HLA et compatibilité tissulaire

en transplantation d’organe
Dossier

Limites des méthodes de recherche

des anticorps anti-HLA par technique
Luminex® “Single Antigen“
Limits of the methods detecting anti-HLA antibodies
with Single Antigen Luminex® technology
Isabelle Jollet1, Alice Aarnink2, Jonathan Visentin3,4

La technique de référence d’étude des anticorps anti-HLA (Human The gold standard for IgG HLA antibodies detection is
Leukocyte Antigen) d’isotype immunoglobuline G (IgG) est le Luminex® the Luminex® “Single Antigen”, because of its resolution
“Single Antigen”, en raison de sa sensibilité et de son pouvoir résolutif, and sensitivity, but it displays several drawbacks. First, its
mais elle n’est pas dénuée de limites. Elle souffre d’interférences interpretation suffers from intravenous immunoglobulins
liées à l’administration d’immunoglobulines intraveineuses et administration and it detects clinically irrelevant anti-
détecte des anticorps reconnaissant des molécules HLA dénaturées, denatured HLA antibodies. Third, the complement
sans signification clinique apparente. En raison de l’activation du activation at beads’ surface by high titer IgG anti-
Summary

complément à la surface des billes en présence de grandes quantités HLA antibodies, but also the presence of IgM anti-
Résumé

d’IgG ou de la présence d’IgM anti-HLA, l’immunisation du patient HLA antibodies, can lead to the underestimation even
contre certains antigènes HLA peut être sous-estimée, voire non missing of patients’ sensitization. Moreover, technical and
détectée. En parallèle, la standardisation technique et d’interprétation interpretation standardization is a difficult task. This article
du “Single Antigen” est difficile. Cet article fait le point sur ces limites exhibits our knowledge about the “Single Antigen” assays
et les moyens d’y remédier. limitations and their solutions.

Mots-clés : Luminex® “Single Antigen” − Interférences − Standardisation. Keywords: “Single Antigen” Luminex® − Interferences −
Standardization.

L
a recherche et l’identification des anticorps (Ac) prétation des profils, en particulier lors du suivi d’Ac
anti-HLA par la technologie Luminex® ont repré- de faible intensité de fluorescence (Mean Fluorescence
senté une avancée majeure dans le domaine de Intensity [MFI]).
la transplantation. La technologie Luminex® “Single
Antigen” est rapidement devenue la méthode de réfé- Antigènes dénaturés 1 Laboratoire
rence en raison de sa sensibilité et de sa résolution. Elle L’existence d’Ac anti-HLA d’isotype immunoglobuline M d’histocompatibilité
n’est cependant pas dénuée de limites, et une connais- (IgM) “naturels”, c’est-à-dire détectés chez des donneurs et d’immunogénétique,
établissement français
sance de celles-ci est primordiale afin d’optimiser la de sang n’ayant jamais connu d’événement allo-­
du sang (EFS)
prise en charge des patients. immunisant, est connue depuis les années 1970. Des Nouvelle-Aquitaine,
Ac naturels anti-HLA d’isotype IgG ont été récemment Poitiers.
2 Laboratoire
mis en évidence avec le “Single Antigen” chez ce même
Les interférences positives type de sujets (2). Plusieurs hypothèses expliqueraient d’histocompatibilité,
CHRU de Nancy, Nancy.
leur existence, comme une réactivité croisée entre des 3 Laboratoire d’immuno-

Interférences médicamenteuses épitopes présents sur le HLA et chez certains micro-­ logie et immunogéné-
L’administration d’immunoglobulines polyvalentes organismes, sur des protéines alimentaires ou aller- tique, CHU de Bordeaux,
intraveineuses est connue pour entraîner une positivité gènes, ou bien une autoréactivité contre HLA-E. Bordeaux.
4 Université de Bordeaux,
de la quasi-totalité des billes du “Single Antigen” (1). Les Ac naturels reconnaissent les molécules HLA sous UMR CNRS 5164
Les préparations contiennent en effet des Ac anti-HLA leur forme native (anti-nHLA) ou dénaturée (anti-dHLA). ImmunoConcept,
(Human Leukocyte Antigen) gênant grandement l’inter- Les molécules HLA dénaturées ont une conformation Bordeaux.

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anormale, par exemple pour la classe I liée à la perte du mais les iBeads® ne sont plus commercialisées depuis
peptide et de la β-2 microglobuline, et sont présentes plusieurs années.
en quantité significative à la surface des billes “Single Au contraire des anticorps anti-HLA natif, la significa-
Antigen” (3). Leur origine n’est pas clairement identifiée, tion clinique des Ac anti-dHLA est considérée comme
mais les contraintes imposées aux molécules HLA par négligeable, un certain nombre de publications rap-
les procédés de purification des antigènes puis de leur portant que ceux-ci ne positivent pas les crossmatchs
fixation sur les billes seraient impliquées. (XM) et n’ont aucun impact sur le rejet ou la survie du
Sachant qu’il est impossible de différencier les Ac greffon (3, 8). Ils ne devraient donc pas être pris en
anti-dHLA des anti-nHLA sur la base de la MFI du test compte dans les stratégies d’attribution des greffons
Luminex® ou des spécificités antigéniques reconnues étant donné qu’ils peuvent réduire l’accès à la greffe
et que ce phénomène touche les réactifs en prove- de manière injustifiée, voire drastique si le nombre de
nance des 2 fournisseurs qui existent sur le marché, spécificités antigéniques est important et/ou si ces
il est nécessaire d’utiliser des examens complémen- spécificités sont fréquentes dans la population des don-
taires pour identifier les Ac anti-dHLA. La méthode neurs (5). Cependant, la distinction antinatif/dénaturé
la mieux décrite pour la classe I consiste à traiter les n’est pas réalisée en pratique courante.
billes avec un tampon acide (pH < 3), ce qui entraîne
une dénaturation particulière et sans doute artificielle
(par rapport à la forme naturelle) des molécules HLA. Les interférences négatives
La présence d’Ac anti-dHLA est suspectée si les MFI
augmentent de façon significative après le traitement Des phénomènes d’interférence négative conduisant
acide. Cependant, ce test ne permet pas d’exclure à la sous-estimation, voire à la non-détection des Ac
l’existence d’Ac reconnaissant d’autres formes de anti-HLA en “Single Antigen” ont également été rap-
dénaturation et donne parfois lieu à des réactions portés. Les premiers articles relataient une interférence
faussement positives (4). Néanmoins, son utilisation a réversible par traitement du sérum au dithiothréitol
permis de montrer que les Ac anti-dHLA sont très fré- (DTT) ou après dialyse hypotonique, laissant penser
quemment détectés par le “Single Antigen” de classe I, à des interférences liées à des IgM anti-HLA entrant
touchant près de 40 % des patients immunisés en en compétition avec les IgG. L’effet “prozone” – terme
classe I inscrits sur liste d’attente (5). provenant de l’homologie observée avec l’interférence
En revanche, l’existence d’Ac anti-dHLA dirigés contre bien connue des réactions d’agglutination – a ensuite
des antigènes de classe II est plus controversée. été décrit pour les IgG de forte MFI (9). L’effet “prozone”
Morales-Buenrostro et al. ont estimé à 23 % la préva- est réversible par traitement du sérum à l’acide éthylène
lence des Ac anti-HLA de classe II “naturels” dans leur diamine tétra-acétique (EDTA), au DTT, à la chaleur (56 °C
cohorte de sujets sans événement immunisant (2), pendant 30 mn) ou par dilution. La première hypo-
mais cette étude n’utilisait pas de test cellulaire per- thèse était que l’association des fragments C1r et C1s
mettant de vérifier la capacité de ces Ac à reconnaître au C1q empêchait la fixation du conjugué (immuno-
ou pas des molécules HLA natives. Grenzi et al. se sont globulines anti-IgG humaines) fluorescent de révélation
intéressés à un profil particulier récurrent obtenu avec du test “Single Antigen” de l’anti-IgG fluorescent par
le “Single Antigen” de classe II (6). La réalisation du test encombrement stérique. Il a ensuite été démontré que
de compatibilité donneur/receveur (le crossmatch l’interférence était liée à l’accumulation des produits
cellulaire) par cytométrie en flux (CMF) montrait que d’activation des facteurs du complément C4 et C3 à
les Ac qui le composaient n’étaient pas capables de lier la surface des billes, cachant le fragment Fc de l’Ac
des cellules humaines. Le traitement acide des billes anti-HLA du patient au conjugué (10). Cette interférence
de “Single Antigen” de classe II ne permettait pas de due au complément est principalement observée lors
conclure quant à leur reconnaissance de molécules de l’utilisation des kits provenant du fournisseur One
HLA de classe II dénaturées. Lambda (9-11), alors que de rares cas ont été rapportés
Le fournisseur One Lambda a également proposé les pour les kits Immucor. Elle est d’autant plus importante
iBeads®, correspondant à des billes “Single Antigen” (donc la détection de l’Ac, plus compromise) que la
de classe I traitées par des procédés enzymatiques densité des Ac à la surface des billes est importante. La
permettant de retirer tout ou partie des molécules fréquence de non-détection des IgG de très haute MFI
HLA dénaturées de leur surface (3, 7). Cela permet- a été estimée à 2,1 % en classe I et 1,1 % en classe II (11),
tait de diminuer leur sensibilité aux anti-dHLA, et alors que la simple sous-estimation de la MFI touche-
les résultats publiés semblaient très prometteurs, rait 10 à 30 % des patients (12). Cette interférence

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par technique Luminex® “Single Antigen“

explique également les fluctuations de profil “Single étant non représentées dans l’une des 2 trousses uti-
Antigen” observées chez certains patients fortement lisées, l’assignation de ces spécificités est impossible
immunisés (11). La description de l’interférence liée pour les laboratoires qui l’emploient. Deuxièmement,
au complément a soulevé la question de l’existence une différence de densité antigénique à la surface des
de l’interférence liée aux IgM. Cette dernière existe billes conduirait à des variations de la MFI mesurée.
vraiment, mais serait moins fréquente (13). Troisièmement, les différences entre les procédés
Les conséquences cliniques de ces interférences néga- de fixation des molécules HLA sur les billes influe-
tives peuvent être importantes, voire graves, que ce raient sur la proportion de molécules dénaturées à la
soit en situation prégreffe, notamment lorsque le XM surface des billes selon les allèles, et donc sur la pro-
n’est pas réalisé avant la transplantation (transplan- portion et la force des réactivités faussement positives.
tation non rénale, XM virtuel), ou en situation post- Quatrièmement, Immucor impose une dilution au 1/5
greffe où un authentique rejet humoral pourrait être du sérum, ce qui entraînerait une sensibilité inférieure
négligé. La Société francophone d’histocompatibilité mais potentiellement une meilleure spécificité. Enfin,
et d’immunogénétique (SFHI) recommande de traiter le calcul destiné à la normalisation des MFI est très dif-
les sérums afin de s’affranchir de l’interférence liée férent entre les 2 fournisseurs.
au complément. Actuellement, plus de 85 % des Ainsi, les études successives de la SFHI (groupe de
laboratoires français utilisent les kits One Lambda travail “anticorps en transplantation d’organes”) de
et plus de 90 % d’entre eux réalisent un prétraite- comparaison interlaboratoires menées depuis 2009
ment (84 % par ajout d’EDTA, 8 % par ajout de DTT, montrent des MFI brutes systématiquement plus faibles
données SFHI 2016). avec les réactifs Immucor, en moyenne à 38 % de celles
obtenues avec les réactifs One Lambda pour la classe I,
et à 70 % pour la classe II (dernier exercice en date de
La standardisation du test mai 2017), les calculs de normalisation ne compensant
“Single Antigen” que partiellement ces résultats.

La littérature scientifique et les travaux de la SFHI Variabilité intrafournisseur

mettent en évidence des disparités entre labora- Deux études du même groupe de travail SFHI,
toires concernant la définition des spécificités HLA conduites en 2012 et 2014, ont comparé les MFI
positives (14, 15), d’ordre technique ou d’ordre ana- obtenues par les utilisateurs des réactifs One Lambda.
lytique, vis-à-vis desquelles un travail de standardi- Les coefficients de variation (CV) interlaboratoires
sation est nécessaire. Le groupe de travail “anticorps retrouvés étaient de l’ordre de 30 %. En intralabora-
en transplantation d’organe” de la SFHI (responsables toire, la reproductibilité était meilleure (CV < 20 %
Dr I. Jollet et Pr J.L. Taupin) a démarré fin 2017 une pour 43 % des laboratoires en 2012 et pour 72 % des
évaluation nationale à l’aide d’un contrôle de qualité laboratoires en 2014).
interne externalisé sous la forme de sérums qui seront Les variabilités intrafournisseur peuvent être expli-
intégrés dans le fonctionnement de routine des labo- quées par l’utilisation de lots différents de billes ou
ratoires y participant. du conjugué fluorescent (14) et l’hétérogénéité des
protocoles techniques utilisés par les laboratoires (14).
Standardisation technique Enfin, la méthode n’étant pas automatisée et faisant
intervenir plusieurs étapes d’incubation, d’agitation
Variabilité interfournisseurs et de lavages, le facteur humain a également été iden-
Lors d’une étude réalisée à partir des résultats d’évalua- tifié comme jouant un rôle important. Il appartient
tion externe de la qualité de l’ASHI (American Society donc à chaque laboratoire de s’efforcer de limiter les
for Histocompatibility and Immunogenetics) suivie variations d’ordre technique par l’observation des
par 124 laboratoires entre 2010 et 2013, Israeli et al. bonnes pratiques de laboratoire et des recomman-
ont décrit un nombre non négligeable de spécificités dations de la SFHI. Parallèlement à ces études SFHI,
n’atteignant pas le consensus en classe 1 (entre 2 et un travail ponctuel américain rapportait une varia-
19 spécificités) ou en classe 2 (entre 1 et 4 spécifi- bilité interlaboratoires de l’ordre de 60 %, ramenée
cités) [15]. à environ 20 % (14) après normalisation des condi-
Plusieurs facteurs pourraient expliquer ces différences. tions opératoires et des techniques. Cette variabilité
Premièrement, les panels d’antigènes HLA proposés atteignait 30 % en France selon le groupe de travail
sont différents. Par exemple, les spécificités B59 et B67 SFHI sur 5 années, et ce dans les conditions usuelles

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d’utilisation par les 20 à 25 participants (Inter- and Anticorps non dirigés contre les produits des gènes
intra-laboratory reproducibility among French HLA labo- HLA-A, -B, -DRB1 et -DQB1
ratories using the One Lambda class I Single Antigen Le “Single Antigen” permet la détection des Ac anti-HLA
Flow Bead assay: a nation-wide SFHI study [P255, EFI dirigés contre les produits des gènes HLA-A, -B, -DRB1,
conference 2015-Genève]), donc sans imposer de -DQB1 mais aussi HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DPA1, HLA-
protocole opératoire unique. DQA1, HLA-DRB3/4/5. Cependant, il a été démontré que
les Ac ciblant ce dernier groupe d’antigènes peuvent
Standardisation de l’interprétation des profils conduire au rejet du greffon, sauf pour HLA-DPA1 pour
d’anticorps lequel aucune donnée n’a été publiée. Ainsi, la prise en
Deux études conduites par le même groupe de travail compte de ces Ac diffère selon les centres et parfois
SFHI en 2009 puis en 2013 auprès de 20 laboratoires même selon le statut immunologique du receveur.
français et portant sur la seule interprétation de En situation prégreffe, une autre source de variabilité
10 profils MFI en “Single Antigen” obtenus dans un lors de la saisie des antigènes interdits dans le dossier
laboratoire de référence avaient révélé des différences immunologique Cristal est liée à la prise en compte des
importantes d’assignation des spécificités interdites ou déséquilibres de liaison existant entre les gènes HLA-B et
permises. En 2009, cela se traduisait par un accès à la -C, HLA-DRB1 et -DRB3/4/5, ainsi que HLA-DRB1, -DQB1
greffe différant d’un facteur 2 à 50 selon les profils et et -DQA1. En effet, certains centres ont pris le parti d’in-
les équipes. En 2014, les mêmes profils réanonymisés terdire les antigènes HLA-B et/ou -DRB1 en déséquilibre
différemment avaient été reproposés en aveugle, et les de liaison avec les antigènes HLA-Cw, DR51/DR52/DR53
différences d’interprétation par rapport à 2009 étaient et -DQalpha afin de limiter les propositions de greffons
marginales (données non publiées). Dans cette étude, pour un receveur présentant une forte immunisation
les disparités étaient seulement liées à l’utilisation de contre ces derniers. La SFHI recommande désormais la
seuils et de modalités d’interprétation des profils “Single prise en compte des déséquilibres de liaison connus
Antigen” différents. entre HLA-DRB1 et HLA-DRB3/4/5 ou HLA-DQA1 pour
affiner la liste des antigènes à interdire dans Cristal.
Seuils de MFI
Outre les problèmes de standardisation des MFI inter- et Anticorps dirigés contre des allèles HLA
intralaboratoires, il existe une variabilité importante de Certains antigènes étant représentés par différents
l’interprétation des données “brutes” obtenues avec les allèles dans les trousses “Single Antigen”, il est fréquent
tests “Single Antigen”. Le seuil de “positivité” biologique d’observer des immunisations spécifiques d’allèles. Face
c’est-à-dire de définition de la présence d’un Ac, ou à ces Ac, l’attitude du biologiste peut varier, certains
clinique c’est-à-dire à partir duquel le résultat peut avoir interdisant d’emblée la spécificité antigénique, d’autres
une conséquence pour le patient ou sa prise en charge prenant en compte la fréquence du/des allèles incriminés.
n’est pas identique pour tous les laboratoires et leurs Par exemple, en cas de positivité d’une bille B*27:03
équipes de greffe, et peut de plus varier en fonction ou B*27:08 (allèles peu fréquents dans la population
de la situation prégreffe et postgreffe. caucasienne) et de négativité de la bille B*27:05 (allèle
En situation prégreffe, une MFI au maximum égale le plus fréquent), certains laboratoires interdisaient l’an-
à 500 obtenue avec la technique One Lambda a été tigène B27 et d’autres, non. La SFHI recommande, en se
définie par le groupe de travail HLA de l’Agence de la basant sur le rapport bénéfice/risque, de ne pas interdire
biomédecine (ABM) en 2009 pour définir les “antigènes la spécificité antigénique dans son ensemble dans ce
permis” lors de l’attribution des greffons rénaux, c’est- genre de situation, pour ne pas pénaliser abusivement un
à-dire les antigènes contre lesquels il est admis qu’un patient à cause d’une réactivité Ac qui sera très rarement
receveur ne possède aucune immunisation. En parallèle, rencontrée avec les donneurs portant cet antigène. On
une MFI supérieure à 1 000 ou 2 000 génère souvent comprend facilement l’impact majeur que peut avoir
un XM positif en méthode sensible telle que la CMF. cette réflexion pour des antigènes fréquents dans la
En situation postgreffe, la MFI des Donor-Specific population et possédant des allèles fréquents et rares.
Antibodies (DSA) de novo n’est pas non plus clairement
associée à la survenue d’épisodes de rejet humoral ou
de perte du greffon. Ainsi, chaque laboratoire alerte Conclusion
les cliniciens de la présence de DSA suivant un seuil de
MFI défini localement et parfois même différent selon Aussi puissante que soit une technique, il est nécessaire
le type d’organe transplanté. d’appréhender ses points forts et surtout ses points

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faibles pour une utilisation optimale au service des tation1 contribue à l’équité d’accès à la greffe et de prise
patients. La connaissance des causes de faux positifs en charge des patients transplantés sur l’ensemble du
et faux négatifs touchant le “Single Antigen” permet de territoire français. ■
mettre en place les moyens d’y remédier et de renforcer
le pouvoir diagnostique et pronostique de ce test. En
parallèle, l’effort commun des biologistes de la SFHI
1 Les recommandations du groupe technique SFT-SFHI ainsi qu’une liste complète des I. Jollet, A. Aarnink et
références bibliographiques ayant soutenu ce travail sont accessibles aux membres J. Visentin déclarent ne pas
concernant la standardisation technique et d’interpré- de la SFHI sur le site http://www.sfhi.eu. avoir de liens d’intérêts.

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Toute l’équipe
Edimark
vous souhaite
de très belles fêtes
de fin d’année

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