Laporan Praktikum PCR
Laporan Praktikum PCR
Laporan Praktikum PCR
Disusun oleh :
Dosen Pengampu :
1. Aprilia Indra K., S.Pd., M.Biotech.
2. Ragil Tyas ., S. Si. M. Sc.
KATA PENGANTAR
Bismillahirrahmanirrohim
Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, ma’unah dan
hidayat-Nya kepada kita sehingga Laporan Praktikum kimia analitik ini dapat kami susun
dan dapat terselesaikan. Shalawat dan salam senantiasa tercurahkan kepada Nabi kita
Muhammad SAW sebagai penuntun umat Islam dan sekaligus sebagai penyelamat di
dunia dan di akhirat bagi seluruh umat islam.
Laporan ini adalah hasil laporan dari kami yang selama kami melaksanakan
Praktikum mata kuliah kimia analitik sesuai peraturan-peraturan yang telah di tentukan.
Penulis menyadari bahwa karya ini masih jauh dari kata sempurna, dan tak lepas
dari bantuan semua pihak
Praktikan
3
DAFTAR ISI
4
DAFTAR ISI
BAB 1. PENDAHULUAN........................................................................................................... 5
1.1 Latar Belakang ............................................................................................................ 5
1.2 Tujuan Praktikum............................................................................................................. 5
BAB II .......................................................................................................................................... 6
TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................................................. 6
2.1 Isolasi DNA .................................................................................................................. 6
2.2 Reaksi Berantai Polimerase PCR .......................................................................... 7
2.2.1 Prinsip Dasar PCR ..................................................................................................... 7
2.3 Electroforesis ............................................................................................................... 8
BAB III ....................................................................................................................................... 10
METODE PRAKTIKUM ......................................................................................................... 10
3.1 Waktu dan Tempat ......................................................................................................... 10
3.2 Alat dan Bahan ................................................................................................................ 10
3.2.1 Alat............................................................................................................................. 10
3.2.2 Bahan ......................................................................................................................... 10
3.3 Prosedur Praktikum ....................................................................................................... 10
3.3.1 Isolasi DNA Bakteri ................................................................................................. 10
3.3.2 Isolasi DNA Whole Blood ........................................................................................ 11
3.3.3 Isolasi DNA Buffy Coat............................................................................................ 11
3.3.4 Isolasi DNA Jaringan ............................................................................................... 12
3.3.5 Eletroforesis .............................................................................................................. 12
3.3.6 Proses PCR......................................................................................................... 13
3.3.7 Elektroforesis Agarose ...................................................................................... 13
BAB IV ....................................................................................................................................... 15
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................................. 15
4.1 Hasil ............................................................................................................................ 15
4.2 Pembahasan ............................................................................................................... 17
4.3 Kesimpulan ................................................................................................................ 18
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................ 18
5
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan protein
histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari
DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA.
DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang
terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA
plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal.
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA terdapat
di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di antara ketiga lokasi
DNA ini, yaitu: DNA nukleus berbentuk linear dan berhubungan sangat erat
dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berhubungan dengan protein histon.
DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung komponenkomponen
gula pentosa, gugus fosfat, dan pasangan basa nitrogen. Satu sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada
keturunannya.
Langkah pertama untuk mendapatkan DNA baik untuk kepentingan rekayasa
genetika, forensik maupun molekular lainnya tahap awal yang akan dilakukan
yaitu isolasi DNA, Reaksi Berantai Polimerase dan Electroforesis yang akan di
praktekkan pada praktikum kali ini.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah prosedur umum memisahkan dan mengumpulkan DNA
untuk analisis rekayasa genetika, forensik, bioinformatika, komputasi, analisis asal-
usul dan antropologi. Ada beberapa teknik ekstraksi yang umum digunakan dalam
DNA teknologi termasuk teknik Chelex. Teknik ini dikembangkan tahun 1991 dan
hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR. Meskipun memiliki keterbatasan,
teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan efektif untuk ekstraksi DNA. Metode
chelex disarankan untuk preparasi DNA karena tidak membutuhkan tabung-tabung
untuk transfer. Metode ini cepat dan menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat
digunakan dalam uji kompleks PCR. Metode ini menjamin untuk menghasilkan
sampel kecil sehingga disarankan untuk semua sampel yang diuji dengan berbagai
ukuran dan volume sampel. Prinsip dasar Ekstraksi DNA adalah mengeluarkan
DNA dari set. Teknik yang biasa digunakan adalah teknik Chelex umumnya teknik
ini mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan prosedur penambahan suspensi
"resin-chela" secara langsung untuk spesimen (darah, noda darah, semen sebagai
contoh) kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen,
magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya.
2.1.1 Tahap Ekstraksi DNA
Ada beberapa tahap dasar dalam ekstraksi DNA, yang rinciannya dapat
berbeda tergantung jenis sampel dan senyawa yang mempengaruhi ekstraksi dan
analisis lanjut. Berikut ini tahap-tahapnya yaitu:
PCR ditemukan oleh Kary Muilis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum yang
digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai
keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan, identifikasi
sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas), deteksi dan
diagnosis penyakit infeksi dan pembentukan organisme transgenik. PCR juga
digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi, ekologi,
biologi perkembangan, dan genetika.
polimerase PCR juga membutukan kondisi tahap ini untuk aktivasi (PCR
awal-panas).
2. Tahap Denaturasi dilakukan pada suhu 94-98°C selama 20-30 detik, tahap
ini berfungsi untuk memutus ikatan hidrogen basa-basa komplemen rantai
DNA untuk menghasilkan rantai tunggal DNA.
3. Tahap Annealing (Penempelan). dalam tahap ini suhu diturunkan sehingga
primer dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal. Gerakan
Brownian menyebabkan primer bergerak di ikatan hidrogen DNA - DNA
yang secara konstan dibentuk dan diputuskan antara dan cetakan. Ikatan
stabil hanya terbentuk bila urutan primer sangat dengan urutan cetakan.
Bagian pendek rantai ganda ini dikatalisis oleh polimerase untuk memulai
sintesis DNA. pada tahap ini bergantung pada suhu primer dan biasanya
antara 40-48 °C selama 20-40 detik.
4. Tahap Elongasi / Pemanjangan yaitu Polimerase memperpanjang rantai
DNA yang komplemen dengan rantai cetakan. Suhu pada tahap ini
bergantung pada DNA polimerase yang digunakan. Taq DNA Polimerase
mempunyai suhu optimum 70-74°C. Umumnya reaksi ini menggunakan
suhu 72°C. DNA polimerase melakukan kondensasi 5'- fosfat dNTP dengan
gugus 5'- hidroksil ujung awal rantai DNA yang komplemen dengan cetakan
dalam arah 5' ke 3'. Pemanjangan bergantung pada DNA polimerase dan
panjang bagian DNA akan diamplifikasi.
5. Tahap Ekstra Ektensi dilakukan selama 5-15 menit (tergantung panjang
cetakan DNA) setelah siklus terakhir digunakan untuk menjamin DNA
rantai tunggal sisa diperpanjang seluruhnya. Akhimya jaga suhu 4-15°C
selama waktu terbatas untuk penyimpanan singkat seiama reaksi misalnya
jika reaksi dikerjakan semalam.
2.3 Electroforesis
Electroforesis adalah teknik laboratorium untuk memisahkan molekul
bermuatan. "Gel" merujuk pada matriks yang digunakan untuk memisahkan
molekulnya. Gel Electroforesis digunakan dalam forensik, biologi molekuler,
genetika, mikrobiologi dan biokimia. Electroforesis gel memisahkan asam
deoksiribonukleat, asam ribonukleat, dan protein melalui muatan listrik. Metode ini
biasanya digunakan untuk tujuan analitik, tetapi dapat digunakan sebagai teknik
preparasi untuk memurnikan molekul sebelum menggunakan metode lain untuk
karakterisasi lanjut seperti spektrometri massa, PCR, kloning, pengurutan DNA,
atau imunobloting.
negatif atau menuju katoda jika bermuatan positif (catatan bahwa Electroforesis gel
bekerja sebagai sel listrik; anoda bermuatan positif dan katoda bermuatan negative).
10
BAB III
METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Biologi Molekuler dengan acara “Polymerase Chain Reaction (PCR)
dan Elektroforesis DNA pada Agarose Gel” dilaksanakan pada hari selasa tanggal
11 November 2018 pukul 07.00 sampai 08.40 di Laboratorium Biologi Molekuler
Fakultas Ilmu Kesehatan dan Keperawatan Universitas Muhammadiyah Semarang.
3.2.2 Bahan
DNA template
Master mix
Gel Agarose
Loading buffer
TBE 1X (Tris-Borate-EDTA)
Ethidium bromide
Primer Reverse
Primer Forward
Nuclease Free Water
Elektroda Buffer
3.3.5 Eletroforesis
A. Pembuatan Gel Agarose
1. 0,4 gr bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml buffer tris, dicampur dan di larutkan
dengan cara di panaskan dengan mikrowave sampai mendidih sehingga larutan
jernih
7. Setelah mengeras sisiran dapat diambil dan gel agarose siap digunakan.
B.Elektroforesis
14
9. 1µl loading day dicampur dengan 3µl produk DNA pada parafilm.
10. Campuran ini dimasukan kedalam sumuran gel agarose yang berbeda.
11. Tangki elektroforesis ditutup dan di hubungkan dengan power suplay 100 volt
dinyalakan 30 menit sampai 1 jam.
C.Pembacaan
BAB IV
a. Marker
b. Bi
c. 3A
d. P
e. Nn
f. B2
g. B1
h. B1
i. B4
j. Wb
k. Bfc
l. Sapi
m. Wb
n. Sapi
o. Bfc
p. Marker
16
a. Bakteri
b. Buffy coat
c. Wb + EDTA
d. Buffy coat 2
e. Jaringan
f. Salmonelathypi
g. Sapi
h. Darah
i. Bakteri 2
j. Jaringan 2
k. Buffy coat
l. Ikan
m. Ayam
n. Wb 2
o. Buffy coat A21
p. Phenol bakteri
q. Bc EDTA
17
r. Jaringan
s. Wb
t. Bakteri
u. Bakteri
v. Bc EDTA
w. Wb
x. Buffy coat
y. Clorofrm
z. Bc
aa. Bakteri
bb. Buffy coat
cc. Wb
dd. Ayam ca
ee. Sapi
Bc3
4.2 Pembahasan
A. Isolasi DNA
Isolasi DNA dengan tujuan untuk memisahkan dari bahan lain seperti protein,
lemak dan karbohidrat.prinsip pertama pada isolasi DNA ada 3 tahap yaitu
penghancuran (lisi), ekstraksi, pemisahan DNA. Proses pertama ekstraksi DNA
bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lainyang tidak di inginkan,
untuk mengeluarkan DNA dari sel , dapat dilakukan dengan cara memecah
dinding sel , membran plasma, dan membran inti. Dinding sel yang telah pecah
atau lisis pada tahap sebelumnya menyebabkanorgael –organel sel sempat
keluar, sehingga didalam larutan hanya ada DNA namun juga ada RNA,
protein.DNA perlu dibersihkan dari pengoto, lalu di centrifuge dengan
kecepatan tinggi menyebabkan komponen – komponen yang ukuran dan berat
molekulnya besar mengendap pada dasar tabung yang disebut dengan pallet.
Sehingga pada akhirnya terbentuk 2 fase, bagianatas diambil sedangkan lapisan
bawah dibuang. Proein yang mungkin ikut terbawa fase atas dipresipitasi dengan
pelarut organik salah stunya adalah klorofom dan kembali di centrifuge hasil
akhirnya terbentu 3 fase. Fase atas/ aquose terdapat DNA, fase tengah/interfes
terdapat klorofom, fase bawah/ organik terdapat protein, lipid. Kemudian di
murnikan dengan ethanol absolut, dan benang-benang DNA akan terlihat.
B. PCR
PCR merupaka proses siklus berulang ulang dalam melakukan
pengandaan DNA yang melputitahap denaturasi, anealing dan elongasi. Prosees
denaturasi terjadi memisahan untai ganda DNA dengan suhu 95°C selama 30
detik. Anealing yaitu penempelan primer DNA dengan suhu 48°C selama 30
detik. Elogasi yaitu pemanjangan DNA templet dengan suhu 72°C selama 2
menit.
18
4.3 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa isolasi
DNA memiliki prinsip yaitu centifuge dan preparasi. Isolasi DNA 3 tahap yaitu
penghancuran atau lisis sel, tahap ekstraksi dan tahap pencucian hasil di peroleh
larutan bening DNA.
Dan pada proses PCR Diperoleh sampel pada sumuran 4,6,7,8 dan 9 menggandung
DNA bakteri almonella thypi pada squense 1500bp.
DAFTAR PUSTAKA
Alimuddin, Goro Y, Viswanath K, Shuichi S, Toshio T. 2004. Enhancement of
EPA and DHA biosynthesis by over-expression of masu salmon D6-desaturase-
like gene in zebrafish.Journal Transgenic Research Vol 14:159-165. Alimuddin,
Goro Y, Viswanath K, Shuichi S, Toshio T. 2006. Expression of Masu Salmon
D5-Desaturase-Like Gene Elevated EPA and DHA Biosynthesis in Zebrafish. J
Marine Biotechnology Vol:9, 92-107 Alimuddin, Goro Y, Viswanath K, Shuichi
S, Toshio T. 2008. Cloning and over-expression of a masu salmon
(Oncorhynchus masou) fatty acid elongase-like gene in zebrafish.Journal
Aquaculture.Vol 282: 13-18
https://www.academia.edu/9271245/laporan_PCR