Analyses bactériologiques:

1-Méthodes analytiques utilisées:

La recherche et le dénombrement des bactéries indicatrices d’une contamination fécale comprennent deux méthodes
classiques :

1- L’une, par filtration sur membrane.

2- L’autre, par ensemencement.

1.1-Méthode de filtration sur membrane:

se fait a l'aide d'une rampe de filtration lié à une pompe selon les étapes suivantes:

-préparer une zone stérile (à l'aide de bec bunsen )

-placer autour du bec bunsen les boites des milieux de culture préparée préablement .

-stériliser la face supérieure (la plaque poreuse )et les entonnoirs de l'appareil à l'aide du bec bunsen .

-procéder un refroidissement avec de l'eau distillé stérile .

-placer la membrane stérile (membrane de 0.45 µm )sur le système de filtration avec une pince flamber et refroidie.

-agiter le flacon par retournement .

-verser le volume nécessaire de l'échantillon pour chaque paramètre.

1.2-Ensemencement:

Mise en culture en zone stérile .

-retirer la membrane avec la pince.

-déposer la membrane sur la gélose .

-les éléments nutritifs de la gélose traversant la membrane, ce qui permet le développement des bactéries en surface .

2-Recherche des indicateurs de contamination fécale:

La recherche et la détermination de la présence ou l'absence des microorganismes dans les prélèvements des boues
résiduaires ont été effectuées selon les normes ISO suivantes :

2.1-Recherche des coliformes totaux et fécaux:

Les coliformes totaux sont des bacilles à Gram(-), non sporulé, oxydase (-), aérobie et anaérobie facultatifs. Ils se multiplient à
37°C pendant 48h. Ce type de germes peut être recherché et dénombré dans le milieu de culture BCPL(Tefyeche, 2014).

Le terme de « coliformes fécaux » ou de « coliformes thermotolérants » correspond à des coliformes qui présentent les mêmes
propriétés que les coliformes totaux après incubation à la température de 44 °C. Ce type de germes peut être recherché et
dénombré dans l’eau peptonée exempte d’indole (Rodier, 2009).

Afin d’examiner ces 2 types de germes on réalise les 2 tests suivants :

A. Teste présomptif :
A partir de l’eau testée, on porte aseptiquement :

ü03 fois10 ml, dans 03 tubes contenant 9ml de milieu BCPL D/C muni d’une cloche de

Durham.

ü03 fois 01 ml, dans 03 tubes contenant 9 ml de milieu BCPL S/C muni d’une cloche de

Durham.

ü03 fois 0.1 ml, dans 03 tubes contenant 9 ml de milieu BCPL S/C muni d’une cloche de

Durham.

ØLecture :

Après 48 Heures d’incubation à 37°C et en absence d’air, seront considérés comme positifs les tubes qui présentent à la fois
un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune et un dégagement gazeux se considèrent comme positifs. Le
dénombrement des coliformes se fait selon les prescriptions de la table du NPP (Rejsek, 2002).

B. Test confirmatif :

Les tubes de BCPL qui montrent un résultat positif après le test de présomption font l’objet d’un repiquage à l’aide d’un ose
bouclé dans des tubes contenant le milieu eau peptonée exempte d’indole l’incubation se fait à 44 °C pendant 24 heures
(Rejsek, 2002).

ØLecture:

Les tubes qui présentent à la fois un anneau rouge en surface (Témoin de la production d’indole par Escherichia Coli), après
adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de Kovacs et un dégagement gazeux se considèrent comme positifs (Fig.1).

Le dénombrement s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP (Rejsek, 2002).
 Figure 1: Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux

2.2-Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux

Les streptocoques du groupe D (possèdent l’antigène du groupe D) sont des coques à Gram (+), catalase(-), immobile,
anaérobie facultatif, et non sporulant formant quand ils sont cultivés en milieu liquide des diplocoques et/ou des chainettes
(Gillespi, 2006).
On fait 2 tests successivement : un test présomptif en milieu de Rothe, et un test confirmatif en milieu Eva-Litsky.
L’incubation dans les 2 tests se fait en 37°C pendant 24 à48h (Rodier, 2009).

A-Teste présomptif :

ØMode opératoire :

* A partir de l’eau à analyser, porter aseptiquement 1 ml dans un tube contenant 9 ml de milieu Rothe S/C pour obtenir la
dilution10-1.

* Prélevé 1ml de tube précédent 10-1et mettre dans le seconde tube contenant 9 ml de milieu Rothe S/C pour avoir la dilution
10₋2.

* Transférer 1ml de la dilution 10₋2dans un tube contenant 9 ml de milieu Rothe S/C, pour obtenir la dilution10 ₋3.

* Refaire la technique pour les 2 autres séries.

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures (Rejsek, 2002; Délarras, 2008).

Ø Lecture:

Les tubes présentant un trouble microbien seront considérés comme positifs (Fig.24) et la lecture finale s’effectue également
selon les prescriptions de la table du NPP (Rejsek, 2002;Délarras, 2008).

B.Test confirmatif:

Ø Mode opératoire:

Le test de confirmation est basé sur la confirmation des streptocoques du groupe (D)éventuellement présents dans le test de
présomption.

Les tubes de Rothe trouvés positifs feront donc l’objet d’un repiquage à l’aide d’un ose bouclé dans un tube contenant le
milieu Eva-Litsky, bien mélangé le milieu et l’inoculum (Rejsek, 2002). L’incubation se fait cette fois ci à 37°C, pendant 24
heures (Délarras, 2003).

Ø Lecture:

Seront considérés comme positifs les tubes présentant à la fois:

ü Un trouble microbien.

ü Une pastille violette (blanchâtre) au fond de tube (Fig.2).

La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP(Lebres, 2006).
 Figure 2 : Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux.

2.3-Recherche et dénombrement des spores anaérobies sulfito-réducteurs:

Cette recherche concerne les bactéries anaérobies strictes, parmi ces bactéries figure le genre Clostridium (Rejsek, 2002), il
s’agit de bacille Gram (+) presque toujours mobile(Pilet et al., 1987) ; elles ont la possibilité de se transformer sous une forme
de spores résistantes aux conditions défavorables. (Rejsek, 2002) ; elles se développent en 24 à 48heures à une température de
36 ± 2°C (Lebres et Mouffok, 2008).
Les ASR se développent sur une gélose VF en donnant des colonies typiques de couleur noire en réduisant les sulfites en
sulfures, et en présence de Fe2+(ion de fer) donne FeS (Rejsek, 2002).

ØMode opératoire:

À partir de la solution mère :

ü Prendre environ 20 ml dans un flacon stérile puis le soumettre à un chauffage à 80°Cpendant 8 à 10 minutes dans le but de
détruire toutes les formes végétatives des ASR éventuellement présentes.

ü Refroidir immédiatement le flacon sous l’eau de robinet.

ü Répartir ensuite le contenu de ce flacon dans 4 tubes stériles, à raison de 5ml par tube.

ü Ajouter environ 20 ml de gélose VF, fondue et additionnée d’une ampoule d’Alun de fer et d’une ampoule de Sulfite de
sodium.

ü Mélanger doucement le milieu et l’inoculum en évitant les bulles d’air.

Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes environ, puis incuber à 37°C, pendant 24 à48 heures (Labres, 2006).

ØLecture:

ü La lecture se fera après 24 heures et après 48 heures.

Dénombrer toute colonie noire d’environ 0,5 mm de diamètre, poussant en masse (Fig.3)(Rejsek, 2002).
 Figure 3 : Recherche et dénombrement des ASR

3-Recherche des germes pathogènes:

Il existe une grande variété de bactéries pathogènes ou potentiellement pathogènes(opportunistes) pour l’homme. Celles-ci
vivent ou survivent dans l’environnement, soit provenant des rejets humains, éliminées par des sujets malades ou des porteurs
sains, soit étant autochtones et pouvant s’adapter à l’homme (RODIER et al., 2009).
Pour rechercher et identifier les bactéries, nous avons utilisé la technique d’ensemencement par râteau sur gélose coulée dans
des boites de Pétri. Les milieux utilisés sont : GN, GNAB, Chapman, Hektoen, SS, Mac Conckey (in BOUCHAALA, 2010).

3.1-Pseudomonas

Un bacille Gram (-), Oxydase (+), Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est
également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.

ØMode opératoire:

üFiltration de 100 ml de l'échantillon sur une membrane retenant les bactéries.

ücette membrane est placée sur un milieu de culture sélectif cétrémide incubé à 37 c° pendant 48 h.

ØLecture:

üAprès incubation ,considérer comme typique toutes les colonies lisses et brillantes avec une couleur blanc crème et un aspect
muqueux.

üRepiquage des colonies caractéristiques sur la gélose GN, incubé à 37 c° pendant 24 h.

3.2-Salmonella :

Ce sont des bacilles à Gram (-), non sporulés, le plus souvent mobiles, elles fermentent le Glucose avec ou sans production de
gaz et réduisent les nitrates en nitrites, elles sont oxydases (-), catalases (+) et aérobie-anaérobie facultative (Souna, 2011).

La recherche de Salmonella à partir des prélèvements de la SM est souvent compliquée par leur faible concentration, il est
nécessaire de pratiquer une méthode d’enrichissement. Au début, les bactéries qui nous intéressent sont diluées dans une
population beaucoup plus nombreuse et très hétérogène que nous éliminons peu à peu au fil de transferts successifs à l’aide
d’un milieu sélectif adéquat. Les cellules les mieux adaptées se multiplient plus vite quels autres et tendent à devenir
majoritaires. Un simple étalement sur boite gélosée et la collecte d’une colonie isolée permettent facilement d’obtenir une
souche présumée pure(PELMONT, 1996).

ØMode opératoire:

Ø Premier jour : Enrichissement

Introduire 1ml de l’échantillon de l’eau à analyser dans 10ml de SFB puis incuber à 37C°(Navoun,2005).

ØDeuxième jour : Isolement et identification

Trois géloses sélectives ont été utilisées : les géloses SS, Hektoen et Mac-conkey qui sont ensemencées par technique d’étale

ment en surface à raison de 0,2 ml puis incubées à 37C°(Navoun, 2005).

Ø Lecture:

Après 24 heures, des salmonelles se présentent sous forme des colonies incolores à centre noir (H2S positif) sur SS et colonies
verdâtre ou bleuâtres à centre noir sur HektoenFig.28) (Navoun, 2005).
 Figure 4: Recherche des Salmonella

3.3-Shigella:

Les Shigelles sont des Enterobacteriacea, rencontrées exclusivement chez l'homme, en ne faisant partie d'aucune de sa flore
commensale, elles sont toutes pathogènes et spécifiques du tube digestif, elles sont éliminées par les selles et dispersées dans
les sols et les eaux où elles ne survivent que pour peu de temps (PECHERE et al., 1982 ; CARBONELLE et al., 1988).

ØMode opératoire:

Sur la surface d’une gélose ordinaire Hektoen, SS ou Mac Conkey, nous étalons de 0,1 ml de l’échantillon (la SM) par la
méthode des quatre quadrants, L’incubation se fait à 35-37C°pendant 18 - 24 heures.(Fig.29) (Rodier, 2009).

➢ Lecture

Les colonies de Shigella formées sont de taille moyenne (2 à 3 mm de diamètre), rondes, régulières et brillantes.
3.4-Vibrion cholérique:

Les Vibrionacae sont des bactéries bâtonnets incurvés en virgule ou droits, mobiles et aérophiles, Gram (–) et oxydase (+). Ils
sont plus au moins basophiles (pH 8.5 à 9), cet propriété est utilisée d’ailleurs pour leur isolement (DELARRAS, 2010). Elles
sont responsables d'une maladie pestilentielle à tropisme digestif, qui se développe souvent par pandémies (BERCHE et al.,
1988).

ØMode opératoire:

ØPremier jour : Enrichissement primaire

L’enrichissement primaire s’effectue sur le milieu Eau Peptonée Alcaline (EPA). Un contenant au préalable 50 ml de milieu,
auquel on ajoute aseptiquement 450 ml d’eau distillée stérile avec 45 g de la boue à analyser. Ce dernier sera par la suite
incubé à 36c° ± 2 pendant 20heures ± 4.(Lebres et al., 2008).

ØDeuxième jour : enrichissement secondaire et Isolement

Après incubation, le tube constituant l’enrichissement primaire fera l’objet :

D’un isolement sur gélose GNAB, l’incubation se fait à 36±2°C pendant 20±4 heures.

D’un deuxième enrichissement en transmettant quelques gouttes de la surface dans un nouveau tube d’EPA (Delarras, 2000).

D’autre part la boite de gélose GNAB subira une lecture après 24 heures (Fig.30) entenant compte de fait que les vibrions se
présentent le plus souvent sous forme de grosses colonies lisses, transparentes et très caractéristiques (Lebres, 2008).

ØIdentification :

Les colonies sont très fines sur la gélose nutritive et jaunâtre sur la gélose hyperalcaline(PATRICK et al.,
1988).L’identification morphologique et biochimique se fait suite à :

- Observation à état frais (bacilles, mobilité) et après une coloration de Gram (bacillesGram négatifs) ;

- Oxydase (+) ;

- Ensemencement sur un tube de TSI qui sera incubé à 37°C pendant 24 heures ;

- Ensemencement sur un tube de gélose nutritive inclinée qui sera incubé à 36 qui sera

incubé à 36°C ± 2 pendant 20 heures ± 4, qui servira à l’agglutination sur lame ;

- Faire une mini-galerie biochimique basée sur l’étude des acides aminés afin de

différencier les Vibrio, des Pleisiomonas et des Aeromonas selon le tableau 1.

Tableau 1: Différences majeures entre les Vibrio, Pleisiomonas et Aeromonas (LABRES et MOUFFOK,2008)
 Figure 5 Recherche des vibrio cholorique

3.5-Staphylococcus:

Nous appelons les staphylocoques à coagulase positive toutes les bactéries qui se présentent sous forme de Cocci à Gram
positive, sphériques, isolées ou regroupées formant ainsi des grappes de raisin, possédant l’enzyme catalase et la coagulase
(CARBONELLE et al., 1988;LABRES et MOUFFOK, 2008). L’espèce type de ce genre est Staphylococcus aureus. Elle est
pathogène et très redoutée.

le milieu Chapman est un milieu sélectif, permettant la croissance des germes halophiles, ce milieu contient un agent
inhibiteur (forte concentration en chlorure de sodium), parmi ces germes figurent au premier rang les bactéries du genre
Staphylococcus (JOFFIN et al., 2001).

➢ Mode opératoire:
Le dénombrement des staphylocoques s’effectue par étalement en surface. Un faible volume d’échantillon (SM) est réparti
avec un étaleur stérile (pipette Pasteur repliée « en râteau »sur la surface d’une gélose sélective gélose Chapman au mannitol
en boite de Pétri (TABET, 2015). Cette dernière sera incubée couvercle vers le bas à 36°C ± 2 pendant 44 heures ±

➢ Lecture et interprétation:

Après une période d’incubation spécifiée, les Staphylocoques à coagulase positive, en particulier Staphylococcus aureus,
apparaissent sous forme de petites colonies lisses légèrement bombées à contours réguliers et pigmentées en jaune
(fermentation du mannitol) ou en blanc(LABRES et MOUFFOK, 2008 ; PECHERE et al., 1982).

Résultats et Discussion :

Analyses bactériologiques :

En se basant sur les résultats des différentes analyses bactériologiques des boues résiduaires qui sont effectuées dans différents
travaux présents dans la littérature, nous avons réalisé une synthèse basée sur deux parties : une analyse quantitative qui
comporte le dénombrement des germes, et une analyse qualitative qui consiste à rechercher tous les germes présents.

Recherche des indicateurs des contaminations fécales :

La recherche des coliformes est primordiale du fait qu’un grand nombre d’entre eux vivent en abondance sur les
matières fécales des animaux à sang chaud et de ce fait constituent des indicateurs de première importance (Aberkane
et al, 2011).
1- Recherche et dénombrement des coliformes fécaux :
Les résultats trouvés par les différentes analyses ont montré une grande variation des concentrations de bactéries.
Tableau :Résultats des analyses effectuées par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA).
 Boue liquide Boue sèche(6mois) Boue sèche(1an) Boue sèche(2ans)
Coliformes fécaux 2400 11000 4600 1200
(UFC/100ml)

Les analyses effectuées par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA) sur les boues résiduaires de la STEP de Guelma
consistent à mesurer les concentrations des bactéries sur des échantillons prisent d’une boue liquide, une boue solide
après 6 mois, une boue solide après 1 an et une boue solide après 2 ans. Les résultats montrent la présence des
coliformes fécaux dans tous les échantillons mais avec des concentrations différentes. L’échantillon pris de la boue
solide après 6 mois présente la concentration la plus élevée des coliformes fécaux, tandis que la valeur minimale est
enregistrée dans l’échantillon pris de la boue liquide.

Tableau: Résultats des analyses effectuées (MAALEM, SAIDIA, et TOGO)

Février Mars Avril

Boue liquide 11000 9000 25000
Boue Mixte 11000 10000 35000
Boue sèche 0 0 2000

Les analyses effectuées par (MAALEM, SAIDIA, et TOGO) en 2018 dans la STEP de Guelma sur 3 échantillons
prisent d’une boue liquide, une boue mixte et une boue sèche respectivement. Les analyses ont été réalisées pendant 3
mois consécutifs. Les résultats ont montré la présence des coliformes fécaux dans tous les échantillons après le
troisième mois avec une forte concentration dans la boue mixte.

Tableau: Résultats des analyses effectuées par (ABESSA et TABET)

Boue liquide Boue sèche

Coliformes fécaux 163333.3 493333.3

Les analyses effectuées par (ABESSA et TABET) sur des boues sèches et des boues liquides ont montré la présence
des coliformes fécaux avec une forte concentration dans les boues sèches par rapport aux boues liquides.
En analysant ces résultats, on peut déduire que les coliformes féaux sont présentes dans tous les boues. En outre, elles
se retrouvent avec une grande concentration dans les boues mixtes et les nouvelles boues sèche formées.

2- Recherche et dénombrement des coliformes totaux :

Tableau :Résultats des analyses effectuées par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA).

Boue liquide Boue sèche(6mois) Boue sèche(1an) Boue sèche(2ans)

Coliformes totaux 4600 11000 2100 11000
(UFC/100ml)

Les analyses effectuées par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA) ont montré que les concentrations des coliformes
totaux extrêmement varient dans les différents échantillons, dont les valeurs maximales sont enregistrées au niveau
des boues solides âgées de 6 mois.

Tableau:Résultats des analyses effectuées par(MAALEM, SAIDIA, et TOGO)

Février Mars Avril

Boue liquide 4500 20000 45000
Boue Mixte 15000 30000 45000
Boue sèche 0 0 15000
 Les analyses effectuées par (MAALEM, SAIDIA, et TOGO) ont montré la forte présence des coliformes totaux dans
les échantillons prisent de la boue mixte. De plus, ils sont présentes avec une forte concentration durant le troisième
notamment dans la boue liquide et la boue mixte.
Tableau : Résultats des analyses effectuées par (ABESSA et TABET).

Boue liquide Boue sèche

Coliformes totaux 112666.67 8033333.3

Les résultats obtenus par (ABESSA et TABET) ont montré la forte présence des coliformes totaux dans la boue sèche
par rapport à la boue liquide.
Ces résultats nous permis de déduire que les coliformes totaux peuvent être fortement observées dans les boues
sèches.

3- Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux :

Les streptocoques fécaux sont des excellents indicateurs de contamination récente par la matière fécale des animaux
(Rodier, 2009).
Tableau :résultats des analyses effectuées par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA).

Boue liquide Boue sèche(6mois) Boue sèche(1an) Boue sèche(2ans)

Streptocoques fécaux 15×10⁵ 45×10⁶ 11×10⁶ 14×10⁷
(SF/l)

Les résultats du dénombrement des Streptocoques fécaux effectué par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA) ont
montré que l’effectif le plus élevé a été représenté par les boues solides âgées de 2 ans tandis que la valeur minimal à
été présenté par les boues liquides.

Tableau:Résultats des analyses effectuées par (MAALEM, SAIDIA, et TOGO).

Février Mars Avril

Boue liquide 6000 9500 9000
Boue Mixte 7000 9500 15000
Boue sèche 0 9 45

Les analyses réalisés par (MAALEM, SAIDIA, et TOGO) montrent une augmentation de ces germes à partir du
deuxième mois dans les boues solides.

Tableau: Résultats des analyses effectuées par (ABESSA et TABET).

Boue liquide Boue sèche

Streptocoques fécaux 273333.3 2000000

Ces résultats sont confirmés par les analyses de (ABESSA et TABET) qui ont trouvé forte présence des Streptocoques
fécaux dans les boues sèches.
Donc, on peut conclure que les Streptocoques fécaux sont présentes avec une forte concentration dans les boues
sèches.

4- Recherche et dénombrement des anaérobies sulfato réductrice :

 Tableau : Résultats des analyses effectuées par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA).

Boue liquide Boue sèche(6mois) Boue sèche(1an) Boue sèche(2ans)

ASR 3631 1019 1474 1379
(UFC/100ml)

Les analyses effectuées par (FERTAS, LAOUISSI et ZOUAIMIA) ont montré que le nombre le plus élevé est au
niveau des boues liquides alors que le nombre le plus faible est au niveau des boues solides âgées de 6 mois.
Tableau :Résultats effectuées par (MAALEM, SAIDIA, et TOGO).

Février Mars Avril

Boue liquide Forte presence Forte presence Forte presence
Boue Mixte Forte presence Forte presence Forte presence
Boue sèche Forte presence Forte presence Forte presence

Les analyses effectuées par (MAALEM, SAIDIA, et TOGO) pour la recherche et le dénombrement des ASR ont
présenté une forte charge de ces germes où les colonies ont été indénombrables pour les trois types des boues et dans
les trois prélèvements.
Tableau :Résultats effectuées par (ABESSA et TABET).

Boue liquide Boue sèche

ASR 14.33 36.33

Les résultats obtenus par (ABESSA et TABET) ont montré la présence des germes anaérobies sulfato réductrice dans
les boues sèches et liquides.
Ces résultats permet de conclure que les anaérobies sulfato réductrice sont présentes avec une forte concentration dans
tous types de boues.

5-Recherche et dénombrement des salmonelles  :

Tableau :Résultats effectuées par (ABESSA et TABET).

Boue liquide Boue sèche

salmonelle 1490 1243.33

Les résultats obtenus par (ABESSA et TABET) ont montré une forte présence des salmonelles  dans les boues
liquides.
6-Recherche et dénombrement des streptocoques  :
Tableau :Résultats effectuées par (ABESSA et TABET).

Boue liquide Boue sèche

streptocoque 166.33 179.33

Les résultats obtenus par (ABESSA et TABET) ont montré une forte présence des salmonelles  dans les boues
sèches.