adicionales son descritos en la presente, y serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras.

Breve descri pción de las fig u ras La F IG. 1 es un diagrama que ilustra la respuesta de interleucina-6 para muestras de prueba de soluciones de diálisis antes y después de tratamiento enzimático y filtración .

La F I G . 2 es un diagrama que ilustra la respuesta de interleucina-6 para muestras de prueba antes y después de tratar con enzima y entonces dosificar con li popol isacárido.

La F I G . 3 es un diagrama que ilustra la respuesta de interleucina-6 para muestras de prueba de soluciones de icodextrina antes y después de tratamiento enzi mático y filtración.

Descripción detal lada La presente descripción se refiere a métodos para usar una enzima para descomponer componentes bacterianos en un componente de diálisis. Las soluciones de diálisis son usadas en varias formas de diálisis para remover productos de desecho de un paciente. Las sol uciones de d iálisis pueden ser específicamente formuladas y adecuadas para diál isis peritoneal , hemod iálisis o cualq uier otra terapia de diálisis. Las soluciones de diálisis pueden i ncluir uno o más componentes de diál isis adecuados (por ejem plo, ingredientes o constituyentes de u na solución de diálisis), tales como agentes osmóticos, amortiguadores, electrolitos o combinaciones de los mismos. Los métodos descritos en la presente pueden ser usados con cualquier tipo de componentes de diálisis o cualquier tipo de solución de diálisis.

Varios compuestos que son componentes mayores de una pared de célula bacteriana pueden servir como un marcador para bacteria. Muchos de estos productos microbianos, i ncluyendo lipopolisacárido ("LSP") y peptidoglicano ("PG") , estimulan la producción de citocinas en cél ulas humanas. Estos productos microbianos pueden provocar reacciones i naceptables en un paciente, incluyendo periton itis. Se ha encontrado q ue enzimas pueden degradar de manera factible estos productos microbianos en sub-productos inofensivos de manera que no provoq uen u na respuesta de citoci nas.

Para destrui r los productos microbianos, un componente de diál isis es contactado con una o más enzimas. El componente de diál isis puede ser provisto en forma de solución . La enzima descompone o digiere contaminantes microbianos en el componente de diál isis. La enzima es separada del componente de diálisis para proporcionar un componente de diálisis purificado. El componente de diálisis purificado puede estar substancialmente li bre de contaminantes microbianos que provocan una respuesta de citocina. De esta manera, el tratamiento del componente de diál isis con una enzima destruye contaminantes microbianos (tal como peptidoglicano) y asegura que estos agentes inflamatorios no son portados al prod ucto de d iál isis final .

La enzi ma puede ser seleccionada para romper enlaces moleculares en los com ponentes bacterianos para descomponer los componentes en compuestos inofensivos. Por ejemplo, la lisozima (también conocida como muramidasa) es una enzima de 14.4 kDa que cataliza la hidrólisis de 1 ,4-beta-enlaces entre residuos de ácido N-acetilmurám ico y N-acetil-D-glucosamina en peptidogl icano. Una amidasa es una enzi ma que cataliza la hidrólisis de amidas monocarboxílicas. La tripsi na es una serina proteasa que descompone proteínas al cortar las cadenas de péptido. La N-aceti lmuramil-L-ananina amidasa también puede ser usada para degradar peptidoglicano. La quiti nasa puede degradar quitina, un polisacárido de pared celular fungal . La beta 1 -3 glucanasa puede ser usada de igual manera para degradar polisacáridos de pared celular microbiana tal como curdlan y zymosan . Otras enzimas posibles incluyen pronasa, otras proteasas, li pasas y endoglicosidasas.

El componente de diálisis puede ser expuesto a la enzima mediante cualquier técnica adecuada. La enzima puede ser preparada en una solución y entonces adicionarse al componente de diálisis o solución de la misma. De manera alternativa, la enzima puede ser fijada a un substrato, tal como una perla o filtro. Por ejemplo, el componente de diálisis puede ser percolado a través de una columna , donde la enzima ha sido inmovi l izada .

La enzima puede ser adicionada al componente de diálisis a una proporción de entre aproximadamente 0.000005% hasta aproximadamente 0.5% , de preferencia entre aproximadamente 0.0005% hasta aproximadamente 0.05%, en peso del componente de diálisis. Por ejemplo, una solución de tratamiento incluyendo 1 mg/ml de enzima puede ser preparada en agua. La solución de tratamiento es adicionada entonces al componente de diálisis a una proporción de aproximadamente 1 % . Se permite que el componente de diálisis y la solución de tratamiento se incuben durante un periodo de entre una a cinco horas, con tres horas siendo un periodo típico.

Después del periodo de incubación, la enzima es removida del componente de diálisis. En una modalidad, la solución puede ser filtrada para remover la enzima. La filtración puede ser realizada mediante cualquier técnica de filtración adecuada. En una modalidad, la enzima tiene un peso molecular mayor que el componente de diálisis más grande de la solución de diálisis (por ejemplo, un polímero de glucosa o derivado de polímero de glucosa), o por arriba de 50 kDa. En otra modalidad, la enzima (tal como lisozima, la cual tiene un peso molecular de 14 kDa) puede unirse a una molécula portadora más grande que aumenta su peso molecular nominal , tales como polímeros de polietilenlgicol que pueden unirse a la proteína de lisozima. La unidad de filtro puede incluir un corte de peso molecular designado como el límite de peso molecular nominal ("NMWL") . El corte de peso molecular indica la capacidad del dispositivo para retener moléculas por arriba del peso molecular especificado. El NMWL usado puede ser 30 kDa. Otros métodos de filtración , tales como filtración de carbono, también pueden ser usados.

En otra modalidad, la enzima es fijada a un substrato. El substrato puede ser parte de un cartucho o dializador usado en sistemas de diálisis y tratamientos. La enzima puede ser unida covalentemente a perlas y la solución de diálisis expuesta a las perlas en un proceso por lotes. De manera alternativa, el componente de diálisis puede ser percolado a través de una columna donde la enzima ha sido inmovilizada a un substrato o matriz. El substrato puede ser una perla, una membrana o cualquier otro substrato adecuado. Al unir la enzima a un substrato, un proceso para filtrar o remover de otra manera la enzima de la solución de diálisis puede no ser necesario. De manera adicional , la enzima puede ser usada mútliples veces, bajando el costo del paso de tratamiento.

Después del paso de tratamiento, el componente de diálisis puede ser probado para confirmar la ausencia de contaminantes probablemente para provocar peritonitis. La respuesta de citocina inducida por un material puede ser medida. Una respuesta de citocina adecuada que ha sido encontrada útil para detectar la presencia de contaminantes microbianos es la respuesta de interleucina-6. En un tipo de prueba, un reactivo que produce una respuesta de citocina es adicionado a una muestra del componente de diálisis. El reactivo puede incluir células mononucleares periféricas de sangre ("PMBCs") o células de línea celular monocítica. Las PBMCs son aisladas de sangre humana fresca de donadores saludables. Un tipo particular de prueba adecuada incluye un kit de prueba con un ensayo. El material a ser probado y las PBMCs son adicionadas al ensayo. Los ensayos son incubados entonces con las células durante la noche. El medio de cultivo es recolectado y la citocina secretada del tipo deseado es cuantificada usando técnicas de ensayo inmuno-sorbente enlazado a enzima ("ELISA"). El uso de tales pruebas es bien conocido en la técnica. Alguien de habilidad ordinaria en la técnica reconocería que otros tipos de pruebas son posibles.

En una modalidad, la presente descripción proporciona métodos para fabricar una solución de diálisis peritoneal. El método puede incluir cualquier número y tipo adecuados de etapas de procesamiento. Por ejemplo, el proceso puede incluir proporcionar un agente osmótico, tal como un pol ímero de glucosa, contactar el polímero de glucosa con una enzima, permitir que la enzima descomponga contaminantes microbianos en el polímero de glucosa, y usar el polímero de glucosa para hacer la solución de diálisis peritoneal. El pol ímero de glucosa puede ser procesado adicionalmente en una manera adecuada. En una modalidad, el polímero de glucosa puede ser procesada con cualquier número y tipo adecuado de dispositivos de separación, tales como columnas de afinidad con resinas que unen específicamente peptidoglicano y/o similares.

El método para fabricar una solución de diálisis de acuerdo con la presente descripción también puede usarse en conjunción con otros procedimientos de prueba de solución de diálisis o materia prima de diálisis adecuados. Ejemplos ilustrativos de procedimientos de prueba adecuados pueden ser encontrados en la patente estadounidense no. 7, 1 1 8,857, titulados METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF MICROBIAL CONTAMINANTS I N PERITONEAL DIALYSIS SOLUTIONS (Métodos y composiciones para detección de contaminantes microbianos en soluciones de diálisis peritoneal), emitida el 10 de octubre de 2006, cuya descripción es incorporada en la • presente por referencia. Por ejemplo, tales procedimientos de prueba pueden ser usados gemelamente para probar soluciones de diálisis o materias primas de diálisis.

Las soluciones de diálisis discutidas en la presente pueden ser formuladas específicamente y adecuadas para diálisis peritoneal, hemodiálisis o cualquier otra terapia de diálisis. Las soluciones de diálisis pueden ser usadas, por ejemplo, como una solución de diálisis simple en un recipiente simple o como una parte de diálisis de un recipiente de múltiples cámaras o alojado por separado. Las soluciones de diálisis pueden ser esterilizadas usando cualquier técnica de esterilización adecuada, tal como, por ejemplo, autoclave, vapor, ultravioleta, alta presión , filtración o combinación de las mismas.

Formulaciones listas para usarse de soluciones de diálisis pueden ser preparadas en una variedad de formas adecuadas. Por ejemplo, las partes de diálisis primera y segunda de una formulación de diálisis multi-partes, pueden ser almacenadas por separado unas de otras, tal como en cámaras conectadas hidráulicamente y separadas de un recipiente multi-cámaras, hasta que se mezclan juntas para formar una solución mezclada. A este respecto, la formulación lista para usarse puede ser preparada dentro del recipiente al mezclar sus partes de diálisis separadas dentro de una cámara del recipiente. Esto puede eliminar de manera efectiva la necesidad de inyectar manualmente toda o al menos una porción de las partes de diálisis en el recipiente para formar la solución mixta, asegurando así que la formulación lista para usarse puede ser preparada fácilmente bajo condiciones estériles.

Además, el recipiente puede ser configurado de manea que una de las partes de diál isis puede ser colocada en comunicación directa de fluido con el paciente antes de mezclarse mientras que la otra parte de diál isis no puede ser colocada en comu nicación directa de fluido con el paciente antes de mezclarse. Esto puede proporcionar un nivel adicionado de seguridad con respecto a la preparación y administración de la formulación lista para usarse de la presente descri pción ya que la solución simple no puede ser colocada en com unicación directa de fluido con el paciente físicamente y no puede ser al imentada al paciente a menos que se mezcle primero con el otro componente. A este respecto, si por casualidad , la sol ución simple que no puede ser colocada físicamente en comunicación directa de fluido con el paciente tendrá una concentración indeseable de constituyentes, tales como potasio, sodio o similar, esta configu ración necesariamente aseguraría que el nivel indeseable de constituyentes no sea alimentado o administrado al paciente.

Se debería apreciar que las partes de diálisis separadas de una solución de diálisis m ultí-partes pueden ser alojadas o contenidas en una manera adecuada, de manera que las partes de diálisis individuales pueden ser preparadas y administradas de manera efectiva . Una variedad de reci pientes pueden ser usados para alojar l as dos partes, tales como recipientes separados (por ejemplo, matraces o bolsas) que son conectadas por un mecanismo de comunicación de fluido adecuado. Las dos o más partes de diál isis separadas pueden ser esterilizadas y almacenadas por separado.

Las soluciones de diálisis pueden incluir uno o más componentes de diálisis adecuados, tales como agentes osmóticos, amortiguadores, electrolitos o combinación de los mismos. Una variedad de agentes ácidos y/o básicos diferentes y adecuados también pueden ser utilizadas para ajustar el pH de las soluciones o concentrados osmóticos, amortiguadores y/o de electrolitos. Por ejemplo, una variedad de ácidos y bases inorgánicos pueden utilizarse incluyendo ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, bromuro de hidrógeno, yoduro de hidrógeno, hidróxido de sodio, similares o combinación de los mismos.

Ejemplos no limitantes de agentes osmóticos incluyen glucosa, fructosa, polímeros de glucosa (por ejemplo, maltodextrina, icodextrina, ciclodextrinas, trehalosa), derivados de polímero de glucosa (por ejemplo, almidón modificado, almidón de hidroxietilo), polioles, aminoácidos, péptidos, proteínas, amino azúcares, N-acetil glucosamina (NAG), glicerol y/o similares y combinaciones de los mismos. Ejemplos de los amortiguadores incluyen bicarbonato, ácido láctico/lactato, ácido pirúvico/piruvato, ácido acético/acetato, ácido cítrico/citrato, aminoácidos, péptidos, un intermediario del ciclo de KREBS y/ similares y combinaciones de los mismos.

Ejemplos no limitantes de electrolitos incluyen calcio, magnesio, sodio, potasio, cloruro y/o similares y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las soluciones de diálisis pueden comprender uno o más electrolitos en los siguientes rangos desde: aproximadamente 100 hasta aproximadamente 140 mEq/l de Na\ aproximadamente 70 hasta aproximadamente 1 30 mEq/l de Cl", 01 hasta aproximadamente 4.0 meEq/l de Ca , 0.1 hasta aproximadamente 4.0 mEq/l de Mg y/o 0.1 hasta aproximadamente 4.0 m Eq/l de K+. Cada uno de estos electrolitos también pueden estar ausentes de la solución de diál isis dependiendo de la formulación de diálisis final deseada .

El agente osmótico puede ser usado para mantener la presión osmótica de la sol ución mayor que la presión osmótica fisiológica (por ejemplo, mayor que aproximadamente 285 mOsmol/kg) . Por ejemplo, la glucosa es el agente osmótico más comúnmente usado porque proporciona velocidades de ultrafiltración rápidas. Otros tipos adecuados de agentes osmóticos tales como aminoácidos pueden ser usados además de o como un substituto para gl ucosa .

Otra fam il ia de compuestos capaces de servir como agentes osmóticos en soluciones de diálisis peritonea l es aquélla de polímeros de glucosa o sus derivados, tales como icodextrina , maltodextrinas, almidón de hidroxietilo y similares. Aunque estos compuestos son adecuados para uso como agentes osmóticos, pueden ser sensibles a pH bajo y alto, especialmente durante esteril ización y almacenamiento de largo plazo. Los pol ímeros de gl ucosa , tal como icodextrina, pueden ser usados además de o en lugar de glucosa en sol uciones de diálisis peritoneal. En general , la icodextrina es un pol ímero de glucosa derivado de la hidrólisis de almidón de ma íz. Tiene un peso molecular de 1 2-20,000 Daltones. La mayoría de las moléculas de glucosa en icodextrina son enlazadas linealmente con enlaces a ( 1 -4) glicosídicos (>90%) mientras que una pequeña fracción (<1 0%) es enlazada por enlaces a ( 1 -6) .

Las soluciones o componentes de diálisis también pueden comprender agentes amortiguadores, tales como bicarbonatos y ácidos. Los bicarbonatos pueden comprender una solución alcalina , de manera que el bicarbonato puede permanecer estable sin el uso de una sobrebolsa de barrera de gas o similar. La solución de bicarbonato individual puede tener un pH que varía por arriba de aproximadamente 8.6, de preferencia aproximadamente. El pH de la parte de solución de bicarbonato puede ser ajustada con cualqu ier tipo adecuado de ingrediente, tal como hidróxido de sodio y/o simi lares. Ejemplos ilustrativos de la solución de bicarbonato de la presente descripción pueden encontrarse en la patente estadounidense no. 6, 309 ,673, titulada Bl CARBON ATE-BASED SOLUTI ON I N TWO PARTS FOR PERITON EAL D IALYS IS OR S UBSTITUTION I N CONTI NUOUS RENAL REPLACEMENT TH ERAPY (Solución basada en bicarbonato en dos partes para diálisis peritoneal o substitución en terapia de reemplazo renal contin uo) , emitido el 30 de octubre de 2001 , cuya descripción es incorporada en la presente por referencia .

Los ácidos pueden incluir uno o más ácidos fisiológicamente aceptables, tales como ácido láctico, ácido pirúvico, ácido acético, ácido cítrico, ácido clorh ídrico y sim ilares. Los ácidos pueden estar en una sol ución i ndividual teniendo un pH que varía desde aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 4 o menos, aproxi madamente 3 o menos, aproxi madamente 2 o menos, aproximadamente 1 o menos, y cualquier otro pH ácido adecuado. El uso de un ácido orgánico, tal como ácido láctico, solo o en combinación con otro ácido adecuado , tal como un ácido inorgánico adecuado incluyendo ácido clorhídrico, otro ácido orgánico adecuado (por ejemplo, ácido láctico/lactato, ácido pirúvico/piruvato, acido acético/acetato, ácido cítrico/citrato) y similares en la solución de ácido pueden hacer la solución más fisiológicamente tolerable.

Como se discute previamente, las soluciones de diálisis de la presente descripción pueden usarse en una variedad de aplicaciones diferentes. Por ejemplo, las soluciones de diálisis pueden ser usadas durante diálisis peritoneal, tal como diálisis peritoneal automatizada, diálisis peritoneal ambulatoria continua, diálisis peritoneal de flujo continuo y similares. Se debería apreciar que la presente descripción puede ser usada en una variedad de terapias de diálisis diferentes y adecuadas para tratar falla de riñon.

Aunque la presente descripción, en una modalidad, puede ser utilizada en métodos para proporcionar una terapia de diálisis para pacientes teniendo falla o enfermedad de riñon crónica, debería apreciarse que la presente descripción puede usarse para necesidades de diálisis aguda, por ejemplo, en una sala de emergencias. Por último, como alguien de habilidad en la técnica aprecia, las formas intermitentes de terapia (por ejemplo, hemofiltración, hemodiálisis, diálisis peritoneal y hemodiafiltración) pueden usarse en el auto cuidado/limitado, de centro, así como en el hogar.

Ejem plos A manera de ejemplo y sin limitación, los siguientes ejemplos son ilustrativos de varias modalidades de la presente descripción e ilustran adicional mente prueba experimental conducida con soluciones de diálisis.

Procedimiento experimental El procedimiento para exponer una muestra de solución de diálisis a una enzima fue conducido como sigue. Para los Ejemplos 1 y 2 y Ejemplo comparativo A, una solución de tratamiento incluyendo 1 mg/ml de lisozi ma fue preparada en agua . Una muestra de 8 mi de la solución de diál isis fue combi nada con 80 µ? de la solución de tratamiento de lisozi ma . Las m uestras fueron i ncubadas a 37°C du rante 3 horas. Las muestras fueron d ivididas en 2 x 4 mi de al ícuotas y una de las al ícuotas fue lavada extensamente en una membrana de 30k para remover la lisozi ma , debido a q ue el material inductor de I L-6 no digerido en esta solución fue conocido por ser retenido por arriba de la membrana de 30 kD. Después de la incubación , las muestras fueron sometidas a prueba de I L-6.

Para los Ejemplos 3 y 4 y Ejemplo comparativo B, una solución de tratamiento incluyendo 1 mg/ml de l isozima fue preparada en solución salina al 0.9% . U na muestra de 4 mi de la solución a ser probada fue com bi nada con 40 µ? de solución de tratamiento de lisozima y se incubó a 37°C durante 3 horas. Después de la incubación , las muestras fueron sometidas a prueba de I L-6.

Para los Ejemplos 5 y 6, icodextri na fue disuelta en ag ua libre de pirógeno para hacer una sol ución de .5% y una solución de tratamiento incluyendo 1 mg/m l de lisozima fue preparada en agua libre de pirógeno. Una muestra de 4 mi de la solución a ser probada fue combinada con 40 µ? de solución de tratamiento de lisozi ma e i ncubada a 37°C durante 3 horas. Después de la incubación, las muestras fueron sometidas a prueba de I L_6.

Para determinar si u n material induciría una respuesta de citocina, se real izó una respuesta de interleucina-6 (I L-6) estándar. Las células mononucleares periféricas de sangre (" PBMCs") fueron aisladas de cuatro donadores de sangre y se usaron para la prueba . Un total de cuatro réplicas (cuatro cavidades por muestra o solución de control) fueron realizadas en cada experimento con cuatro donadores de sangre. Una suspensión cel u lar y la solución a ser probada se mezclaron y se i ncubaron d urante la noche. Después del periodo de i ncubación, las muestras fueron centrifugadas y cada sobrenadante fue recolectado. La concentración de I L-6 en el sobrenadante fue determinada usando el kit QuantiGlo Chemiluminescent ELI SA: Para realizar el paso de fi ltración, se usaron dispositivos de filtración AM ICON® U ltra-4. Los dispositivos AM ICON® Ultra-4 incluyen membranas hechas de celulosa regenerada de unión de proteína baja y se caracterizaron por un NMWL. Los dispositivos de filtración Ultra-4 son diseñados para permiti r u na recuperación de efecto simple del retenido concentrado (recolectado en la u nidad de filtro) y filtrado (recolectado en el tu bo de centrífuga) que ha pasado a través del filtro.

Aproximadamente 4 mi de la muestra de prueba fueron cargados en la unidad de filtro y se centrifugaron durante un tiempo pre- determi nado de manera que aproximadamente 2 mi de filtrado fueron obtenidos. Tanto el filtrado como el retenido fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de jeringa de 0.2 m antes del ensayo de PBMC-I L-6. Cada muestra fue probada por separado usando los filtros de NMWL a 30 kDa .

Resultados El Ejemplo 1 fue una solución de diálisis peritoneal usando icodextrina como u n agente osmótico. El Ejemplo 2 fue una solución de diál isis peritoneal de icodextrina contaminada con productos microbianos. El Ejemplo comparativo A fue una solución de agua con lisozi ma.

La FIG . 1 ilustra los resultados de prueba I L-6 para el Ejemplo 1 , Ejemplo 2 y Ejemplo comparativo A. El Ejemplo comparativo A, una sol ución de la lisozi ma por sí misma, no provocó u na respuesta de I L-6. El Ejemplo 1 exhibió una respuesta muy baja y el Ejemplo 2 exhibió una respuesta fuerte. Los Ejemplos 1 y 2 fueron sometidos entonces al tratamiento de lisozima descrito antes. Después del tratamiento de lisozima, cada muestra mostró m uy poca respuesta de I L-6. Los Ejemplos 1 y 2 y Ejemplo comparativo A fueron filtrados entonces con filtro de N MWL de 30 kDa y la respuesta de I L-6 se probó nuevamente usando las muestras de retenido de los filtros. Ninguna de las muestras dio una respuesta de I L-6 significativa. De esta manera, se encontró que el tratam iento con lisozima digiere o descompone los contaminantes microbianos en el Ejemplo 2. Debido a q ue la lisozima no produjo una respuesta de IL-6 (Ejemplo comparativo A), la filtración no fue necesaria y no se realizó en experimentos subsecuentes.

En una segunda serie de experimentos, las muestras fueron sujetadas con lipopolisacárido ("LPS") después de ser tratadas con una solución de lisozima. Estas pruebas fueron conducidas para demostrar que los contaminantes microbianos múltiples pueden producir una respuesta sinérgica de citocina y que los tratamientos enzimáticos específicos pueden eliminar el sinergismo, pero múltiples enzimas pueden ser necesarias para remover completamente todos los contaminantes microbianos inflamatorios. El Ejemplo 3 fue una solución de diálisis peritoneal de icodextrina. El Ejemplo 4 fue una solución de diálisis peritoneal de icodextrina contaminada con productos microbianos. El Ejemplo comparativo B fue solución salina. Para cada uno de Ejemplo comparativo B, Ejemplo 3 y Ejemplo 4, la respuesta de I L-6 fue medida a partir de muestras bajo las siguientes condiciones: 1 ) muestra sola, 2) tratamiento de lisozima de la muestra, 3) adición de LPS a la muestra, y 4) adición de LPS después del tratamiento de lisozima de la muestra. Los resultados son ilustrados en la FIG. 2.

En cada caso, la adición de LPS después de tratamiento de lisozima de una muestra creó una respuesta de I L-6 que refleja solo la adición de LPS. Por ejemplo la respuesta de IL-6 de Ejemplo comparativo B con LPS, Ejemplo comparativo B con lisozima y LPS, Ejemplo 3 con LPS, Ejemplo 3 con lisozima y LPS, y Ejemplo 4 con lisozima y LPS, todos muestran repuestas de IL-6 comparables. La respuesta de I L-6 para el Ejemplo 4 con LPS es mayor debido a los contaminantes origi nales y la LPS están activando las células mononucleares a través de dos Receptores Toll-Like separados (tales como TLR4 para LPS y TLR2 para peptidog licano) induciendo una repuesta si nérgicamente elevada . Destru i r el contaminante microbiano en el Ejemplo 4 antes de la adición del LPS respuesta en una respuesta consistente con solo estim ulación de LPS de TLR4.

En un tercer conjunto de experimentos, una material prima que es usada como un componente de una solución de diálisis, icodextrina, fue probado en un ensayo de I L-6 antes de tratamiento de lisozima y después de tratamiento de lisozima. El Ejemplo 5 fue una materia prima contaminada con productos microbianos y el Ejemplo 6 fue una materia prima no contami nada con productos microbianos. La FIG . 3 ¡lustra los resultados de prueba como sigue: el Ejemplo 5 exhi be una fuerte repuesta de I L-6, el Ejemplo 5 después de tratamiento de lisozima muestra una baja respuesta, el Ejemplo 6 muestra una baja respuesta, y el Ejemplo 6 después del tratamiento de lisozima muestra una baja respuesta. El Ejemplo 6 muestra la misma respuesta antes del tratam iento como después de tratamiento, mostrando así que el Ejemplo 6 no está contaminado. El Ejemplo 5 después del tratamiento de lisozima muestra una respuesta de I L-6 comparable con el Ejemplo 6 tanto antes como después del tratamiento de lisozima , mostrando así que los contaminantes microbianos en el Ejem plo 5 fueron destruidos.

Se debería entender que varios cambios y modificaciones a las modal idades actual mente preferidas descritas en la presente serán evidentes para aquéllos expertos en la técnica. Tales cambios y modificaciones pueden hacerse sin apartarse del espíritu y alcance de la presente materia en cuestión y sin disminuir sus ventajas pretendidas. Por lo tanto, se pretende que tales cambios y modificaciones sean cubiertos por las reivindicaciones anexas.

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar un componente de diálisis, comprendiendo el método: proporcionar un componente de diálisis; contactar el componente de diálisis con una enzima; y permitir que la enzima descomponga contaminantes microbianos en el componente de diálisis.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además separar la enzima del componente de diálisis para proporcionar un componente de diálisis purificado.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el componente de diálisis purificado está substancialmente libre de contaminantes microbianos que provocan una respuesta de citocinas en humanos.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la enzima es lisozima.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la enzima es N-acetilmuramil-L-alanina amidasa.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la enzima es seleccionada del grupo que consiste de amidasas, tripsinas, quitinasas, beta 1-3 glucanasas, pronasas, proteasas, lipasas, endoglicosidasas y combinaciones de las mismas.

7. El método de la reivindicación 1,e n donde la enzima es adicionada a una proporción de entre aproximadamente 0.0005% y aproximadamente 0.05% en peso del componente de diálisis.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el componente de diálisis es seleccionado del grupo que consiste de polímeros de glucosa, derivado de polímero de glucosa y combinaciones de los mismos.

9. El método de la reivindicación 1 , que comprende además incubar el componente de diálisis y la enzima durante un periodo.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el periodo es al menos 1 hora.

1 1 . El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de contactar el componente de diálisis con una enzima comprende adicionar al componente de diálisis una solución de tratamiento comprendiendo la enzima.

12. El método de la reivindicación 1 1 , que comprende además filtrar la enzima del componente de diálisis.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la enzima es ya sea naturalmente más grande que el corte de peso molecular del filtro o la enzima es modificada para aumentar su peso molecular.

14. El método de la reivindicación 1 , en donde la enzima es fijada a un substrato.

1 5. El método déla reivindicación 14, en donde el substrato es una perla o una membrana.

16. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de contactar el componente de diálisis con una enzima es realizado en un proceso por lotes.

17. El método déla reivindicación 1 , en donde el paso de contactar el componente de diálisis con una enzima es realizado en un proceso continuo.

18. El método de la reivindicación 1 , que comprende además el paso de probar el componente de diálisis por la presencia de contaminantes microbianos después del paso de permitir que la enzima descomponga contaminantes microbianos en el componente de diálisis.

19. El método de la reivindicación 18, donde la prueba es prueba de interleucina-6.

20. El método de la reivindicación 1 , en donde el componente de diálisis incluye peptidoglicano como un contaminante microbiano.

21 . El método de la reivindicación 1 , en donde el componente de diálisis es icodextrina.

22. Un método para tratar una solución de diálisis peritoneal, comprendiendo el método: proporcionar una solución de diálisis peritoneal comprendiendo un polímero de glucosa o un derivado de pol ímero de glucosa; contactar la solución de diálisis peritoneal con una enzima; y permitir que la enzima descomponga contaminantes microbianos en la solución de diálisis peritoneal.

23. El método de la reivindicación 22, que comprende además separar la enzima de la solución de diálisis peritoneal para proporcionar una solución de diálisis peritoneal purificada.

24. El método de la reivindicación 22, en donde la enzima es seleccionada del grupo que consiste de lisozimas, amidasas, tripsinas, quitinasas, beta 1 -3 glucanasas, pronasas, proteasas, lipasas, endoglicosidadas y combinaciones de las mismas.

25. El método de la reivindicación 22, en donde el paso de contactar la solución de diálisis peritoneal con una enzima comprende adicionar a la solución de diálisis peritoneal una solución de tratamiento comprendiendo la enzima.

26. El método de la reivindicación 22, que comprende además filtrar la enzima de la solución de diálisis peritoneal.

27. Un método para proporcionar diálisis peritoneal a un paciente, comprendiendo el método: proporcionar un componente de diálisis peritoneal comprendiendo un polímero de glucosa o un derivado de polímero de glucosa; contactar el componente de diálisis peritoneal con una enzima; permitir que la enzima descomponga contaminantes microbianos en el componente de diálisis peritoneal; usar el componente de diálisis peritoneal para hacer una solución de diálisis peritoneal ; y usar la solución de diálisis peritoneal en un tratamiento de un paciente.