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Proteínas Inmunología
Proteínas Inmunología
Proteínas Inmunología
Cuantificación de proteínas
Cuantificación de proteínas
Cuantificación de proteínas
Cuantificación de proteínas
Producción de anticuerpos monoclonales
1
2
3
Inmunoensayos
Incoloro Amarillo
Ej.
pNPP
Generación de la señal:
a. Colorimétrica
b. Fluorimétrica
c. Quimioluminiscente
2H2O + D 4- metilumbeliferilferona + P
HRP AP
H2O2 +DH2 4- metilumbeliferilfosfato
Anti conejo
2H2O + D 4- metilumbeliferilferona + P
HRP AP
H2O2 +DH2 Anti conejo 4- metilumbeliferilfosfato
Anti cabra
O O OH
O O OH
HO O O
COOH
COOH
U
CH 3
Cl N NH
N=C=S
N N
Cl HO O O
FITC DTAF
4-metil-U
H3C CH 3
O N H3CH 2C CH 2CH 3
N CH 3
H3C N O N
H3CH 2C CH 2CH 3
O
C O O
C O
N=C=S
N=C=S
TRITC RBITC
-21-
Amplificación de señal
Fig 1A: A directly conjugated primary antibody binds specifically to the protein of interest
(antigen); Fig 1B: Multiple conjugated secondary antibodies bind to each primary antibody,
amplifying signal; Fig 1C: Further signal enhancement is achieved by using a biotinylated
secondary antibody, followed by a conjugated streptavidin.
Amplificación de señal
Fig 1A: A directly conjugated primary antibody binds specifically to the protein of interest
(antigen); Fig 1B: Multiple conjugated secondary antibodies bind to each primary antibody,
amplifying signal; Fig 1C: Further signal enhancement is achieved by using a biotinylated
secondary antibody, followed by a conjugated streptavidin.
Amplificación de señal
ELISA
lavado lavado
El antígeno se inmoviliza en
la placa. Se añade el anticuerpo primario Se agrega el sustrato y se convierte en
marcado que se unirá al un producto coloreado gracias a la
antígeno de interés. enzima; la intensidad del color es
proporcional a la cantidad del
antígeno de interés.
ELISA Indirecto
Se añade el anticuerpo
El antígeno se Se añade el anticuerpo Se agrega el sustrato para
secundario marcado que se
inmoviliza en la placa. primario que se unirá al generar la señal visible, la
unirá al anticuerpo
antígeno de interés. primario. intensidad del color es
proporcional a la cantidad de
anticuerpos primarios.
ELISA Sándwich
El antígeno queda atrapado entre 2 anticuerpos, uno de captura
(anticuerpo primario) y uno de detección (anticuerpo secundario
marcado con una enzima).
lavado lavado o
El anticuerpo primario Se agrega el antígeno de Se agrega el sustrato. Entre más colorida sea la muestra, más
se inmoviliza en la interés y la proteína proteína marcada contiene y por ende, menos antígeno de interés.
placa. marcada. Si la muestra es menos colorida, significa que se unió una mayor
cantidad del antígeno de interés.
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 232
Western Blot
Técnica inmunológica en sólido, rápida y muy sensible basada en la
especificidad de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo de la
interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA.
proteínas
A B C D E
Western BLOT
Todas Proteína
las de interés
proteínas
Electroforesis
INMUNOPRECIPITACIÓN
Inmunoprecipitación
A
AC
IRS PI3K
A
AC PDK2
IRS
A
AC
IRS PI3K
A
AC
IRS
Inmunohistoquímica
¿Qué es?
Es una técnica utilizada para identificar la presencia de
antígenos específicos en tejidos o células basándose en la reacción
antígeno-anticuerpo
¿Cómo lo hace?
Mide la expresión proteica utilizando anticuerpos específicos
marcados con una enzima que se unen a la proteína que
necesitas identificar.
¿Qué la hace diferente de las otras técnicas?
Se realiza en cortes de tejido y te dice exactamente en qué parte de
la célula se encuentra tu proteína de interés.
Inmunohistoquímica
2. Inclusión
Su propósito es sustituir el agua del tejido por un medio líquido capaz de solidificar la
muestra que le de la consistencia adecuada para poder realizar el corte de tejido.
3. Corte