CM3 M1 Techpurif

M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
III – Techniques de Purification et d’Analyse

A - Solubilisation – extraction des protéines
B - Précipitation différentielle
1 - précipitation isoélectrique
2 - précipitation par des sels
C - Techniques chromatographiques
1 - échange d’ions
2 - exclusion / diffusion
3 - affinité
D - Techniques électrophorétiques
1 - électrophorèse sur papier
2 - électrophorèse sur gel de polyacrylamide
E - Technique immunoenzymatiques
Les hétéro molécules
Introduction
• Les extraits biologiques sont des ensembles complexes

comprenant souvent des dizaines de milliers de biomolécules
différentes, chacune en proportions extrêmement variables, allant de
109 à 1023 exemplaires.
• Si on considère les biomolécules sur un plan qualitatif, elles

présentent des propriétés physico-chimiques variables :
 solubilité
 polarité (hydrophobicité / hydrophilie)
 charge électrique
 taille
 capacité à lier un ligand
Les hétéro molécules
Introduction
• Certaines de techniques ne sont employées que pour la purification des protéines,

d’autres sont également applicables à la purification des oligo/polysaccharides ou
des acides nucléiques.
• Concernant les lipides, les techniques de séparation en phase directe ou en phase

inverse, sont privilégiées.
• La purification d’une biomolécule s’effectue en 3 phases :

1 - préparation d’un extrait brut ;
2 - enrichissement de la fraction biologique ;
3 - purification finale.
• Les protéines hydrosolubles sont généralement obtenues :

- à partir d’un liquide physiologique (sérum, lait, …) pour les protéines sécrétées
- après lyse des cellules pour les protéines intracellulaires
• Les membranes biologiques sont habituellement déstructurées grâce à des

techniques :
- mécaniques (broyage par exemple)
- physiques (sonication par ultrasons-microcavitation)
- physico-chimique (détergents par exemple)
• Pour les protéines membranaires, un détergent permet leur solubilisation :

- évite la perte de structure 3D (dénaturation),
- empêche l’agrégation.
Maintien du détergent pendant toutes les étapes de la purification.
Après solubilisation, on obtient un extrait brut.

B - Précipitation différentielle des protéines

1 - Précipitation isoélectrique
Une étape intermédiaire d’enrichissement par précipitation permet

souvent d’éliminer de nombreux contaminants contenus dans l’extrait.
Le pH de l’extrait brut est amené à la valeur du point isoélectrique ou pI de la protéine
d’intérêt :
la charge globale de la protéine étant nulle
 peu ou pas de répulsion électrostatique entre les molécules
 agrégation puis la précipitation des agrégats.
Récupération de la protéine précipitée par centrifugation.

Resolubilisation dans une solution tampon au pH adéquat. On obtient un extrait enrichi.
On obtient un extrait enrichi.

B - Précipitation différentielle des protéines

2 - Précipitation par des sels
Des concentrations croissantes en sels (généralement le sulfate
d’ammonium), sont ajoutées jusqu’à obtenir la précipitation de la protéine
d’intérêt ou celles des protéines contaminantes :
• le sel piège l’eau  précipitation des protéines.

Toutes les protéines ne précipitent pas pour des concentrations
équivalentes en sels.
• plus la solubilité d’une protéine dans l’eau sera importante, plus la

concentration en sels qu’il faudra ajouter pour obtenir sa précipitation sera
élevée.
• les petites protéines sont généralement plus solubles que les grosses.
Avant purification Après purification
extrait enrichi biomolécule pure

Technique inventée en 1905 par un botaniste russe pour séparer

les pigments présents dans les feuilles des plantes.
Mikhail Tswett
1872-1919
En chromatographie, les constituants d'un mélange se partagent entre 2 phases :

une phase mobile et une phase stationnaire.
Les différences entre les diverses chromatographies viennent de la nature des phases
fixes et mobiles.
• Le support (ou matrice) utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de
résine : très petites billes sphériques ou, plus rarement, de forme irrégulière (diamètre
quelques micromètres)
• Ces billes sont des polymères de différents types de molécules comme par exemple :
- de styrène-divinylbenzène pour certaines résines d'échange d'ions
- de polyholosides pour les gels de tamisage moléculaire
- de silice pour la chromatographie en phase inverse
• Différents traitements ou modifications chimiques de ces résines permettent d'obtenir

divers types de phases stationnaires.
colonne
88% 02.00
12% 02.00 A 0.255

pH 7.790
pompes injecteur détecteur collecteur

1 – échange d’ions
Les échangeurs d'ions sont des macromolécules insolubles portant d’innombrables
groupements ionisables :
+ +
+ ++ + +
+ + +
+ + +
+ + + + + C2 H5
++ +
+ + + ++ +
+
+ + + + + + +
+ + + + + N C2 H5 C=O
+ + ++
+ + + + + ++ O-
+ + ++ C2 H5
+ + + +
+ + + + +
triéthylammonium carboxylate
échangeur d’anions échangeur de cations
Ils peuvent échanger, de façon réversible, les ions qui leur sont liés au contact d'autres ions
provenant d'une solution éluante.
charge lavage
- -
- + +-+ + -
- + +- + -
+ + +
+ + - -
+ + - -
+ +
-
F
L
+ + F
L
+ ++
- -
F
L
+ + + +
U U + U
X X X
+
- -
+ + + +
D D D
E E + E
-
+
+ ++ + ++
T T + + T
A A A
M M M
P P P
+ + + +
O O - O
N N + N
+ + + +
+ -
+ + + + +
+
+
élution
L’élution se réalise :
- via une augmentation de la concentration en sels :
+ +
+ + Exemple : si [NaCl] augmente dans la colonne, les charges + du Na entrent
+
F
L
+ +
U
X
en compétition avec celles des groupements chimiques de la résine et les
charges – du Cl entrent en compétition avec celles de la molécule verte.
+ +
D
E
+
T
+ +
A
M
P
+ +
O
N
- via une variation de pH du tampon d’élution :
+ + Exemple : si le pH diminue, la charge de la molécule va passer de négative à
+ + neutre puis positive.
 La molécule va se détacher du support immobile, elle est éluée.
--
-
--
-
- -
- -
-
élution chromatogramme
Dépôt échantillon protéique
Lavage avec tampon de dépôt
+ + Tampon à pH faible
+ + Absorbance 280 nm
pH dans la colonne
+
F
L
+ +
U
X
+ +
D
E
+
T
+ +
A
M
P
+ +
O
N
+ +
+ +
--
-
--
- -
- Volume élution
- -
-
élution chromatogramme
Dépôt échantillon protéique
Lavage avec tampon de dépôt
+ + Tampon à pH faible
+ + Absorbance 280 nm
pH dans la colonne
+
F
L
+ +
U
X
+ +
D
E
+
T
+ +
A
M
P
+ +
O
N
+ +
+ +
--
-
--
- Volume élution
- -
- -
-
2 – exclusion diffusion
Elle permet de séparer les molécules en fonction de leur taille et donc (en approximation)
en fonction de leur poids moléculaire.
50 µm
La filtration s’effectue sur gel de dextrane (polymère de

sucres) de haut poids moléculaire (Sephadex,
Sepharose…) :
après traitement chimique, ces macromolécules forment
des réseaux poreux à 3 dimensions.
Les substances dont le poids moléculaire (donc la taille)
dépasse le diamètre des pores (« limite du gel ») sont exclues
du réseau :
du réseau :
 elles n’ont accès qu’au volume de solvant extérieur aux

billes du gel et sortent les premières de la colonne.
du réseau :
 elles n’ont accès qu’au volume de solvant extérieur aux

billes du gel et sortent les premières de la colonne.
Les molécules de taille plus petite pénètrent aussi dans le réseau

3D des billes de Sephadex :
 elles ont accès à un plus grand volume dans la colonne et

nécessitent un volume de tampon plus important pour les
faire sortir.
F
L
U
X
D
E
T
A
M
P
O
N
chromatogramme
F
L Absorbance 280 nm
U
X
D
E
T
A
M
P
O
N
Volume élution
chromatogramme
F
L Absorbance 280 nm
U
X
D
E
T
A
M
P
O
N
Volume élution
Cette technique permet de séparer des molécules selon leur taille et leur forme
en solution.
Une estimation de la masse molaire des molécules séparées est possible

 calibration de la colonne par des molécules de masses molaires connues.
Le paramètre expérimental à déterminer :

 constante de volume de colonne accessible de la molécule.
Vt = Σ volume des billes + volume extérieur aux billes

Vt = volume d’élution d’une molécule de très faible masse molaire (100 Da)
H
D Vt = H x p ( D )2
2
V0 = volume d’élution d’une molécule exclue = volume extérieur aux billes

= Vt – volume des billes
Ve = volume d’élution d’une molécule X = V0 + volume des billes traversées

Ve - V0
Kav =
Vt - V0
+ Ve tendra vers Vt
+ la molécule est petite
+ le volume des billes traversées Kav1
Kav = constante de volume accessible estimer la MM d’une protéine inconnue
(fraction des billes accessible aux molécules)

1 Kav
Mélange injecté (témoins)

NOM kDa
aprotinine
Aprotinine 6,5 ribonucléase

Ribonucléase 13,7
anhydrase carbonique
Anhydrase carbonique 29 0,5
Ovalbumine 43
Conalbumine 75 ovalbumine
Chlorure de cobalt 0,238
Bleu dextran 2000 2000
conalbumine
• MM connue
• Kav calculé
logMM
0
2 3 4 5 6
3 – affinité
• Ce type de chromatographie met à profit l’affinité de la molécule à purifier pour une
seconde molécule (appelée ligand) fixée sur la phase stationnaire :
enzyme/substrat ou enzyme/cofacteur
antigène/anticorps
glycoprotéine/lectine
hormone/récepteur.
• 1ère étape : fixer de façon covalente le ligand sur la phase stationnaire

(utilisation d’un groupement chimique réactif).
• L’élution se fait grâce à un excès libre de ligand, un saut de pH ou une

augmentation de la force ionique de la phase mobile.
3 – affinité
La fixation du ligand sur la résine se fait via un

bras chimique appelé espaceur.
La molécule qui a de l’affinité pour le ligand

se fixe alors que les autres molécules du
mélange traversent la colonne.
3 – affinité
CHARGE
3 – affinité
CHARGE
3 – affinité
LAVAGE
3 – affinité
ligand libre
ELUTION
3 – affinité
ligand libre
ELUTION
3 – affinité
chromatogramme
Dépôt échantillon
Concentration en ligand libre

F
L Lavage avec tampon
U
X
Absorbance 280 nm
D
E
T
A
M
P
O
N
Tampon avec
ligand libre
Volume élution
3 – affinité
chromatogramme
Dépôt échantillon
Concentration en ligand libre

F
L Lavage avec tampon
U
X
Absorbance 280 nm
D
E
T
A
M
P
O
N
Tampon
+
ligand libre
Volume élution
1 – électrophorèse sur papier
Trempage tampon de migration

aspartate
Migration sous champs électrique
glycine
dépôt
Essorage tampon de migration

lysine
-
Fixation sur support Mise en place dans la cuve Tampon de migration pH 6,25
2 – électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
L’acrylamide est une petite molécule
acrylamide
L’acrylamide est une petite molécule qui peut former un polymère

réticulé dans certaines conditions et en présence de méthylène bisacrylamide.
acrylamide
méthylène bisacrylamide
Acrylamide et méthylène bisacrylamide, en présence de 2 autres molécules

(catalyseurs) vont former un gel composé d’un réseau de mailles :
acrylamide
méthylène
bisacrylamide
polyacrylamide
Le gel d’acrylamide
polymérise entre
Acrylamide/bisacrylamide 2 plaques de verre
Tampon Tris pH6,8 ou 8,8
SDS
Persulfate d’ammonium
TEMED
« peigne à 10 dents »
Gel de concentration
pH 6,8
Espaceurs
Gel de résolution
pH 8,8 Plaques de verre
Préparation des échantillons protéiques

Les protéines sont incubées en présence de :
- détergent anionique (SDS : sodium dodécyl sulfate)
CH2-SH
- agent réducteur (b mercaptoéthanol) : rompt les ponts disulfure
CH2-OH - tampon de haute densité (glycérol) / colorant bleu.
- 5 minutes à 100°C.
Partie chargée négativement
O
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-S-O- + Na
O
Partie hydrophobe
Les protéines sont « nappées » de SDS et ont un rapport masse/charge négative

constant.
protéine
SDS
échantillon protéique dans un

milieu dense (exemple :
glycérol)
+
Après dépôt des protéines, le gel est mis sous tension.
La migration se fait dans un tampon Tris, glycine, SDS à pH 8,3.

COLORATION
- Bleu de Coomassie
Limite de détection : 0,1 μg
bleu de Coomassie
Bain colorant - Nitrate d’argent

Limite de détection : 10 ng
COLORATION
- Bleu de Coomassie
Limite de détection : 0,1 μg
bleu de Coomassie
Bain décolorant - Nitrate d’argent

Limite de détection : 10 ng
Estimation de la masse moléculaire des protéines : précision 5-10%
électrophorèse SDS-PAGE
Marqueurs (masses
connues)
E - Techniques immunoenzymatiques
1- Western Blot
1ère étape
Gel polyacrylamide
Seringue
Tampon Tampon dépôt
anode cathode
Compartiment
électrode (-)
échantillon
Anode (+) Cathode (-)
Réservoir Générateur électrique

Protéines
séparées
Tampon
transfert
2ème étape
Cathode (-)
Générateur électrique
Trempage
Mise en place
filtres et membrane
sandwich transfert
Papier filtre
Transfert
Gel
Membrane de nitrocellulose Empreinte
Papier filtre
Anode (+) Protéines séparées sur

membrane
Adapté de Bensaccount at English Wikipedia, CC BY 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=11468345

1- Western Blot
Dilution
3ème étape Dilution d’anticorps
d’anticorps secondaire
primaire couplé à la HRP
Tampon Tampon de Tampon de Tampon de

blocage lavage lavage lavage
Protéines
séparées sur
membrane
Incubation à 4°C Incubation à T°

ambiante Membrane
prête à la
révélation,
1- Western Blot
NH2 O NH2 O
Luminol NH NH
Luminol
NH NH
O O
4ème étape
HRP Peroxydase HRP

Lumière Lumière
Anticorps II Anticorps II
Anticorps I Protéine cible

1- Western Blot
Bcl-2
2- ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) est très utilisée en laboratoire.
2- ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) est très utilisée en laboratoire.
3
2
1

CM3 M1 Techpurif

Transféré par

Informations du documentcliquez pour développer les informations du document

Informations du documentcliquez pour développer les informations du document

Droits d'auteur :

Formats disponibles

CM3 M1 Techpurif

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

CM3 M1 Techpurif

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical

III – Techniques de Purification et d’Analyse

• Les extraits biologiques sont des ensembles complexes

• Si on considère les biomolécules sur un plan qualitatif, elles

• Certaines de techniques ne sont employées que pour la purification des protéines,

• Concernant les lipides, les techniques de séparation en phase directe ou en phase

• La purification d’une biomolécule s’effectue en 3 phases :

A - Solubilisation – extraction des protéines

• Les protéines hydrosolubles sont généralement obtenues :

• Les membranes biologiques sont habituellement déstructurées grâce à des

A - Solubilisation – extraction des protéines

• Pour les protéines membranaires, un détergent permet leur solubilisation :

Maintien du détergent pendant toutes les étapes de la purification.

Après solubilisation, on obtient un extrait brut.

B - Précipitation différentielle des protéines

Une étape intermédiaire d’enrichissement par précipitation permet

Récupération de la protéine précipitée par centrifugation.

On obtient un extrait enrichi.

B - Précipitation différentielle des protéines

• le sel piège l’eau  précipitation des protéines.

• plus la solubilité d’une protéine dans l’eau sera importante, plus la

Avant purification Après purification

extrait enrichi biomolécule pure

Technique inventée en 1905 par un botaniste russe pour séparer

En chromatographie, les constituants d'un mélange se partagent entre 2 phases :

• Différents traitements ou modifications chimiques de ces résines permettent d'obtenir

12% 02.00 A 0.255

pompes injecteur détecteur collecteur

La filtration s’effectue sur gel de dextrane (polymère de

 elles n’ont accès qu’au volume de solvant extérieur aux

 elles n’ont accès qu’au volume de solvant extérieur aux

Les molécules de taille plus petite pénètrent aussi dans le réseau

 elles ont accès à un plus grand volume dans la colonne et

Une estimation de la masse molaire des molécules séparées est possible

Le paramètre expérimental à déterminer :

Vt = Σ volume des billes + volume extérieur aux billes

V0 = volume d’élution d’une molécule exclue = volume extérieur aux billes

Ve = volume d’élution d’une molécule X = V0 + volume des billes traversées

(fraction des billes accessible aux molécules)

Mélange injecté (témoins)

Aprotinine 6,5 ribonucléase

• 1ère étape : fixer de façon covalente le ligand sur la phase stationnaire

• L’élution se fait grâce à un excès libre de ligand, un saut de pH ou une

La fixation du ligand sur la résine se fait via un

La molécule qui a de l’affinité pour le ligand

Concentration en ligand libre

Concentration en ligand libre

Trempage tampon de migration

Essorage tampon de migration

L’acrylamide est une petite molécule

L’acrylamide est une petite molécule qui peut former un polymère

Acrylamide et méthylène bisacrylamide, en présence de 2 autres molécules

Préparation des échantillons protéiques

Les protéines sont « nappées » de SDS et ont un rapport masse/charge négative

échantillon protéique dans un

La migration se fait dans un tampon Tris, glycine, SDS à pH 8,3.

Bain colorant - Nitrate d’argent