Cours 2
Cours 2
Cours 2
Nathalie Demont-Caulet
Université Paris 7 – Denis Diderot
UMR Ecosys- INRA Versailles
Nathalie.Demont-Caulet@versailles.inra.fr
Meilleure compréhension:
– Propriétés fonctionnelles
– Impact des mutations
– Rôle des AA dans les interactions
1
Comment obtenir des données
structurales
Absorbance, fluorescence,
dichroïsme circulaire
Spectrophotométrie / Spectrofluorométrie
Applications
Ä Analyse quantitative (identification et concentration)
Ä Modifications structurales (changement de conformation,
liaison de ligands…)
2
Propriétés de la matière et états électroniques (exemple H2)
Energie
e- liaison Nuage
Etat excité électronique
a b
Fondamental
Niveaux
vibrationnels Rotationnels dab
dab
Orbitale
E Orbitale antiliante
antiliante
σ*1S
1SA 1SB 1SA 1SB
Interaction rayonnement
- matière
Rayonnement λ E (kJ)
Rayons X, γ
< 100 nm >1190
λ du
domaine
visible
3
I0 intensité incidente,
I intensité transmise
I0, λ0 I
N et n nombre de photon
N
n Si la solution « absorbe », n < N
Log (I0/I) = DO (Densité Optique)
DO sans unité
C en M ε
λ en M -1.cm-1 Coefficient
d’extinction molaire
l en cm
DO
Détermination expérimentale de εM
⇒ DO ∝ C tant que C < Clim
ε
Clim C
ε λ en M-1.cm-1 dépend de la λ
ε
ε = f(λ) ⇒ spectre d’absorption
de l’espèce chimique étudiée.
4
Transitions électroniques possibles
σ*
n→σ*
π* Niveaux libres
n→π*
n
π→π*
π
Niveaux occupés
σ→σ*
σ
Vibrationnels
Rotationnels
S1 S1
Energie
S0 Rotationnels
S0
λ
λ
Ligne d’absorption Spectre d’absorption
5
Absorption des protéines: la liaison peptidique
La liaison peptidique
δ-
O
C N
δ+
H
Transition π→π*
ε190 ~ 7 000 M-1cm-1
Transition n→π*
ε210-220 ~ 100 M-1cm-1
Aromatiques
Absorption de F+Y+W
Absorption de Y+W
Absorption de W
6
Exemple d’application:
(1) Détermination de la concentration d’une protéine pure
D’après Pace C.N., et al. (1995), sur 80 protéines à l’état natif en solution.
DO
DO=εMCl ð C=
εMl
Exemple d’application:
(2) Détermination de la concentration en protéine
(mélange complexe)-Méthode de Bradford
7
Chromophore λmax εmax
(nm) (l.mol-1.cm-1)
Acides nucléiques
Adénine 260 15 000
Guanosine 255 14 000
Thymidine 265 10 000
Cytidine 270 9 000
Protéines
Tryptophane 280 5 600
Tyrosine 275 1 400
Phénylalanine 257 200
Pont disulfure 250 300
Liaison peptidique 190 4-8 000
Coenzyme
Flavine (FAD…) 450 12 700
NADH, NADPH 338 6 400
Appareillage: spectrophotomètre
Simple faisceau
Double faisceau
8
Spectrophotométrie / Spectrofluorométrie
Applications
Ä Analyse quantitative (identification et concentration)
Ä Modifications structurales (changement de conformation,
liaison de ligands…)
Fluorescence
A* A*
Absorption Rayonnement
UV/visible Chaleur (hν)
10-15 sec 10-10 à 10-12 sec 10-9 à 10-3sec
A
A
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Absorption Emission
(excitation)
Dissipation
S1 non radiative
Energie
Eexc Eem hc
E=
λ
S0
Diagramme de Jablonski
Eexc > Eem
λexc < λem (déplacement de Stokes)
Excitation
Emission
340 nm absorption
spécifique du NADH
10
Fluorophore λmax (nm) φ
excitation émission (Rdt quantique)
Intrinsèques
Tryptophane 295 350 0.2
Tyrosine 275 300 0.15
NADH, NADPH 340 470 0.02
Extrinsèques
ANS 375 455 1
DANSYL 330 510 0.5
Spectre de d’émission de
fluorescence du tryptophane
et de la tyrosine
réorganisation du solvant
autour du fluorophore
chaleur
hν
11
Effets de l’environnement du fluorophore sur λem
Red shift
Solvant polaire (solution aqueuse)
Stabilisation
de l’état excité
lem (nm)
l du domaine
visible
12
Effets de l’environnement du fluorophore sur IF
S1
Energie Pas d’effet (ou très peu)
Eexc Eem du solvant sur l’absorption
S0
Diagramme de Jabolnski
Polarité du solvant
Blue shift Red shift
λem
Rdt quantique
Exemple de l’effet de
Blue shift
l’environnement
sur le spectre de fluorescence,
Lactate déhydrogénase
Lactobacillus helveticus
13
Inhibition de fluorescence
Equation de Stern-Volmer
F0
= 1 + KSV [Q]
F
F0 fluorescence en absence de ligand (quencher)
F fluorescence en présence de ligand
KSV Constante de Stern-Volmer (KSV = kqt0 avec kq constante de
vitesse de quenching et t0 temps de vie de la fluorescence)
[Q] concentration de quencher.
le quenching statique:
* Modification de conformation,
* Localisation du fluorophore.
14
Stern-Volmer plots of P-glycoprotein Trp quenching by
acrylamide in the absence and presence of nucleotides.
Equation de Stern-Volmer
F0
= 1 + KSV [Q]
F
F0 1 1
Autre formulation: Loi de Lehrer: = +
ΔF faK[Q] fa
Avec : ΔF = F0 – F et K = 1
KSV
fa fraction de fluorophore qui émet
F0
ΔF Si plusieurs Trp fluorescent,
cette analyse permet de
1
déterminer la fraction
faK d’entre eux qui interagit
1 avec Q
fa
1
[Q]
15
Exemple de quenching statique du tryptophane
Homéodomaine de la protéine bicoïde de D.
melanogaster (BCD-HD)
- Le spectre d’émission de D
recouvre au moins partiellement
le spectre d’excitation de A.
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Schéma d’un fluorimètre
Cellule d’échantillon
λexc
Lampe Absorption
Fluorescence
Monochromateurs
(sélection des λ)
Dichroïsme circulaire
* Le dichroïsme circulaire CD est un type de
spectroscopie d’absorption qui permet d’obtenir
des informations structurales sur les
macromolécules biologiques (protéines, acides
nucléiques).
17
Lumière polarisée circulairement
18
Deux ondes lumineuses polarisées linéaires peuvent se combiner.
La résultante est une onde lumineuse polarisée circulaire.
19
Composantes circulaires d’une onde polarisée
Définitions et unités a
θ
b
Ellipticité = tang. de l’angle d’ouverture de l’ellipse
a
tan θ =
b
Les données de CD peuvent être exprimées :
1- ΔA = AG – AD
AG-AD
Δε = εG-εD = Δε coefficient d’extinction différentiel (en
c.l M-1.cm-1)
2- Ellipticité θ:
θ x 100 x Mr
[θ] Ellipticité molaire (degré.cm². dmol-1)
[θ] = Avec: θ (degré), mesurée expérimentalement
cxl
c, la concentration molaire
l, la longueur de la cellule (cm)
Mr, le poids moléculaire
20
Structure des protéines et spectre de CD
* Les spectres de CD entre 260 et 320 nm (UV proche ou near UV) nous
renseignent sur leur structure tertiaire (mobilité de la chaîne
latérale du W par ex).
80000
-1
60000
Mean residue ellipticity in deg.cm2.dmol-1
α-helix
dmol
2
β-sheet
40000 random coil
20000
-20000
-40000
Mean residue ellipicity in deg cm
wavelength in nm
polylysine à différents pH
pH7 random coil, pH10.8 hélice α; pH 11.1 brin β
21
Le spectre de CD est sensible aux variations de
structure secondaire
70
60
0 OC
50 50 OC
[θ] in1000 deg.cm2.dmol-1
-1
40 75 OC
dmol
2
30
20
10
0
in θ]
-10
1000
[
-20
deg cm
-30
-40
190 200 210 220 230 240 250 260
wavelength in nm
100% hélice α à 0oC
2 minima aux environs de à 220nm random coil à 75°C
spectre caractéristique d’hélice
0
peptide in water
peptide in 50% TFE
-5
-10
-15
TFE
MRE
-20
-25
-30
-35
200 210 220 230 240
wavelength in nm
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Spectre de CD et structure secondaire des protéines
—— chymotrypsine (~ β)
—— lysozyme (α & β)
—— triosephosphate isomérase
(principalement α , qqles β)
—— myoglobine (α)
Spectres de dichroïsme
circulaire de la
Cu/Zn SOD humaine
Structure tertiaire
de la Cu/Zn SOD
humaine
23
Détermination de la proportion des différentes
structures secondaires à partir d’un spectre CD
-1
60000 α-helix
dmol
2
β-sheet
40000 random coil
xα+ xβ + xc = 1.0
0
-20000
-40000
Mean residue ellipicity in deg cm
wavelength in nm
Exemple : la myoglobine
θt = xαθα + xβθβ + xcθc
Le meilleur ajustement est obtenu pour
Xα = 80%,
Xβ = 0%
Xc = 20%
80000
En accord avec la structure 3D:
-1
Mean residue ellipticity in deg.cm2.dmol-1
60000
β-sheet
40000 random coil
20000
-20000 www-structure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm
-40000
Mean residue ellipicity in deg cm
wavelength in nm
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Caractéristiques des spectres CD des
structures secondaires
Chromophores impliqués
* 250-270 nm → phenylalanine
* 270-290 nm → tyrosine
* 280-300 nm → tryptophane.
Les liaisons S-S donnent une bande large sur toute la zone.
25
Spectres de CD dans
l’UV proche des
αA- et αB- crystallines à
25 et 62°C
CD dans le proche UV
permet de suivre les
changements
conformationnels ayant lieu
à proximité des chromophores
(acides aminés aromatiques)
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Spectres CD dans l’UV proche
(A) et lointain (B)
UV proche à différentes températures
1- 0°C 2- 37°C 3- 45°C
4- 55°C 5- 65°C 6- 75°C
Fluorescence de l’ANS, 1-
Fluorescence du trp
anilo-8-naphtalène sulfonate
λexc = 380nm
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