Practica 7 y 8

Cuantificación de
proteínas
Práctica 7 y 8
(Análisis de datos)
• Muchas de las investigaciones se centran en el estudio de las
proteínas y sus funciones que realizan en el organismo… para su
estudio de manera general se siguen los siguientes pasos:
1) ¿Qué proteína se quiere analizar?
2) En caso de existir, hacer un análisis bioinformático de la proteína
(peso molecular, punto isoeléctrico, secuencia de aminoácidos)
3) Aislamiento de la proteína (identificación de localización de la
proteína, ej., citoplasma, lisosomal, vesículas de transporte, etc.)
4) Purificación
5) Análisis (análisis de secuencia, cuantificación, función)
Análisis experimental de la secuencia
de una proteína
• Actualmente, una de las herramientas más valiosas y precisas para analizar la
secuencia de una proteína después de que se purifica es la secuenciación.
• La secuenciación de proteínas mediante el método de Ed–man consiste en

marcar el extremo N–terminal de las moléculas con el reactivo químico
fenilisotiocianato (PITC).
• El método analítico maldi (matrix–

associated laser
desorption/ionizaton) acoplado a
espectrometría de masas , que
identifica los péptidos de acuerdo a su
huella de fragmentación iónica.
• Sin embargo, anteriormente para tratar de predecir la secuencia de
proteínas existían una serie de reacciones basados en la identificación
de propiedades de proteínas y que muchas veces fueron utilizados
para tratar de dilucidar la secuencia de una proteína.
Algunas de estas reacciones son:
Reacción de Biuret: El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en
solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH). La reacción se basa en la
formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación
de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm.
Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los

aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico
(Negativo) ( Positivo )
CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. (Prueba
general para proteínas y polipéptidos de cadena no menor de tres
unidades de aminoácidos)
Reacción Xantoproteica: Determina presencia o ausencia de
aminoácidos aromáticos, tales como la tirosina y el triptófano, que
pueden estar de forma libre o constituyendo proteínas solubles,
péptidos o polipéptidos.
La reacción xantoproteica utiliza ácido nítrico concentrado, calor y

un álcali neutralizador. Si al neutralizar la reacción la solución vira
de color amarillo a naranja la prueba se considera positiva. La
coloración observada es debida a la formación de compuestos
nitrogenados derivados de la nitrificación de los grupos bencénico
Reacción Millon: La reacción es debida a la presencia del grupo

hidroxifenílico (-C6H4OH) en la molécula proteica. Cualquier
compuesto fenólico no sustituido en la posición 3,5, como la
tirosina, fenol y timol, dan positiva la reacción.
Reacción cisteína y cistina: Tiene como objetivo la identificación
de aminoácidos azufrados (metionina, cisteína y cistina) gracias a
la reacción entre el azufre de estos aminoácidos con acetato de
plomo en medio alcalino formando sulfuro de plomo (precipitado
gris oscuro o negro).
.
(+) (-)
Reacción ninhidrina: La ninhidrina es un poderoso oxidante que

reacciona con el grupo amino de aminoácidos y proteínas a través
de una descarboxilación oxidativa en presencia de calor.
La ninhidrina se reduce a hidridantina al reaccionar con el amino

Rxn con grupo amino acido, que es convertido en aldehído, amoniaco y dióxido de
carbono. La hidridantina reacciona con el amoniaco liberado y otra
molécula de ninhidrina, generando un complejo purpura/violeta.
Con el aminoácido prolina genera un complejo amarillo
característico que sirve de ensayo específico para este aminoácido
Rxn con prolina
Reacción Hopkins-cole: El ensayo de Hopkins-Cole, también
conocida como la reacción de Adamkiewicz o ensayo del ácido
glioxílico, es un ensayo para la detección de triptófano en proteínas.
El ácido sulfúrico concentrado causa la deshidratación del triptófano,

que reacciona con el reactivo de Hopkins – Cole, generando un anillo
violeta/rojo en la interfase de las dos capas.
Formación del
anillo positivo
a la reacción.
Cuantificación de proteínas
La cuantificación de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados con proteínas en una multitud de
temas de investigación.
Los ejemplos más comunes de la importancia de cuantificación proteínas son:

1) Reportar la actividad específica de una enzima (esto es la velocidad a la que una cantidad definida de enzima
forma productos o usa el sustrato por unidad de tiempo)
2) Para realizar una carga de un homogenado de proteína en geles de poliacrilamida-SDS.
Los métodos de cuantificación más comunes son: Lowry, Bradford y Biuret.
Método de Lowry: Cuando a un péptido o proteína en disolución básica se

le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por
coordinación entre los nitrógenos del péptido con el ion metálico. En el
método de Lowry, el reactivo de Folin-Ciocalteu (mezcla de fosfomolibdato y
fosfotungstato) se añade para incrementar la cantidad de color desarrollado.
El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado
transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato,
reacción que produce una coloración azul que se lee a 750 nm.
Ventajas: Desventajas:
a) 10-20 veces más sensible que la medición a) El color varia dependiendo de la
de la absorbción uv de proteínas (280 nm). proteína.
b) Más sensible que la detección con b) Puede tener interferencia con
ninhidrina. detergentes y agentes reductores.
c) 100 veces más sensible que la reacción de
Biuret.
Método de Bradford: Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los residuos de
aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante Azul Coomassie.
El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar). · La
intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos
La cuantificación de proteína por la medida de la absorción a 280 nm depende de la presencia de los aminoácidos
aromáticos tirosina (Tyr) y triptófano (Trp).
Ventajas: Desventajas:
a) La muestra no se destruye durante la a) Puede producir resultados poco
determinación exactos cuando se tiene una
b) No es necesario producir una curva de mezcla de proteínas y ácidos
calibración. nucleicos.
c) No requiere esperar tiempos de incubación.
d) No utiliza reactivos adicionales
Método de Bradford: En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un
color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución
de albúmina. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces
peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad
del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).
• Los datos que a continuación se enlistan, fueron obtenidos con el propósito de
conocer la concentración de una enzima presente en la membrana plasmática,
las muestras se trataron con el reactivo de Bradford y se leyeron cuantificando
espectrofotométricamente a 280 nm.
Lo primero que se realizó fue obtener los datos de la curva patrón (estándar) con
una muestra de albumina con una concentración de 2 mg/mL:
Absorbancia Absorbancia
BSA (µg/µL) (280 nm) final Lo que deben realizar, son los mismos pasos
utilizados en la cuantificación de azúcares.
0 0.0805
1) Obtener la gráfica en Excel (recuerden restar la
0.5 0.1215 lectura de “0” a todas las muestras, incluidas las
de muestra problema) para que les sea más fácil
1 0.1735
visualizar estos valores adjunte la columna de
1.5 0.2215 “absorbancia final”
2) De la curva patrón para sacar la ecuación de la
2 0.285
recta
3) A partir de la ecuación de la recta calcular las
Proteína problema a 0.185 proteínas problemas a y b
Proteína problema b 0.283

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Cuantificación de

• La secuenciación de proteínas mediante el método de Ed–man consiste en

• El método analítico maldi (matrix–

Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los

La reacción xantoproteica utiliza ácido nítrico concentrado, calor y

Reacción Millon: La reacción es debida a la presencia del grupo

Reacción ninhidrina: La ninhidrina es un poderoso oxidante que

La ninhidrina se reduce a hidridantina al reaccionar con el amino

El ácido sulfúrico concentrado causa la deshidratación del triptófano,

Los ejemplos más comunes de la importancia de cuantificación proteínas son:

Los métodos de cuantificación más comunes son: Lowry, Bradford y Biuret.

Método de Lowry: Cuando a un péptido o proteína en disolución básica se

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