Topo da laboratorio

Il topo da laboratorio è un piccolo mammifero dell'ordine Rodentia che viene allevato e utilizzato per la ricerca scientifica o come mangime per determinati animali domestici. I topi da laboratorio appartengono solitamente alla specie Mus musculus^[1]. Sono il modello di ricerca sui mammiferi più comunemente utilizzato per la ricerca in genetica, fisiologia, psicologia, medicina e altre discipline scientifiche. I topi appartengono al clado Euarchontoglires, che include gli esseri umani. Questa stretta relazione, l'elevata omologia associata con gli esseri umani, la loro facilità di manutenzione e gestione e il loro alto tasso di riproduzione, rendono i topi modelli particolarmente adatti per la ricerca orientata all'uomo. Il genoma del topo da laboratorio è stato sequenziato e molti suoi geni hanno omologhi umani^[2]. I topi da laboratorio vengono venduti nei negozi di animali come cibo per serpenti e possono anche essere tenuti come animali domestici.

Altre specie di topi talvolta utilizzate nella ricerca di laboratorio includono due specie americane: il topo dai piedi bianchi (Peromyscus leucopus)^[3] e il topo cervo nordamericano (Peromyscus maniculatus)^[4].

L'inizio della riproduzione avviene a circa 50 giorni di età sia nelle femmine che nei maschi^[5], anche se le femmine possono avere il loro primo estro (il periodo in cui la femmina è pronta per l'accoppiamento e accetta il contatto con i maschi) a 25-40 giorni. I topi sono poliestri^[6], vale a dire si riproducono tutto l'anno; l'ovulazione è spontanea. La durata del ciclo estrale è di 4-5 giorni^[7] e dura circa 12 ore, verificandosi la sera^[8].

Il periodo medio di gestazione è di 20 giorni. Un estro fertile post-partum si verifica 14-24 ore dopo il parto, e l'allattamento e la gestazione simultanee prolungano la gestazione di 3-10 giorni a causa dell'implantazione differita. La dimensione media della cucciolata è di 10-12 individui durante la produzione ottimale^[9], ma è altamente dipendente dal ceppo. I cuccioli pesano 0,5-1,5 g alla nascita, sono senza pelo e hanno palpebre e orecchie chiuse. I cuccioli vengono svezzati a 3 settimane di età quando pesano circa 10-12 g^[10]. Se la femmina non si accoppia durante l'estro post-partum, riprende il ciclo 2-5 giorni dopo lo svezzamento.

I topi sono stati utilizzati nella ricerca biomedica fin dal XVII secolo, quando William Harvey li utilizzò per i suoi studi sulla riproduzione e la circolazione sanguigna e Robert Hooke li utilizzò per studiare le conseguenze biologiche di un aumento della pressione atmosferica^[11]. Durante il XVIII secolo Joseph Priestley e Antoine Lavoisier utilizzarono entrambi i topi per studiare la respirazione. Nel XIX secolo Gregor Mendel condusse le sue prime indagini sull'ereditarietà del colore del pelo del topo, ma il suo superiore gli chiese di smettere di riprodurre nella sua cella "creature puzzolenti che, inoltre, si accoppiavano e facevano sesso"^[11]. Quindi spostò le sue indagini sui piselli, ma, poiché le sue osservazioni furono pubblicate in una rivista botanica piuttosto oscura, furono praticamente ignorate per oltre 35 anni, fino a quando non furono riscoperte all'inizio del XX secolo. Nel 1902 Lucien Cuénot pubblicò i risultati dei suoi esperimenti sui topi che dimostrarono che le leggi di Mendel sull'ereditarietà erano valide anche per gli animali, risultati che furono presto confermati ed estesi ad altre specie^[11].

Nella prima parte del XX secolo, lo studente universitario di Harvard Clarence Cook Little stava conducendo studi sulla genetica dei topi nel laboratorio di William Ernest Castle. Little e Castle collaborarono a stretto contatto con Abbie Lathrop, che era un'allevatrice di topi e ratti addomesticati che lei commercializzava agli appassionati di roditori e ai custodi di animali esotici, e in seguito iniziò a venderli in grandi quantità ai ricercatori scientifici^[12]. Insieme generarono il ceppo di topi consanguinei DBA (Dilute, Brown e non-Agouti) e avviarono la generazione sistematica di ceppi consanguinei^[13]. Da allora il topo è stato ampiamente utilizzato come organismo modello ed è associato a molte importanti scoperte biologiche del XX e XXI secolo^[11].

Il Jackson Laboratory di Bar Harbor, nel Maine, è attualmente uno dei maggiori fornitori di topi da laboratorio al mondo, con circa 3 milioni di esemplari all'anno^[14]. Il laboratorio è anche la fonte mondiale di oltre 8.000 ceppi di topi geneticamente definiti ed è la sede del database Mouse Genome Informatics^[15].

I topi sono mammiferi del clado (un gruppo costituito da un antenato e tutti i suoi discendenti) Euarchontoglires, il che significa che sono tra i parenti non primati più stretti degli esseri umani, insieme ai lagomorfi, alle tupaie e ai lemuri volanti.

Il sequenziamento del genoma del topo da laboratorio è stato completato alla fine del 2002 utilizzando il ceppo C57BL/6. Questo è stato solo il secondo genoma di mammifero ad essere sequenziato dopo quello umano^[16]. Stimare il numero di geni contenuti nel genoma del topo è difficile, in parte perché la definizione di gene è ancora oggetto di dibattito e di ampliamento. Il conteggio attuale dei geni codificanti primari nel topo da laboratorio è 23.139 rispetto a una stima di 20.774 negli esseri umani^[17].

Sono stati creati vari ceppi mutanti di topi con vari metodi. Una piccola selezione tra i molti ceppi disponibili include:

• Topi derivanti da riproduzione ordinaria e consanguineità:
  • Topi diabetici non obesi (NOD - Non-obese diabetic), che sviluppano diabete mellito di tipo 1.
  • Topi Murphy Roths Large (MRL), con capacità rigenerative insolite^[18].
  • Topi giapponesi (Mus musculus molossinus) che camminano in modo circolare a causa di una mutazione che colpisce e danneggia le loro orecchie all'interno.
  • Topi nudi immunodeficienti, privi di pelo e di timo: questi topi non producono linfociti T; pertanto, non montano risposte immunitarie cellulari. Sono utilizzati per la ricerca in immunologia e nei trapianti.
  • Topi con immunodeficienza combinata grave (SCID), con un sistema immunitario quasi completamente difettoso.
  • Topi FVB, le cui grandi cucciolate e i grandi pronuclei degli ovociti ne velocizzano l'uso nella ricerca genetica.
  • Topi da latte tossici, che non riescono a reclutare rame (come nutriente) nel latte, causando la morte dei cuccioli. È causato da una mutazione autosomica recessiva tx che si è manifestata in una razza consanguinea. Theophilos e altri nel 1996 hanno scoperto che questa problematica è genetica e localizzata nel cromosoma 8, vicino al centromero^[19].
• Topi transgenici, con geni estranei inseriti nel loro genoma:
  • Topi anormalmente grandi, con un gene dell'ormone della crescita inserito.
  • Topi di Harvard (detti anche OncoMice al plurale e OncoMouse al singolare), con un oncogene attivato, in modo da aumentare significativamente l'incidenza del cancro.
  • Topi Doogie, con funzione recettoriale NMDA migliorata, con conseguente miglioramento della memoria e dell'apprendimento.
• Topi knockout, in cui un gene specifico è stato reso inoperabile tramite una tecnica nota come knockout genico: lo scopo è studiare la funzione del prodotto del gene o simulare una malattia umana
  • Topi grassi, inclini all'obesità a causa di una carenza di carbossipeptidasi
  • Topi forti e muscolosi, con il gene della miostatina disattivato, soprannominati "topi possenti".

Dal 1998 è possibile clonare topi a partire da cellule derivate da animali adulti.

Esistono molti ceppi di topi utilizzati nella ricerca, tuttavia, i ceppi consanguinei sono solitamente gli animali preferiti per la maggior parte dei campi. I topi consanguinei sono definiti come il prodotto di almeno 20 generazioni di accoppiamento fratello X sorella, con tutti gli individui derivati ​​da una singola coppia riproduttiva^[20].

I topi consanguinei hanno diverse caratteristiche che li rendono ideali per scopi di ricerca. Sono isogenici, il che significa che tutti gli animali sono quasi geneticamente identici^[21]. Circa il 98,7% dei loci genetici nel genoma sono omozigoti, quindi probabilmente non ci sono tratti recessivi "nascosti" che potrebbero causare problemi^[21]. Hanno anche fenotipi molto unificati a causa di questa stabilità. Molti ceppi consanguinei hanno caratteristiche ben documentate che li rendono ideali per specifici tipi di ricerca. La seguente tabella mostra i 10 ceppi più popolari secondo i Jackson Laboratories^[21].

Ceppi consanguinei comuni di topi da laboratorio disponibili presso i Jackson Laboratories

Razza	Colore del pelo[22]	Usi comuni della ricerca	Pubblicazioni PubMed totali che fanno riferimento al ceppo al 19 aprile 2023
C3HeB/FeJ	Aguti	Immunologia, infiammazione, autoimmunità[23]	482
NOD/ShiLtJ	Albino	Diabete autoimmune di tipo 1[24]	105
DBA/1J	Marrone diluito	Artrite reumatoide[25]	445
BALB/cByJ	Albino	Cancro, problemi cardiovascolari, immunologia[26]	628
DBA/2J	Marrone diluito (dato da un gene di diluizione, il quale agisce per creare un colore del pelo più chiaro nelle creature viventi)[27][28]	Problemi cardiovascolari, dermatologia, biologia dello sviluppo[29]	2.722
C3H/EJ	Aguti	Cancro, problemi cardiovascolari, ematologia[30]	4.037
C57BL/6J	Nero	Scopo generale, background[31]	25.723
SJL/J	Albino	Cancro, problemi cardiovascolari, dermatologia[32]	1.448
FVB/NJ	Albino	Immunologia, infiammazione, autoimmunità[33]	350
129S1/SvImJ	Aguti	Mutazioni genetiche, cancro[34]	222

Il progetto DO (Diversity Outbred) dei Jackson Labs^[35] è un programma di allevamento di topi che utilizza più ceppi fondatori consanguinei per creare una popolazione di topi geneticamente diversificata da utilizzare nella ricerca scientifica.

Questi topi sono progettati per la mappatura genetica fine e catturano una grande porzione della diversità genetica del genoma del topo^[36].

Questo progetto ha prodotto oltre 1.000 topi geneticamente diversi che sono stati utilizzati per identificare fattori genetici per malattie come l'obesità, il cancro, il diabete e il disturbo da uso di alcol^[37].

Ceppi fondatori utilizzati nel progetto DO

Razza	Derivazione	Origine della sottospecie[38]	Colore del pelo[39]	Usi comuni della ricerca	Totale pubblicazioni PubMed che fanno riferimento al ceppo al 19 aprile 2023
A/J	Laboratorio	Mus musculus domesticus	Albino	Cancro, immunologia[40]	5.500
C57BL/6J	Laboratorio	Mus musculus domesticus	Nero	Scopo generale, background genetico[41]	25.723
129S1/SvImJ	Laboratorio	Mus musculus domesticus	Aguti	Mutazioni mirate, cancro[42]	222
NOD/ShiLtJ	Laboratorio	Mus musculus domesticus	Albino	Diabete autoimmune di tipo 1[43]	105
NZO/HILtJ	Laboratorio	Mus musculus domesticus	Aguti	Obesità[44]	11
CAST/EiJ	Di origine selvatica	Mus musculus castenus	Aguti	Incrocio di ibridi eterozigoti F1, mappatura genetica[45]	154
PWK/PhJ	Di origine selvatica	Mus musculus musculus	Aguti	Mappatura genetica[46]	52
WSB/EiJ	Di origine selvatica	Mus musculus domesticus	Aguti, grigiastro	Mappatura genetica, evoluzione[47]	65

I topi da laboratorio hanno mantenuto molte delle caratteristiche fisiche e comportamentali dei topi domestici; tuttavia, a causa di molte generazioni di selezione artificiale, alcune di queste caratteristiche ora variano notevolmente. A causa del gran numero di ceppi di topi da laboratorio, non è pratico descrivere in modo esaustivo l'aspetto e il comportamento di tutti loro; tuttavia, sono descritti di seguito per due dei ceppi più comunemente utilizzati.

I topi C57BL/6 hanno un pelo marrone scuro, quasi nero. Sono più sensibili al rumore e agli odori e hanno più probabilità di mordere rispetto ai ceppi di laboratorio più docili come BALB/c^[48].

BALB/c è un ceppo albino allevato in laboratorio da cui derivano numerosi sotto-ceppi comuni. Con oltre 200 generazioni allevate dal 1920, i topi BALB/c sono distribuiti a livello globale e sono tra i ceppi consanguinei più ampiamente utilizzati nella sperimentazione animale^[49].

Un modello utile per la malattia di Alzheimer (AD) in laboratorio è il ceppo di topi Tg2576. Le doppie mutazioni K670M e N671L osservate nella variante umana 695 della proteina precorritrice della beta-amiloide (APP) sono espresse da questo ceppo. Un promotore del gene della proteina prionica del criceto, prevalentemente nei neuroni, guida l'espressione. Rispetto ai compagni di cucciolata non transgenici, i topi Tg2576 mostrano un aumento di cinque volte di Aβ40 e un aumento di 10-15 volte di Aβ42/43^[50][51][52].

Tradizionalmente, i topi da laboratorio sono stati maneggiati per la base della coda durante gli esperimenti. Tuttavia, ricerche del 2010 hanno dimostrato che questo tipo di manipolazione aumenta l'ansia e il comportamento avversivo^[53]. Si consiglia invece di maneggiare i topi utilizzando le mani a coppa. Nei test comportamentali, i topi maneggiati per la coda mostrano una minore volontà di esplorare e di investigare gli stimoli del test, al contrario dei topi maneggiati con le mani a coppa che mostrano risposte maggiori agli stimoli del test^[54].

In natura, i topi sono solitamente erbivori e consumano un'ampia gamma di frutta o cereali^[55]. Tuttavia, negli studi di laboratorio è solitamente necessario evitare variazioni biologiche e per raggiungere questo obiettivo, i topi da laboratorio vengono quasi sempre nutriti solo con mangime commerciale in pellet per topi. L'assunzione di cibo è di circa 15 g (0,53 oz) per 100 g (3,5 oz) di peso corporeo al giorno; l'assunzione di acqua è di circa 15 ml (0,53 imp fl oz; 0,51 US fl oz) per 100 g di peso corporeo al giorno.

Le vie di somministrazione delle iniezioni nei topi da laboratorio sono principalmente sottocutanee, intraperitoneali ed endovenose^[56]. La somministrazione intramuscolare non è raccomandata a causa della piccola massa muscolare. È possibile anche la somministrazione intracerebrale. Ogni via ha un sito di iniezione raccomandato, un calibro approssimativo dell'ago e un volume massimo iniettato raccomandato in un singolo momento in un sito, come indicato nella tabella seguente:

Somministrazione	Sito consigliato[56]	Birmingham Wire Gauge[56]	Volume massimo[57]
sottocutanea	dorso, tra le scapole	25-26 BWG	2-3 ml
intraperitoneale	quadrante inferiore sinistro	25-27 BWG	2-3 ml
endovenosa	vena laterale della coda	27-28 BWG	0,2 ml
intramuscolare	arto posteriore, coscia caudale	26-27 BWG	0,05 ml
intracerebrale	cranio	27 BWG

Per facilitare l'iniezione endovenosa nella coda, i topi da laboratorio possono essere riscaldati con attenzione sotto lampade termiche per dilatare i vasi^[56].

Un regime comune per l'anestesia generale per il topo domestico è la ketamina (nella dose di 100 mg per kg di peso corporeo) più xilazina (nella dose di 5-10 mg per kg), iniettata per via intraperitoneale^[58]. Ha una durata dell'effetto di circa 30 minuti^[58].

Le procedure approvate per l'eutanasia dei topi da laboratorio includono gas CO2 compresso, anestetici barbiturici iniettabili, anestetici inalabili, come l'alotano, e metodi fisici, come la dislocazione cervicale e la decapitazione^[59]. Nel 2013, l'American Veterinary Medical Association ha pubblicato nuove linee guida per l'induzione di CO2, affermando che una portata dal 10% al 30% di volume/min è ottimale per l'eutanasia dei topi da laboratorio^[60].

Uno studio del 2013 ha rilevato un astrovirus murino nei topi da laboratorio tenuti in più della metà degli istituti statunitensi e giapponesi esaminati. L'astrovirus murino è stato trovato in nove ceppi di topi, tra cui NSG, NOD-SCID, NSG-3GS, C57BL6 - Timp-3 ^−/−, uPA-NOG, B6J, ICR, Bash2 e BALB/C, con vari gradi di prevalenza. La patogenicità dell'astrovirus murino non era nota^[61].

Sebbene i topi siano di gran lunga gli animali più utilizzati nella ricerca biomedica, studi recenti hanno evidenziato i loro limiti^[62]. Ad esempio, l'utilità dei roditori nei test per la sepsi^[63][64], le ustioni^[65], l'infiammazione^[66], l'ictus^[67][68], la SLA^[69][70][71], il morbo di Alzheimer^[72], il diabete^[73][74], il cancro^[75][76][77], la sclerosi multipla^[78], il morbo di Parkinson, e altre malattie è stata messa in discussione da numerosi ricercatori. Per quanto riguarda gli esperimenti sui topi, alcuni ricercatori hanno lamentato che “anni e miliardi di dollari sono stati sprecati seguendo false piste” a causa della preoccupazione per l’uso di questi animali negli studi^[79].

I topi differiscono dagli esseri umani per diverse proprietà immunitarie: sono più resistenti ad alcune tossine rispetto agli umani; hanno una frazione totale di neutrofili nel sangue inferiore, una capacità enzimatica dei neutrofili inferiore, una minore attività del sistema del complemento e un diverso set di pentrassine coinvolte nel processo infiammatorio; e mancano di geni per componenti importanti del sistema immunitario, come IL-8, IL-37, TLR10, ICAM-3, ecc^[80]. I topi da laboratorio allevati in condizioni prive di patogeni specifici (SPF) hanno solitamente un sistema immunitario piuttosto immaturo con un deficit di cellule T della memoria. Questi topi possono avere una diversità limitata del microbiota, che influisce direttamente sul sistema immunitario e sullo sviluppo di condizioni patologiche. Inoltre, le infezioni virali persistenti (ad esempio, herpesvirus) vengono attivate negli esseri umani, ma non nei topi SPF con complicazioni settiche e possono modificare la resistenza alle co-infezioni batteriche. I topi "sporchi" sono probabilmente più adatti a imitare le patologie umane. Inoltre, nella stragrande maggioranza degli studi vengono utilizzati ceppi di topi consanguinei, mentre la popolazione umana è eterogenea, il che evidenzia l'importanza degli studi sui topi ibridi interceppo, esogami e non lineari^[80].

Un articolo su The Scientist nota: "Le difficoltà associate all'uso di modelli animali per le malattie umane derivano dalle differenze metaboliche, anatomiche e cellulari tra gli esseri umani e le altre creature, ma i problemi vanno anche più in profondità", compresi i problemi con la progettazione e l'esecuzione dei test stessi^[81]. Inoltre, la gabbia degli animali da laboratorio può renderli modelli irrilevanti della salute umana perché questi animali non hanno variazioni quotidiane nelle esperienze, nell'agenzia e nelle sfide che possono superare^[82]. Gli ambienti impoveriti all'interno di piccole gabbie per topi possono avere influenze deleterie sui risultati biomedici, specialmente per quanto riguarda gli studi sulla salute mentale e sui sistemi che dipendono da stati psicologici sani^[83].

Ad esempio, i ricercatori hanno scoperto che molti topi nei laboratori sono obesi a causa di cibo in eccesso e di esercizio minimo, che altera la loro fisiologia e il metabolismo dei farmaci. Molti animali da laboratorio, compresi i topi, sono cronicamente stressati, il che può anche influenzare negativamente i risultati della ricerca e la capacità di estrapolare accuratamente i risultati agli esseri umani^[84][85]. I ricercatori hanno anche notato che molti studi che coinvolgono i topi sono mal progettati, portando a risultati discutibili^[86][87][88].

Alcuni studi suggeriscono che dati inadeguati pubblicati sui test sugli animali potrebbero dare origine a ricerche non riproducibili, con dettagli mancanti su come vengono condotti gli esperimenti omessi dagli articoli pubblicati o differenze nei test che potrebbero introdurre pregiudizi. Esempi di pregiudizi nascosti includono uno studio del 2014 della McGill University che suggerisce che i topi maneggiati da uomini piuttosto che da donne mostravano livelli di stress più elevati^{[89][90][91][92]}. Un altro studio del 2016 ha suggerito che i microbiomi intestinali nei topi potrebbero avere un impatto sulla ricerca scientifica^[93].

• Ratto da laboratorio