DNA-raðgreining

DNA-raðgreining er samheiti yfir aðferðir til að komast að því hver basaröð DNA-búts er. Sú aðferð sem hefur hvað mest verið notuð er svokölluð Sanger-raðgreining. Frá árinu 2005 hefur verið kapphlaup um nýja tækni fyrir DNA raðgreiningar, talað er um næstu kynslóð af DNA raðgreiningum "next-generation sequencing". Slíkar DNA raðgreiningar eru einnig kallaðar Háafkasta-raðgreiningar.

Aðferðin byggir á því að DNA fjölliðunarhvarf er sett af stað. Í hvarfinu eru auk venjulegra hvarfefna einnig til staðar breytt núkleótíð, ddNTP. Þegar ddNTP er sett inn í röðina í stað dNTP stöðvast fjölliðunin því á ddNTP-ið vantar OH-hóp sem er nauðsynlegur fyrir hvarfið. Þar sem ddNTP-ið er sett inn á handahófskenndum stöðum fást að lokum allar mögulegar styttri útgáfur af upprunalega bútnum. Raðirnar eru svo aðskildar eftir stærð með rafdrætti. Áður fyrr voru einfaldlega sett af stað 4 mismunandi hvörf, eitt fyrir hvert núkleótíð. Síðan var rafdregið á geli. Nú eru yfirleitt notast við flúrmerkt ddNTP og rafdregið í örpíplum. Hægt er að raðgreina um 1000 basa langa röð með Sanger-raðgreiningu en algengast er að fá 500-700 basa raðir.

Háafkasta raðgreining (high-throughput sequencing) vísar til iðnvæðingar DNA raðgreininga. Á tíunda áratug 20. aldarinnar urðu framfarir í Sanger-raðgreiningu sem uku afköst og gerðu ferlið sjálfvirkt að miklu leiti. Helstu framfarirnar voru að:

• Byrjað var að nota flúrmerkt ddNTP.
• Rafdregið er í örpíplum á stað gels og hægt er að raðgreina mörg sýni í einu með nútíma Sanger-raðgreiningartækjum.
• Sýni voru rafdregið framhjá leysergeisla og skanna í stað þess að rafdraga á geli.
• Hreinsun og fjölliðunarhvarfið sjálft voru bætt t.d. með betri fjölliðunarensímum.

Nútildags er algengast að Sanger raðgreiningar séu framkvæmdar í örpíplum og að svokallaðar "trace" skrár séu búnar til. Í þeim er skráður styrkur þeirra fjögurra basa sem notaðir eru við DNA nýmyndun hvers DNA móts (template) fyrir sig.

• trace

er skrá sem inniheldur mælingar á flúrljómum þegar raðgreint er með nútíma Sanger-raðgreiningu.

• Basakall (Base calling)

eða ,,basa ákvörðun” er þegar DNA röð er ákveðinn út frá flúrmælingum í Sanger raðgreiningu. Flúrmælingin er lesin úr svokallaðri ,,trace file”. Yfirleitt er notast við sjálfvirka hugbúnað en einnig er hægt að ákvarða röðina handvirkt.

• Phred-Phrap forritin.

Phred er forrit sem les inn flúrmælingar (trace files) og ákvarðar basaröð úr Sanger-raðgreingu. Hver basi fær einnig gæðaeinkunn. Phrap er forrit til að raða saman stöku röðum (reads) í contig í búta raðgreingu (shotgun sequencing). Phrap notast við gæðaeinkunina frá Phred þegar raðað er saman. Þegar frumgögnin hafa verið unnin fæst FASTA röð fyrir hvern raðgreindan DNA bút. Þessar raðir má síðan vinna með, t.d. að raða saman í DNA samfellu (contig), og byggja upp heilstæða mynd af genum og erfðamengjum.

Með erfðamengjaöldinni urðu miklar framfarir í DNA raðgreiningu, en ljóst var að Sanger-raðgreiningaraðferðin var ekki endilega sú besta. Í kjölfarið byrjaði tímabil mikillar grósku, margskonar nýjar aðferðir komust á koppinn og sumar í brúk. Oft er talað um næstu kynslóð DNA raðgreiningaaðferða, sem byggja á öðrum lögmálum en Sanger-raðgreining. Nokkrar slíkar eru komnar í almenna notkun. Miða þær allar að því að auka afköst og minnka kostnað við raðgreiningu. Nokkur dæmi eru:

• Raðgreiningu með basapörun, sem er aðferð til skoða breytileika í erfðamengjum sem hafa þegar verið raðgreind. Hægt er að skoða hvora samsætuna af ákveðnum SNP einstaklingur hefur með þessari aðferð.
• Massgreining hefur einnig verið notuð til að raðgreina og nú er hægt að raðgreina um 50bp bút. Massgreining er frekar dýr og því líklegt að þessi aðferð verði notuð til að finna út hvora samsætu af ákveðnu geni einstaklingar bera.
• Verið er að þróa aðferðir sem geta lesið lengri DNA-búta og á ódýrari hátt en þekkist í dag. Raðgreining með nanopores eða öropum er aðferð þar sem breyting í rafstraumi í miðu opsins þegar basi fer í gegnum það gerir mönnum kleift að finna út röðina.
• Þær aðferðir sem lengst eru komnar, eru 454 raðgreining, Illumia-raðgreining og ABI SOLiD raðgreining^(en).

Úrvinnsla gagna úr þessum nýju raðgreiningaaðferðum fer eftir því hvaða tækni er notuð. Úrvinnsla SOLiD gagnanna er t.d. mjög sérstök á meðan raðir úr 454 og Illumina má meðhöndla á svipaðan hátt og FASTA skrár, og byggja úr þeim DNA samfellur.

Illumina raðgreining var upphaflega nefnt Solexa-raðgreining eftir fyrirtækinu (Solexa) sem fann aðferðina upp. Um er að ræða raðgreiningaraðferð sem tilheyrir þriðju kynslóð (next generation) raðgreiningaraðferða. Fyrst eru stuttar raðir, viðhengi, (adaptors) festar við DNA-bútanna sem skal raðgreina. Þeim er síðan komið fyrir á flögu sem hefur raðir sem geta basaparast við viðhengin, bútarnir festast því á báðum endum og mynda einskonar brú. PCR-hvarf er sett af stað og þar sem DNA-bútarnir komast ekki langt án þess að festast aftur við flöguna myndar hver bútur einskonar kóloníu af samsvarandi bútum (polonies). Raðgreiningin sjálf hefst með því að dNTP með flúrmerki og verndarhóp skellt á flöguna. Siðan er flúrmerkið mælt áður en verndarhópurinn er tekinn af og næsta basi getur bundist. Fyrir hverja poloníu er raðgreint frá báðum endum þar sem búturinn er til staðar í báðum stefnum eftir PCR-hvarfið. Samkvæmt heimasíðu Illumina er þannig hægt að raðgreina allt að 150 bp frá hvorum enda á hverjum DNA bút og fá allt að 640 milljón raðir í einni keyrslu. Hámarkslengd raða og fjöldi í hverri keyrslu er eykst samt stöðugt með framförum í tækni.

454 raðgreining er aðferð sem tilheyrir háafkasta DNA-raðgreiningar aðferðum. Með þessari aðferð eru límdar stuttar raðir, viðhengi, (e. adaptors) á DNA-búta svo þeir bindist með basapörun við örsmáar kúlur. Styrkur kúlanna og DNAsins er hafður þannig að sirka ein DNA-sameind bindist á hverja kúlu. Kúlurnar eru síðan settar í olíudropa og PCR-hvarf sett af stað til að auka magn einstakra DNA-búta. Kúlunum er síðan komið fyrir á plötu með örsmáum holum sem taka einungis eina kúlu stærðar sinnar vegna. Síðan er notast við pyroraðgreiningu (pyro sequencing) til að raðgreina samtímist allar DNA-sameindirnar á plötunni, sem eru fjöldamargar. Pyro-raðgreining byggir á því að við DNA-fjölliðun losnar pyrofosfat (PPi), sulfurylasi umbreytir því svo í ATP sem lúsíferasi notar svo til að framleiða ljós. Aðeins einni gerð af dNTP er hleypt á plötuna í einu og því berst einungis ljós frá þeim holum þar sem tilsvarandi dNTP er bætt við röðina. Styrkur ljósins ræðst svo af fjölda eins núkleotíða í röð. Meðallengd reada er um 400 bp með þessari aðferð en hægt er að raðgreina tæpa milljón reada samtímis samkvæmt heimasíðu framleiðands.

Einnig er til prótínraðgreining, en slíkt hefur verið erfiðara í framkvæmd en DNA-raðgreining.