Informes-Bioquímica Pr-Toabanda Evelyn
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1. Demostrar la actividad catalitica de la enzima catalasa en diversos tejidos bajo diferentes condiciones
de ensayos.
La catalasa es una enzima que desempeña un papel fundamental en la protección de las células contra el
daño oxidativo al catalizar la descomposición del peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno.
Esta enzima es esencial para la supervivencia celular, ya que el peróxido de hidrógeno es un subproducto
común del metabolismo celular y puede ser tóxico si se acumula en grandes cantidades.
Estructura y Función:
La catalasa se encuentra comúnmente en los peroxisomas de las células eucariotas, y su función principal
es acelerar la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno, una molécula que puede dañar las
estructuras celulares y los componentes biológicos. La enzima catalasa es una proteína tetramérica
compuesta por cuatro subunidades idénticas, cada una conteniendo un grupo hemo que juega un papel
crucial en la catálisis de la reacción.
Reacción Catalítica:
Esta reacción es fundamental para mantener el equilibrio redox en las células y prevenir el estrés
oxidativo. La velocidad de esta reacción enzimática está influenciada por diversos factores, como la
concentración de sustrato (peróxido de hidrógeno) y la temperatura.
Activación de la Catalasa:
La actividad de la catalasa puede regularse mediante varios mecanismos. Uno de los principales es el
cambio conformacional de la enzima, que puede ser inducido por factores como el pH y la temperatura.
La catalasa tiende a mostrar su máxima actividad en un rango específico de pH, que suele ser ligeramente
alcalino. Además, la temperatura también puede influir en la actividad enzimática, alcanzando su punto
óptimo a temperaturas moderadas. La síntesis de la catalasa también puede estar regulada por la
expresión génica, siendo inducida en respuesta a la presencia de peróxido de hidrógeno u otros
compuestos oxidativos. Este proceso asegura que la célula tenga suficiente catalasa disponible cuando
sea necesario para contrarrestar el estrés oxidativo.
Importancia Biomédica:
La catalasa desempeña un papel crucial en la salud humana y animal, ya que su deficiencia puede
conducir a enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, como el síndrome de acatalasia. Además,
la enzima también se utiliza en estudios científicos y en medicina clínica para medir la cantidad de
peróxido de hidrógeno presente en muestras biológicas, proporcionando así información sobre el estado
oxidativo de un organismo.
Reactivos de laboratorio • HCl 5%
• Cl2Hg 5%
• NaOH 1%
Muestra • Manzana
• Hígado de res
• Papa
Materiales de laboratorio • Vaso de precipitado
• Espátula • Pipetas / pipetas Pasteur
• Gradilla • Mortero
• Gasa • Pinzas
• Vidrio reloj • Probeta
• Tubos de ensayo
Equipos de laboratorio
• Balanza anlítica
• Hornilla de calentamiento
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento
• Actividad catalítica
• Efecto de temperatura
• Efecto de HCl
• Efecto de NaOH
Resultados obtenidos
• Actividad catalítica
Muestra Observaciones
Papa Efervescencia, sin cambio de color, desprendimiento de oxígeno
Manzana Poca efervescencia, sin cambio de color, desprendimiento de oxígeno
Efecto de temperatura
Muestra Observaciones
Papa Poca efervescencia, sin cambio de color, sin desprendimiento de oxígeno
Tejido de cerdo+ agua dest+ Manzana + agua dest+ H2O2 Papa + agua dest + H2O2
H2O2 reactivo poco reactivo Sin reacción
3. Al trabajar con sustancias químicas como el peróxido de hidrógeno, y el ácido acético, es esencial
seguir las medidas de seguridad adecuadas, como el uso de guantes y gafas de protección.
Bibliografía
76 ALDABE, J., HUETO, A., JUNI, J., LÓPEZ, P., Biología, Ed. Erein, 1998, p. 125.
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica 4º Edición, Ed. Omega,
Martínez-Damián, MT, Cruz-Álvarez, O., Colinas-León, MTB, Rodríguez-Pérez, JE, & RamírezRamírez,
SP (2013). ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN MENTA
(Mentha piperita L.) ALMACENADA BAJO REFRIGERACIÓN. Agronomía
Mesoamericana , 24 (1), 57-69.
Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas
Carrera: Bioquímica y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Bioquímica
Numero de Tema de la práctica:
practica: 7 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA AMILASA
INTEGRANTES:
Las enzimas hidrolasas catalizan la división de un enlace covalente en el sustrato utilizando H2O como grupo
atacante:
A – B + H2O → A– OH + B – H
Para la mayoría de los humanos, el almidón es la principal fuente de glúcidos en la dieta.La digestión
comienza en la boca, donde la α-amilasa de la saliva hidroliza las uniones glucosídicasinternas (α l→4) del
almidón, dando lugar a fragmentos cortos de polisacáridos u oligosacáridos.
En el estómago, la αamilasa de la saliva es inactivada por el pH bajo, pero una segunda forma deα-amilasa,
secretada por el páncreas al intestino delgado, continúa el proceso de degradación.La α-amilasa pancreática
da lugar principalmente a maltosa y maltotriosa.
Para medir la actividad enzimática de la α-amilasa, se utilizará un test colorimétrico que detecta el
almidón. Para ello se contará con una solución de iodo/ioduro de potasio (I 2 /IK), ya que el almidón en
presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación
física: el iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas),
formando un complejo de color azul.
Cuando la α-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I 2 /IK
ya no dará una coloración azul. Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparición de sustrato (evidenciada
por el test colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan
las distintas condiciones en que actúa la enzima (pH, temperatura, concentración de NaCl), así como los
efectos que pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa, calor).
La dilución óptima nos indicará cuánto debemos diluir la saliva para que se logre el efecto acromático dentro
del rango propuesto (2-8 minutos).
IDENTIFICACIÓN DE LA AMILASA
Lugol
La prueba del lugol permite identificar la presencia de almidón. Con este reactivo se obtiene un positivo
cuando la muestra presenta color azul – violeta.
Reactivo de Fehling A y B
El reactivo de Fehling es un complejo tártrico cúprico formado por una solución por una solución A de
sulfato de cobre y una solución B de hidróxido sódico potásico; el tartrato en solución alcalina reacciona
con el hidróxido cúprico formando un ion complejo y da un óxido cuproso de color rojo que indica la
presencia de un reductor.
Los azúcares reductores reducen el ion cúprico a cuproso formando precipitado de óxido cuproso rojo.
Se emplean para reconocer monosacáridos y disacáridos. Si hay hidratos de carbono en exceso el óxido
cuproso puede ser reducido a cobre metálico. (L. Reyna M., 2004) Test de Biuret
Se produce en presencia de péptido y proteína, pero no en presencia de aminoácidos debido a que los enlaces
peptídicos se rompen al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali
concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret, que, en contacto con una solución de
sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta características. (GómezRivas, 2017)
REACTIVOS DE LABORATORIO
• Fehling A y B
• Reactivo de Biuret
• Lugol
• Lactosa solución al 1%
• D- fructosa 99%
• Almidón 2%
• Solución de NaCl
• Buffer pH 4
MATERIALES DE LABORATORIO • Vasos de precipitación
• Agitador
• Bísturi
• Termómetro
• Epátulas
• Cronometro
• Tubos de ensayo
• Gradilla
• Pinzas
• Pipetas
EQUIPOS DE LABORATORIO
• Estufa
• Baño de hielo
TÉCNICA OPERATORIA
2) Llevarlos a diferentes temperaturas por 10 minutos, 1 tubo a baño de Maria a 90°C, y el otro a
un baño de
3) hielo a 0°C, y otro a baño de maría a 37°C.
7) Esta será positiva si se torna de color naranja la reacción es positiva dado que se aprecia la
actividad enzimática de la enzima, si la rección es marrón oscuro, será negativa, dado que no ha
existido ruptura de
8) los enlaces debido a la inhibición enzimática.
EFECTO DEL pH SOBRE LA ENZIMA AMILASA
2) A cada tubo, agregar las soluciones Buffer a PH 4, 7, 10, o el que se disponga y agitar fuertemente.
6) Luego de haber pasado este tiempo, agregar al tubo # 1 0,5 ml de Lugol, para observar la 7)
especificidad de la enzima.
8) Al tubo # 2 agregar 5 gotas de reactivo de Biuret, para observar la presencia de proteínas.
9) Al tubo # 3, se agregará, 0,5 ml de Fehling A y 0,5 ml de Fehling B a temperatura de 90°C por 10)
máximo 5 minutos y observaremos la oxidación reducción de los azucares tornándose una reacción 11)
de color rojo ladrillo.
RESULTADOS OBTENIDOS
Resultado
• Se logró determinar que al realizar las pruebas y estas salir positivas, conlleva a que la enzima no
actuó de manera eficiente debido a las condiciones de trabajo
• Se puede determinar la temperatura óptima a la cual la amilasa muestra su máxima actividad
enzimática. Esto es crucial para comprender las condiciones en las que la enzima es más eficiente.
• Completar por parte del estudiante con las siguientes interrogantes:
Lugol :El lugol, también conocido como solución de Lugol, es una solución de yodo y yoduro de
potasio en agua. En la actividad enzimática de la amilasa, el lugol se utiliza como un reactivo para
detectar la presencia de almidón.
Fehling A y B
Los reactivos de Fehling A y Fehling B se utilizan para detectar la presencia de azúcares reductores,
como la glucosa, en una muestra. En el contexto de la actividad enzimática de la amilasa, estos
reactivos se pueden usar para medir la cantidad de azúcares simples producidos a partir de la
descomposición del almidón por la amilasa.
Reactivo de Biuret
El reactivo de Biuret se utiliza para detectar la presencia de proteínas en una muestra. En el contexto
de la actividad enzimática de la amilasa, el reactivo de Biuret puede utilizarse para medir la
concentración de proteínas, incluida la amilasa, en una muestra.
Lactosa solución al 1%
La D-fructosa al 99% puede ser utilizada como sustrato en la actividad enzimática de la amilasa. La
Dfructosa es un monosacárido, un tipo de azúcar simple, y puede ser descompuesta por la amilasa. Al
agregar D-fructosa al 99% a un experimento de actividad enzimática que involucra amilasa, se
proporciona a la enzima un sustrato para que actúe.
Almidón al 2%
La solución de NaCl, que es una solución salina de cloruro de sodio, puede tener varios usos en la
actividad enzimática de la amilasa. En general, el cloruro de sodio puede ser utilizado para ajustar el
entorno de reacción en un experimento enzimático, ya que puede influir en la actividad y estabilidad
de la enzima. Buffer pH 4
El buffer a pH 4 se utiliza en la actividad enzimática de la amilasa para proporcionar un entorno de
pH específico durante el experimento. Los buffers son soluciones que ayudan a mantener un pH
constante, lo que es crucial para muchas reacciones enzimáticas, incluida la actividad de la amilasa.
En el caso específico del buffer a pH 4, se utiliza para simular o mantener un entorno ácido. La amilasa
es una enzima que funciona de manera óptima en un rango de pH ligeramente ácido a neutro, por lo
que el buffer a pH 4 puede ser útil para estudiar la actividad enzimática de la amilasa en condiciones
ácidas.
2. ¿Por qué agrega almidón en los tubos de ensayo?
El almidón se agrega a los tubos de ensayo en pruebas de actividad enzimática de la amilasa porque
el almidón es el sustrato natural de la amilasa. La amilasa es una enzima que descompone el almidón
en azúcares más simples, como la maltosa y la glucosa, a través de un proceso de hidrólisis.
Al agregar almidón a los tubos de ensayo, se proporciona a la amilasa un sustrato sobre el cual actuar.
Luego, al medir la velocidad a la que el almidón es descompuesto en productos más simples, como la
glucosa, se puede determinar la actividad enzimática de la amilasa. Este tipo de prueba es común en
la investigación y en el estudio de las propiedades bioquímicas de las enzimas.
3. ¿Cuál de los pH utilizados en la práctica fue el óptimo para la actividad de la enzima amilasa?
En la práctica solo se realizó con pH 4 sin embargo, el pH 4 si es una manera óptima para realizar la
práctica
4. ¿Cuál de las temperaturas utilizadas en la práctica fue la óptima para la actividad de la enzima
amilasa?
La temperatura óptima para la actividad enzimática es de 37ºC, ya que, se pudo observar la máxima
cantidad enzimática a simple vista
5. ¿Cómo explica la especificidad de la enzima amilasa en esta práctica?
• El estudiante que vaya a donar la saliva debe ir bien hidratado, y que done más de lo necesario para
realizar alguna prueba adicional en el caso que se tenga alguna inquietud sobre los resultados obtenidos
Tener un control y estar precavido sobre el agua al calentar
BIBLIOGRAFÍA
Vargas Pérez, J. (2016). Identificación del gen de la α-amilasa de Arthrobacter sp. C27 Antártica
(Doctoral dissertation, ESPOL. FCV.).