Isolasi Dna Sederhana - Kelompok 2
Isolasi Dna Sederhana - Kelompok 2
Isolasi Dna Sederhana - Kelompok 2
Alfa Sahaya, Carmenita Alifka, Haniam Mariya Br Ginting, Ribka Marisi Sonia
Simanihuruk, Syharla Finanda
Abstrak
I. Pendahuluan
DNA adalah sejenis asam nukleat, juga dikenal sebagai materi genetik. DNA
nukleolar mengontrol semua proses kehidupan dari tingkat sel. Selain itu, ada DNA,
mitokondria dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA inti berbentuk linier dan
berasosiasi dengan histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
lingkaran dan tidak berasosiasi dengan histon. ( Listryoni et al. 2020)
DNA terletak di dalam sel. Oleh karena itu, untuk memperoleh DNA diperlukan
langkah-langkah khusus yang biasanya dilakukan di laboratorium tertentu. Untuk
mengambil DNA dari sel, dilakukan teknik pemurnian DNA biokimia dengan cara
merusak dinding sel menggunakan campuran larutan buffer tertentu dan berbagai
jenis deterjen. Dengan membuka lapisan membran sel, DNA dapat dikeluarkan dan
1
diendapkan dengan menambahkan alkohol. Isolasi DNA adalah serangkaian proses
yang memisahkan DNA dari komponen seluler seperti lipid, protein, dan RNA.
(Puspitaningrum et al. 2018)
Prosedur analisis berbasis DNA yang dikembangkan hingga saat ini meliputi
isolasi DNA, elektroforesis, dan PCR (polymerase chain reaction). Isolasi DNA
adalah ekstraksi DNA dari sampel berbagai organisme, seperti daun tumbuhan, sel
bakteri, darah atau otot hewan, rambut, dan kuku. Elektroforesis adalah migrasi
partikel bermuatan, seperti asam nukleat (DNA dan RNA) dan protein, pada matriks
berpori (gel agarosa dan poliakrilamida) di bawah pengaruh medan listrik.
polymerase chain reaction adalah reaksi berantai yang menggunakan enzim
polimerase (Roslim et al. 2018)
Pemisahan DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel lain seperti
lipid, protein, polisakarida dan zat lainnya. Isolasi DNA dapat dilakukan pada semua
organisme dan virus. Salah satu tantangan isolasi DNA adalah isolasi DNA pada
organisme mamalia. Mamalia mempunyai kompleksitas jaringan dan organ yang
sangat tinggi, sehingga berbagai kendala sering ditemui dalam proses isolasi DNA
hewan, seperti lipid dan protein penyusun jaringan yang berlebihan serta adanya
nuklease pada beberapa organ hewan sehingga dapat merusak asam nukleat.
Permasalahan lain yang juga dijumpai pada proses isolasi DNA hewan adalah
tingkat ketahanan organ atau jaringan hewan berbeda dengan tumbuhan dan hewan
lainnya.Jaringan hewan akan sangat cepat membusuk dan menyebabkan kerusakan
pada jaringan dalam waktu yang singkat, sehingga disarankan untuk melakukan
proses isolasi pada saat proses isolasi. DNA hewan adalah tingkat ketahanan dari
organ atau jaringan hewan tidak seperti tumbuhan dan lainnya, jaringan hewan dapat
membusuk dengan cepat dan menyebabkan kerusakan dalam jaringannya dalam
waktu yang singkat, sehingga disarankan dalam proses isolasi DNA hewan
digunakan sampel yang masih segar. Akan tetapi, untuk melakukan isolasi DNA
hewan dengan menggunakan sampel segar sangatlah sulit. Organ yang telah di
ambil setelah pembedahan harus diawetkan dan disimpan dalam freezer apabila
akan digunakan pada lain hari. Banyaknya kendala yang ada dalam proses isolasi
2
DNA hewan dari jaringan atau organ yang diawetkan menyebabkan tingkat
keberhasilan isolasi DNA hewan tersebut menjadi semakin minimum. Oleh sebab itu,
perlu adanya optimalisasi metode yang bisa digunakan untuk memperoleh DNA yang
baik dan selanjutnya dapat digunakan dalam proses bioteknologi dan biomolekular
(Hariyadi et al. 2018)
Tahapan ekstraksi DNA terdiri dari tiga proses utama, yaitu proses lisis sel,
purifikasi, dan presipitasi. Proses lisis sel merupakan proses pertama ekstraksi DNA
diawali dengan menghancurkan membran sel dengan cara memberikan enzim
Proteinase K untuk merusak protein dan Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) untuk
mengikat lipid sehingga membran sel rusak dan semua isi sel keluar. Proses lisis sel
menyebabkan DNA bercampur dengan makromolekul sel lainnya. Pemurnian DNA
dari makromolekul sel dilakukan pada tahap purifikasi dengan cara memberikan
Phenol dan CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol) untuk mengikat makromolekul selain
DNA seperti protein, lipid, dan karbohidrat. Pada tahap ini DNA dan air terpisah dari
bahan organik lainnya setelah disentrifugasi. Untuk menarik air dari DNA dibutuhkan
alkohol. Proses ini disebut dengan presipitasi. Metode ekstraksi DNA tersebut
merupakan metode Fenol-Chloroform yang umum digunakan didalam prosedur
laboratorium (Kamaliah, 2017)
DNA dapat diisolasi dari sel tanaman, hewan, manusia, maupun bakteri
(Fatih, 2009). Isolasi DNA digunakan untuk berbagai macam keperluan seperti
amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis maupun spektrofotometri. Isolasi
DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Melalui isolasi DNA kita dapat memperoleh DNA
murni, yaitu tanpa protein maupun RNA dari suatu sel dalam jaringan.DNA hasil
isolasi selanjutnya dilakukan uji kuantitas dan kualitas untuk melihat kemurniannya
dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis gel. Uji kualitas DNA
dilakukan dengan elektroforesis horizontal melalui media gel agaros. Prinsip dasar
elektroforesis adalah pergerakan molekul bermuatan atau ion melalui medium
3
semisolid di bawah pengaruh suatu medan listrik. Elektroforesis dapat digunakan
untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah
diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pembanding sehingga bisa
diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Jika molekul yang bermuatan negatif (DNA)
dilewatkan melalui gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub
yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif, sehingga elektroforesis dapat memisahkan DNA berdasarkan
ukuran panjangnya ( Sundari & Priadi. 2020)
III. Metode
3.1 Alat
7. Sudip 1 buah
8. Corong 1 buah
4
3.2 Bahan
3. Belalang 5 gram
4. Jangkrik 5 gram
8. Air Mineral pH 8 60 ml
11. Es Batu 1
bungkus
5
3.3 PROSEDUR KERJA :
Buat larutan buffer lisis dengan campuran air mineral ph 8 (60 ml), detergen aktif (20
ml/gram), dan garam dapur (20 gram) (volume ini adalah volume buffer lisis yang
dibutuhkan untuk 1 jenis sampel);
Gerus 5 gram sampel dengan mortar steril sambil sesekali menambahkan sedikit
buffer lisis agar proses menggerus lebih mudah
Setelah selesai, masukkan sampel yang telah digerus pada wadah dan rendam
menggunakan seluruh buffer lisis yang telah dibuat;
6
Tetesi hasil penyaringan dengan etanol 96% dingin melalui dinding tabung reaksi;
Amati proses timbulnya DNA meliputi waktu yang diperlukan, bentuk, warna, serta
jumlah DNA yang terbentuk;
Lapisan berwarna putih seperti benang halus merupakan DNA hasil proses
presipitasi menggunakan etanol;
Ambil lapisan putih tersebut dengan hati-hati menggunakan pipet tetes, lalu
pindahkan dua tetes ke tube sentrifuge 1,5 ml;
Buang larutan etanol dengan cara memiringkan tube sentrifuge, lalu isi ulang lagi
dengan etanol 96% dan sentrifuge kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama
10 menit;
7
Buang kembali etanol dalam tube dengan cara memiringkan tube sentrifuge;
Bagian putih bening yang menempel pada dasar tube merupakan DNA yang telah
berhasil diisolasi;
Simpan DNA hasil isolasi tersebut dalam kulkas dengan suhu -20℃.
8
IV. Hasil dan Pembahasan
Lisis mekanik
Deskripsi:
Pada tahapan ini proses
lisis dilakukan dengan cara
menggerus sample
dengan mortar dan alu
hingga teksturnya halus
Lisis kimiawi
Deskripsi:
Pada proses ini sample
dicampurkan dengan
larutan buffer (Soklin
20ml,Garam 20gr, Air
mineral 60ml) lisis kimiawi
bekerja dengan merusak
sampel dengan
mengganggu bilayer lipid
dan protein denaturasi.
Sample bertekstur kental
dan berbau sedikit amis
9
Ekstraksi 15 menit
Presipitasi 1 menit
Deskripsi: mengendapkan
benang kromatin dengan
menggunakan ethanol
dingin karena temperatur
yang rendah, akan
menurunkan aktivitas
molekul air yang dapat
menyebabkan
pengendapan DNA lebih
efektif
10
Pembahasan
Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA
murni, tanpa adanya protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Dalam
percobaan ini, kelompok 2 (dua) melakukan isolasi DNA yang berasal dari hewan
dengan sampel bahan hati ayam. DNA pada hati ayam dapat diisolasi secara
sederhana. Dalam praktikum isolasi DNA yang telah dilakukan, ada tiga proses yang
dilalui yakni lisis, ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa
dan protein dan presipitasi. Setiap prosedur yang dilakukan memiliki durasi yang
berbeda-beda sesuai kondisi di laboratorium.
Bahan kimia yang digunakan untuk ekstrak DNA adalah 3 jenis buffer: 1).
Buffer CTAB (komposisi: 1M Tris HCl pH 8; 0,5M EDTA pH 8; 5M NaCl; 0,2% 14M ß-
ME; Aquabidestilata), kloroform (CIAA), isopropanol, TE (0,5 M EDTA pH 8,0 dan 1M
Tris-HCl pH 8,0). 2). Buffer detergen dengan kandungan bahan aktif surfaktan Alkyl
Benzena Sulfonat (ABS) 3). Buffer detergen dengan kandungan surfaktan Sodium
Laureth Sulphate (SLS)(Mahadi dkk., 2021). Pada percobaan ini buffer detergen
yang digunakan adalah So Klin Liquid dengan bahan aktif surfaktan 25%.
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan
dilakukan dengan menggunakan etanol/alkohol dingin berkonsentrasi 96%.
Etanol/alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari
air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan. Penambahan etanol
11
96% bertujuan untuk mempermudah terjadinya presipitasi pada benang-benang
DNA. Waktu yang dibutuhkan untuk terbentuknya suatu endapan adalah 1 menit.
Etanol tersebut mampu membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik
dan membentuk sebuah endapan di bagian tengah tabung reaksi. Endapan tersebut
merupakan benang-benang kromatin yang akan dimasukkan ke dalam sentrifuse
tube.
Dari percobaan isolasi DNA ini tidak diperoleh DNA murni melainkan hanya
DNA kasar atau benang – benang kromatin dalam jumlah yang sedikit. Benang-
benang kromatin dari hati ayam adalah berwarna putih. Benang-benang kromatin
dalam sentrifuse tube ini akan memasuki tahap berikutnya yakni sentrifugasi. Prinsip
utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan
berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik
sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.
V. Kesimpulan
12
VI. Daftar Pustaka
Ariyanti, Y., & Sianturi, S. (2019). Ekstraksi DNA total dari sumber jaringan hewan
(Ikan Kerapu) menggunakan metode kit for animal tissue. Journal of science
and applicative technology. 3(1): 40-45.
Fitriya, R. T., Ibrahim, M., & Lisdiana, L. (2015). Keefektifan Metode Isolasi DNA Kit
dan CTAB/NaCl yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan Shigella
dysentriae. Lentera Bio. 4 : 87–92.
http://ejournal.unesa.ac.id/index.php/lenterabio
Hapsari, Ari Indriana.2015. Isolasi DNA Tanaman Bayam (Amaranthus sp.) dan Ikan
Lele (Clarias sp.) Sebagai Kajian Dalam Biologi Molekuler.Didaktika.vol 13
(2):23-30
Hariyadi, S., Narulita, E., & Rais, M. A. (2018, October). Perbandingan Metode Lisis
Jaringan Hewan dalam Proses Isolasi DNA Genom pada Organ Liver Tikus
Putih (Rattus novergicus). In Proceeding Biology Education Conference.Vol 15
(1): 689-692
Mahadi, I., Zulfarina dan Megawati Anggraini. 2021. Penggunaan Buffer Alternatif
Untuk Isolasi DNA Genomik Pada Tanaman Hutan. Jurnal Penelitian
Kehutanan Wallacea. 10(2):117-130.
Roslim, D. I., Herman, H., Elvyra, R., Sofiyanti, N., & Chahyadi, E. (2018). Pelatihan
Prosedur Laboratorium Analisis DNA. Jurnal Pengabdian UntukMu Negeri,
2(2): 44-48.
Sundari, S., & Priadi, B. (2020). Teknik Isolasi Dan Elektroforesis DNA Ikan Tapah.
13
Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur.Vol 17(2): 87-90.
Syahputra, A., Mutaqin, K. H., & Damayanti, T. A. (2016). Komparasi Metode Isolasi
DNA Patogen Antraknosa dan Bulai untuk Deteksi PCR. Jurnal Fitopatologi
Indonesia, 12(4), 124-124.
Utaminingsih, S., Utami, S. D., & Sophian, A. (2022). Isolasi DNA pada Produk Otak-
Otak Ikan Bandeng. Muhammadiyah Journal of Nutrition and Food Science
(MJNF), 3(1), 36-41.
14
VIII. Lampiran-Lampiran
Lampiran Dokumentasi
Di timbang 5 gram hati Gerus hati ayam hingga Masukkan hati ayam yang
ayam halus telah digerus halus
kedalam larutan buffer lisis
15
Aduk hingga merata lalu Saring larutan dengan Tuangkan etanol dingin
tunggu hingga 30 menit menggunakan kertas kedalam larutan yang
saring sebanyak 2 kali telah disaring. Tunggu
hingga terbentuk
gumpalan benang
kromatin.
16