MX2008016146A - Familia de genes (lbfl313) asociados con el cancer pancreatico. - Google Patents

Abstract

En general, la invención se refiere a los cambios en la expresión de genes en el adenocarcinoma pancreático humano; específicamente, la invención se refiere a una familia de genes humanos que se expresa diferencialmente en los tejidos del cáncer pancreático en comparación con los tejidos pancreáticos no cancerosos correspondientes.

Description

FAMILIA DE GENES (LBFL313) ASOCIADOS CON EL CANCER PANCREATICO CAMPO TECNICO La presente invención se refiere a los cambios en la expresión de genes en los tejidos del cáncer pancreático de pacientes con cáncer pancreático. Específicamente, la invención se refiere a un gen humano que se expresa diferencialmente en los tejidos del cáncer pancreático, en comparación con los tejidos pancreáticos normales correspondientes, y en otros neoplasmas malignos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cáncer pancreático, la cuarta causa principal de mortalidad del cáncer tanto en el hombre como en la mujer, es un problema mayor de salud en el mundo desarrollado y se asocia con un pronóstico demasiado malo (Faint y otros (2004) Datamonitor DMHC2045; Garcea y otros (2005) Pancreatology 5:514-529; Kern y otros (2002) Cáncer Biol Therapy 1 :607-613; Laheru y Jaffee (2005) Nature Rev Cáncer 5: 59-467; Li y otros (2004) Lancet 363:1049-1057). Se ha estimado que aproximadamente 30,000 norteamericanos desarrollan esta enfermedad por año y mueren de la misma. A pesar del manejo quirúrgico médico agresivo, la esperanza de vida media es de aproximadamente 15 a 18 meses en pacientes con enfermedad local y regional, y de 3 a 6 meses en pacientes con enfermedad metastásica. Cerca del 100 % de los pacientes con cáncer pancreático desarrollan metástasis y mueren debido a los efectos metabólicos debilitantes de su crecimiento no restringido, y la supervivencia general de 5 años de los grupos de pacientes que no son sometidos a procedimientos de resección es claramente menor de 5%. Es particularmente agresivo, con síntomas iniciales no específicos y su diagnóstico temprano es difícil. Los métodos de detección tempranos del cáncer pancreático están bajo desarrollo pero todavía no existen en la práctica; las terapias convencionales del cáncer tienen poco impacto sobre el pronóstico o resultado de la enfermedad. El pronóstico malo del cáncer pancreático es atribuible a su tendencia a la presentación tardía, invasión local agresiva, metástasis temprana y respuesta deficiente a la quimioterapia. Como muchas otras enfermedades malignas, el cáncer pancreático se origina de la acumulación de mutaciones adquiridas. Múltiples cambios genéticos y epigenéticos, que incluyen la activación de protooncogenes, desactivación de genes supresores de tumor y anormalidades de los genes de mantenimiento, están implicados en el desarrollo, crecimiento continuo y metástasis del cáncer pancreático. Se considera que las mutaciones acumuladas en dichos genes ocurren en un tiempo predecible durante las etapas "PanINs" (Neoplasia Intraepitelial Pancreática) (Hruban y otros (2000), Clin Cáncer Res 6:2969-2972; Kern y otros (2002), Cáncer Bíol Therapy 1 :607-613; Li y otros (2004), Lancet 363:1049-1057). La mutación del gen K-ras ocurre en la mitad de las PanlN-1. La etapa PanlN-2 es notable por cambios adicionales y aumento en la velocidad de mutaciones de K-ras, y por la aparición de muchas anormalidades de p16, y la sobreexpresión de la proteína p53, que puede indicar la presencia de mutaciones de p53, aparece ocasionalmente en PanINs más avanzadas. Parece ocurrir tardíamente pérdida de los genes supresores de tumor, TP53, DPC4 y BRCA2, en el desarrollo de la neoplasia pancreática, PanlN-3. Más del 85 % de los cánceres ductales pancreáticos tienen una mutación de punto activadora del gen K-ras en el desarrollo del cáncer pancreático (Li y otros (2004), Lancet 363:1049-1057; Xiong (2004), Cáncer Chem Pharm 54.S69-77). La mutación de K-ras resulta en la activación constitutiva de una ruta de señalización intracelular, Ras-Raf-MEK-ERK, que conduce a proliferación celular y por lo tanto confiere propiedades de transformación a las células que contienen mutaciones de punto en este gen. La mutación de Ras no está asociada con la etapa o pronóstico del tumor, indicando que el oncogen K-ras puede estar relacionado con el inicio de la carcinogénesis, pero no está asociado con potencial maligno ni promoción de cáncer pancreático humano. Uno de los blancos finales claves de la familia Ras es la fosfoinositol-3 cinasa (PI3K). La activación de PI3K está implicada en la resistencia del cáncer pancreático a la apoptosis inducida por agentes quimioterapéuticos o de dirección molecular. La desactivación del gen supresor del tumor p16 parece ocurrir ligeramente después. El gen p16 es desactivado virtualmente en todos los adenocarcinomas ductales por mutación, supresión homocigótica, o silenciamiento transcripcional asociado con metilación del promotor (Kern y otros (2002) Cáncer Biol Therapy 1 :607-613; Maitra y otros (2006) Best Pract Res Clin Gastroenterol 20:211-226). La proteína p16 regula el ciclo celular mediante la ruta p16/Rb, por lo tanto la desactivación genética del gen p16 significa que se pierde un regulador crítico del ciclo celular en el cáncer pancreático. De manera interesante, mutaciones heredadas en el gen p16 son una causa del síndrome de melanoma familiar atípico con molas múltiples (FAMMM), y los pacientes con FAMMM tienen un mayor riesgo de desarrollar melanoma y cáncer pancreático. La desactivación del gen TP53 casi siempre ocurre por medio de una mutación intragénica en un alelo, acoplada con la pérdida del segundo alelo (Maitra y otros (2006), Best Pract Res Clin Gastroenterol 20:211-226). El mal funcionamiento de p53 significa que dos controles críticos del número de células, el punto de verificación del ciclo celular G1/S y el mantenimiento de la detención de G2/M, no están regulados en la mayoría de los cánceres pancreáticos. El gen DPC4, también conocido como SMAD4, es desactivado genéticamente en más de la mitad de los cánceres pancreáticos, en 35 % por supresión homocigótica, y en 20 % por una mutación intragénica acoplada con la pérdida del alelo remanente (Maitra y otros (2006) Best Pract Res Clin Gastroenterol 20:211-226; Wilentz y otros (2000) Am J Pathol 156:37-43). Sin embargo, la desactivación génica de DPC4 aparece solo raramente en otros tipos de tumor. La proteína DPC4 tiene una función crítica en la señalización y control del crecimiento por medio de la ruta TGF-B. El gen BRCA2, relacionado con la reparación del ADN, solo es alcanzado en un pequeño porcentaje (-10%) del cáncer pancreático, pero ocasiona la agregación familiar del cáncer pancreático (Maitra y otros (2006) Best Pract Res Clin Gastroenterol 20:211-226; Murphy y otros (2002) Cáncer Res 62:3789-3793). Los portadores de un solo par de bases del gen BRCA2 (denominado la mutación del gen BRCA2 6174delT) tienen un incremento de 10 veces del riesgo de desarrollar cáncer pancreático. El factor nuclear ?? (NF-??), un factor de transcripción que existe predominantemente como heterodímero p65 (RelA)/p50, también es considerado como uno de los genes relacionados con el cáncer pancreático (Garcea y otros (2005), Pancreatology 5:514-529; Xiong (2004), Cáncer Chem Pharm 54:S69-77). La subunidad p65 de NF-??, RelA, es activada constitutivamente en cerca de 67% de los adenocarcinomas pancreáticos, pero no en tejidos pancreático sanos, e IkBa es sobreexpresado en tejidos y líneas celulares de tumor pancreático humano. La activación constitutiva de Re1A parece estar correlacionada con la ruta de señalización del principio, tal como Ras, en células de tumor pancreático. Se ha sugerido que NF-kB tiene una función importante en la resistencia del tumor a la apoptosis inducida por agentes citotóxicos en el cáncer pancreático. Otros resultados también indican que el principal mecanismo mediante el cual NF-kB parece promover el crecimiento de la célula pancreática es por inhibición de la apoptosis. Persiste la necesidad de materiales y métodos que permitan un diagnóstico más preciso del adenocarcinoma pancreático. Además, persiste la necesidad de métodos de tratamiento y métodos de identificación de agentes que puedan tratar eficazmente esta enfermedad. La presente invención cubre estas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Problema técnico La presente invención provee un material y un método para diagnosticar con precisión el adenocarcinoma pancreático. La presente invención también provee un método de tratamiento para tratar eficazmente el adenocarcinoma pancreático.

Solución técnica La presente invención se basa en un gen nuevo (en adelante denominado "LBFL313") que es expresado diferencialmente en tejidos de adenocarcinoma pancreático en comparación con los tejidos pancreáticos normales. La invención provee (a) una molécula de ácido nucleico aislado que comprende la SEQ ID NO: 1 , (b) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la SEQ ID NO: 2, (c) una molécula de ácido nucleico aislado que exhibe por lo menos 95% de identidad de secuencia de nucleótidos con la SEQ ID NO: 1 , y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que comprende el complemento de las mismas. Además, la presente invención provee las moléculas de ácido nucleico enlazadas operativamente a uno o más elementos de control de expresión, que incluyen vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico aislado. La invención provee también células hospederas transformadas para contener las moléculas de ácido nucleico de la invención, y métodos para producir una proteína, que comprenden el paso de cultivar una célula hospedera transformada con una molécula de ácido nucleico de la invención, bajo condiciones en las cuales se expresa la proteína. Además, la invención provee un polipéptido o proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o que exhibe por lo menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2. Además, la invención provee métodos de identificación de un agente que modula la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención. Además, la invención provee métodos de identificación de un agente que modula la cantidad o por lo menos una actividad de una proteína de la invención. Además, la presente invención provee métodos de modulación de la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención.

Además, la invención provee métodos de identificación de socios de unión para una proteína de la invención. Además, la presente invención provee métodos para identificar agentes que pueden bloquear o modular la asociación de una proteína de la invención con un socio de unión. Además, la presente invención provee métodos para reducir o bloquear la asociación de una proteína de la invención con uno o más de sus socios de unión. Además, la presente invención provee animales transgénicos no humanos modificados para contener las moléculas de ácido nucleico de la invención, o animales transgénicos no humanos modificados para contener las moléculas de ácido nucleico mutado, de tal manera que se impide la expresión de los polipéptidos codificados de la invención. La presente invención también provee animales transgénicos no humanos en los cuales una porción o todo un gen que comprende parcial o totalmente la SEQ ID NO: 1 , ha sido destruido o suprimido del genoma del animal. Además, la invención provee composiciones que comprenden un diluente y un polipéptido o proteína, en donde el polipéptido o proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o exhibe por lo menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2. Los genes y proteínas de la invención se pueden usar como agentes diagnósticos o marcadores para detectar el cáncer pancreático o para diferenciar el adenocarcinoma pancreático del tejido normal en una muestra. También pueden servir como un blanco para agentes que modulan la expresión o actividad génica. Por ejemplo, se pueden identificar agentes que modulan procesos biológicos asociados con el crecimiento de tumor, que incluyen el proceso hiperplásico del cáncer pancreático.

A. Proteínas asociadas con el cáncer pancreático La presente invención provee proteínas aisladas, variantes alélicas de las proteínas, y sustituciones de aminoácido conservativas de las proteínas. Como se usa aquí, la "proteína" o el "polipéptido", se refiere en parte a una proteína que tienen la secuencia de aminoácidos humana representada en la SEQ ID NO: 2. Los términos también se refieren a variantes alélicas naturales y proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente a la que se cita arriba específicamente. Las vanantes alélicas, mediante procesamiento de una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente a la citada anteriormente, todavía tendrán funciones biológicas iguales o similares asociadas con estas proteínas. Como se usa aquí, la familia de proteínas relacionadas con la secuencia de aminoácidos humana de la SEQ ID NO: 2 se refiere a las proteínas que han sido aisladas de organismos además de los humanos. Los métodos usados para identificar y aislar otros miembros de la familia de proteínas relacionadas con estas proteínas se describen más abajo. Preferiblemente, las proteínas de la presente invención están en forma aislada. Como se usa aquí, se dice que una proteína está aislada cuando se usan métodos físicos, mecánicos o químicos para remover la proteína de los constituyentes celulares asociados normalmente con la proteína. El experto en la materia puede usar fácilmente métodos de purificación estándares para obtener una proteína aislada. Las proteínas de la presente invención también incluyen variantes de inserción, supresión o sustitución conservativa de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Como se usa aquí, una vanante conservativa se refiere a alteraciones de la secuencia de aminoácidos que no afectan adversamente las funciones biológicas de la proteína. Se dice que una sustitución, inserción o supresión afecta adversamente la proteína cuando la secuencia alterada impide o interrumpe una función biológica asociada con la proteína. Por ejemplo, en algunos casos se pueden alterar la carga general, estructura o propiedades hidrofóbicas/hidrofílicas de la proteína, sin afectar adversamente una actividad biológica. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos se puede alterar, por ejemplo, para hacer al péptido más hidrofóbico o hidrofílico, sin afectar adversamente las actividades biológicas de la proteína. Comúnmente las variantes alélicas, las variantes de sustitución conservativa y los miembros de la familia de proteínas, tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70% o 75% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 2, de preferencia por lo menos aproximadamente 80-90%, de preferencia por lo menos aproximadamente 92-94%, y muy de preferencia por lo menos aproximadamente 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia. La identidad u homología con respecto a dichas secuencias se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos a la SEQ ID NO: 2, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de homología, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia (véase la sección B para ver los parámetros relevantes). Se considera que las proteínas de fusión, extensiones N-terminales, C-terminales o internas, supresiones, o inserciones en la secuencia de péptido, no afectan la homología. De esta manera, las proteína de la presente invención incluyen moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2; fragmentos de la misma que tienen una secuencia consecutiva de por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o más residuos de aminoácido de estas proteínas; variantes de secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácido han sido insertados en el extremo N o C, o dentro de la secuencia codificadora descrita; y variantes de secuencia de aminoácidos de la secuencia descrita, o sus fragmentos anteriormente definidos que han sido sustituidos por al menos un residuo. Dichos fragmentos, referidos también como péptidos o polipéptidos, pueden contener regiones antigénicas, regiones funcionales de la proteína identificadas como regiones de la secuencia de aminoácidos que corresponden a dominios de proteína conocidos, así como también regiones de hidrofilicidad pronunciada.

Todas las regiones son fácilmente identificables usando un software de análisis de secuencia de proteína comúnmente disponible, tal como el MacVector (Oxford Molecular). Las variantes contempladas también incluyen las que contienen mutaciones predeterminadas, por ejemplo por recombinación homologa, mutagénesis dirigida al sitio o de PCR, y las proteínas correspondientes de otras especies animales, que incluyen sin limitación, de conejo, ratón, rata, porcina, bovina, ovina, equina, y especies de primates no humanos, y los alelos u otras variantes naturales de las familias de proteínas; y derivados en donde la proteína se ha modificado covalentemente por sustitución química o enzimática, u otros medios adecuados, con una porción diferente de un aminoácido natural (por ejemplo, una porción detectable tal como una enzima o radioisótopo). Además, la presente invención provee composiciones que comprenden una proteína o polipéptido de la invención y un diluente. Los diluentes adecuados pueden ser disolventes acuosos o no acuosos o una combinación de los mismos, y pueden comprender componentes adicionales, por ejemplo sales solubles en agua o glicerol, que contribuyen a la estabilidad, solubilidad, actividad, o almacenamiento de la proteína o polipéptido. Como se describe más abajo, los miembros de la familia de las proteínas se pueden usar: (1) para identificar agentes que modulan la cantidad o por lo menos una actividad de la proteína, (2) para identificar socios de unión para la proteína, (3) como un antígeno para producir anticuerpos policlonales o monoclonales, (4) como un agente o blanco terapéutico, y (5) como un agente diagnóstico o marcador del cáncer pancreático y otras enfermedades hiperplásicas.

B. Moléculas de ácido nucleico La presente invención también provee moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína que tiene la SEQ ID NO: 2 y las proteínas relacionadas aquí descritas, preferiblemente en forma aislada. Como se usa aquí, "ácido nucleico" se define como ARN o ADN que codifica una proteína o péptido como el que se define arriba, es complementario a una secuencia de ácido nucleico que codifica dichos péptidos, híbrida con el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 y permanece unido establemente al mismo bajo condiciones de severidad adecuadas, codifica un polipéptido que comparte por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70% o 75%, de preferencia por lo menos aproximadamente 80-90%, de preferencia por lo menos aproximadamente 92-94%, y muy de preferencia por lo menos aproximadamente 95%, 98%, 99% o más de identidad con la secuencia de péptido de la SEQ ID NO: 2, o que exhibe por lo menos 50%, 60%, 70% o 75%, de preferencia por lo menos 80-90%, de preferencia por lo menos aproximadamente 92-94%, y muy de preferencia por lo menos aproximadamente 95%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia de nucleótidos sobre los marcos de lectura abiertos de la SEQ ID NO: 1. Además, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico aislado que hibridan específicamente con el complemento de la SEQ ID NO: 1 , particularmente moléculas que hibridan específicamente sobre los marcos de lectura abiertos. Dichas moléculas que hibridan específicamente con el complemento de la SEQ ID NO: 1 , típicamente lo hacen así bajo condiciones de hibridación severas. Se contemplan específicamente moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm y moléculas de antisentido, así como también ácidos nucleicos basados en esqueletos alternativos o que incluyen bases alternativas, ya sea derivada de fuentes naturales o sintetizadas. Sin embargo, dichos ácidos nucleicos hibridantes o complementarios se definen adicionalmente como novedosos y no obvios sobre cualquier ácido nucleico de la técnica anterior, incluyendo los que codifican, hibridan bajo las condiciones de severidad adecuadas, o son complementarias al ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la presente invención. La homología o identidad de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos se determina por medio de análisis de BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica) usando el algoritmo usado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul y otros (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, y Karlin y otros (1990), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, que se incorporan aquí completamente como referencia), que se ajustan para búsqueda de similitud de secuencia. El enfoque usado por el programa BLAST es considerar primero segmentos similares, con y sin espacios, entre una secuencia de consulta y una secuencia de base de datos; después evaluar el significado estadístico de todas las coincidencias que son identificadas; y finalmente resumir únicamente aquellas coincidencias que satisfagan un umbral de significancia preseleccionado. Para una exposición de las cuestiones básicas de búsqueda de similitud en bases de datos de secuencias, véase Altschul y otros (1994), Nat. Genet. 6: 119-129, que se incorpora aquí completamente como referencia. Los parámetros de búsqueda para hístograma, descripciones, alineaciones, expectativa (es decir, el umbral de significado estadístico para reportar coincidencias contra las secuencias de la base de datos), corte, matriz y filtro (complejidad baja), son a los valores por omisión. La matriz de puntuación por omisión usada por blastp, blastx, tbiastn y tbiastx, es la matriz BLOSUM62 (Henikoff y otros (1992), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, que se incorpora aquí completamente como referencia), recomendada para consultar secuencias de más de 85 nucleótidos o aminoácidos de longitud. Para blastn, la matriz de puntuación se pone por medio de las relaciones de M (es decir, la puntuación de rescate para un par de residuos de coincidencia) a N (es decir, la puntuación de penalización para residuos discordantes), en donde los valores por omisión para M y N son 5 y -4, respectivamente. Se ajustaron 4 parámetros de blastn de la siguiente manera: Q=10 (penalización de creación de espacio); R=10 (penalización de extensión de espacio); wink=1 (genera aciertos de palabra en cada posición de incremento de wink a lo largo de la consulta); y gapw=16 (establece el ancho de ventana dentro del cual se generan las alineaciones con espacios). Los ajustes de parámetro Blastp equivalentes fueron Q=9; R=2; wink=1 ; y gapw=32. Una comparación Bestfit entre las secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, utiliza parámetros de ADN GAP=50 (penalización de creación de espacio) y LEN=3 (penalización de extensión de espacio), y los ajustes equivalentes en comparaciones de proteína son GAP=8 y LEN=2. Las "condiciones severas" son aquellas que (1) usan fuerza iónica baja y temperatura alta para lavar, por ejemplo 0.015 M de NaCI /0.0015 M de citrato de sodio /0.1% de SDS a 50 °C, o (2), usan durante la hibridación un agente de desnaturalización tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (vol/vol) con 0.1% de seroalbúmina bovina /0.1% de Ficoll /0.1% de polivinilpirrolidona /50 mM de amortiguador de fosfato de sodio a pH 6.5 con 750 mM de NaCI, 75 mM de citrato de sodio, a 42 °C. Otro ejemplo es hibridación en formamida 50%, SSC 5x (0.75 M de NaCI, 0.075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), 0.1 % de SDS y 10% de sulfato de dextrano, a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0.2x y SDS 0.1 %. El experto en la materia puede determinar y variar fácilmente las condiciones de severidad adecuadamente para obtener una señal de hibridación clara y detectable. Las moléculas preferidas son aquellas que hibridan bajo las condiciones anteriores con el complemento de la SEQ ID NO: 1 , y que codifican una proteína funcional o de longitud completa. Las moléculas de hibridación más preferidas son las que hibridan bajo las condiciones anteriores con la cadena de complemento del marco de lectura abierto de la SEQ ID NO: 1. Como se usa aquí, se dice que una molécula de ácido nucleico está "aislada" cuando la molécula de ácido nucleico se separa sustancialmente de moléculas de ácido nucleico contaminante que codifican otros polipéptidos. Además, la presente invención provee fragmentos de las moléculas de ácido nucleico descrito. Como se usa aquí, un fragmento de una molécula de ácido nucleico se refiere a una pequeña porción de la secuencia codificadora o no codificadora. El tamaño del fragmento será determinado por el uso deseado. Por ejemplo, si se elige el fragmento a fin de codificar una porción activa de la proteína, se requerirá que el fragmento sea suficientemente grande para codificar la región o regiones funcionales de la proteína. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos que codifican péptidos que corresponden a las regiones antigénicas predichas. Si el fragmento se va a usar como una sonda de ácido nucleico o iniciador de PCR, entonces la longitud del fragmento se elige a fin de obtener un número relativamente pequeño de falsos positivos durante el sondeo/iniciación (véase la exposición en la sección G). Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (es decir, oligonucleótídos sintéticos) que se usan como sondas o iniciadores específicos para la reacción en cadena de polimerasa (PCR), o para sintetizar secuencias de gen que codifican las proteínas de la invención, se pueden sintetizar fácilmente mediante técnicas químicas, por ejemplo, el método de fosforamidita de Matteucci y otros ((1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191), o usando métodos de síntesis automáticos. Además, se pueden preparar fácilmente segmentos de ADN más grandes mediante métodos muy conocidos, tales como la síntesis de un grupo de oligonucleótidos que definen varios segmentos modulares del gen, seguida por ligación de los oligonucleótidos para construir el gen modificado completo. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden modificar adicionalmente a fin de contener una marca detectable para fines diagnósticos y de sonda. Una variedad de dichas marcas se conocen y se pueden usar fácilmente con las moléculas codificadoras que aquí se describen. Las marcas adecuadas incluyen, sin limitación, biotina, nucleótidos marcados por fluorescencia o radiomarcados, etcétera. El experto en la materia puede usar fácilmente cualquier marca para obtener variantes marcadas de las moléculas de ácido nucleico de la invención.

C. Aislamiento de otras moléculas de ácido nucleico relacionadas Como se describe arriba, la identificación y caracterización de la molécula de ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO: 1 permite al técnico aislar moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de proteína, además de las secuencias aquí descritas. Además, las moléculas de ácido nucleico que se describen en la presente permiten al experto en la materia aislar moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de proteínas, además de las proteínas que tienen la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, un experto en la materia puede usar fácilmente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 para generar sondas de anticuerpo para examinar colecciones de expresión preparadas de las células adecuadas. Normalmente se puede usar antisuero policlonal de mamíferos, tales como conejos inmunizados con la proteína purificada (como se describe más abajo), o anticuerpos monoclonales, para sondear un ADNc de mamífero o colección de expresión genómica tal como la colección lambda gtll, para obtener la secuencia codificadora adecuada para otros miembros de la familia de proteína. La secuencia de ADNc clonado se puede expresar como una proteína de fusión, se puede expresar directamente usando sus propias secuencias de control, o se puede expresar por medio de construcciones usando las secuencias de control adecuadas para el hospedero particular usado para la expresión de la enzima. Alternativamente, se puede sintetizar una porción de la secuencia codificadora aquí descrita y usarse como una sonda para recuperar el ADN que codifica un miembro de la familia de proteína, de cualquier organismo de mamífero. Se preparan oligómeros que contienen aproximadamente 18-20 nucleótidos (que codifican un tramo de aproximadamente 6-7 aminoácidos), y se usan para examinar colecciones de ADN genómico o ADNc, para obtener una hibridación bajo condiciones severas o condiciones de suficiente severidad para eliminar un grado mayor de falsos positivos. Adicionalmente, se pueden preparar pares de iniciadores de oligonucleótido para usarse en PCR, para clonar selectivamente una molécula de ácido nucleico codificador. Un ciclo de desnaturalización /apareamiento /extensión de PCR para usar dichos iniciadores de PCR es muy conocido en la técnica y se puede adaptar fácilmente para aislar otras moléculas de ácido nucleico codificador. Las moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de proteínas también se pueden identificar en la información genómica o de otras secuencias existentes usando cualquier método computacional disponible, que incluye sin limitación: PSI-BLAST (AltschuI y otros (1997), Nucí. Acids Res. 25: 3389-3402); PHI-BLAST (Zhang y otros (1998), Nucí. Acids Res. 26: 3986-3990), 3D-PSSM (Kelly y otros (2000), J.

Mol. Biol. 299: 499-520); y otros métodos de análisis computacional (Shi y otros (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun. 262: 132-138, y Matsunami y otros (2000), Nature 404: 601-604).

D. Moléculas de ADNr que contienen una molécula de ácido nucleico La presente invención también provee moléculas de ADN recombinantes (ADNr's) que contienen una secuencia codificadora. Como se usa aquí, una molécula de ADNr es una molécula de ADN que ha sido sometida a manipulación molecular in situ. Los métodos para generar moléculas de ADNr son muy conocidos, véase por ejemplo Sambrook y otros, "Molecular Cloning -A Laboratory Manual", tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. En las moléculas de ADNr preferidas, una secuencia de ADN codificadora está enlazada operativamente a secuencias de control de expresión o secuencias de vector. La elección de secuencias de vector o de control de expresión a las cuales se enlaza operativamente una de las secuencia codificadoras de la familia de proteínas de la presente invención, depende directamente, como es muy conocido, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la expresión de proteína, y la célula hospedera por transformar. Un vector contemplado por la presente invención es por lo menos capaz de dirigir la duplicación o inserción en el cromosoma hospedero, y preferiblemente también la expresión del gen estructural incluido en la molécula de ADNr. Los elementos de control de expresión que se usan para regular la expresión de una secuencia codificadora de proteína enlazada operativamente, son conocidos e incluyen, sin limitación, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción y otros elementos reguladores. Preferiblemente, el promotor inducible se controla fácilmente, por ejemplo siendo sensible a un nutriente en el medio de la célula hospedera. En una modalidad, el vector que contiene una molécula de ácido nucleico codificadora incluirá un replicón procariótico, esto es, una secuencia de ADN que tiene la capacidad para dirigir la duplicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en una célula hospedera procariótica, tal como una célula hospedera bacteriana, transformada con la misma. Tales replicones son muy conocidos. Además, los vectores que incluyen un replicón procariótico también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable tal como una resistencia a fármaco. Los genes de resistencia a fármaco bacterianos que son típicos, son los que confieren resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los vectores que incluyen un replicón procariótico pueden incluir también un promotor procariótico o bacteriófago capaz de dirigir la expresión (transcripción y traducción) de las secuencias de gen codificadoras en una célula hospedera bacteriana, tal como E. coli. Un promotor es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ADN que permite la ocurrencia de la unión de ARN polimerasa y la transcripción. Las secuencias de promotor compatibles con hospederos bacterianos son provistas típicamente en vectores plasmídicos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Típicos de dichos vectores plasmídicos son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329, disponibles de BioRad Laboratories, (Richmond, California), pPL y pKK223, disponibles de Pharmacia (Piscataway, Nueva Jersey). También se pueden usar vectores de expresión compatibles con células eucarióticas, preferiblemente las compatibles con células de vertebrado, para formar moléculas de ADNr que contienen una secuencia codificadora. Los vectores de expresión de célula eucariótica, incluyendo vectores virales, son muy conocidos, y están disponibles de varias fuentes comerciales. Típicamente, dichos vectores son provistos conteniendo sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Típicos de dichos vectores son pSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC, #31255), el vector pCDM8 aquí descrito, y vectores de expresión eucarióticos similares. Los vectores se pueden modificar para incluir promotores específicos de tejido si así se requiere. Los vectores de expresión de célula eucariótica usados para construir las moléculas de ADNr de la presente invención pueden incluir también un marcador seleccionable que es efectivo en una célula eucariótica, preferiblemente un marcador de selección de resistencia a fármaco. Un marcador de resistencia a fármaco preferido es el gen cuya expresión resulta en resistencia a la neomicina, esto es, el gen de neomicina fosfotransferasa (neo) (Southern y otros (1982), J. Mol. Anal. Genet. 1 :327-341). Alternativamente, el marcador seleccionable puede estar presente en un plásmido separado, y los dos vectores se introducen por medio de cotransfección de la célula hospedera, y seleccionarse cultivando en el fármaco adecuado para el marcador seleccionable.

E. Células hospederas que contienen una molécula de ácido nucleico codificador suministrado exóqenamente Además, la presente invención provee células hospederas transformadas con una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. La célula hospedera puede ser procariótica o eucariótica. Las células eucarióticas útiles para la expresión de una proteína de la invención no están limitadas, siempre que la línea celular sea compatible con los métodos de cultivo de célula y compatible con la propagación del vector de expresión y la expresión del producto de gen. Las células hospederas eucarióticas preferidas incluyen, sin limitación, células de levadura, insecto y mamífero, preferiblemente células de vertebrado, como una línea de células de ratón, rata, mono o humano. Las células hospederas eucarióticas preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), disponibles de la ATCC como CCL61 , células embrionarias de ratón suizo NIH (NIH/3T3), disponibles de la ATTC como CRL 1658, células de riñon de hámster crío (BHK), y líneas celulares eucarióticas de cultivo de tejido similares. Se puede usar cualquier hospedero procariótico para expresar una molécula de ADNr que codifica una proteína de la invención. El hospedero procariótico preferido es E. coli. La transformación de células hospederas adecuadas con una molécula de ADNr de la presente invención se realiza mediante métodos muy conocidos que dependen típicamente del tipo de vector usado y el sistema hospedero usado. Con respecto a la transformación de células de hospedero procarióticas, se usan normalmente métodos de electroporación y tratamiento con sal (véase, por ejemplo, Cohén y otros (1972), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 69: 2110; y Sambrook y otros, arriba). Con respecto a la transformación de células de vertebrado con vectores que contienen ADNr's, normalmente se usa electroporación, lípido catiónico o métodos de tratamiento con sal; véase por ejemplo Graham y otros (1973), Virol. 52: 456; Wigler y otros (1979), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76: 1373-1376. Las células transformadas exitosamente, es decir, las células que contienen una molécula de ADNr de la presente invención se pueden identificar mediante técnicas muy conocidas que incluyen la selección de un marcador seleccionable. Por ejemplo, las células que resultan de la introducción de un ADNr de la presente invención se pueden clonar para producir colonias individuales. Las células de estas colonias se pueden cosechar, se pueden lisar, y su contenido de ADN se puede examinar para determinar la presencia del ADNr, usando un método tal como el que describe Southern, (1975) J. Mol. Biol. 98: 503, o Berent y otros, (1985) Biotech. 3: 208, o las proteínas producidas de la célula se analizan por medio de un método inmunológico. Los presentes inventores prepararon una Escherichia coli DH5@/p313-JF3, y la depositaron en la Colección Coreana para Cultivos Tipo del Instituto Coreano de Investigación en Biociencia y Biotecnología, el 5 de junio de 2006 (Depósito No. KCTC 10954BP).

F. Producción de proteínas recombinantes usando una molécula de ADNr La presente invención también provee métodos para producir una proteína de la invención usando las moléculas de ácido nucleico aquí descritas. En términos generales, la producción de una forma recombinante de una proteína incluye normalmente los siguientes pasos: En primer lugar, se obtiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención, tal como una molécula de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente, o consiste en la SEQ ID NO: 1 , o los nucleótidos 53-643 o 53-640 de la SEQ ID NO: 1. Si la secuencia codificadora no es interrumpida por intrones, como lo son estos marcos de lectura abiertos, es adecuada directamente para su expresión en cualquier hospedero. Después, la molécula de ácido nucleico se coloca preferiblemente en enlace operable con secuencias de control adecuadas, como se describe arriba, para formar una unidad de expresión que contiene el marco de lectura abierto de la proteína. La unidad de expresión se usa para transformar un hospedero adecuado, y el hospedero transformado se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de la proteína recombinante. Opcionalmente, la proteína recombinante se aisla del medio o de las células; en algunos casos la recuperación y purificación de la proteína pueden no ser necesarias cuando se pueden tolerar algunas impurezas. Cada uno de los pasos anteriores se puede hacer en una variedad de formas. Por ejemplo, las secuencias codificadoras deseadas se pueden obtener de fragmentos genómicos y utilizarse directamente en hospederos adecuados. La construcción de vectores de expresión que son operables en una variedad de hospederos se realiza usando replicones y secuencias de control adecuados, como se expuso arriba. Las secuencias de control, vectores de expresión y métodos de transformación, dependen del tipo de célula hospedera usada para expresar el gen, y se expusieron más arriba detalladamente. Los sitios de restricción adecuados, si no están disponibles normalmente, se pueden añadir a los extremos de la secuencia codificadora a fin de proveer un gen extirpable para insertarlo en estos vectores. El experto en la materia puede adaptar fácilmente cualquier sistema de hospedero/expresión conocido para usarlo con las moléculas de ácido nucleico de la invención para producir la proteína recombinante.

G. Métodos para identificar agentes que modulan la expresión de un ácido nucleico que codifica los genes asociados con el cáncer pancreático Otra modalidad de la presente invención provee métodos para identificar agentes que modulan la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la invención, tal como una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Dichas pruebas pueden utilizar cualquier medio disponible para monitorear los cambios en el grado de expresión de los ácidos nucleicos de la invención. Como se usa aquí, se dice que un agente modula la expresión de un ácido nucleico de la invención si es capaz de regular positiva o negativamente la expresión del ácido nucleico en una célula.

En un formato de prueba, se pueden preparar líneas celulares que contienen fusiones de gen reportero entre los nucleótidos de dentro del marco de lectura abierto definido por los nucleótidos 53-643 de la SEQ ID NO: 1 , o los elementos reguladores 5' o 3' y cualquier socio de fusión analizable. Muchos socios de unión analizables son conocidos y están disponibles fácilmente, incluyendo el gen de luciferasa de luciérnaga y el gen que codifica cloranfenicol acetiltransferasa (Alam y otros (1990), Anal. Biochem. 188: 245-254). Las líneas de células que contienen las fusiones del gen reportero se exponen entonces al agente por probar bajo las condiciones y tiempo adecuados. La expresión diferencial del gen reportero entre muestras expuestas al agente y muestras de control identifica los agentes que modulan la expresión de un ácido nucleico de la invención. Se pueden usar formatos de pruebas adicionales para monitorear la capacidad del agente para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la invención, tal como la proteína que tiene la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, se puede monitorear directamente la expresión de ARNm por medio de hibridación con los ácidos nucleicos de la invención. Las líneas celulares se exponen al agente por probar bajo las condiciones y tiempo adecuados, y se aisla ARN total o ARNm mediante los procedimientos estándares, como los que describen Sambrook y otros, "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Las células preferidas serán las derivadas de tejido humano, por ejemplo, tejido de biopsia o células cultivadas de pacientes con cáncer. Se pueden usar líneas celulares tales como las líneas de células de carcinoma ductal de mama ATCC (Nos. de catálogo CRL-2320, CRL-2338 y CRL-7345), líneas de células de adenocarcinoma colorrectal ATCC (Nos. de catálogo CCL-222, CCL-224, CCL-225, CCL-234, CRL-7159 y CRL-7184), líneas de células de adenocarcinoma de pulmón ATCC (Nos. de catálogo CRL-5944, CRL-7380 y CRL-5907), líneas de células de adenocarcinoma de ovario ATCC (Nos. de catálogo HTB-161 , HTB-75 y HTB-76), líneas de células de adenocarcinoma pancreático ATCC (Nos. de catálogo HTB-79, HTB-80 y CRL-2547), líneas de células de adenocarcinoma de próstata ATCC (Nos. de catálogo CRL-1435, CRL-2422 y CRL-2220), y líneas de células de adenocarcinoma gástrico ATCC (Nos. de catálogo CRL-1739, CRL-1863 y CRL-1864). Alternativamente se pueden usar otras células o líneas de células disponibles. De los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar sondas para detectar las diferencias en los grados de expresión del ARN entre las células expuestas al agente y células de control. Es preferible, aunque no necesario, diseñar sondas que hibridan únicamente con los ácidos nucleicos objetivo bajo condiciones de alta severidad. Bajo condiciones de alta severidad solo se forman híbridos de ácido nucleico altamente complementarios. Por consiguiente, la severidad de las condiciones de prueba determina la cantidad de complementariedad que existiría entre dos cadenas de ácido nucleico para formar un híbrido. La severidad se debe elegir para máximizar la diferencia de estabilidad entre el híbrido sonda:objetivo y los híbridos sonda:no objetivo. Las sondas de los ácidos nucleicos de la invención se pueden diseñar mediante los métodos conocidos. Por ejemplo, el contenido de G+C de la sonda y la longitud de la sonda pueden afectar la unión de la sonda a su secuencia objetivo. Los métodos para optimizar la especificidad de las sondas están disponibles comúnmente en Sambrook y otros, arriba, o Ausubel y otros, "Short Protocols in Molecular Biology", cuarta edición, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999. Las condiciones de hibridación se modifican usando los métodos conocidos, por ejemplo los que describen Sambrook y otros y Ausubel y otros, según se requiera para cada sonda. La hibridación del ARN celular total o ARN enriquecido en ARN poli-A, se puede realizar en cualquier formato disponible. Por ejemplo, el ARN celular total o ARN enriquecido en ARN poli-A se puede fijar a un soporte sólido, y el soporte sólido se expone a por lo menos una sonda que comprende por lo menos una, o parte de una, de las secuencias de la invención, bajo condiciones en las cuales la sonda se hibridará específicamente. Alternativamente, fragmentos de ácido nucleico que comprenden por lo menos una, o parte de una, de las secuencias de la invención se pueden fijar a un soporte sólido, tal como un chip de silicio, oblea de vidrio poroso o membrana. Después, el soporte sólido se puede exponer al ARN celular total o ARN poli-A de una muestra bajo condiciones en las cuales las secuencias fijas hibriden específicamente. Dichos soportes sólidos y los métodos de hibridación están ampliamente disponibles, por ejemplo los que describe Beattie (1995) WO 95/11755. Al examinar la capacidad de una sonda dada para hibridar específicamente con una muestra de ARN de una población de células no tratadas y de una población de células expuestas al agente, se identifican los agentes que regulan positiva o negativamente la expresión de un ácido nucleico que codifica la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2. La hibridación para análisis cualitativo y cuantitativo de los ARNm's también se puede efectuar usando una prueba de protección de ribonucleasa (esto es, RPA, véase Ma y otros (1996), Methods 10: 273-238). Brevemente, un vehículo de expresión que comprende ADNc que codifica el producto del gen y un promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN específico de fago (por ejemplo, ARN polimerasa T7, T3 o SP6), se linealiza en el extremo 3' de la molécula de ADNc en dirección 3' desde el promotor de fago, en donde dicha molécula linealizada se usa subsiguientemente como un molde para sintetizar un transcrito de antisentido marcado del ADNc por transcripción in vitro. Después, el transcrito marcado se híbrida con una mezcla de ARN aislado (esto es, ARNm total o fraccionado) por incubación a 45 °C durante la noche, en un amortiguador que comprende 80% de formamida, 40 mM de Pipes, pH 6.4, 0.4 M de NaCI y 1 mM de EDTA. Después, los híbridos resultantes se digieren en un amortiguador que comprende 40 pg/ml de ribonucleasa A y 2 pg/ml de ribonucleasa. Después de desactivación y extracción de proteínas ajenas, las muestras se cargan en geles de urea/poliacrilamida para su análisis. En otra prueba, para identificar los agentes que afectan la expresión de los presentes productos de gen, primero se identifican células o líneas de células que expresan fisiológicamente los productos de gen de la invención. Se esperaría que las células o líneas de células así identificadas comprendan la maquinaria celular necesaria para mantener la fidelidad de modulación del aparato de transcripción, con respecto al contacto exógeno del agente con mecanismos de transducción de superficie adecuados o las cascadas citosólicas. Además, dichas células o líneas de células serían tranducidas o transfectadas con una construcción de vehículo de expresión (por ejemplo un plásmido o vector viral), que comprende un extremo que contiene un promotor 5' no traducido operable del gen estructural que codifica los presentes productos de gen, fusionados con uno o más fragmentos antigénicos, que son peculiares para los presentes productos de gen, en donde dichos fragmentos están bajo el control de transcripción de dicho promotor y se expresan como polipéptidos cuyo peso molecular puede ser distinguido de los polipéptidos naturales, o puede comprender adicionalmente una marca inmunológicamente distinta u otro marcador detectable. Dicho proceso es muy conocido (véase Sambrook y otros, arriba). Después, las células o líneas de células transducidas o transfectadas, como se indica arriba, se ponen en contacto con agentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, el agente en un excipiente farmacéuticamente aceptable se pone en contacto con células en un amortiguador fisiológico acuoso, tal como solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) a pH fisiológico, solución salina balanceada de Eagle (BSS) a pH fisiológico, PBS o BSS que comprende suero o medio acondicionado que comprende PBS o BSS, o suero incubado a 37 °C. Dichas condiciones se pueden modular conforme el experto en la materia lo considere necesario. Después de poner en contacto las células con el agente, dichas células se romperán y los polipéptidos del lisado se fraccionarán, de tal manera de reunir una fracción de polipéptido y ponerla en contacto con un anticuerpo para ser procesada adicionalmente mediante una prueba inmunológica (por ejemplo, ELISA, inmunoprecipitación o Western blot). La cantidad reunida de proteínas aisladas de la muestra de "contacto con el agente" será comparada con una muestra de control, en donde solo el excipiente hizo contacto con las células, y un aumento o disminución de la señal generada inmunológicamente de la muestra "de contacto con el agente", en comparación con el control, se usará para distinguir la eficacia del agente.

H. Métodos para identificar agentes que modulan la cantidad o por lo menos una actividad de las proteínas asociadas con el cáncer pancreático Otra modalidad de la presente invención provee métodos para identificar agentes que modulan la cantidad o por lo menos una actividad de una proteína de la invención, tal como la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Dichos métodos o pruebas pueden utilizar cualquier medio para monitorear o detectar la actividad deseada y son particularmente útiles para identificar agentes para tratar el cáncer pancreático. En un formato, se pueden determinar las cantidades relativas de una proteína de la invención entre una población de células que ha sido expuesta al agente por probar, en comparación con una población de células de control no expuestas. En este formato, se usan sondas tales como anticuerpos específicos para monitorear la expresión diferencial de la proteína en las diferentes poblaciones de células. Líneas o poblaciones de células se exponen al agente por probar bajo las condiciones y tiempo adecuados. Se pueden preparar lisados célulares de la línea o población de células expuestas y una población o línea de células no expuestas de control. Después se analizan los lisados celulares con la sonda. Las sondas de anticuerpo se preparan inmunizando hospederos de mamíferos adecuados en protocolos de inmunización adecuados, usando los péptidos, polipéptidos o proteínas de la invención si son de longitud suficiente, o si se desea, o si se requiere para aumentar la inmunogenicidad, conjugados con vehículos adecuados. Los métodos para preparar conjugados inmunogénicos con vehículos como BSA, KLH, u otras proteínas de vehículo son muy conocidos. En algunas circunstancias la conjugación directa puede ser eficiente, usando por ejemplo reactivos de carbodiimida; en otros casos pueden ser deseables reactivos de enlazamiento como los provistos por Pierce Chemical Co. (Rockford, Illinois), para proveer accesibilidad al hapteno. Los péptidos del hapteno se pueden extender en el extremo amino o carboxi con un residuo de cisteína, o interpuesto con residuos de cisteína, por ejemplo, para facilitar el enlazamiento a un vehículo. La administración de los inmunógenos generalmente se realiza por inyección durante un periodo adecuado y usando los adyuvantes adecuados, como se entiende generalmente en la técnica. Durante el programa de inmunización, se toman los títulos de anticuerpo para determinar la adecuación de la formación de anticuerpo. Aunque el antisuero policlonal producido de esta manera puede ser satisfactorio para algunas aplicaciones, para composiciones farmacéuticas se prefiere usar preparaciones monoclonales. Se pueden preparar lineas de células inmortalizadas que segregan los anticuerpos monoclonales deseados usando el método estándar de Kohler y Milstein ((1975), Nature 256: 495-497), o usando modificaciones que efectúan la inmortalización de linfocitos o células de bazo, como es generalmente conocido. Las líneas de células inmortalizadas que segregan los anticuerpos deseados se examinan por medio de un inmunoensayo en el cual el antígeno es el hapteno de péptido, polipéptido o proteína. Cuando se identifica el cultivo de células inmortalizadas adecuado, que segrega el anticuerpo deseado, las células se pueden cultivar in vitro o mediante producción en fluido de ascitis. Después, los anticuerpos monoclonales deseados se recuperan del sobrenadante del cultivo o del sobrenadante de ascitis. Los fragmentos de los anticuerpos monoclonales, o el antisuero policlonal que contiene la porción inmunológicamente significativa (de unión de antígeno), se pueden usar como antagonistas, así como también los anticuerpos intactos. Frecuentemente se prefieren usar fragmentos de anticuerpo inmunológicamente reactivos (de unión de antígeno), tales como los fragmentos Fab, Fab', o F(ab')2l especialmente en un contexto terapéutico, ya que estos fragmentos generalmente son menos inmunogénicos que toda la inmunoglobulina. Los anticuerpos o fragmentos de unión de antígeno también se pueden producir usando la tecnología actual por medios recombinantes. Las regiones de anticuerpo que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína también se pueden producir en el contexto de quimeras con origen múltiple de especie, tal como anticuerpos humanizados. Los agentes que se analizan en el método anterior se pueden seleccionar al azar, o se pueden seleccionar o diseñar racionalmente. Como se usa aquí, se dice que un agente se selecciona al azar cuando el agente se elige aleatoriamente sin considerar las secuencias específicas involucradas en la asociación de una proteína de la invención sola o con sus substratos asociados, socios de unión, etcétera. Un ejemplo de agentes seleccionados al azar es el uso de una colección química o una colección combinatoria de péptidos, o un caldo de crecimiento de un organismo. Como se usa aquí, se dice que un agente se seleciona o diseña racionalmente cuando el agente se elige sobre una base no aleatoria que toma en consideración la secuencia del sitio objetivo o su conformación con respecto a la acción del agente. Los agentes se pueden seleccionar racionalmente o diseñar racionalmente utilizando las secuencias de péptido que integran estos sitios. Por ejemplo, un agente de péptido seleccionado racionalmente puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a cualquier sitio de consenso funcional, o a un derivado del mismo. Los agentes de la presente invención pueden ser, por ejemplo, péptidos, moléculas pequeñas, derivados de vitamina, y también carbohidratos. Las proteínas negativas dominantes, ADN's que codifican estas proteínas, anticuerpos para estas proteínas, fragmentos de péptido de estas proteínas, o imitaciones de estas proteínas, se pueden introducir en las células para afectar la función. "Imitación" como se usa aquí, se refiere a la modificación de una región o varias regiones de una molécula de péptido para proveer una estructura químicamente diferente del péptido progenitor, pero topográfica y funcionalmente similar al péptido progenitor (véase Grant en: "Molecular Biology and Biotechnology", Meyers, ed., p. 659-664, VCH Publishers, Inc., Nueva York, 1995). El experto en la materia puede reconocer fácilmente que no hay limitación en cuanto a la naturaleza estructural de los agentes de la presente invención. Los agentes de péptido de la invención se pueden preparar usando los métodos estándares de síntesis de péptido en fase sólida (o en fase de solución), como se conoce en la técnica. Además, el ADN que codifica estos péptidos se puede sintetizar usando la instrumentación de síntesis de oligonucleótidos disponible comercialmente, y se puede producir de forma recombinante usando los sistemas estándares de producción recombinante. La producción usando la síntesis de péptido en fase sólida es necesaria si se quiere incluir aminoácidos no codificados por gen. Otra clase de agentes de la presente invención son anticuerpos inmunorreactivos con las posiciones críticas de las proteínas de la invención. Los agentes de anticuerpo se obtienen por inmunización de sujetos mamíferos adecuados con los péptidos, que contienen como regiones antigénicas aquellas porciones de la proteína destinadas a ser blanco de los anticuerpos.

I. Usos de los agentes que modulan la expresión o por lo menos una actividad de las proteínas asociadas con el cáncer pancreático Como se provee en los ejemplos, las proteínas y ácidos nucleicos de la invención, tales como las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, se expresan diferencialmente en tejido canceroso pancreático. Se pueden usar agentes que regulan o modulan positiva o negativamente la expresión de la proteína, o por lo menos una actividad de la proteína, tales como agonistas o antagonistas, para modular procesos biológicos y patológicos asociados con la función y actividad de la proteína. Esto incluye los agentes identificados usando homólogos y análogos de la presente invención. Como se usa aquí, un sujeto puede ser cualquier mamífero, siempre que el mamífero esté en necesidad de modulación de un proceso patológico o biológico mediado por una proteína de la invención. El término "mamífero" se define como un individuo que pertenece a la clase Mammalia.

La invención es particularmente útil en el tratamiento de sujetos humanos. Los procesos patológicos se refieren a una categoría de procesos biológicos que producen un efecto nocivo. Por ejemplo, la expresión de una proteína de la invención puede estar asociada con crecimiento celular o hiperplasia. Como se usa aquí, se dice que un agente modula un proceso patológico cuando el agente reduce el grado o severidad del proceso. Por ejemplo, el cáncer se puede prevenir o el avance de la enfermedad se puede modular administrando agentes que regulan positiva o negativamente, o que modulan de alguna manera, la expresión o por lo menos una actividad de una proteína de la invención. Los agentes de la presente invención se pueden proveer solos o en combinación con otros agentes que modulan un proceso patológico particular. Por ejemplo, un agente de la presente invención se puede administrar en combinación con otros fármacos conocidos. Como se usa aquí, se dice que dos agentes se administran en combinación cuando los dos agentes se administran simultáneamente o se administran independientemente, de una manera tal que los agentes actuarán al mismo tiempo. Los agentes de la presente invención se pueden administrar por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica o bucal. Alternativa o concurrentemente, la administración puede ser por vía oral. La dosis administrada dependerá de la edad, salud y peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente si lo existiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Además, la presente invención provee composiciones que contienen uno o más agentes que modulan la expresión o por lo menos una actividad de una proteína de la invención. Aunque varían las necesidades individuales, la determinación de escalas óptimas de cantidades efectivas de cada componente es del dominio del experto en la materia. Las dosis típicas comprenden de 0.1 pg/kg a 100 pg/kg de peso corporal. Las dosis preferidas comprenden de 0.1 pg/kg a 10 pg/kg de peso corporal. Las dosis más preferidas comprenden de 0.1 pg/kg a 1 pg/kg de peso corporal. Además del agente farmacológicamente activo, las composiciones de la presente invención pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente para su suministro al sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas adecuadas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de ajonjolí, o esteres de ácido graso sintético, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscocidad de la suspensión, e incluyen por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano.

Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores.

También se pueden usar liposomas para encapsular el agente para su suministro a la célula. La formulación farmacéutica para administración sistémica de acuerdo con la invención se puede formular para administración enteral, parenteral o tópica. En realidad, se pueden usar los tres tipos de formulaciones simultáneamente para lograr la administración sistémica del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen cápsulas duras o blandas de gelatina, pildoras, tabletas que incluyen tabletas recubiertas, elíxires, suspensiones, jarabes o preparaciones inhalables, y formas de liberación controlada de los mismos. Para practicar los métodos de esta invención, los compuestos de esta invención se pueden usar solos o en combinación, o en combinación con otros agentes terapéuticos o diagnósticos. En algunas modalidades preferidas, los compuestos de esta invención se pueden coadministrar junto con otros compuestos normalmente prescritos para estas condiciones, de acuerdo con la práctica médica aceptada generalmente. Los compuestos de esta invención se pueden utilizar in vivo, ordinariamente en mamíferos tales como humanos, ovejas, caballos, reses, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in vitro.

J. Método para identificar socios de unión Otra modalidad de la presente invención provee métodos para aislar e identificar socios de unión de las proteínas de la invención. En general, una proteína de la invención se mezcla con un socio de unión potencial o un extracto o fracción de célula, bajo condiciones que permiten la asociación de socios de unión potenciales con la proteína de la invención. Después de mezclarse, péptidos, polipéptidos, proteínas u otras moléculas que se han asociado con una proteína de la invención, se separan de la mezcla. El socio de unión que se une a la proteína de la invención se puede remover entonces y después se analiza. Para identificar y aislar un socio de unión se puede usar la proteína completa, por ejemplo, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, se puede usar un fragmento de la proteína. Como se usa aquí, un extracto celular se refiere a una preparación o fracción que está hecha de una célula lisada o rota. La fuente preferida de extractos celulares serán las células derivadas de tumores humanos o células transformadas, por ejemplo tejido de biopsia o células de cultivo de tejido de carcinomas. Alternativamente, se pueden preparar extractos celulares de tejido normal o líneas de células disponibles. Se puede usar una variedad de métodos para obtener un extracto de una célula. Las células se pueden romper usando métodos de ruptura físicos o químicos. Los ejemplos de métodos de ruptura físicos incluyen, sin limitación, sonicación y corte mecánico. Los ejemplos de métodos de lisis química incluyen, sin limitación, lisis de detergente y lisis de enzima. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente los métodos para preparar extractos celulares para usarlos en los presentes métodos. Una vez que se prepara un extracto de una célula, el extracto se mezcla con la proteína de la invención bajo condiciones en las cuales puede ocurrir la asociación de la proteína con el socio de unión. Se puede usar una variedad de condiciones, siendo las condiciones preferidas las condiciones más semejantes a las encontradas en el citoplasma de una célula humana. Las características como la osmolaridad, pH, temperatura y la concentración del extracto celular usado, se pueden variar para optimizar la asociación de la proteína con el socio de unión. Después de mezclar bajo condiciones adecuadas, el complejo enlazado se separa de la mezcla. Se puede utilizar una variedad de técnicas para separar la mezcla. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos específicos para una proteina de la invención para inmunoprecipitar el complejo del socio de unión. Alternativamente, se pueden usar técnicas estándares de separación química, tales como cromatografía y centrifugación de densidad/sedimento. Después de remover los constituyentes celulares no asociados encontrados en el extracto, el socio de unión se puede disociar del complejo usando los métodos convencionales. Por ejemplo, la disociación se puede realizar alterando la concentración de sal o pH de la mezcla. Para ayudar a separar los pares de socios de unión asociados del extracto mixto, la proteína de la invención se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Por ejemplo, la proteína se puede unir a una matriz de nitrocelulosa o cuentas acrílicas. La unión de la proteína a un soporte sólido ayuda a separar pares de péptido/socio de unión de otros constituyentes encontrados en el extracto. Los socios de unión identificados pueden ser una sola proteína o un complejo formado de dos o más proteínas. Alternativamente, se pueden identificar socios de unión usando una prueba de Far-Western, de acuerdo con los procedimientos de Takayama y otros (1997), Methods Mol. Biol. 69: 171-184, o Sauder y otros (1996), J. Gen. Virol. 77: 991-996, o se pueden identificar usando proteínas de epítope marcado o proteínas de fusión GST. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar en un sistema bi-híbrido de levadura u otro sistema de proteína-proteína in vivo. El sistema bi-híbrido de levadura se ha usado para identificar otros pares de socios de proteína y se puede adaptar fácilmente para usar las moléculas de ácido nucleico que aquí se describen.

K. Uso de los socios de unión de las proteínas asociadas con el cáncer pancreático Una vez aislados, los socios de unión de las proteínas de la invención, y sus homólogos y análogos, obtenidos usando los métodos anteriormente descritos, se pueden usar para una variedad de propósitos. Los socios de unión se pueden usar para generar anticuerpos que se unen al socio de unión usando las técnicas conocidas. Se pueden usar anticuerpos que se unen al socio de unión para analizar la actividad de la proteína de la invención, como un agente terapéutico para modular un proceso biológico o patológico mediado por la proteína de la invención, o para purificar el socio de unión. Estos usos se describen más abajo en detalle.

L. Métodos para identificar agentes que bloquean las asociaciones entre los socios de unión y las proteínas asociadas con el cáncer pancreático Otra modalidad de la presente invención provee métodos para identificar agentes que reducen o bloquean la asociación de una proteína de la invención con un socio de unión. Específicamente, una proteína de la invención se mezcla con un socio de unión en presencia o ausencia de un agente que se quiere probar. Después de mezclar bajo condiciones que permiten la asociación de las proteínas, las dos mezclas se analizan y se comparan para determinar si el agente redujo o bloqueó la asociación de la proteína de la invención con el socio de unión. Los agentes que bloquean o reducen la asociación de la proteína de la invención con el socio de unión serán identificados porque disminuyen la cantidad de asociación presente en la muestra que contiene el agente probado. Como se usa aquí, se dice que un agente reduce o bloquea la asociación entre una proteína de la invención y un socio de unión, cuando la presencia del agente disminuye la magnitud de la asociación del socio de unión con la proteína de la invención, o incluso la impide. Una clase de agentes reducirán o bloquerán la asociación uniéndose al socio de unión, mientras que otra clase de agentes reducirán o bloquearán la asociación uniéndose a la proteína de la invención. El socio de unión usado en la prueba anterior puede ser una proteína aislada y caracterizada completamente, o puede ser una proteína parcialmente caracterizada que se une a la proteína de la invención o un socio de unión que ha sido identificado como presente en un extracto celular. Será evidente para el experto en la materia que siempre que el socio de unión haya sido caracterizado por una propiedad identificable, por ejemplo el peso molecular, se puede usar la presente prueba. Los agentes que se analizan en el método anterior se pueden seleccionar al azar, o se pueden seleccionar o diseñar racionalmente. Como se usa aquí, se dice que un agente se selecciona al azar cuando el agente se elige aleatoriamente sin considerar las secuencias específicas involucradas en la asociación de la proteína de la invención con el socio de unión. Un ejemplo de agentes seleccionados al azar es el uso de una colección química o una colección combinatoria de péptidos, o un caldo de crecimiento de un organismo. Como se usa aquí, se dice que un agente se seleciona o diseña racionalmente cuando el agente se elige sobre una base no aleatoria que toma en consideración la secuencia del sitio objetivo o su conformación con respecto a la acción del agente. Los agentes se pueden seleccionar racionalmente o diseñar racionalmente utilizando las secuencias de péptido que integran los sitios de contacto del socio de unión con la proteína de la invención. Por ejemplo, un agente de péptido seleccionado racionalmente puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica al sitio de contacto de la proteína de la invención en el socio de unión. Dicho agente reducirá o bloqueará la asociación de la proteína de la invención con el socio de unión uniéndose al socio de unión. Los agentes de la presente invención pueden ser, por ejemplo, péptidos, moléculas pequeñas, derivados de vitamina, y también carbohidratos. El experto en la materia puede reconocer fácilmente que no hay limitación en cuanto a la naturaleza estructural de los agentes de la presente invención. Una clase de agentes de la presente invención son los agentes de péptido cuyas secuencias de aminoácidos se eligen basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la invención. Los agentes de péptido de la invención se pueden preparar usando los métodos estándares de síntesis de péptido en fase sólida (o en fase de solución), como se conoce en la técnica. Además, el ADN que codifica estos péptidos se puede sintetizar usando la instrumentación de síntesis de oligonucleótidos disponible comerciaimente, y se puede producir de forma recombinante usando los sistemas estándares de producción recombinante. La producción usando la síntesis de péptido en fase sólida es necesaria si se quiere incluir aminoácidos no codificados por gen.

Otra clase de agentes de la presente invención son los anticuerpos inmunorreactivos con las posiciones críticas de las proteínas de la invención o el socio de unión. Como se describe arriba, los anticuerpos se obtienen por inmunización de sujetos mamíferos adecuados con los péptidos que contienen como regiones antigénicas las porciones de la proteína de la invención o socio de unión destinadas a ser blanco de los anticuerpos. Las regiones críticas incluyen los sitios de contacto involucrados en la asociación de la proteína de la invención con el socio de unión. Como se expone más abajo, la secuencia mínima importante de residuos involucrados en la actividad de la proteína de la invención define un dominio lineal funcional que se puede usar eficientemente como un anzuelo para el examen e identificación de dos híbridos de moléculas asociadas potenciales. El uso de dichos fragmentos aumentará significativamente la especificidad de la exploración, a diferencia de usar la molécula de longitud completa, y por lo tanto se prefiere. Similarmente, esta secuencia lineal también se puede usar como una matriz de afinidad también para aislar proteínas de unión, usando una estrategia de purificación bioquímica por afinidad.

M. Usos de los agentes que bloquean las asociaciones entre los socios de unión y las proteínas asociadas con el cáncer pancreático Como se provee en los ejemplos, las proteínas y ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, son expresadas diferencialmente en el tejido del cáncer pancreático. Los agentes que reducen o bloquean las interacciones de una proteína de la invención, incluyendo las identificadas usando homólogos y análogos de la proteína, con un socio de unión, se pueden usar para modular procesos biológicos y patológicos asociados con la función y actividad de la proteína. Como se usa aquí, un sujeto puede ser cualquier mamífero, siempre que el mamífero esté en necesidad de modulación de un proceso patológico o biológico mediado por una proteína de la invención. El término "mamífero" se entiende como un individuo que pertenece a la clase Mammalia. La invención es particularmente útil en el tratamiento de sujetos humanos. Los procesos patológicos se refieren a una categoría de procesos biológicos que producen un efecto nocivo. Por ejemplo, la expresión de una proteína de la invención puede estar asociada con crecimiento celular o hiperplasia. Como se usa aquí, se dice que un agente modula un proceso patológico cuando el agente reduce el grado o severidad del proceso. Por ejemplo, el cáncer pancreático se puede prevenir o el avance de la enfermedad se puede modular, administrando agentes que reducen o bloquean las interacciones de una proteína de la invención con un socio de unión. Los agentes de la presente invención se pueden administrar por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica o bucal. Alternativa o concurrentemente, la administración puede ser por vía oral. La dosis administrada dependerá de la edad, salud y peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente si lo existiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Además, la presente invención provee composiciones que contienen uno o más agentes que bloquean la asociación de una proteína de la invención con un socio de unión. Aunque varían las necesidades individuales, la determinación de escalas óptimas de cantidades efectivas de cada componente es del dominio del experto en la materia. Las dosis típicas comprenden de 0.1 pg/kg a 100 pg/kg de peso corporal. Las dosis preferidas comprenden de 0.1 pg/kg a 10 pg/kg de peso corporal. Las dosis más preferidas comprenden de 0.1 pg/kg a 1 pg/kg de peso corporal. Además del agente farmacológicamente activo, las composiciones de la presente invención pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente para su suministro al sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas adecuadas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de ajonjolí, o ésteres de ácido graso sintético, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscocidad de la suspensión, e incluyen por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores. También se pueden usar liposomas para encapsular el agente para su suministro a la célula. La formulación farmacéutica para administración sistémica de acuerdo con la invención se puede formular para administración enteral, parenteral o tópica. En realidad, se pueden usar los tres tipos de formulaciones simultáneamente para lograr la administración sistémica del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen cápsulas duras o blandas de gelatina, pildoras, tabletas que incluyen tabletas recubiertas, elíxires, suspensiones, jarabes o preparaciones inhalables, y formas de liberación controlada de los mismos. Para practicar los métodos de esta invención, los compuestos de esta invención se pueden usar solos o en combinación, o en combinación con otros agentes terapéuticos o diagnósticos. En algunas modalidades preferidas, los compuestos de esta invención se pueden coadministrar junto con otros compuestos normalmente prescritos para estas condiciones, de acuerdo con la práctica médica aceptada generalmente. Los compuestos de esta invención se pueden utilizar in vivo, ordinariamente en mamíferos tales como humanos, ovejas, caballos, reses, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in vitro.

N. Diseño racional de fármacos y química combinatoria La presente invención también abarca el diseño racional de fármacos y química combinatoria. Los expertos en la materia reconocerán métodos apropiados para utilizar y aprovechar los aspectos de la presente invención para identificar compuestos que se pueden desarrollar para el tratamiento del cáncer pancreático. El diseño racional de fármacos que involucra polipéptidos requiere identificar y definir un primer péptido con el cual va a interactuar el fármaco diseñado, y usar el primer péptido objetivo para definir los requerimientos para un segundo péptido. Con dichos requerimientos definidos, se puede encontrar o preparar un péptido o no péptido adecuado que cumpla todos o sustancialmente todos los requerimientos definidos. De esta manera, una meta del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales o funcionales de los polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales interaccionan (por ejemplo, agonistas, antagonistas, compuestos nulos), para modelar fármacos que son por ejemplo formas más o menos potentes del ligando (véase por ejemplo, Hodgson (1991), Bio. Technology 9:19-21). La química combinatoria es la ciencia de sintetizar y probar compuestos para determinar su bioactividad en masa, en lugar de uno a uno, siendo la finalidad descubrir fármacos y materiales más rápidamente y de forma más barata que la anteriormente posible. El diseño racional de fármacos y la química combinatoria se han relacionado más íntimamente en los últimos años debido al desarrollo de enfoques de modelación de proteína ayudada por computadora y descubrimiento de fármacos (véase por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 4,908,773; 5,884,230; 5,873,052; 5,331 ,573; y 5,888,738). El uso de la modulación molecular como una herramienta para el diseño racional de fármacos y la química combinatoria han aumentado notablemente debido al avance de las gráficas de computadora. No solo es posible observar moléculas en tres dimensiones sobre la pantalla de la computadora, sino que también es posible examinar las interacciones de macromoléculas tales como enzimas y receptores y moléculas derivadas diseñadas racionalmente para probar (véase Boorman (1992), Chem. Eng. News 70:18-26). Actualmente está disponible una gran cantidad de software y hardware fácil de manejar para el usuario, y virtualmente todas las compañías farmacéuticas tienen grupos de modelación de computadora dedicados al diseño racional de fármacos. Por ejemplo, Molecular Simulations Inc. (www.msi.com), vende varios programas sofisticados que permiten a un usuario empezar desde una secuencia de aminoácidos, construir un modelo bidimensional o tridimensional de la proteína o polipéptido, compararlo con otros modelos bidimensionales y tridimensionales, y analizar las interacciones de los compuestos, fármacos y péptidos con un modelo tridimensional en tiempo real. Por consiguiente, en algunas modalidades de la invención, se utiliza software para comparar las regiones de la proteína de la invención y las moléculas que interaccionan con la misma (referidas colectivamente como "socios de unión" -por ejemplo anticuerpos anti-proteínas), y fragmentos o derivados de estas moléculas con otras moléculas, tales como péptidos, peptidomiméticos y agentes químicos, de modo que se pueden predecir y diseñar interacciones terapéuticas (véase Schneider (1998), Genetic Engineering News, diciembre: página 20; Tempczyk y otros (1997), "Molecular Simulations Inc. Solutions", abril; y Butenhof (1998), "Molecular Simulations Inc." Notas de casos (agosto de 1998), para una exposición de la modelación molecular).

O. Terapia génica En otra modalidad, se puede usar terapia génica como medio para modular procesos biológicos y patológicos asociados con la función y actividad de la proteína. Esto comprende insertar en una célula cancerosa una construcción de gen que codifica una proteína que comprende todas las secuencias de SEQ ID NO: 2, o una porción de la misma, o alternativamente una construcción de gen que comprende toda la región no codificadora de SEQ ID NO: 1 , o una porción de la misma, enlazada operativamente a un promotor o elemento incrementador, de tal manera que la expresión de dicha proteína ocasiona la supresión de dicho cáncer, y en donde dicho promotor o elemento incrementador es un promotor o elemento incrementador que modula dicha construcción de gen. En las construcciones descritas, la expresión de dicha proteína se puede dirigir desde cualquier promotor adecuado (por ejemplo, los promotores de citomegalovirus humano (CMV), virus de simio 40 (SV40), o promotores de metalotioneína), y regular mediante cualquier elemento regulador de mamífero adecuado. Por ejemplo, si se desea, se pueden usar incrementadores conocidos que dirigen preferentemente la expresión genética en células neurales, células T, o células B, para dirigir la expresión. Los incrementadores usados pueden incluir, sin limitación, los que están caracterizados como específicos de tejido o célula en su expresión. Alternativamente, si se usa una clona genómica de LBFL313 como una construcción terapéutica (por ejemplo, después de su aislamiento por hibridación con la molécula de ácido nucleico de la invención anteriormente descrita), la regulación se puede mediar mediante las secuencias reguladoras cognadas, o si se desea por secuencias reguladoras derivadas de una fuente heteróloga, que incluye cualquiera de los elementos promotores o reguladores anteriormente descritos. La inserción de la construcción en una célula cancerosa se realiza in vivo usando por ejemplo un vector viral o plasmídico. Dichos métodos también se pueden aplicar a usos in vitro. De esta manera, los métodos de la presente invención son fácilmente aplicables a diferentes formas de terapia génica, ya sea en donde las células son modificadas genéticamente ex vivo y después administradas a un hospedero, o en donde la modificación genética se realiza in vivo usando cualquier cantidad de métodos adecuados que incluyen vectores especialmente adecuados para dichas terapias.

Se pueden usar vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores virales adeno-asociados, u otros vectores virales con el tropismo adecuado para las células probablemente involucradas en el cáncer (por ejemplo, células epiteliales), como un sistema de suministro de transferencia de genes para una construcción génica terapéutica. Generalmente se conocen muchos vectores útiles para este propósito (Cozzi PJ, y otros (2002) Prostate, 53(2):95-100; Bitzer M, Lauer U., (2002) Dtsch Med Wochenschr. 127(31 -32): 1623-1624; Mezzina y Danos (2002), Trends Genet. 8:241-256; Loser y otros (2002) Curr. Gene Ther. 2:161-171 ; Pfeifer y Verma (2001), Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211). Los vectores retrovirales están particularmente bien desarrollados y se han usado en situaciones clínicas (Anderson y otros (1995), patente de EE. UU. No. 5,399,346). También se pueden usar enfoques no virales para la introducción del ADN terapéutico en las células que de otra forma se predice que han de sufrir el cáncer (Jeschke y otros (20002) Curr. Gene Ther. 1 :267-278; Wu y otros (1988), J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Wu y otros (1989), J. Biol. Chem. 264:16985-16987). Por ejemplo, se puede introducir un gen en una neurona o célula T por lipofección, conjugación de polilisina asialorosonucoide, o menos preferiblemente microinyección bajo condiciones quirúrgicas. Para cualquiera de los métodos de aplicación anteriormente descritos, preferiblemente la construcción de ácido nucleico terapéutico se aplica en el sitio del evento de cáncer (por ejemplo por inyección). Sin embargo, también se puede aplicar a tejido en la vecindad del evento de cáncer o a un vaso sanguíneo que abastece a las células que se predice que sufrirán cáncer.

P. Animales transqénicos También están incluidos en la invención animales transgénicos que contienen genes mutantes, knock-out o modificados, que corresponden a la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 1 , o el marco de lectura abierto que codifica la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 2, o fragmentos de las mismas, que tienen una secuencia consecutiva de por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o más residuos de aminoácido. Los animales transgénicos son animales modificados genéticamente en los cuales se ha transferido experimentalmente material genético recombinado, exógeno o clonado. Frecuentemente dicho material genético es referido como un "transgen". La secuencia de ácido nucleico de transgen, en este caso una forma de SEQ ID NO: 1 , se puede integrar en un locus de un genoma, en donde esa secuencia de ácido nucleico particular no es encontrada normalmente de otra manera, o en el locus normal para el transgen. El transgen puede consistir en secuencias de ácido nucleico derivadas del genoma de la misma especie o de una especie diferente de la especie del animal objetivo. En algunas modalidades, se pueden construir animales transgénicos en los cuales se suprime todo un gen que comprende la SEQ ID NO: 1 , o una porción del mismo. En aquellos casos en donde el gen que corresponde a la SEQ ID NO: 1 contiene uno o más intrones, se puede suprimir todo el gen -todos los exones, intrones y las secuencias reguladoras. Alternativamente se puede suprimir menos que todo el gen. Por ejemplo, se puede suprimir un solo exón o intrón, a fin de crear un animal que expresa una versión modificada de una proteína de la invención. El término "animal transgénico de línea de célula germinal" se refiere a un animal transgénico en el cual se introdujo la alteración genética o información genética en una célula de línea germinal, confiriendo así la capacidad del animal transgénico a transferir la información genética a la descendencia. Si dicha descendencia de hecho posee parte o toda esa alteración o información genética, entonces también son animales transgénicos. La alteración o información genética puede ser ajena para la especie de animal a la que pertenece el receptor, ajena solo para el receptor individual particular, o puede ser información genética ya poseída por el receptor. En este último caso, el gen alterado o introducido puede ser expresado diferentemente que en el gen nativo. Los animales transgénicos se pueden producir mediante una variedad de métodos diferentes que incluyen transfección, electroporación, microinyección, dirección de gen en células madres embriónicas e infección recombinante viral y retroviral (véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 4,736,866; la patente de EE. UU. No. 5,602,307; Mullins y otros (1993), Hypertension 22: 630-633; Brenin y otros (1997), Surg. Oncol. 6: 99-110; "Recombinant Gene Expression Protocols" (Methods in Molecular Biology, Vol. 62), Tuan, ed., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 1997). Se han producido varios ratones recombinantes o transgénicos que incluyen los que expresan una secuencia de oncogen activado (patente de EE. UU. No. 4,736,866); expresan el antígeno T de SV40 de simio (patente de EE. UU. No. 5,728,915); carecen de la expresión del factor regulador de interferón 1 (IRF-1 ) (patente de EE. UU. No. 5,731 ,490); exhiben disfunción dopaminérgica (patente de EE. UU. No. 5,723,719); expresan por lo menos un gen humano que participa en el control de la presión sanguínea (patente de EE. UU. No. 5,731 ,489); exhiben mayor similitud a las condiciones que existen en la enfermedad de Alzheimer que ocurre naturalmente (patente de EE. UU. No. 5,720,936); tienen una capacidad reducida para mediar la adhesión celular (patente de EE. UU. No. 5,602,307); poseen un gen de la hormona de crecimiento bovina (Clutter y otros (1996), Genetics 143: 1753-1760); o son capaces de generar una respuesta de anticuerpo completamente humana (McCarthy (1997), Lancet 349: 405). Aunque los ratones y las ratas siguen siendo los animales de elección para la mayor parte de la experimentación transgénica, en algunos casos es preferible, o incluso necesario, usar especies de animal alternativas. Se han utilizado procedimientos transgénicos exitosamente en una variedad de animales no murinos que incluyen ovejas, cabras, cerdos, perros, gatos, monos, chimpancés, hámsters, conejos, vacas y conejillos de indias (véase por ejemplo Kim y otros (1997), Mol. Reprod. Dev. 46: 515-526; Houdebine (1995), Reprod. Nutr. Dev. 35: 609-617; Petters (1994), Reprod. Fértil. Dev. 6: 643-645; Schnieke y otros (1997), Science 278: 2130-2133; y Amoah (1997), J. Animal Sci. 75: 578-585). El método de introducción de fragmentos de ácido nucleico en células de mamífero competentes de recombinación puede ser cualquier método que favorezca la cotransformación de múltiples moléculas de ácido nucleico. Están fácilmente disponibles para el experto en la materia procedimientos detallados para producir animales transgénicos, que incluyen las descripciones de patente de EE. UU. No. 5,489,743 y la patente de EE. UU. No. 5,602,307.

Q. Métodos diagnósticos Como los genes y proteínas de la invención se expresan diferencialmente en tejidos del cáncer pancreático en comparación con tejidos pancreáticos no cancerosos, los genes y proteínas de la invención se pueden usar para diagnosticar o monitorear el cáncer pancreático, para rastrear el avance de la enfermedad, o para diferenciar el tejido pancreático de muestras de tejido pancreático no canceroso. Un medio para diagnosticar cáncer usando las moléculas de ácido nucleico o proteínas de la invención incluye obtener tejido de sujetos vivos. Las pruebas para detectar moléculas de ácido nucleico o proteína de la invención pueden estar en cualquier formato disponible. Las pruebas típicas para moléculas de ácido nucleico incluyen hibridación o formatos basados en PCR. Las pruebas típicas para la detección de proteínas, polipéptidos o péptidos de la invención, incluyen el uso de sondas de anticuerpo en cualquier formato disponible, tal como pruebas de unión in situ, etcétera (véase Harlow & Lañe, "Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988). En modalidades preferidas, se efectúan pruebas con los controles adecuados. Generalmente, los diagnósticos de la invención se pueden clasificar de acuerdo a si la modalidad es una prueba basada en ácido nucleico o proteína. Algunas pruebas diagnósticas detectan mutaciones o polimorfismos en los ácidos nucleicos o proteínas de la invención, que contribuyen a aberraciones cancerosas. Otras pruebas diagnósticas identifican y distinguen defectos en la actividad de proteína detectado una cantidad de ARN o proteína de la invención en un organismo probado, que se aproxima a la cantidad de ARN o proteína de la invención en un organismo que sufre de una enfermedad, tal como cáncer, o detectando una cantidad de ARN o proteína en un organismo probado que es diferente que la de un organismo que no sufre de una enfermedad. Adicionalmente, se contempla la fabricación de equipos que incorporan los reactivos y métodos descritos en las siguientes modalidades, a fin de permitir la rápida detección e identificación de aberraciones en la actividad o cantidad de proteína. Los equipos diagnósticos pueden incluir una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo, o combinaciones de los mismos, que detectan específicamente una forma mutante de la proteína de la invención, o una sonda de ácido nucleico, o un anticuerpo, o combinaciones de los mismos, que se puede usar para determinar el grado de expresión de ARN o proteína de una o más proteínas de la invención. El componente de detección de estos equipos normalmente será provisto en combinación con uno o más de los siguientes reactivos. Frecuentemente se proveerá un soporte capaz de absorber o unirse de otra manera a ADN, ARN, o proteína. Los soportes disponibles incluyen membranas de nitrocelulosa, nylon o nylon modificado, que puede estar caracterizado por llevar un arreglo de sustituyentes cargados positivamente. En estos equipos se pueden proveer una o más enzimas de restricción, reactivos de control, amortiguadores, enzimas de amplificación y polinucléotidos no humanos como ADN de timo de becerro o de esperma de salmón. Las técnicas diagnósticas útiles basadas en ácido nucleico incluyen, sin limitación, secuenciación directa de ADN, electroforesis en gel de gradiente, análisis de Southern Blot, análisis de confirmación de una sola cadena (SSCA), prueba de protección de ribonucleasa, análisis dot blot, amplificación de ácido nucleico, PCR específica de alelo, y combinaciones de estos enfoques. El punto inicial para estos análisis es el ácido nucleico aislado o purificado de una muestra biológica. Se contempla que biopsias de tejido proveerían una buena fuente de muestras. El ácido nucleico se extrae de la muestra y se puede amplificar mediante una técnica de amplificación de ADN, tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando iniciadores. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente métodos disponibles para confirmar la presencia de polimorfismos. Ademas, en este aspecto de la invención se puede usar cualquier tecnología de arreglo manejable conocida. Una modalidad particular de arreglos de polinucleótido es el conocido como Genechips™, y se ha descrito generalmente en la patente de EE. UU. 5,143,854; las publicaciones de PCT WO 90/15070 y 92/10092. Una gran variedad de marcas y técnicas de conjugación son conocidas por el experto en la materia y se pueden usar en varias pruebas de ácido nucleico. Existen varias maneras de producir ácidos nucleicos marcados para hibridación o PCR, que incluyen, sin limitación, marcación de oligonucleótido, traducción de nick, marcación de extremos, o amplificación de PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, un ácido nucleico que codifica una proteína de la invención se puede clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos, están disponibles comercialmente, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro por adición de una polimerasa de ARN adecuada, tal como T7, T3 o SP6, y nucleótidos marcados. Varias compañías tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, Nueva Jersey), Promega (Madison, Wisconsin), y U.S. Biochemical Corp (Cleveland, Ohio) suministran equipos y protocolos comerciales para estos procedimientos. Las moléculas reporteras o marcas adecuadas incluyen las de radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos, así como también substratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, etcétera.

En un diagnóstico preferido basado en proteína, los anticuerpos de la invención se unen a un soporte en un arreglo ordenado, en donde una pluralidad de anticuerpos se unen a distintas regiones del soporte que no se traslapan entre sí. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente pruebas disponibles que son diagnósticos basados en proteína. Las proteínas se obtienen de muestras biológicas y se marcan mediante enfoques convencionales (por ejemplo radiactividad, colorimétricamente o fluorescentemente). Usando estándares marcados de una concentración conocida de proteína de la invención mutante o de tipo silvestre, un investigador puede determinar con precisión la concentración de la proteína de la invención en una muestra, y de esta información puede evaluar el grado de expresión de la forma particular de la proteína. También de pueden usar métodos convencionales en densitometría para determinar con mayor precisión la concentración o grado de expresión de dicha proteína. Estos enfoques también se pueden automatizar fácilmente usando la tecnología conocida para el experto en análisis diagnóstico de alto rendimiento. Como se detalló arriba, se puede usar cualquier tecnología de arreglo manejable conocida con este aspecto de la invención, y se pueden desplegar los arreglos de proteína en los chips para maximizar los patrones de unión de anticuerpo y la información diagnóstica. Como se expuso arriba, la presencia o detección de un polimorfismo en un gen o proteína de la invención puede proveer el diagnóstico de un cáncer o malignidad similar en un organismo. Las modalidades adicionales incluyen la preparación de equipos diagnósticos que comprenden componentes de detección, tales como anticuerpos específicos para una variante polimórfica particular del gen o proteína de la invención. El componente de detección normalmente será provisto en combinación con uno o más de los siguientes reactivos. Frecuentemente se suministrará un soporte capaz de absorber o unirse de otra manera al ARN o proteína. Los soportes disponibles para este propósito incluyen, sin limitación, membranas de nitrocelulosa, nylon o nylon modificado que puede estar caracterizado por llevar un arreglo de sustituyentes cargados positivamente, y Genechips™ o sus equivalentes. Se pueden proveer en el equipo una o más enzimas tales como transcriptasa inversa o polimerasa Taq, igual que dNTPs, amortiguadores, o polinucleótidos no humanos como ADN de timo de becerro o esperma de salmón. Los resultados de las pruebas del equipo pueden ser interpretadas por un proveedor de servicios de salud o un laboratorio diagnóstico. Alternativamente, los equipos diagnósticos se fabrican y se venden a particulares para autodiagnóstico. Además de diagnosticar una enfermedad de acuerdo con la presencia o ausencia de un polimorfismo, algunas enfermedades que involucran cáncer resultan de cantidades sesgadas de la proteína o gen de la invención en tejidos particulares, o patrones aberrantes en la expresión de la proteína de la invención. Monitoreando el grado de expresión en varios tejidos, por ejemplo, se puede hacer un diagnóstico o se puede identificar el estado de una enfermedad. Similarmente, determinado las relaciones del grado de expresión de varias proteínas de la invención en tejidos específicos (por ejemplo, patrones de expresión), se puede hacer un pronóstico de salud o enfermedad. Se determinan los grados de expresión de la proteína de la invención en varios tejidos de individuos sanos y también en individuos que sufren de cáncer. Estos valores se pueden registrar en una base de datos y se pueden comparar con los valores obtenidos de los individuos analizados. Adicionalmente, las relaciones o patrones de expresión de varios tejidos de individuos sanos y enfermos se registran en una base de datos. Estos análisis son referidos como "perfiles de estado de enfermedad", y comparando un perfil de estado de enfermedad (por ejemplo de un individuo sano o enfermo) con un perfil de estado de enfermedad de un individuo analizado, un clínico puede diagnosticar rápidamente la presencia o ausencia de enfermedad. Las técnicas basadas en ácido nucleico y proteína anteriormente descritas se pueden usar para detectar la cantidad o grado de expresión de los genes o proteínas de la invención en un tejido. Mediante hibridaciones cuantitativas de Northern, análisis in situ, inmunohistoquímica, ELISA, tecnología de arreglo de genechip, PCR y Western blots, por ejemplo, se puede determinar rápidamente la cantidad o grado de expresión de ARN o proteína para una proteína particular de la invención (de tipo silvestre o muíante), y de esta información se pueden determinar los grados de expresión. Alternativamente, las proteínas de la invención por analizar pueden ser miembros de la familia que actualmente son desconocidos, pero que se identifican basándose en su posesión de una o más regiones de homología anteriormente descritas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la secuencia de señal predicha para la secreción de LBFL313 (SEQ ID NO: 2). El análisis se hizo usando el servidor SignalIP 3.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignallP/). La figura 2 es el resultado del análisis de Western que muestra que LBFL313 es detectado en el sobrenadante de cultivo de las células. Las figuras 3A-3C muestran los efectos de la sobreexpresión de LBFL313 en las células CHO sobre la proliferación celular (figura 3A), la motilidad (figura 3B) y la invasividad (figura 3C). Las figuras 4A-4B muestran los efectos de la sobreexpresión de LBFL313 en ratones sin pelo sobre la tumorigénesis (figura 4A) y la formación de microvaso (figura 4B). Las figuras 5A-5B muestran resultados representativos del análisis inmunohistoquímico de la expresión de LBFL313 usando muestras de biopsia pancreática y anticuerpo anti-LBFL313. La figura 6 representa gráficas que muestran los efectos del anticuerpo policlonal anti-LBFL313 sobre la invasividad de líneas celulares de cáncer pancreático.

MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCION Sin más descripción, se considera que una persona con conocimientos medios en la materia, usando la descripción precedente y los ejemplos ilustrativos siguientes, puede hacer y utilizar los compuestos de la presente invención y puede practicar los métodos reclamados. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo describen específicamente modalidades preferidas de la presente invención, y no se consideran limitativos del resto de la descripción en modo alguno.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación del ARNm expresado diferencialmente en el adenocarcinoma pancreático Se derivaron muestras de tejido de pacientes coreanos y se clasificaron en dos grupos. Un grupo consistió en pacientes a los que se les había diagnosticado adenocarcinoma pancreático. Los pacientes de este grupo, seis hombres y tres mujeres, tenían de 51-70 años de edad. Al segundo grupo de pacientes se les había diagnosticado páncreas normal. En este grupo de tres hombres, los pacientes tenían 63-66 años de edad. Se hizo un análisis histológico de cada una de las muestras de tejido y las muestras se segregaron en categoría cancerosa o no cancerosa. Con modificaciones menores, el protocolo de preparación de muestra siguió el Manual de Análisis de Expresión GeneChip de Affymetrix. Primero, se trituró tejido congelado hasta hacerlo polvo, usando el molino Spex Certiprep 6800 Freezer Mili. Después se extrajo el ARN total usando Trizol (Life Technologies). Enseguida, se aisló ARNm usando el equipo Oligotex mRNA Midi (Qiagen). Usando 1-5 mg de ARNm, se creó ADNc de doble cadena usando el sistema SuperScript Choice (Gibco-BRL). La síntesis de la primera cadena de ADNc se inició con un oligonucleótido T7-(dT24). Después, el ADNc se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con etanol hasta una concentración final de 1 mg/ml. De 2 mg de ADNc, se sintetizó ARNc de acuerdo con los procedimientos estándares. Para marcar con biotina el ARNc, se añadieron a la reacción los nucleótidos Bio-11-CTP y Bio-16-UTP (Enzo Diagnostics). Después de una incubación a 37 °C durante 6 horas, el ARNc marcado se limpió de acuerdo con el protocolo del equipo Rneasy Mini kit (Qiagen). Después, el ARNc se fragmentó (amortiguador de fragmentación 5': 200 mM de Tris-Acetato (pH 8.1), 500 mM de KOAc, 150 mM de MgOAc) durante 35 minutos a 94°C. Se hibridaron 55 mg de ARNc fragmentado sobre la serie de arreglos de Affymetrix Human Genome U133, durante 24 horas a 60 rpm, en un horno de hibridación a 45°C. Los chips se lavaron y se tiñeron con estreptavidina ficoeritrina (SAPE) (Molecular Probes) en estaciones de fluidos Affymetrix. Para amplificar la tinción, se añadió solución de SAPE dos veces con un paso intermedio de tinción de anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Vector Laboratories). La hibridación con los arreglos de sonda se detectó por exploración fluorométrica (Escáner de Arreglo de Gen Hewlett Packard). Después de hibridación y exploración se analizaron las imágenes de microarreglo para control de calidad, buscando defectos mayores de chip o anormalidades en la señal de hibridación. Después todos los chips pasaron el CC, Affymetrix Microarray Suite (v5.0), y LIMS (v3.0). La expresión diferencial de los genes entre las muestras pancreáticas cancerosas y no cancerosas se determinó usando las series U133 human GeneChip de Affymetrix, con los siguientes métodos estadísticos. (1) Para cada gen, se determinaron valores de señal para U133 por medio de la Affymetrix Microarray Suite (v5.0), que también hizo llamadas de "Ausente" (=no detectado), "Presente" (=detectado) o "Marginal" (=no claramente Ausente ni Presente) para cada elemento del GeneChip. (2) Usando el criterio de llamada por lo menos 40% presente en los grupos de muestra pancreática cancerosa, se seleccionó una serie de genes para análisis ulterior. (3) Todos los valores de señal se transformaron a una escala logarítmica. (4) Se usó el método de análisis de varianza (ANOVA) para analizar los datos (Steel y, "Principies and Procedures of Statistics: A Biometrical Approach", tercera edición, McGraw-Hill, 1997). El análisis de los datos de chips mostró que la expresión del marcador LBFL313 fue regulada positivamente de manera significativa (11.13 veces, p =0) en las muestras de adenocarcinoma pancreático en comparación con las muestras de tejido pancreático normal. Estos datos indican que la regulación positiva de LBFL313 puede ser un diagnóstico para el cáncer pancreático. El grado de expresión de LBFL313 (SEQ ID NO: 1) se puede medir por medio del fragmento de secuencia de chip no. 228058_at en el GeneChip U 133 de Affymetrix. Mediante los datos combinados anteriores con la GeneExpress Oncology Datasuite™ de Gene Logic, Inc. (Gaithersburg, Maryland), se muestran en el cuadro 1 los grados de expresión de 228058_at en varios neoplasmas malignos, en comparación con tejidos normales de control, en donde también se indican las veces de cambio y la dirección del cambio (regulación positiva o negativa). Un cambio mayor de 1.5 veces se consideró significativo. Los resultados de la expresión en el GeneChip, determinada por unión de la muestra al fragmento de secuencia de chip no. 228058_at, se validaron por RT-PCR cuantitativa (Q-RT-PCR) usando la prueba Taqman® (Perkin-Elmer). En la prueba se usaron iniciadores de PCR diseñados del archivo de información de secuencia del fragmento Affymetrix específico (228058_at). El gen objetivo en cada muestra de ARN (diez ng de ARN total) se analizó con respecto a un gen de referencia añadido exógenamente. Para este fin, se usó el gen de resistencia a tetraciclina como el gen añadido exógenamente. Este enfoque provee la expresión relativa medida mediante el valor de umbral del ciclo (Ct) del ARNm objetivo con respecto a una cantidad constante de valores de Ct de Tet añadido. El panel de muestra incluyó ARNs de tejido que se analizaron en GeneChips U133. Además, se usaron varias muestras nuevas que no se analizaron en el GeneChip para validar la expresión por medio de Q-RT-PCR. Los datos de Q-RT-PCR confirman la regulación positiva de LBFL313 observada en el adenocarcinoma pancreático, en comparación con las muestras de biopsia pancreática normal.

CUADRO 1 Expresión de LBFL313 en neoplasmas malignos Tejido Patología/Morfología Cambio Regulación Valor p (veces) Mama Carcinoma lobular infiltrado 1.64 Positiva 0.19 Carcinoma de conducto y 1.59 Positiva 0.06 lobular infiltrado Cérvix Carcinoma de célula escamosa 1.61 Positiva 0.38 Colon Adenocarcinoma mucinoso 1.88 Positiva 0.05 Duodeno Adenocarcinoma 1.69 Positiva 0.19 Esófago Adenocarcinoma 1.83 Positiva 0.15 Hígado Carcinoma hepatocelular 1.52 Positiva 0.02 Pulmón Adenocarcinoma 1.52 Positiva 0.21 Ovario Cistadenocarcinoma mucinoso 9.65 Positiva 0 Cistadenocarcinoma seroso 2.15 Positiva 0.13 Páncreas Adenocarcinoma 8.62 Positiva 0 Piel Carcinoma de célula basal -3.01 Negativa 0.01 Melanoma maligno -6.61 Negativa 0 Carcinoma de célula escamosa -3.82 Negativa 0.03 Estómago Carcinoma de células en anillo 2.40 Positiva 0.03 de sello EJEMPLO 2 Clonación de ADNc humano de longitud completa (LBFL313) que corresponde a especies de ARNm expresadas diferencialmente El ADNc de longitud completa que tiene la SEQ ID NO: 1 se obtuvo por medio del método de arrastre de oligonucleótido. Brevemente, se diseñó un oligonucleótido específico de gen basándose en la secuencia de LBFL313. El oligonucleótido se marcó con biotina y se usó para hibridarlo con 2 pg de ADN plasmídico de una sola cadena (recombinantes de ADNc) de una colección de placenta humana, siguiendo los procedimientos de Sambrook y otros. Los ADNc's hibridados se separaron por medio de cuentas conjugadas con estreptavidina y se eluyeron por calentamiento. El ADNc eluido se convirtió a ADN plasmídico de doble cadena y se usó para transformar células de E. coli (DH10B), y se seleccionó el ADNc más grande. Después de que se confirmó una selección positiva por medio de PCR usando los iniciadores específicos de gen, la clona de ADNc se sometió a secuenciación de ADN. La secuencia de nucleótidos de los ADNc's humanos de longitud completa, que corresponden al ARNm regulado diferencialmente detectado arriba, se indica en la SEQ ID NO: 1. El ADNc comprende 777 pares de bases. Un marco de lectura abierto dentro de la secuencia de nucleótidos del ADNc de la SEQ ID NO: 1 , en los nucleótidos 53-640 (53-643 incluyendo el codón de detención), codifica una proteína de 196 aminoácidos.

En la SEQ ID NO: 2 se indica la secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína predicha codificada por la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 2 contiene un dominio de lectina de tipo Jacalin: las proteínas que contienen este dominio son lectinas. Se encuentra en 1 a 6 copias en estas proteínas. El dominio también se encuentra en la proteína prostática de unión de espermina de animal (Raval y otros (2004) Glycobiology 14:1247-1263). La figura 1 muestra el resultado del análisis de secuencia de señal usando el servidor SignalIP 3.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignallP/). Se predice que el sitio potencial de corte de secuencia de señal para la secreción está entre las posiciones de aminoácido 40 (Ala) y 41 (Gly). Se hizo un análisis de Northern blot para determinar el tamaño de los transcritos de ARNm que corresponden a LBFL313. Se usó un Northern blot que contiene ARN's totales de varios tejidos humanos (Human 12-Lane MTN Blot, Clontech, Palo Alto, California), y un EST que contenía una secuencia 228058_at se marcó radiactivamente por medio del método de iniciador aleatorio y se usó para sondear el blot. El blot se hibridó en 50% de formamida, SSPE 5X, 0.1% de SDS, 5X de solución de Denhart y 0.2 mg/ml de ADN de esperma de arenque, a 42°C, y se lavó con SSC 0.2X que contenía 0.1% de SDS a temperatura ambiente. El Northern blot mostró un solo transcrito para este gen, que es de aproximadamente 0.8 kb de tamaño. Esto corresponde al tamaño de LBFL313 solo (SEQ ID NO: 1).

EJEMPLO 3 Producción de líneas de células transfectadas con LBFL313 La región codificadora de LBFL313 se amplificó por PCR usando el iniciador delantero (5'-TTG GGATCCGTATAAAGGCGATGTGGAGG-3') que incorpora el sitio BamHI, y el iniciador inverso (5'-ACC ATC TAG AGC GAC CCA CGG GTG AGT-3') que incorpora el sitio Xbal. La PCR se hizo usando la AND polimerasa de precisión TaqPlus (Stratagene, California) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ciclos de amplificación de PCR incluyeron desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 min, y 27 ciclos; 94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min, seguido por una extensión final a 72 °C durante 10 min. El producto de PCR se clonó en el sitio BamHI y Xbal del vector de expresión de mamífero pcDNA3.1-mycHis (Invitrogen). El plásmido clonado (pLFG250) se secuenció en la región del sitio de clonación para confirmar su estructura primaria. Células CHO subconfluentes se transfectaron establemente con pLFG250 o con el vector pcDNA3.1-mycHis solo, usando el reactivo LipofectaminePLUS (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 h, las células transfectadas se cultivaron en F12 de Ham (Invitrogen) que contenía 10% de FBS y 400 pg/ml de G418 (Sigma) para selección. Este medio de selección se cargó cada 2 días y después de 10-12 días se usaron anillos de clonación para aislar las clonas positivas. Adicionalmente, los cultivos se expandieron y se examinaron para determinar la expresión de LBFL313. Las células se lisaron en amortiguador de lisis que contenía 50 mM de HEPES (pH 7.2), 150 mM de NaCI, 25 mM de beta-glicerofosfato, 25 mM de NaF, 5 mM de EGTA, 1 mM de EDTA, 1% de NP-40, 1 mM de ortovanadato de sodio, 0.1 mM de PMSF, y coctel de inhibidores de proteasa (Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, y antipaina, cada una 5 pg/ml). Los medios de cultivo se concentraron por medio de un microcon de corte de 10k (Amicon) hasta un volumen de 15 pl. Las proteínas se redujeron por incubación durante 5 min a 95 °C en amortiguador de carga de SDS 4x. Los polipéptidos se resolvieron a 10 mA/gel sobre geles de PAGE-SDS 12% y se transfectaron electroforéticamente a membranas Immobilon P-transfer de 0.45 pm (Millipore) durante 2 h a 200 mA/gel a 4°C. Las membranas se bloquearon 1 h en amortiguador TBST (25 mM de Tris, pH 7.5; 125 mM de NaCI, y 0.1 % (v/v) de Tween-20), que contenía 5% (p/v) de leche descremada. Después, los blots se sondearon durante la noche con anticuerpo anti-His HRP (Santa Cruz). Después, el material inmunorreactivo se visualizó por medio de quimioluminiscencia incrementada (Elpis Biotech.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como se muestra en la figura 2, la proteína LBFL313 se detectó solo en el sobrenadante del cultivo pero no en el extracto celular. Esto confirma la predicción de que LBFL313 codifica una proteína secretada.

EJEMPLO 4 Análisis de la sobreexpresión de LBFL313 sobre la proliferación. migración e invasión de células Para determinar el efecto de la sobreexpresión de LBFL313 sobre la proliferación de células, se midió la velocidad de crecimiento por conteo de las células. En placas de 12 pocilios se depositaron 4 x 104 células. Las placas se incubaron a 37 °C y 5% de C02 durante 12 días, y todos los días se contó el número de células con un hemocitómetro. El resultado representa los valores medios de triplicados + desviación estándar. Como se muestra en la figura 3A, en las células CHO la sobreexpresión de LBFL313 indujo una proliferación más rápida. Se observó un efecto similar con la línea de células de cáncer pancreático PANC-1 que sobreexpresan LBFL313. La migración e invasión se estudiaron por medio de una prueba de cámara de Boyden. Las dos pruebas se hicieron en una cámara de Boyden de 48 pocilios, microcámara de 48 pocilios Neuri Probé (Neuroprobe). Las células se tripsinizaron y se resuspendieron en solución de inhibidor de tripsina de soya (Sigma). Las células se hicieron pella y se suspendieron hasta una concentración final de 2x 06 células/ml en medio libre de suero. Los pocilios inferiores de la cámara se llenaron con 30 µ? de medio estándar. La cámara se ensambló usando filtros de policarbonato (policarbonato, 8 pm de diámetro de tamaño de poro, Neuroprobe). Para las pruebas de invasión de células, se estratificó 1 mg/ml de matriz de membrana de basamento Matrigel (BD Biosciences) sobre cada filtro (500 pg/filtro), y se secó. Al compartimiento superior se le agregaron 50 µ? de muestra de suspensión celular (1x105 células/pocilio). La cámara se incubó a 37 °C y 5% de CO2 y el tiempo de incubación se varió dependiendo de los tipos de célula por analizar: durante 24 h en para la prueba de migración de CHO, durante 48 h para la prueba de invasión de CHO, y durante 18 h para la prueba de migración e invasión de PANC-1. Al final de la incubación, las células de la superficie superior de los filtros se removieron mecánicamente. Los filtros se fijaron en metanol y se tiñeron en solución modificada de satin Giemsa (Sigma). Se contó el número de células emigradas por campo (100x) bajo el microscopio óptico (Olympus). Cada muestra se analizó por triplicado. Como se muestra en la figura 3B y la figura 3C, la motilidad y la invasividad de las células CHO se incrementaron por la sobreexpresión de LBFL313. Se observaron efectos similares con la línea de células de cáncer pancreático PANC-1 que sobreexpresan LBFL313.

EJEMPLO 5 Efectos de la sobreexpresión de LBFL313 sobre la tumorigénesis en ratones sin pelo Se determinaron los efectos biológicos de la sobreexpresión de LBFL313 sobre el crecimiento de tumor in vivo. Se inyectaron por vía subcutánea células CHO en los costados de ratones sin pelo inmuno-deficientes. Las células CHO confluentes, no transfectadas o transfectadas establemente con el vector de LBFL313 (pLFG250) o con vector solo, se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS a una densidad de 3.3 x107 células/ml. Se inyectaron 5 millones de células CHO de cada tipo por vía subcutánea en el costado de cinco ratones Balb/c (nu/nu) hembras de 8 semanas de edad. En el proceso de crecimiento de los ratones se midieron las longitudes y anchos de los tumores. El volumen de tumor se calculó con la fórmula: Volumen de tumor = (longitud) x (ancho)2 12. Después de 37 días, los ratones se sacrificaron y los tumores se analizaron. Como se muestra en la figura 4A, el tamaño de los tumores generados por células transfectadas con LBFL313 fue 5 veces mayor que los formados por células de control tratadas en falso. Para determinar el grado de angiogénesis inducida por tumor, secciones de parafina de los xenoinjertos de tumor se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII (Dako). Secciones de tejido embebidas en parafina (3-5 pm de grosor) obtenidas de tumores de cada grupo de ratones se limpiaron de la parafina con xileno y se rehidrataron en una serie graduada de etanol (100-90-80-70-50-30%) y el lavado de PCS. La peroxidasa endógena se bloqueó sumergiendo el portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 0.3% (v/v) en metanol durante 15 min a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBS durante 4 min cada vez, las secciones se bloquearon remojando en suero normal de asno al 10% (v/v) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBS durante 4 min cada vez, las secciones bloqueadas se incubaron en anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII (Factor de von Willebrand, dilución 1 :50) (Dako) durante 2 h, a temperatura ambiente. Después de 2 h, lavando tres veces con PBS durante 4 min cada vez, el portaobjetos se incubó 30 min con Link biotinilado universal a temperatura ambiente, se lavó tres veces en PBS durante 4 min cada vez, y se incubó con conjugado de estraptividina-HRP (Dako) durante 15 min a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBS, las secciones se incubaron con cromógeno y se lavaron en agua destilada. Las secciones del factor VIII no se contratiñeron. El número de microvasos se determinó como lo describe Padro (Padro y otros (2000), Blood 95:2637-2644). El conteo de microvasos fue efectuado simultáneamente por dos investigadores experimentados independientes usando microscopía óptica. Los investigadores no conocían el hallazgo clínico patológico. Toda la sección se exploró sistemáticamente, esto es, campo por campo, a una amplificación de 100x para encontrar las áreas que mostraran la vascularización más intensa. Después, la amplificación se cambió a 200x o 400x y se permitió a los investigadores recolocar el portaobjetos hasta que el número más alto de microvasos estuviera dentro del campo de 400x. Esta área fue definida como un punto crítico después de la obtención de un consenso entre los dos investigadores, reduciendo así el error entre observadores del conteo de microvasos. En cada punto crítico, los dos investigadores hicieron un conteo de microvasos individuales en un campo 400x. Como se muestra en la figura 4B, los resultados revelaron una cuenta más alta de microvasos en los tumores de los ratones inyectados con células transfectadas con LBFL313, que con células de control tratadas en falso. Los experimentos in vivo implican la formación agresiva de tumor y el aumento de la angiogénesis con LBFL313.

EJEMPLO 6 Producción de anticuerpo policlonal anti-LBFL313 Se amplificó ADNc de longitud completa de LBFL313 por medio de PCR usando un iniciador delantero (5'-CTAAGGCCCAGCCGGCCGGGAAGATGTATGGCCCTGGA-3') e iniciador inverso (5-'CATAGGCCCCACCGGCCGAGCGACCCACGGGTGAGTT-3'). La PCR se hizo usando la ADN polimerasa de precisión TaqPlus (Stratagene, California), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ciclos de amplificación de PCR incluyeron desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, y 30 ciclos; 94°C durante 30 s, 58°C durante 30 s, 72°C durante 30 s, seguido por una extensión final a 72°C durante 10 min. El producto de PCR se visualizó sobre un gel de TAE al 1.5% y se lavó del gel usando el equipo de recuperación de ADN Zymoclean Gel (Zymo Research, California), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ADN purificado se insertó en el sitio Sfil del vector pLFG106 para producir la proteína de fusión recombinante LBFL313-Fc. El pLFG106 es un vector de expresión que contiene la secuencia de señal, la región Fe de IgG humana, y genes DHFR en el esqueleto de pcDNA3.1 (Invitrogen). PLFG106 también contiene una secuencia de reconocimiento de trombina entre el sitio de clonación y la región Fe. El plásmido de expresión LBFL313-Fc se transfectó establemente en líneas de células CHO mutantes deficientes en DHFR usando reactivos ExGen 500 (Fermentas, Lituania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas establemente se seleccionaron en MEM-a libre de nucleótido (Invitrogen, California) que contenía 800 pg/ml de G418 (Invitrogen, California) y 10% de FBS dializado durante 2 semanas. Los transfectantes adecuados se adaptaron adicionalmente bajo una concentración de 100 nM de metotrexate (Sigma, Misuri) durante 2 semanas. La proteína de fusión recombinante LBFL313-Fc, secretada en el medio de cultivo, se identificó por medio de análisis de Western blot y ELISA usando anticuerpo anti-Fc humano (Sigma, Misuri). Se realizó expresión en gran escala de la proteína de fusión recombinante LBFL313-Fc usando recipientes de Roller (1750 cm2). Transfectantes estables que expresan proteínas de fusión recombinantes LBFL313-Fc se desarrollaron en IMDM más 5% de FBS. El cultivo de recipiente Roller se inoculó con 3 x 108 células y el dispositivo se centrifugó a 5 rpm en incubadora a 37 °C. Las células se cultivaron durante 5 días y el medio se intercambió con medio libre de suero cada tres días. Los desechos celulares en el medio cosechado libre de suero se removieron por centrifugación a 6,000 rpm durante 10 min. Para purificar la proteína de fusión LBFL313-Fc recombinante, el medio libre de células se procesó adicionalmente por concentración usando un Concentrator, ProFlux M12 (Amicon) a través de una membrana 10K MWCO, Pellicon 2 (Millipore). El medio concentrado se pasó entonces a través de una columna de agarosa de proteína A de 10 mi (Pierce) previamente equilibrada en fosfato de sodio 20 mM, pH 8.0. La proteína no enlazada se lavó de la columna con amortiguador de fosfato de sodio 20 mM. La columna se eluyó entonces con citrato 0.1 M, pH 3.0, recogiendo fracciones de 4.5 mi en tubos que contenían 500 pl de Tris-HCI 1 M, pH 9.0. Las fracciones que contenían la proteína de fusión recombinante LBFL313-Fc se reunieron y se purificaron adicionalmente por cromatografía de exclusión de tamaño, usando una resina de Sepharose 200HR (Amersham, Illinois). El Fe C-terminal se separó de la proteína de fusión recombinante LBFL313-Fc por medio del equipo Thrombin Cleavage Capture Kit (Novagen), y después se removió por medio de proteína A inmovilizada ImmunoPureR Immobilized Protein A (Pierce). Brevemente, la proteína de fusión recombinante LBFL313-Fc se incubó con trombina biotinilada a 20°C durante la noche. Después de la proteólisis, la trombina biotinilada se removió por medio de cuentas de agarosa. La solución resultante, mezcla de LBFL313 recombinante y Fe, se separó pasándola dos veces a través de una columna de proteína A inmovilizada ImmunoPureR Immobilized Protein A (Pierce). La pureza de la LBFL313 recombinante se verificó en geles de PAGE-SDS. La LBFL313 recombinante purificada se usó para inmunizar dos conejos usando las técnicas estándares. Se recogió el suero inmunizado y después se purificó usando el equipo de purificación de IgG ImmunoPureR (A Plus) (Pierce), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se purificó adicionalmente usando el equipo de inmovilización AminoLinkR(A Plus) Immobilization Kit (Pierce), enlazado con Fe recombinante humana. El anticuerpo policlonal purificado detecta proteína de aproximadamente 21 kDa en Western blots de medio acondicionado obtenido de células de cáncer pancreático que expresan LBFL313. La especificidad del anticuerpo se muestra también por el aumento de detección de la proteína LBFL313 obtenida del medio acondicionado de células PANC-1 transfectadas con LBFL313, mientras que no hubo aumento con las células PANC-1 transfectadas solo con vector.

EJEMPLO 7 Análisis inmunohistoquímico de la expresión de LBFL313 Portaobjetos de microarreglo de tejido se limpiaron de la parafina con xileno y se rehidrataron en alcohol graduado. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó con metanol que contenía peróxido de hidrógeno al 0.3% a temperatura ambiente durante 20 min. Se recuperó antígeno por medio de microondas en amortiguador de citrato (0.01 M, pH 6.0) durante 4 min. Después, los portaobjetos se incubaron con solución de suero normal de asno al 10% durante 1 h para reducir la tinción inespecífica de fondo. El anticuerpo primario era anticuerpo policlonal anti-LBFL313, a una dilución de 1 :500. Secciones bloqueadas se incubaron en anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. La reacción subsiguiente se hizo usando un equipo LSAB+ kit (DakoCytomation, Carpintería, California, EE. UU.), y el procedimiento recomendado. Finalmente, los portaobjetos se incubaron con 3-amino-9-etil-carbazol (DakoCytomation, Carpintería, California, EE. UU.), y se contratiñeron con solución de hematoxilína de Harris modificada (Sigma-Aldrich, Inc., San Luis, Misuri, EE. UU.). En todos los casos, se observó inmunorreactividad en el citoplasma de células de tumor. La inmunorreactividad se evaluó por medio del método de puntuación H. La intensidad de tinción se calificó como 0, 1 , 2 y 3, que corresponde a la presencia de tinción parda negativa, débil, intermedia y fuerte, respectivamente. Se determinó el porcentaje de tinción de células a diferentes intensidades y se aplicó la siguiente fórmula: Puntuación H = (% de células teñidas a la puntuación de intensidad 1) + 2 X (% de células teñidas a la puntuación de intensidad 2) + 3 X (% de células teñidas a la puntuación de intensidad 3). Las puntuaciones H de tejido de tumor y tejido no tumoral adyacente se analizaron usando la prueba de rango de los signos de Wilcoxon. Como se muestra en las figuras 5A-5B, los tejidos de tumor tuvieron una expresión de LBFL313 significativamente más alta que los tejidos no tumorales adyacentes (14 de 16 casos) (p<0.05).

EJEMPLO 8 Efecto del anticuerpo anti-LBFL.313 sobre la invasividad de las células de cáncer pancreático Para determinar el efecto del anticuerpo anti-LBFL313 sobre la invasión de líneas de células de cáncer pancreático humano, se hizo una prueba de cámara de Boyden en presencia de anticuerpo anti-LBFL313 o IgG normal de conejo. Brevemente, se tripsinizaron cinco tipos de líneas celulares de cáncer pancreático, CFPAC-1 , MiaPaCa-2, PANC-1 , AsPC-1 y BxPC-3, y se resuspendieron en solución de inhibidor de tripsina (Sigma). Las células se hicieron pella y se suspendieron en medio libre de suero en presencia de PBS, anticuerpo anti-LBFL313, o IgG normal de conejo, a una concentración final de 1-5x106 células/ml. Los pocilios inferiores de la cámara se llenaron con 30 µ? de medio estándar. La cámara se ensambló usando filtros de policarbonato de 8 pm de tamaño de diámetro del poro (Neuroprobe), recubiertos en el lado superior con 1 mg/ml de matriz de membrana Matrigel™ Basement Membrane Matrix (BD Biosciences). Al compartimiento superior se le agregaron 50 µ? de suspensión celular. La cámara se incubó a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h. Al final de la incubación, las células de la superficie superior de los filtros se removieron mecánicamente. Los filtros se fijaron en metanol y se tiñeron en solución modificada de satin Giemsa (Sigma). Se contó el número de células emigradas por campo (100x) bajo el microscopio óptico (Olympus). Cada muestra se analizó por triplicado. Como se muestra en la figura 6, el anticuerpo anti-LBFL313 inhibió eficazmente la invasividad de las líneas de células de cáncer pancreático humanas de manera dependiente de la dosis. Se observaron efectos similares en las líneas de células de cáncer gástrico, AGS y N87.

Aplicación Industrial Aunque la presente invención se ha descrito detalladamente haciendo referencia a los ejemplos anteriores, se entiende que se pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Por consiguiente, la invención se limita únicamente por las reivindicaciones siguientes. Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas en esta solicitud se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada del grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que comprende la SEQ ID NO: 1 , (b) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la SEQ ID NO: 2, (c) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica una proteína que es expresada en el cáncer, y que exhibe por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de nucleótidos con respecto a toda la secuencia contigua de SEQ ID NO: 1 , y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que comprende el complemento de una molécula de ácido nucleico de (a), (b) o (c).

2. - La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende los nucleótidos 53- 640 de la SEQ ID NO: 1.

3. - La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende los nucleótidos 53-643 de la SEQ ID NO: 1.

4.- La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque está enlazada operativamente a uno o más elementos de control de expresión.

5.- Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislado como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6.- Una célula hospedera transformada para contener la molécula de ácido nucleico que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7.- Una célula hospedera que comprende un vector como el que se reclama en la reivindicación 5.

8.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste en células hospederas procarióticas y células hospederas eucarióticas.

9.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque es Escherichia coli DH5@/p313-JF3 (Depósito No. KCTC 10954BP).

10.- Un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar una célula hospedera transformada con la molécula de ácido nucleico que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 11 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha célula hospedera se selecciona del grupo que consiste en células hospederas procarióticas y células hospederas eucarióticas. 12.- Un polipéptido aislado producido por medio del método que se reclama en la reivindicación 10. 13.- Un polipéptido o proteína aislada seleccionada del grupo que consiste en la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una proteína que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2. 14. - Un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo de unión de antígeno, que se une a un polipéptido como el que se reclama en la reivindicación 13. 15. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal o policlonal. 16. - Un método de identificación de un agente que modula la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, que comprende: exponer las células que expresan el ácido nucleico al agente; y determinar si el agente modula la expresión de dicho ácido nucleico, con lo cual se identifica un agente que modula la expresión de un ácido nucleico que codifica la proteína. 17. - Un método de identificación de un agente que modula la cantidad o por lo menos una actividad de una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, que comprende: exponer las células que expresan la proteína al agente; determinar si el agente modula la cantidad o por lo menos una actividad de dicha proteína, con lo cual se identifica un agente que modula la cantidad o por lo menos una actividad de la proteína. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente modula una actividad de la proteína. 19.- Un método in vitro de modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, que comprende: administrar una cantidad efectiva de un agente que modula la expresión de un ácido nucleico que codifica la proteína. 20. - Un método in vitro de modulación de por lo menos una actividad de una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, que comprende: administrar una cantidad efectiva de un agente que modula por lo menos una actividad de la proteína. 21. - Un método de identificación de socios de unión para una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, que comprende: exponer dicha proteína a un socio de unión potencial; y determinar si el socio de unión potencial se une a dicha proteína, con lo cual se identifican socios de unión para la proteína. 22. - Un método de identificación de un agente que modula la interacción entre un socio de unión de la reivindicación 21 y una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, que comprende: exponer dicha proteína con dicho socio al agente; y determinar si el agente modula la asociación del socio de unión con dicha proteína, con lo cual se identifica un agente que modula la asociación de un socio de unión con dicha proteína. 23. - Un método in vitro de modulación de la interacción entre un socio de unión de la reivindicación 21 y una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, que comprende: administrar una cantidad efectiva de un agente que modula la asociación de un socio de unión con dicha proteína. 24. - Un animal transgénico no humano modificado para contener una molécula de ácido nucleico como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 25.- El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la molécula de ácido nucleico contiene una mutación que impide la expresión de la proteína codificada. 26.- Una composición que comprende un diluente y un polipéptido o proteína, en donde el polipéptido o proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o exhibe por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2. 27.- El uso de un agente que modula la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína, como el que se reclama en la reivindicación 13, para preparar una composición farmacéutica útil para modular la expresión del ácido nucleico que codifica dicha proteína. 28. - El uso de un agente que modula por lo menos una actividad de una proteína, como el que se reclama en la reivindicación 13, para preparar una composición farmacéutica útil para modular por lo menos una actividad de dicha proteína. 29. - El uso de un agente que modula la asociación del socio de unión que se reclama en la reivindicación 21 con una proteína como la que se reclama en la reivindicación 13, para preparar una composición farmacéutica útil para modular la interacción entre el socio de unión con dicha proteína.