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    PB61 : 2ème partie

    Bases de la microscopie

    Orestis Faklaris
    Laboratoire Photonique Quantique Moléculaire
    ENS de Cachan

    orestis.faklaris@lpqm.ens-cachan.fr
    Plan

    • But de la microscopie

    • Rappel: lumière et optique géométrique

    • Le Microscope

    • Caractéristiques de la lumière

    • Techniques de microscopie classique

    • Autres Techniques plus avancées


    But de la microscopie
    • Voir la structure fine des objets biologiques
    Excellent try, my dear Watson, but …
    Could you bring me a mirror, old boy?

    • Explorer les propriétés moléculaires des échantillons


    (fixés ou vivantes) de manière non invasive (non destructive)
    - Localisation: marquage, coloration, colocalisation, …
    - Dynamique: FCS, …
    - Interactions: FRET, FLIM, …
    Comment voir les détails d’un échantillon?

    …élémentaire, mon cher Watson !

    La loupe:

    Grandissement: h’ / h (de 1.5x à 10x)


    Agrandir plus … le microscope !

    Image à l’infini
    Grossissement= grandissement de l’objectif
    x grossissement de l’oculaire

     agrandir jusqu’à 2000x !


    Nature de la lumière

    Ondes ou Particules ??
    • Qu’est ce que la lumière?
    Pendant plusieurs siècles deux tendances se sont affrontés: onde-corpuscule

    • Au 17ème siècle:
    - Corpusculaire pour expliquer la réflexion (Descartes, Newton)
    - Ondulatoire pour expliquer la diffraction (Young, Huygens)

    • Du 17ème au 19ème siècle:


    - Expériences validant l’aspect ondulatoire (Fresnel, Maxwell – ondes
    électromagnétiques)
    - Expériences validant l’aspect corpusculaire (Planc - corps noir, Einstein -
    effet photoélectrique)

    • Au 20ème siècle:
    - Dualité onde-corpuscule, comme pour les e- et tout objet avec une masse m
    et vitesse u (de Broglie, Heisenberg)

    Question fausse – lumière est lumière


    De fois comportement des particules de fois des ondes
    Ondes électromagnétiques

    • Lumière – Onde électromagnétique (Maxwell)


    • Variation d’un champ électrique et du champ magnétique, dans
    l’espace et dans le temps
    • La lumière naturelle est une superposition d’ondes
    électromagnétiques de différentes longueurs d’ondes (couleurs)
    Caractéristiques de la lumière

    • Vitesse – c = 3x108 m/s dans le vide


    • Longueur d’onde – λ (400 – 700 nm)
    • Fréquence – sec-1 (Hz)
    c = λ f
    Photon associé:
    Energie E = h f (J), h const. de Planc, paquets d’énergie!

    Quelques repères:
    - 7 fois le tour de la terre en 1s
    - Distance terre soleil en 8 min
    Longueur d’onde ---- Fréquence

    bleu
    488 nm Photon
    comme un
    petite λ
    paquet
    f élevée d’énergie E

    rouge
    650 nm
    longue λ
    f basse
    Er > Eb
    Optique géometrique ou ondulatoire?
    • Optique géometrique : propagation rectiligne des ondes –
    rayon de la lumière

    • Optique ondulatoire : on considère la propagation des


    ondes
    Interactions lumière-matière

    a) Réflexion

    b) Réfraction

    c) Dispersion

    d) Diffraction
    e) Absorption (pour nos études = 0)
    a) Réflexion: 2 types

    θ1 = θ2
    b) Réfraction
    -> vitesse de la lumière pas même pour tous les milieux

    Loi de Snell
    • Définition: Indice de
    réfraction
    n = c / u ≥ 1

    n1 sinθ1 = n2 sinθ2

    Exemples
    Mirages : changement de n avec T
    déviation des rayons lumineuses vers les indices élevés

    .
    • Réflexion Totale
    Passage d’un milieu d’indice fort à un milieu d’indice faible :
    existe angle θc  pour θ > θc  réflexion totale

    n1 sinθc = n2 sin90°

     sinθc = n2 / n1

    Applications: fibres optiques  télécommunications , médicine (endoscope), …


    c) Dispersion
    n dépend de λ !
    Dispersion par une goutte d’eau
    n = f(λ)
    λ = λo/ n

    Application : Spectrographie!
    Etudier les λ d’une source de lumière
    Rappels d’Optique Géometrique
    i) Introduction - Lentilles
    • Convergentes (un faisceau de lumière parallèle converge en sortie)
    • Divergentes (un faisceau de lumière parallèle diverge en sortie)
    • Association

    convexe Plan convexe

    • Plupart des lentilles en verre, n = 1.5


    • Pour les UV  quartz (verre arrête les UV)
    • Lentilles

    • Approximation de Gauss
    - faisceaux proches de l’axe optique
    - faisceaux peu inclinés sur l’axe optique

    • Lentilles modélisées par lentilles minces:


     Centre optique O, foyer objet F, foyer image F ’
    On note f = OF (distance focale objet), f’ = OF’ (distance focale
    image)

    • En pratique: lentille formée de deux dioptres sphériques de


    rayons de courbure R1 et R2.
    1/f’ = (n-1) (1/R1 – 1/R2)

    Plus la focale est courte, plus la lentille est bombée.


    ii) Approximation des lentilles minces
    Faible épaisseur devant rayons de courbure
    • Lentilles convergentes : définition des foyers

    Notion: rayon lumineux


    Foyer

    Convention de signes:
    f’
    grandeurs algébriques, O origine d’un
    axe orienté de gauche à droite

    F F’ •Objet réel: avant la lentille p<0


    •Objet virtuel: après la lentille p>0
    O •Image réelle: après la lentille p’>0
    •Image virtuelle: avant la lentille p’<0

    Pour lentilles convergentes: f<0, f’>0


    Plan focal Plan focal Pour lentilles divergentes: f>0, f’<0
    objet image
    Objet virtuel pas existence physique -
    Image de l’objet à travers du
    système optique
    • Règles de construction des images

    Construction géométrique:
    -Un rayon passant par le centre
    optique O n’est pas dévié
    -Un rayon parallèle à l’axe optique
    sorte de la lentille en passant par
    le foyer image F’
    -Un rayon passant par le foyer
    objet F sort en parallèle à l’axe
    optique

    Construction à partir des formules de conjugaison:


     p = OA et p’ = OA’, où A’ l’image de A par la lentille
     formule de conjugaison: 1/p’ – 1/p = 1/f’ (f’ foyer image)
     Notion : grandissement g = A’B’/AB = p’/ p

    Les plans AB et A’B’ sont conjugués par la lentille


    iii) Association des lentilles

    Deux lentilles minces (focales f1’ et f2’) dont les centres optiques
    sont séparés de la distance d sont équivalentes à une lentille mince
    de distance focale f’ telle que:
    1/f’ = 1/f1’ + 1/f2’ – d/ (f1’f2’)

    Application d=0 -> 1/f’ = 1/f1’ + 1/f2’

    iv) Lentille épaisse (lentille réelle)

    Définition des plans principaux objet – image


    Equivalence avec une lentille simple
    v) Diaphragme de champ – diaphragme d’ouverture
    • Diaphragme de champ: restreint la zone visible de l’objet
    L’intensité de l’objet est inchangée

    • Diaphragme d’ouverture restreint la quantité de lumière qui forme


    l’image objet: l’image reste entière mais
    1) Moins lumineuse
    2) De meilleur qualité (moins des aberrations)
    écran

    image
    objet F F’

    Diaphragme
    de champ
    Diaphragme
    d’ouverture

    Diaphragme d’ouverture: accolé à une lentille ou dans un plan conjugué


    Diaphragme de champ: dans un plan conjugué à l’image
    Aberrations des lentilles
    i) Aberration chromatique
    L’indice n dépend de λ de la lumière qui
    traverse le verre  f (λ)
    car 1/f’ = (n-1) (1/R1 – 1/R2)

    Lentille convergente:

    Lentille divergente: foyer bleu et rouge inversés

    Correction: association de 2 lentilles, une convergente (crown) et une


    divergente (flint): achromat ou doublet achromatique
    ii) Aberration sphérique
    Lentilles simples: un ou plusieurs dioptres sphériques
    Les rayons lumineux qui passent à la périphérie ne convergent pas au même endroit
    que les rayons qui passent au voisinage de l’axe

     l’image d’un point source n’est pas un point, mais une tâche définie comme le
    « cercle de moindre confusion ».

    Conséquences: diminution du contraste et de la résolution (image floue)


    Correction:
    Limitation des bords des lentilles (diaphragme d’ouverture)
    Association de lentilles de courbures différents (doublet, triplet).
    Autres aberrations:

    iii) Aberration de coma


    Lentille pas perpendiculaire à l’axe optique

    iv) Astigmatisme
    Deux foyers dus à l’asymétrie du montage

    Conclusion : Toutes les aberrations peuvent être corrigées


    par association de lentilles et traitement des surfaces

     Objectifs de microscope d’optique compliqué, fragiles,


    coûteux
    Que peut-on voir à l’œil nu ?

    A d

    θmin= 3.10-4 rad (limite angulaire de résolution)


    dmin= 250 mm (distance minimale d’accommodation)
     ABmin = 85 µm

     Nécessité d’un instrument optique qui grossit !


    Bibliographie
    • Optique (Eugene Hecht)
    • Optique – fondements et applications (Pérez)

    • http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html
    Très bon site, apprentissage interactif !

    • http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm
    Cours de microscopie

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