RAPPORT DE STAGE

PRATIQUE DU MÉTIER DANS UN LABORATOIRE EN

AGROALIMENTAIRE

Laboratoire régional d’analyses et de recherches ONSSA MEKNES

Unité de chimie alimentaire

Réalisé par :
HAMDAOUI IBTISSAM
Horria EL-ATTAR

Année universitaire 2018/2019

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Table of Contents
REMENRCIEMENTS...................................................................................................................................................5
INTRODUCTION..........................................................................................................................................................6
 Les objectifs de stage..........................................................................................................................................6
 Apprentissage technique :..................................................................................................................................7
I. PRÉSENTATION DE LABORATOIRE..............................................................................................................7
1. HISTORIQUE....................................................................................................................................................7
2. Organisation du laboratoire..............................................................................................................................7
3. Localisation.........................................................................................................................................................8
4. Organigramme de l’ONSSA..............................................................................................................................8
5. Activité du laboratoire par section :..................................................................................................................9
5.1. Activités en Chimie -Toxicologie :.............................................................................................................9
II. METHODOLOGIE................................................................................................................................................9
1. Analyse de l’huile................................................................................................................................................9
1.1. Taux d’acidité.............................................................................................................................................9
1.2. Indice de peroxyde (taux d’oxydation de l’huile)...................................................................................10
2. ANALYSE DE LAIT........................................................................................................................................13
2.1. Humidité de lait........................................................................................................................................13
2.2. Teneur en protéines (méthode de Kjeldahl)...........................................................................................14
2.3. La matière grasse (méthode de GERBER).............................................................................................18
3. ANALYSE DE MIEL.......................................................................................................................................19
3.1. TEST DE GLUCOSE SYNTHÉTIQUE.................................................................................................19
3.2. Teneur en sucre.........................................................................................................................................20
4. Analyse de conserve de poisson.......................................................................................................................21
4.1. Teneur en histamine.................................................................................................................................21
5. ANALYSE DE L’EAU.....................................................................................................................................24

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 5.1. Détermination du pH (par la méthode électrochimique).......................................................................24
5.2. Teneur en chlorures (méthode de Mohr)................................................................................................24
Conclusion....................................................................................................................................................................26

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Liste des figures
Figure1 : Emplacement de laboratoire de l’ONSSA
Figure2 : Organigramme de l’ONSSA
Figure3 : Les étapes du test d’acidité
Figure4 : Les étapes du test Indice de peroxyde
Figure5 : Les étapes de mesure de l’Humidité
Figure6 : Les étapes de minéralisation
Figure7 : Les étapes de distillation
Figure8 : Les étapes de mesure la matière grasse
Figure9 : Les étapes du test de glucose synthétique
Figure 10 : Les étapes de mesure la teneur en sucre
Figure 11 : Schéma simplifié de la réaction de formation de l'histamine
Figure 12 : Les étapes de purification des colonnes
Figure 13 : les étapes de complexations
Figure 14 : Lecture de la fluorescence
Figure 15 : Les étapes de dosage de chlorure

RÉFIRENCE
http://www.onssa.gov.ma/fr/laboratoires-sp-2215/lrar-meknes

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 REMENRCIEMENTS
Avant toute chose, nous remercions Dieu, le tout puissant, pour nos avoir
donnée la force et la patience.
Nous tenons à remercier très chaleureusement toute l’équipe de LABORATOIRE
REGIONAL D'ANALYSES ET DE RECHERCHES DE MEKNES (LRARM)
pour son accueil plus que chaleureux, son aide et sa confiance.
Nous voudrions également adresser nos sincères remerciements à nos encadrants
à l’ONSSA de Meknès. Mme FADMA, à l’unité de Chimie Alimentaire pour
avoir encadré et dirigé ce travail avec une grande rigueur scientifique. Nous
remercions également Mme OUMAYMA, pour ses qualités humaines et ses
orientations. Nous vous remercions de votre disponibilité, vos conseils et la
confiance que vous nous avez accordés tout au long de mon stage.
Nous adressons nos remerciements aux membres de jury qui ont accepté
d’évaluer ce travail.

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 INTRODUCTION
Dans le cadre de notre première année de Technicien spécialisé en laboratoire agroalimentaire, nous avons
effectué un stage au LABORATOIRE REGIONAL D'ANALYSES ET DE RECHERCHES (LARARM) de
Meknès du 25 septembre 2018 à 24 novembre 2018.
Dans le but de se familiariser avec l’univers professionnel et d’y mettre en application notre connaissances et
prendre des contacts pour se constituer notre réseau professionnel. Nous avons effectué ce stage au sein du
laboratoire régional d’analyse et de recherches à l’ONSSA qui est reconnu sur le plan national et même
international pour la prestation de ses services dans le domaine du contrôle de qualité des produits
alimentaires. C’est donc la raison pour laquelle mon choix s’est porté sur ce laboratoire.
Ce stage a donc été pour nos l’opportunité d’appréhender quelques causes d’intoxication alimentaires, de
comprendre davantage le lien étroit qui existe entre la composition microbiologique d’un aliment et sa
qualité, aussi bien nutritionnelle que sanitaire.
Après notre intégration rapide dans le service, nous avons eu l’occasion de réaliser plusieurs t âches qui ont
constitué une mission de stage globale. Chacune de ces tâches est utile et indispensable à l’établissement du
critère de qualité de certains aliments.
Le stage se déroule au sein de l’unité de Chimie et Microbiologie alimentaire, il consistait essentiellement à
faire des analyses physico-chimiques et microbiologique sur différents produits alimentaires que nous
recevions selon les demandes d’analyses formulées par les particuliers, nous devrions leur fournir les
résultats d’analyses attendues, en se servant des outils requis pour chaque type d’échantillon.
 Les objectifs de stage
Le stage est une étape essentielle de notre parcours de formation, il nous permet de se familiariser avec
l’organisation du laboratoire, d’exécuter des analyses et d’en interpréter les résultats, conformément aux
règles d’hygiène, de santé et de sécurité.
De ce fait, le stage vise principalement les six objectifs suivants :
- Découvrir et confronter le monde professionnel exerçant dans des laboratoires d’analyse en
agroalimentaire et de s’adapter à ses exigences.
- Se familiarisation avec l’organisation générale du laboratoire (les locaux, le personnel, le processus
d’hygiène et de sécurité). Ceci regroupe la réalisation ou la réception du prélèvement,
l’enregistrement des dossiers, les étapes de la réalisation technique des analyses et les démarches de
sécurité, d’hygiène et de qualité mises en œuvre tout au long du cheminement.
- Appliquer dans des situations concrètes les lois, règlements et normes régissant la profession ;
- Mettre en pratique des connaissances acquises lors de votre formation et de les approfondir ;

6
 - Reconnaitre les principales analyses effectuées en identifiant les techniques, les équipements et le
matériel utilisés ;
- Réaliser les analyses physicochimiques et microbiologiques courantes et interpréter les résultats ;
 Apprentissage technique :
Préparation des milieux de culture.
Préparation des échantillons pour les analyses.
L’ensemencement.
Dilution
Décontamination et stérilisation.
Parallèle avec les bonnes pratiques d’hygiène.
Dosage
Mesurage

I. PRÉSENTATION DE LABORATOIRE
1. HISTORIQUE
Office National de Sécurité Sanitaire des Produits Alimentaires (ONSSA) est un établissement public doté de
la personnalité morale et de l’autonomie financière crée par la loi n° 25-08 et placé sous la tutelle de l’Etat. Il
exerce, pour le compte de l’Etat, les attributions relatives à la protection de la santé du consommateur et à la
préservation de la santé des animaux et des végétaux. Il est appelé à appliquer la politique du gouvernement
en matière de sécurité sanitaire des végétaux, des animaux et des produits alimentaires depuis les matières
premières jusqu’au consommateur final, y compris les aliments pour animaux.
L’ONSSA, dispositif institutionnel, a été créé pour appuyer les orientations stratégiques tracées par le Plan
Maroc Vert qui ambitionne de faire de l’agriculture un moteur de croissance essentiel dans l’économie
marocaine. L’une des composantes de cet ambitieux plan consiste à accompagner la profonde mutation que
connaît le système agro-alimentaire et à assurer la sécurité sanitaire des produits alimentaires afin de les
rendre plus compétitifs aussi bien sur le marché national qu’international. [1]
2. Organisation du laboratoire
L’organisation du laboratoire assure une indépendance opérationnelle des sections les unes par rapport aux
autres. Le laboratoire comporte la structure suivante :
Une section administrative et comptable
Une section de microbiologie alimentaire
Une section de chimie alimentaire
Une section de santé animale
Une section de biologie moléculaire [1]

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 3. Localisation

Figure1 : Emplacement de laboratoire de l’ONSSA

4. Organigramme de l’ONSSA

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 Figure2 : organigramme de l’ONSSA
5. Activité du laboratoire par section :
5.1. Activités en Chimie -Toxicologie :
Contrôle de la qualité chimique des aliments et recherche de la composition chimique des denrées
alimentaires (Laits et produits laitiers ; Viandes, produits carnés et produits de la pêche ; Conserves et semi-
conserves ; Eaux ; Aliments des animaux ; …..),[1]
5.2. Activités en Chimie -Toxicologie :
- Recherches et dénombrements des germes pour le contrôle microbiologique des aliments tels que Lait et
produits laitiers, les produits carnés, les produits de la pêche et de la pisciculture, ainsi que les analyses
bactériologiques des eaux utilisées dans l'industrie agro-alimentaire ou dans les élevages avicoles et
piscicoles,
- Plan de surveillance : Recherche des résidus dans les viandes ovines par l'activité antibactérienne selon la
méthode des 4 boites.

II. Les analyses physiquo-chimiques

1. Analyse de l’huile
1.1. Taux d’acidité
L’acidité est le pourcentage en poids d’acide oléique libre par rapport à la quantité totale d’huile.
Elle a été déterminée par la méthode suivante :
En effet, une prise de 10 g de chaque échantillon est additionnée à 150ml du mélange 50% éther 50%
éthanol. Est titrée par l’hydroxyde de Sodium (NaOH) 0,1 N. en présence de phénolphtaléine comme
indicateur.

M
m :: prise
massed’essai
molaire de l’acide oléique

9
 Figure3 : les étapes du test d’acidité
Résultat
Prise d’essai (g) Volume équivalent (ml) Taux d’acidité (%) Type d’huile
10 2.8 0.789 Extra-vierge
9.574 8.3 2.444 courant
5.018 1.45 0.814 Vierge

1.2. Indice de peroxyde (taux d’oxydation de l’huile)

L’indice de peroxyde est le nombre d’oxygène actif dans les chaines organiques d’un corps gras. Cet
oxygène actif peut être sous forme d’époxyde ou sous forme d’hydro peroxyde.

Plus l’indice de peroxyde est élevé plus la matière grasse est oxydée

Ve × N ×1000
I ( P)=
m

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Ve : volume d’équivalent
N: normalité de thiosulfate de sodium (0.01N)
m : prise d’essai

Mode opératoire
Dans un erlenmeyer on ajoute 2 à 5 g de l’huile d’olive plus 10 ml de chloroforme 99% avec 15 ml d’acide
acétique 100% et 1 ml de la solution d'iodure de potassium (KI) toujours on travaille sous la hotte ;
On met notre solution à l’obscurité pour le temps de réaction pendants 5 min.
Après on ajoute 75 ml d’eau distillée pour l’arrêt de la réaction ; on ajoutant l’empois d’amidon comme
indicateur coloré jusqu'à l’obtention une couleur noir.
Après on dose avec de thiosulfate de sodium (0.1N) jusqu'au le virage (une couleur blanche)

Figure4 : les étapes du test Indice de peroxyde

Remarque : la solution de KI avec de l’eau distillée doit être saturée.

11
Résultats
Prise d’essai (g) Volume équivalent (ml) Taux d’oxydation Nombre d’O2
(meq(O2)/Kg
2.050 1.6 7.804 Inferieur à 20
2.019 5.5 27.241 Supérieur à 20
2. ANALYSE DE LAIT
2.1. Humidité de lait
C’est la quantité de l’eau dans la poudre de lait, il est déterminé par séchage de la poudre de lait par étuvage
Avec
m1 masse avant étuvage : capsule vide + prise d’essai
m2 masse après étuvage
m : prise d’essai

Mode opératoire
Sur une balance analytique, peser 2 g de chaque échantillon (lait poudre) et mettre dans une étuve à 102°C
pendant 3h sans couvercle pour éviter le retour des gouttelettes de l’eau dans l’échantillon. Après on les met
Dans le dessiccateur qui contient un gel de dessiccation (pour l’absorption de l’humidité) jusqu'à le
refroidissement (peu près 30 min).
Les résultats de l’humidité sont exprimés selon la formule suivante :
H : Teneur en eau (humidité) exprimé en %.
m o : Masse de la prise d’essai en (g).
m 1 : Masse de la capsule additionnée à celle de la prise d’essai en (g).
m 2 : Masse totale après étuvage en (g).

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 Figure5 : les étapes de mesure de l’Humidité
Résultat
Echantillon avant l’étuvage Masse capsule vide (g) Echantillon après Taux d’humidité (%)
prise d’essai (g) l’étuvage (g)
2.028 16.803 18.799 1.578
2.005 16.594 18.155 2.144
2.040 18.648 20.652 1.765
2.062 16.638 18.648 2.521

2.2. Teneur en protéines (méthode de Kjeldhar)

La minéralisation est la transformation de l’azote organique en azote minérale
Réactifs
Lait en poudre ou liquide
Sulfate de cuivre (CuSO4) 5% (donne une coloration bleue)
Catalyse
Sulfate de potassium (K2SO4)
Acide sulfurique(H2SO4) 100% à manipuler avec précaution sous hotte
L’eau distillée
tashiro (Rouge de méthylène + vert de bromocrésol) indicateur coloré
Hydroxyde de sodium (NaOH) 40%
Acide borique (H3BO3 ) 4%
Matériels utilisés
La hotte
Minéralisateur

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Distillateur
Matras
Erlenmeyer
Balance
Burette
Agitateur
Pipette
Pipteur

Mode opératoire
Lait en poudre 1% et liquide
1 ère étape : minéralisation des protéines
On met notre échantillon (0.5 g lait poudre et +1g de sulfate de cuivre en poudre + 15 g de sulfate de
potassium) ou (10g du lait liquide + 5ml de sulfate de cuivre liquide+15 g de sulfate de potassium) dans les
matras et on rajoutant 25ml de l’acide sulfurique toujours sous la hotte , et avec précaution ! (acide ça
brule !)
On lance la minéralisation pendant 2 heures dans le minéralisateur
L’azote organique se transforme en NH4+
Appareil sous hotte avec aspiration des fumées soufrées
Après la minéralisation on laisse refroidir
On rajoute un peu d’eau distillé

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 Figure6 : les etapes de miniralisation des protéines

K2SO4 , CuSO4 /400°C- 500°C

2ème étape : distillation

Le minéralisât est placé dans le distillateur, à gauche et l’erlen avec l’acide borique et 2 gouttes de tashiro à droite .

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Une pression sur le bouton de NaOH pour leur libération , le minéralisât est passé de bleu au noir alors la soude
transforme de NH4+ en NH3 et le niveau de soude monté dans le matras.
Fin de l’injection de soude, le matras contient du NH3 après on commence la distillation
Dans laquelle la solution d’acide borique passe du rose à l'incolore (le NH3 passe du matras vers l’erlen grâce à la
vapeur bouillante puis au refroidissement du condensateur)

Figure7 : les étapes de distillation

Noté que l’acide borique capte le NH3 alors la formation du complexe NH4(H2BO3) dans l’erlenmeyer
NH3 + OH- NH3 + H2O
NH3 + H3BO3 NH4(H2BO3) complexes de dihodrogenoborate d’ammonium
3ème étape : dosage
Titrage de toute la solution par l’acide sulfurique (H2SO4 0.1N)
La couleur a virée au rose après l’introduction de Ve(H2SO4) c’est la quantité nécessaire pour casser tout le
complexe
On utilise de l’acide sulfurique que l’on ajoute goutte à goutte on règle l’agitation jusqu’à le point de virage
(l’indicateur coloré change de couleur )
4ème étape : calcule de la teneur en protéine
T(azote)=(Ve * 0.1N(H2SO4) *M(N2) )/prise d’essai

TENEUR EN PROTIENE = TENEUR EN AZOTE * 6.83

Résultat
échantillons Prise Volume Teneur en T en Résultats
d’essai (g) équivalent (ml) azote(%) protéine(%)
1022 E1 10.193 36.25 0.49 3.17 Entier
E2 10.272 30.75 0.42 2.67 Ecrémer

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 1023 E1 0.518 14.30 3.86 24.65 Entier
E2 0.536 15.05 3.93 25.07 Entier
Noté que :
Lait poudre
Entier : T en protéine entre 24-27%
Ecrémer : T en protéine inferieur à 1%
Lait liquide
Entier : T en protéine supérieur à 3%
Ecrémer : T en protéine inferieur à 1%
2.3. La matière grasse (méthode de GERBER)
La matière grasse dont la quantité varie en fonction des conditions d'élevage, est présente dans le lait sous forme de
globules gras émulsionnées dans la phase aqueuse. La matière grasse est constituée principalement de triglycérides
Le principe de cette technique consiste à la dissolution des protéines par addition d'acide sulfurique. La
séparation de la matière grasse du lait par l’action mécanique de la centrifugation dans un butyromètre est
favorisée par l'addition d'une quantité d'alcool iso-amylique.
Selon la teneur en matières grasses :

On peut distinguer trois types de laits dont les teneurs en matières grasses sont les suivantes :
Le lait entier qui contient au moins 3,5% de MG
Le lait demi-écrémé contenant au moins 1,5% et au plus 1,8% de MG
Le lait écrémé qui inferieur à 1 % de MG
La teneur en lipide
Matériels utiliser

Butyromètre
Balance
Centrifugeuse
Pipette de 1ml et 5 ml
Mode opératoire

Le lait est pesé dans un butyromètre, lait poudre (2.5 g de lait + 10 ml d’eau distillé tiède 65°C) et pour lait
liquide (11 ml directement) puis 10 ml de l’acide sulfurique Gerber et 1 ml de l’alcool iso-amylique. Le
butyromètre est fermé et agité puis centrifugé pendant 6 minutes, la lecture se fait sur le butyromètre. Le
résultat final en pourcentage.
Noté que :
H2SO4 pour casser la liaison entre les protéines et la matière grasse

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L’alcool isoamylique pour la séparation des protéines et la MG
Centrifugeuse pour l’apparition de cette séparation.

Figure8 : Les étapes du dosage la matière grasse

3. ANALYSE DE MIEL
3.1. TEST DE GLUCOSE SYNTHÉTIQUE
Sur une balance analytique peser 2 g de chaque échantillons (miel) à analyser dans un bicher et additionner à
2 g de l’eau distillée puis agiter la solution pour bien mélanger.
Dans un tube d’essai introduire 1 ml de solution préparée et ajouter 4 m de l’éthanol.

18
 Figure9 : les etapes du test de glucose synthétique pour de miel
Résultat
Observation s’il y a un précipité blanc ou non
Absence (glucose naturel)
Présence (glucose synthétique)
3.2. Teneur en sucre
Dans un bécher peser 1 g de miel + 100 ml d’eau ultra pur (peu à peu)
On ajoutant dans une Vial 2 ml de l’échantillon alors que la deuxième Vial d’HPLC est standard
Les deux Vial sont placer dans l’HPLC et on observe les résultats (PIC).

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 Figure 10: les etapes de mesure la teneurensucre pour le miel

4. Analyse de conserve de poisson

4.1. Teneur en histamine
Cette analyse consiste à déterminer le taux d’histamine contenu dans le poisson. En effet, l’histamine est un
médiateur chimique qui résulte de la décarboxylation de l’histidine (acide aminé naturellement présent dans
le poisson) par l’action des microorganismes. Cette histamine déjà présente même dans le poisson frais (en
très petite quantité) intervient dans certaines manifestations allergiques, lorsqu’elle atteint un certain seuil.
Par conséquent, l’histamine devient toxique. La formation d'histamine est très rapide lorsque les conditions
de température, de pH et de la salinité sont favorables.

Figure 11: Schéma simplifié de la réaction de formation de l'histamine

Dosage de l’histamine par spectrofluorimétrie dans le poisson.

20
Le principe du dosage de l'histamine consiste à solubiliser cette amine dans de l'acide trichloracétique (TCA)
suivie d'une séparation sur une colonne échangeuse d'ions. L'éluant obtenu est complexé avec
l'orthophtalaldéhyde (OPA) comme agent dérivatisant pour former un dérivé fluorophore (His-OPA),
facilement détectable par fluorimétrie.

Vérification des colonnes :

Étape 1 : purification
En prélève 0.2 ml de filtrat (SM : standard) et en complète avec 20 ml du tampon et introduire dans les 6
colonnes on purifie les colonnes par l’ajout du tampon 30 ml puis 30 ml, 100 ml de tampon

Figure 12 : les étapes de purification

Étape 2 : récupération
On ajoute dans les 6 colonnes 20ml de HCl (0.2N) pour casser la liaison entre la résine et l’histamine
(élution)
Étape 3 : complexassions
Dans un tube à essai introduire 2 ml d’éluât ajouter 1ml de NaOH (1N) et 0.1 ml de OPA (1%) on attendant
3min 30s pour le temps de réaction
Après pour arrêter la réaction on ajoute 2 ml HCl (0.7N)

21
 Figure 13 : les étapes de complexassions
Étape 4 : lecture
OPA est stable dans le milieu basique et n’est pas stable dans le milieu acide alors la lecture Doit s’effectuer
dans les 30 min suivant l’ajout de l’OPA.

Figure 14 : lecture de la fluorescence

Préparation de la solution tampon
27.2g du sodium acétate tri hydraté (C2H3NaO2, H2O) + 11.4 ml acide acétique + 2ml H2O

Préparation du Standard :

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La Solution mère d'histamine à 1 g/litre. Dans une fiole jaugée de 100ml on introduite 0.1 g d'histamine,
10mL d'HCl 0.1 N et compléter au trait de jauge avec H2O. Solution fille 20 mg/ml (20 ppm). Introduire 2 ml
de la solution mère dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait de jauge par TCA. Solution du
standard final. Prélève 0.2ml de la solution fille plus 20ml HCl 0.2 N.
Préparation d’OPA
Sur une balance analytique prélever 0,1 g de OPA à l’aide d’une pipette ajouter 10 ml de méthanol.

La solution préparée est sensible de la lumière c’est pour cela il est couvert par un papier aluminium.

5. ANALYSE DE L’EAU
5.1. Détermination du pH (par la méthode électrochimique)
5.2. Teneur en chlorures (méthode de Mohr)
Principe de la méthode de Mohr : Les chlorures sont dosés en milieu neutre par une solution titrée de nitrate
d’argent en présence de chromate de potassium servant d’indicateur. La fin de la réaction est indiquée par
l’apparition de la teinte rouge caractéristique du chromate d’argent.
Mode opératoire

100 ml d'échantillon sont introduits dans un erlenmeyer, sur la hotte ajouter quelque goute de d’acide
nitrique pour neutraliser le milieu, Pincée de carbonate de calcium CaCO3 (Pour le précipité). Mélanger,
Ajouter quelques gouttes de solution de chromate de potassium K2CrO4 10 % (indicateur de couleur jaune).
Titrer par nitrate d'argent AgNO3 (0.1 N) jusqu'à apparition de la couleur rouge.

Figure 15: les étapes de dosage de chlorure

L’équation de la réaction.

23
 Ag+(aq) + Cl-(aq) = AgCl(s)
2 Ag+(aq) + CrO42-(aq) = Ag2CrO4 (s)
On observe d’abord un précipité blanc de chlorure d’argent (précipité coloré en jaune dû aux ions CrO4) puis
un précipité rouge de chromate d’argent.

Le chlorure d’argent AgCl précipite avant le chromate d’argent Ag2CrO4 car le moins soluble précipite le
premier.

Les résultats sont exprimés selon la formule suivante :

Avec

T [Cl] : teneur en chlorure

Ve : volume d’équivalent

M : masse molaire de Cl- (35.5)

Résultat
Echantillon Volume d’équivalent Teneur en chlorure
E1 1.7 60.35
E2 1.75 62.125
Noté que
Selon les normes, la concentration de chlorure devrait être inférieure à 750 mg/L

Les analyse microbiologique

1.
Les prélèvements des échantillons alimentaires, sont analysés, le plus tôt possible, après leur réception au
laboratoire. L’analyse microbiologique des denrées alimentaires nécessite cinq étapes qui sont la pesée, la
dilution et l’agitation, l’isolement (ensemencement), l’incubation et le dénombrement, puis, l’identification
biochimique.

24
Pesage : Il faut disposer de 25 g de l’échantillon à analyser, pour la recherche de Salmonella, 25g de
l’échantillon à analyser, pour la recherche de Listeria monocytogenese et une quantité équivalente, pour
l’isolement et le dénombrement de tous les autres microorganismes recherchés selon les critères nationaux et
internationaux en vigueur.
Ajouter, aseptiquement, dans un sac en plastique stérile, 225 ml du milieu liquide électif dit Eau peptonée
Tamponnée (EPT), à l’unité d’analyse préalablement pesée.
Mélanger au Stomacher (agitateur), pendant 30s, jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène.

Dilution : Réalisation des dilutions décimales des

échantillons à analysés par Tryptone Sel (TS).

Les deux premières étapes (pesage et dilution) sont communes pour analyser tous les germes.

25
Ensemencement : Se réalise en profondeur puis couler par le milieu de culture spécifique au germe analysée
(lors de la recherche de salmonella ou listeria à l’étape d’isolement l’ensemencement effectuer par la
méthode des stries).
Incubation : Chaque germe analysé ou/et rechercher se caractérise par une température optimum
d’incubation.
Dénombrement : Contage des colonies entre 15 et 300.
 Expression des résultats
Il est impossible de compter une boite contenant plus de 300 colonies. Le risque d’erreur est top
important donc elles sont écartées. Les boites contenant moins de 15 colonies sont aussi écartées. Les
colonies sont trop rares et peuvent induire en erreur.
 La formule mathématique suivante peut être
utilisée.
Avec :
 N : nombre d’UFC par gramme ou par ml de produit
initial.
 ∑colonies
 : somme de colonies des boites interprétables.
 V ml : volume de solution déposée (1 ml).
 n1 : nombre de boites considéré à la première dilution
retenue.

26
  n2 : nombre de boite considéré à la seconde dilution retenue.
 d1 : facteur de la première dilution retenue.

Tableau 1 : les types des bactéries avec son condition pour la croissance

Bactérie Milieu de culture Température La durée

d’incubation d’incubation

FMAT PCA 30 °C 72H

CT VL 30 °C 24H

CF VL 44°C 24h

E.coli TBX 44 24H

Staph BP+ supplément RPF 37°C 48H

ASR TSC+ supplément 46°C 24h

Cyclocerine

Levures et moisissures EGA 25°C 5 jours

Entéro bactéries VG 37°C 24H

Listeria Palcam+ aloa 37°C 48H

Salmonella HEKT + XLD 37°C +41.5 24h

1.1. Recherche de la Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT)

1. Déposer, 1 ml de la suspension mère et/ou des dilutions décimales, dans une boîte de Pétri stérile.
2. Ajouter, par incorporation du milieu gélosé nutritif Plate Count Agar (PCA).
3. Mélanger l’inoculum au milieu et laisser se solidifier.

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4. Recouvrir, l’ensemble ainsi obtenu, d’une deuxième couche dite protectrice du milieu gélosé nutritif Plate
Count Agar (PCA).
5. Laisser se solidifier.
6. Incuber, l’ensemble ainsi préparé, à 30°C±1°C, durant 24 Heures à 72 Heures.
7. Dénombrer les colonies petites et blanches caractéristiques de la Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT).
8. Exprimer les résultats en UFC/25g.

1.2. Recherche de la Flore Fongique (FF) ou levures et moisissures

1. Déposer, 1 ml de la suspension mère et/ou des dilutions décimales, dans une boîte de Pétri stérile
contenant du milieu OGA préalablement coulé.
2. Ensemencer, par épuisement, à la surface du milieu OGA.
3. Incuber, l’ensemble ainsi préparé, à 25°C±1°C, durant 24 Heures à 72 Heures.
4. Dénombrer les colonies petites et blanchâtres caractéristiques de la Flore Fongique (FF).
5. Exprimer les résultats en UFC/25g.

28
 1.3. Recherche des coliformes totaux et des coliformes fécaux
1. Déposer, 1 ml de la suspension mère et/ou des dilutions décimales, dans deux boîtes de Pétri stériles.
2. Ajouter, par incorporation, du milieu gélosé sélectif Désoxycholate 1‰ ou Bouillon lactosébilié au vert
brillant+ cloche (VRBL).
3. Mélanger l’inoculum au milieu et le laisse solidifier.
4. Recouvrir, l’ensemble ainsi obtenu, d’une deuxième couche protectrice de milieu gélosé VRBL.
5. Laisser se solidifier.
6. Incuber, une boîte, à 30°C±1°C, pour les Coliformes Totaux et une boîte à 44°C±0,5°C pour les
Coliformes Fécaux, durant 24 Heures à 48 Heures.
7. Dénombrer les colonies rouge brique caractéristiques des Coliformes Totaux et des Coliformes Fécaux sur
le milieu gélosé sélectif.
8. Exprimer les résultats en UFC/25g.

1.4. Recherche d’E. Coli

1. Déposer, 1 ml de la suspension mère et/ou des dilutions décimales, dans une boîte de Pétri stérile est après
coulé par milieu de culture gélosé TBX.
2. Incuber, l’ensemble ainsi préparé, à 44°C±1°C, durant 24 Heures à 72 Heures.
3. Dénombrer les colonies petites d’E. Coli sur le milieu TBX.
4. Exprimer les résultats en UFC/25g

1.5. Recherche des anaérobies sulfito-réducteurs

1. Transférer, 1 ml de la suspension mère et/ou des dilutions décimales, dans une boîte de Pétri stérile
contenant du milieu gélosé Tryptone-Sulfite-Cyclosérine (TSC)
2. Incuber, à 46,0°C±1°C, pendant 24 Heures.

29
3. Dénombrer les colonies noires caractéristiques des anaérobies sulfitoréducteurs sur le milieu gélosé
sélectif TSC.
4. Exprimer les résultats en UFC.g-1. 25

Colonie noir

1.6. Recherche de Staphylococcus aureus

 Isolement et Dénombrement
1. Ensemencer en profondeur, 1 ml de la suspension mère et/ou des dilutions décimales, avec milieu gélosé
sélectif Baird Parker (BP+ supplément RPF).
2. Incuber, la ou les boîtes ainsi préparées, à 36°C±1°C, pendant 24 Heures à 48 Heures.
3. Dénombrer les colonies noires, brillantes, entourées d’un halo clair, présomptives de Staphylococcus
aureus sur le milieu gélosé sélectif Baird Parker.
4. Exprime les résultats en UFC/25g.

30
 Colonie noir entourée
un halo clair

1.7. Recherche de Salmonella

Depuis de nombreuses années, Salmonella constitue la cause majeure des infections du tractus digestif
humain, liées à la consommation de denrées alimentaires d’origine animales.
La recherche de Salmonella, à partir des aliments, nécessite quatre étapes obligatoires qui sont le pré-
enrichissement, l’enrichissement, l’isolement et l’identification biochimique et sérologique.
 Pré-enrichissement
Comme tous les analyses cette étapes de pré-enrichissement consiste a réalisé un pesage et une série de
dilution décimales après incubation à 37°C±1°C, pendant 24 Heures.
 Enrichissement
1. Transférer, à l’aide d’une pipette stérile, 0,1 ml du milieu liquide pré-enrichi dans 10 ml de milieu liquide
sélectif Rappaport-Vassiliadis (RV) et 1ml dans 10ml de milieu liquide sélectif MKTTn (bouillon de müller-
kauffmann au tétra-thionate-novobiocine)+0.2 mliodine+0.1 ml de Novobiocine.
2. Incuber, l’ensemble ainsi préparé, à 41,5°C±1°C pour RV et 37°C±1 pour MKTTn, pendant 18 Heures à 24
Heures.

31
 Rappaport -Vassiliadis (RV)

MKTTn

 Isolement sélectif
1. Ensemencer, à l’aide d’une anse on utilisant la méthode des stries une petite culture des deux milieux
liquide enrichi,chacune sur un milieu gélosé sélectif Hektoen et un milieu XLD(Xylose-Lysine-
Désoxycholate).
2. Incuber, l’ensemble ainsi préparé, à 37°C±1°C, pendant 24 Heures.
Les colonies caractéristiques de Salmonella sur le milieu gélosé sélectif Hektoen sont de couleur bleu vert
(non utilisation du saccharose) avec (production de sulfure de fer) ou sans (absence de production de sulfure
de fer) centre noir, et sur l’autre milieu XLD sont des colonies rouges avec un précipité noir de sulfure de fer
(souche H2S +) au centre.

1.8. Recherche de Listeria monocytogenes

32
Le genre Listeria regroupe des bactéries qui ont en commun les caractères suivants : bacilles gram +,en
palissade, oxydase -, catalase + ; aéro-anaérobies ; fermentant le glucose ; esculine + ; halophiles ;
auxotrophes pour de nombreux facteurs de croissance ; mobiles a 30-35°C ; non sporulées.
Les Listeria sont responsables de TIAC, le nombre de cas de listériose est relativement faible car seuls des
individus immunodéprimés et les femmes enceintes sont touches. Par contre, les troubles peuvent être
morbides.
Or, cette bactérie étant ubiquitaire, on la retrouve en faible quantité mais dans un très grand nombre
d'aliments. La recherche de Listeria monocytogenes nécessite quatre étapes obligatoires qui sont le pré
enrichissement, l’enrichissement, l’isolement et l’identification biochimique et sérologique.

 Pré-enrichissement
1. Prélever, aseptiquement 25g de l’échantillon à analyser.
2. Ajouter, aseptiquement, dans un sac en plastique stérile, 225 ml du milieu liquide sélectif dit Fraser-Demi,
à l’unité d’analyse préalablement pesée.
3. Mélanger au Stomacher (agitateur), pendant 30s, jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène.
4. Incuber, l’ensemble ainsi préparé, à 30°C±1°C, pendant 24 Heures.
 Enrichissement
1. Transférer, à l’aide d’une pipette stérile, 0,1 ml du milieu liquide pré-enrichissement dans 10 ml de milieu
liquide sélectif dit Fraser on ajoutant 0.1 ml de supplément Feric ammonium.
2. Incuber, l’ensemble ainsi préparé, à 37,0°C±1°C, pendant 48 Heures.
 Isolement Sélectif
<1. Ensemencer, à l’aide d’une anse on utilisant la méthode des strie un petit inoculum du milieu liquide
d’enrichissement, sur un milieu gélosé sélectif dit Palcam et un milieu gélosé sélectif dit Aloa.
2. Incuber, les deux boîtes ainsi préparées, à 37°C±1°C, pendant 24 Heures à cinq jours.

33
Les colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes sur le milieu gélosé sélectif Palcam sont noires et
incurvées et les colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes sur le milieu gélosé sélectif Aloa sur ce
milieu, les Listeria forment des colonies rondes, régulières, de couleur bleue à bleu vert (détection de la bêta-
glucosidase grâce à un substrat chromo-génique spécifique).
Les colonies de Listeria monocytogenes présentent en plus un halo opaque qui permet de les différencier
aisément des autres espèces de Listeria. Ce halo est lié à l'activité d'une phospholipase impliquée dans le
processus infectieux de cette bactérie. La sélectivité est obtenue par l'action combinée du chlorure de lithium
et des antibiotiques et antifongiques contenus dans le milieu.

34
Tableau 2 : Le matériel du laboratoire de microbiologie et leurs utilisations

Type du materiel Son utilisation

La hotte Stérilisation d’environnement
Réfrigérateur Refroidissement
Congélateur Congélation
Etuve Incubation et stérilisation
Bain marrie Solubilité
Autoclave Stérilisation
Balance Pour déterminer le poids
PH mètre Pour déterminer puissance hydrogène
Bec bunsen La stérilisation
Stromacher Malaxeur
Vortex Mélange des tubes
Agitateur magnétique Mélangeur
Microscope Identification
Les verreries : Pour les échantillons
-Les flacons
-Les tubes
-Les pipettes …

b-Hygiène. Santé et sécurité en milieu de travail

Tableau 3:Description de la démarche de prévention des risques professionnels
Comment (pour assurer l’hygiène, la santé et
Principales tâches sécurité de manipulateur)

35
 1- lavage des mains Utiliser HYGM, délivré par le distributeur, prendre un
peu du produit puis frotter
soigneusement les mains, puis rincer à l’eau, pour
2- port des blouses - Mettre les blousses propres destinées pour les
zones « propres» et lessabots.
- Mettre les blousses destinées pour les zones «
sales » et lessabots.
3- Disinfection surface de travail Ecarter tout produit alimentaire. Pulvériserle produit
LUFRA sur la surface, laisse agir 5 min;
Essayer avec du papier jetable, ‘en cas de fortes
salissures prélaver la surface avec un chiffon + DETD
dilué à 3%).
En plus, pour la hotte, allumer les U.V pendant 15
min.
4- Mettre la charmotte et les gants Couvrir toute la chevelure
5- Enlever la blouse, charlotte, sabot Remettre blouse et sabot dans leur endroit réservé

Tableau 4 : Evaluation de la gestion des risques

Questions relatives à la gestion des risques Oui non Observation
professionnels et
commentaire
Les dangers sont-ils clairement identifiés par des 
panneaux d’avertissement ?
Les salaries sont-ils informés des dangers des 
produits utilisés ?
Les manipulateurs sont-ils équipés des 
équipements de protection individuelle ?
Existe-t-il des équipements des protections
collectives ? 

Le matériel et équipements de travail sont-ils 

munis des dispositifs de sécurité ?
Existe-il un responsable de secours sur le lieu de 
travail ?

36
 Les instructions en cas d’accident ou d’urgence 
sont-elles clairement comprises pour le
personnel ?
Existe-il des procédures relatives en cas  Cela dépend
d’urgence et /ou accidents ? de la
personne,
mais est
souvent une
bonne
compréhensio
n des
instructions
d’urgence
Les trousses de premiers soins de secours sont- 
elles disponibles ?
Existe –t-il des bacs par catégories des déchets ? 

c-traitement des déchets

Au L.R.A.R., il y a une personne spéciale de traitement des déchets pour se débarrasser d’eux et ne
sont pas dangereux au environnement :

0Au la salle de décontamination en mettons les déchets et les matériels Ce qui a travaillé au
l’autoclave pendent 45 min au 121°C pour éliminer sur les micro-organismes.

37
 Conclusion
Nous avons effectué notre stage à unité de chimie alimentaire dont nous avons apte
des techniques d’analyses et contrôle de qualité des aliments ainsi que l’eau au sein
du laboratoire ONSSA.
Lors de ce stage, nous avons beaucoup appris. Nous avons pu mettre en pratique
notre connaissances théorique acquises durant notre formation, notamment celles des
bonnes pratiques de laboratoire, des différentes méthodes d’analyses physico-
chimique, en plus avec notre notion de certification, nous nous somme confronter aux
exigences réelles du monde du travail et de tout ce qu’un service de qualité peut
impliquer.
Au-delà d’enrichir notre connaissance théorique ce stage nous a donné l’occasion de
nos exercer davantage sur le plan des analyses chimique qui se font au laboratoire. Il
a été une expérience particulièrement enrichissante pour nous. Et cette expérience
nous a permis d’apprécier et d’être fière de la formation que nous avons reçue.
Désormais lorsqu’on nous demandera comment peut-on vérifier la qualité des denrées
alimentaires, du lait, du poisson, de l’eau ou encore de la viande, nous serions
répondues convenablement en faisant recours à cette première expérience
professionnelle.
Nous pensons que cette expérience en laboratoire nous a offert une bonne préparation
à ma future insertion professionnelle car elle fut pour nous un apprentissage
enrichissant et pratiquement complet qui conforte notre désir d’exercer nos futurs
métiers.

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