UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE

MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

GERMINACIÓN IN VITRO DE Barkeria uniflora

LEX. DRESSLER & HALBINGER, UNA ORQUÍDEA
ENDÉMICA DE MÉXICO.

T E S I S
PARA OBTENER EL TÍTULO DE

B I Ó L O G O

P R E S E N T A:

IRVING JULIAN DUARTE SALINAS

DIRECTORA DE TESIS: M. en C. Bárbara Susana Luna Rosales

Financiado por: DGAPA-PAPIME PE206113

MÉXICO, D.F 2014

Este trabajo fue realizado bajo la
dirección de la Maestra en Ciencias
Bárbara Susana Luna Rosales, en la
Unidad de Investigación en Biología
Vegetal en La Facultad de Estudios
Superiores Zaragoza de la
Universidad Nacional Autónoma de
México.

In Memoriam Maestro Amadeo Barba Álvarez

 AGRADECIMIENTOS

A la M. en C. Bárbara Susana Luna Rosales por todo su apoyo, tiempo,

confianza, disposición y ayuda brindada para la elaboración de ésta tesis. Pero
sobre todo gracias por su amistad.

Al M. en C. Armando Cervantes Sandoval por todo su apoyo brindado

para el término de esta tesis.

A los miembros del jurado, por su tiempo, disposición y aportaciones

durante la revisión de la tesis.

Biól. Juan Romero Arredondo

M. en C. Bárbara Susana Luna Rosales
Biól. Marco Antonio Hernández Muñoz
Dra. Hortensia Rosas Acevedo
M. en C. Florencia Becerril Cruz
 DEDICATORIAS

A mis padres, por su paciencia, comprensión, su inmenso apoyo, sus

palabras de aliento, por todo el esfuerzo y sacrificio, pero sobre todo por su gran
cariño y amor, siempre estaré agradecido por su ayuda incondicional.

A mis hermanos, por estar siempre conmigo, por compartir mis metas y
derrotas, sus consejos y apoyo, pero sobre todo, gracias por ser mis mejores
amigos.

A mi má Juana, por estar siempre a mi lado, por apoyarme siempre, por

tu amor, cariño y buenos consejos, tu confianza y educación. A mi pá Santos,
aunque ya no estés en este mundo siempre estaré agradecido por todo el apoyo,
amor y educación que siempre me brindaste.

A Martha, gracias por tu inmenso apoyo, tu amor, tus consejos, por estar
conmigo en las buenas y en las malas, tus palabras de aliento, tus regaños, por
hacer más alegres esos días de trabajo en el laboratorio, te agradezco por
ayudarme a crecer como persona.

A mis compañeros, Alejandra, Héctor, Bernardo y Paola, por hacer las

prácticas de campo más divertidas, por su apoyo en el laboratorio y por su
amistad.

A mis amigos del Museo de la Luz, de la FES ZARAGOZA,

especialmente a Oscar, Aldo y Ramiro, gracias por todo su apoyo, por todos los
buenos y malos momentos y por todas sus palabras de aliento.
 Gracias maestro Amadeo, por su apoyo, confianza, tiempo y ayuda
brindada para la elaboración de ésta tesis, gracias por sus consejos, su
confianza, sus enseñanzas y conocimiento. Pero sobre todo por su amistad,
por esas largas y amenas pláticas que teníamos, por todos esos momentos
de risas y por haberme orientado acertadamente un gran número de veces.
Siempre lo recordaré.
 ÍNDICE

RESUMEN ............................................................................................................... I

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1

ANTECEDENTES ................................................................................................... 3

Generalidades de las Orquídeas .......................................................................... 3

Germinación de las Semillas de Orquídea .......................................................... 7

Reproducción ...................................................................................................... 10

Cultivo in vitro ..................................................................................................... 10

Cultivo in vitro de Orquídeas ............................................................................. 11

Medios de cultivo ................................................................................................ 12

Medios Nutritivos ................................................................................................ 13

Sales inorgánicas ................................................................................................ 13

Carbohidratos ...................................................................................................... 14

Carbón Activado .................................................................................................. 16

Materiales inertes de soporte ............................................................................. 16

Género Barkeria (Knowles y Wetc., 1838) ......................................................... 17

Clasificación taxonómica ................................................................................... 17

Descripción Botánica Barkeria uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb. .. 18

Distribución ......................................................................................................... 19

Ecología ............................................................................................................... 20

Estado de conservación ..................................................................................... 21

CULTIVO IN VITRO DEL GÉNERO Barkeria ...................................................... 22

JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 23

HIPÓTESIS ........................................................................................................... 24

OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 25

OBJETIVOS PARTICULARES ............................................................................. 25

MATERIAL Y MÉTODO ........................................................................................ 26

Material Biológico ............................................................................................... 26

Evaluación de Viabilidad .................................................................................... 26

Medios de Cultivo ................................................................................................ 27

Carbohidratos Experimentales .......................................................................... 27

Desinfestación y siembra de semillas ............................................................... 28

Evaluación de la Germinación ........................................................................... 29

Evaluación del Índice de Desarrollo .................................................................. 29

Evaluación del estadio 8 a los 98 días de cultivo ............................................. 30

Diseño estadístico............................................................................................... 30

RESULTADOS ...................................................................................................... 32

Viabilidad ............................................................................................................. 32

Germinación de semillas de Barkeria uniflora.................................................. 33

Índice de Desarrollo ............................................................................................ 36

Índice de Desarrollo para el Medio Murashige & Skoog .................................. 41

Índice de Desarrollo para el Medio Kao y Michayluk ....................................... 46

Índice de Desarrollo para el Medio Knudson C ................................................ 50

Respuesta Morfogénica en los diferentes Carbohidratos. .............................. 55

Medio MS al 100 % .............................................................................................. 55

Medio MS al 75 % ................................................................................................ 56

Medio MS al 50 % ................................................................................................ 57

Medio KM al 100 % .............................................................................................. 57

Medio KM al 75 % ................................................................................................ 58

Medio KM al 50 % ................................................................................................ 59

Medio KC al 100 % ............................................................................................... 60

Medio KC al 50 %................................................................................................. 61

Plantas Completas a los 98 días de cultivo. ..................................................... 62

DISCUSIÓN .......................................................................................................... 65

CONCLUSIONES ................................................................................................. 72

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 72

ANEXOS ............................................................................................................... 82

Anexo 1. Composición de los medios nutritivos. ............................................ 83

Anexo 2. Resultados ........................................................................................... 84

Anexo 3 Análisis de varianza para ID por todos los tratamientos. ................ 84

Anexo 3.1 Rangos Múltiples para ID por Tiempo. ............................................ 84

Anexo 3.2 Rangos Múltiples para ID por Medio nutritivo. ............................... 85

Anexo 3.3 Rangos Múltiples para ID por [ ] Sales. ........................................... 85

Anexo 3.4 Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos.................................. 85

Anexo 3.5 Análisis de varianza para el ID por Medio MS. ................................ 85

Anexo 3.6 Rangos Múltiples para ID por Tiempo (MS)..................................... 86

Anexo 3.7 Rangos Múltiples para ID por [ ]Sales (MS). ................................... 86

Anexo 3.8 Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos (MS). ........................ 86

Anexo 3.9 Análisis de varianza para el ID por Medio KM................................. 86

Anexo 3.10 Rangos Múltiples para ID por Tiempo (KM). ................................. 87

Anexo 3.11 Rangos Múltiples para ID por [ ] Sales (KM). ................................ 87

Anexo 3.12 Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos (KM). ...................... 87

Anexo 3.13 Análisis de varianza para el ID por Medio KC. .............................. 87

Anexo 3.14 Rangos Múltiples para ID por Tiempo (KC). .................................. 88

Anexo 3.15 Rangos Múltiples para ID por [ ] Sales (KC). ................................ 88

Anexo 3.16 Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos (KC). ...................... 88

Anexo 3.17 Análisis de varianza plantas completas. ....................................... 88

Anexo 3.18 Rangos Múltiples para plantas completas .................................... 88

 RESUMEN

Barkeria uniflora (Lex.) es una orquídea epífita endémica de México con

flores de gran belleza que se ha visto afectada por la alteración de su hábitat,
propiciado por la intensa actividad humana y por la extracción de ejemplares
adultos con fines de ornato o comerciales.
El presente estudio tuvo como objetivo establecer un protocolo efectivo
para la germinación de B. uniflora por medio del estudio del efecto de distintas
fuentes exógenas de azúcares y de medios nutritivos a diferentes
concentraciones. Se indujo la germinación a partir de la siembra de semillas de B.
uniflora durante 98 días se registró el desarrollo ontogénico y el índice de
desarrollo, al término del cultivo se determinó el porcentaje de plantas completas
obtenidas. Los medios nutritivos utilizados fueron las sales inorgánicas analíticas,
Kao y Michayluk (KM), Murashige & Skoog (MS) y Knudson C, en una
concentración del 100 %, 75 % y 50 %, suplementados con sacarosa, fructosa,
glucosa, maltosa y galactosa como fuente exógena de azúcar.

Las semillas germinaron a partir de los siete días de iniciado el cultivo en

todos los tratamientos, excepto en aquellos suplementados con galactosa. El
máximo porcentaje de germinación fue de 99 %, en los medios con maltosa,
fructosa, glucosa y sacarosa.

El medio de cultivo Kao y Michayluk (KM) fue el que promovió de mejor

manera el desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora ya que para los 56 días
de cultivo los protocormos ya presentaban una hoja, seguido por el medio
Murashige & Skoog y por último el medio Knudson C. Las sales inorgánicas
diluidas a la mitad de su concentración son las que generan una mayor respuesta
para la germinación de B. uniflora independientemente del medio de cultivo usado.

~I~
 La maltosa y fructosa como fuente exógena de carbón y de energía induce
el desarrollo morfológico del embrión en las semillas de Barkeria uniflora y
concluyen su desarrollo a los 91 días de cultivo. La galactosa es tóxica para las
semillas de B. uniflora ya que no inducen su germinación y éstas mueren.

El máximo porcentaje de plantas completas se obtuvieron en el medio MS

con el estímulo de maltosa (84 %) y en KM adicionado con fructosa (83 %). Se
estableció así un protocolo de germinación asimbiótica in vitro para las semillas de
Barkeria uniflora, como una estrategia de conservación con la finalidad de reducir
la presión en las poblaciones silvestres de esta especie.

~ II ~
 INTRODUCCIÓN

México es un país con una excepcional riqueza biológica, en parte debido a su

ubicación geográfica, ya que se sobrepone y entrelaza con 2 regiones biogeográficas:
la neártica y la neotropical (Hágsater et al., 2005). A esta condición se suma una
compleja historia geológica y una accidentada topografía, lo que explica la enorme
variedad de condiciones ambientales que hacen posible la inmensa heterogeneidad en
su diversidad biológica. En México es posible localizar 10% de las especies de plantas
superiores del planeta, y más del 40% de ellas son exclusivas del territorio nacional, es
decir son especies endémicas (CONABIO, 2000). Las familias de plantas mejor
representadas en México son las Asteraceae, Fabaceae, Poaceae y Orchidaceae, esta
última con aproximadamente 1260 especies y 170 géneros (Villaseñor, 2003; Hágsater
et al., 2005; Soto et al., 2007) y se estima que el número final de especies estará entre
1 300 y 1 400, lo que le confiere el cuarto lugar en cuanto a riqueza de especies
vegetales (Hágsater et al., 2005).

La Orchidaceae incluye aproximadamente 800 géneros y alrededor de 20,000

especies. Los miembros de esta Familia se pueden encontrar en todo el mundo,
aunque su presencia es más importante en el cinturón tropical del planeta en donde se
encuentra casi el 56 %. (Espejo et al, 2002). En México la riqueza Orquideológica se
manifiesta con más de 1260 especies, el porcentaje de endemismos es alto,
aproximadamente 40 % de especies, 8 % de géneros y generalmente se delimita a
cadenas montañosas o a zonas de extensión reducida. (Luna et al, 2007). Las
Orquídeas se ubican al sur del Trópico de Cáncer, desde las costas del Pacifico y del
Golfo, en altitudes que pueden rebasar los 3, 500 m. (Espejo y López-Ferrari, 1998;
Hágsater et al, 2005; Soto, 1988).

~1~
 La Orchidaceae se considera la más evolucionada dentro del reino vegetal, ya
que presentan una gran complejidad y especialización en su morfología floral y en sus
tipos de polinización. Lo anterior es el resultado de sus numerosas adaptaciones
estructurales y funcionales. Algunas de las más interesantes son las que están
relacionadas con sus semillas y con los procesos relacionados a la germinación y al
desarrollo de las plántulas. Asimismo existen dentro de la familia muy diversas formas
de vida y desde el punto de vista ecológico muchos de sus integrantes son
componentes importantes en diversos tipos de vegetación. (Espejo et al, 2002).

Dado la belleza y rareza de sus flores, un gran número de especies son

buscadas por horticultores y el público en general, por lo que constituye además una
importante fuente de ingreso para algunos países tropicales. (Espejo et al, 2002).

Una de las características más interesantes de esta familia es su alta

proporción de especies endémicas, se han registrado 444 especies o subespecies que
corresponden aproximadamente al 40 % del total del taxa en el país. (Espejo et al,
2002). Lo anterior la convierte en una de las familias más ricas en endemismos entre
los países de América Tropical. (Hágsater et al, 2005).

Las Orchidaceae es una de las familias más vulnerables por la destrucción y

transformación de sus hábitats, crecimiento urbano desordenado, extracción masiva de
plantas de poblaciones silvestres (tráfico ilegal de especies), dado su alto valor
hortícola, comercial y por las características ecológicas que presentan las especies,
como sus bajas tasas de crecimiento, ciclos de vida relativamente largos y el escaso
reclutamiento de nuevos individuos en condiciones naturales (Sarmiento y Romero,
2000).

Las orquídeas presentan problemas serios para su propagación en forma

natural debido a que la mayor parte de las semillas están escasamente diferenciadas
por lo que no se les distinguen los cotiledones ni las radículas y carecen de
endospermo (Pierik, 1990).

~2~
 Es bien conocido el largo periodo de tiempo que se requiere para la
propagación; establecimiento, desarrollo y floración de las orquídeas, sin embargo es
posible disminuir este tiempo e incrementar las poblaciones a través de modernas
técnicas biotecnológicas de cultivo; suministrando las condiciones óptimas y los
nutrimentos necesarios para su crecimiento y desarrollo (Francisco, 2008).

La presente investigación tuvo como finalidad establecer un protocolo de

germinación in vitro para Barkeria uniflora, especie endémica, por medio del estudio del
efecto de distintas fuentes exógenas de azúcares y de medios nutritivos a diferentes
concentraciones para su conservación y desarrollo sostenible.

ANTECEDENTES

Generalidades de las Orquídeas

Las orquídeas son plantas herbáceas perennes, de hábito epífito, terrestre,

litófilo, semiacuático, saprófito y raramente subterráneo (restringidas a Australia).
Presentan una estructura básica a la de muchas otras monocotiledóneas. Están
constituidas por vástagos organizados que pueden generan dos hábitos de crecimiento;
en el primer tipo de crecimiento, el desarrollo se da mediante la extensión vegetativa a
partir de un meristemo apical que da lugar a un solo eje principal (monopodial). Entre
las orquídeas mexicanas este tipo de crecimiento se presenta principalmente en las
vainillas, en los géneros Campylocentrum, Dendrophylax y Dichaea y en algunas
especies de Epidendrum.

~3~
 En el segundo el eje está formado por una serie de vástagos generados de
manera consecutiva a partir de meristemos o yemas de renuevo situadas basal, lateral
o apicalmente en el vástago anterior, el conjunto de vástagos forma un eje compuesto
(simpodial) (Fig.1). En los géneros Cattleya, Laelia, Oncidium, Cymbidium se aprecia
este tipo de crecimiento (Bell y Bryan, 1991).

Figura 1. Tipos de crecimiento en orquídeas: a) Simpodial, b) Monopodial.

Los tallos de las orquídeas son comparables a una caña o carrizo. Pueden ser
caulescentes o acaules. Las orquídeas con tallo caulescentes por lo general presentan
pseudobulbo, los cuales son tallos aéreos notablemente engrosados, presentes en
muchas orquídeas epífitas y algunas terrestres o rupícolas, como en el género
Cyrtopodium (Hágsater et al., 2005).

Están formados por segmentos o entrenudos delimitados por nudos o anillos

cicatrizales donde originalmente se insertaban hojas, vainas o escamas foliares: son de
distintas formas y grosores. Las orquídeas acaules tienen un tallo corto, como en
muchas orquídeas terrestres que presentan tubérculos o cormos característicos en
varios grupos de orquídeas epidendroides terrestres como Bletia, Govenia, Liparis y
Malaxis (De la Cruz, 2006).

~4~
 Ambos tipos de tallos engrosados son útiles como almacenes de agua y
sustancias de reserva, como el almidón, que son utilizados para sustentar la producción
de flores y frutos y el desarrollo de vástagos (Hágsater et al., 2005).

Las raíces de las orquídeas son órganos que presentan diferentes

adaptaciones. Tienen las funciones de absorber agua, nutrientes y fijar la planta al
suelo o a materia orgánica acumulada en troncos. Son simples o ramificadas, carnosas
y con un diámetro aproximado de entre 1 y 10 mm dependiendo de la especie. Por lo
general son circulares con corte transversal (Hágsater et al., 2005). La porción más
externa de la raíz es la epidermis, que suele formar un tejido esponjoso constituido por
células que al madurar mueren y pierden el citoplasma, quedando sólo sus paredes
parcialmente engrosadas, está cubierta de células muertas llamada velamen puede
tener entre una y ocho células de grosor y es lo que le confiere el aspecto blanquecino
característico a muchas raíces de orquídeas epífitas como Barkeria scandens y Laelia
autumnalis (Hágsater et al., 2005).

Las hojas son como en la mayoría de las monocotiledóneas, es decir simples,

con nervaduras paralelas, alargadas, generalmente persistentes, solitarias, en número
de dos o más hojas, lanceoladas, trianguladas, forma ovalada y de color generalmente
verde (De la Cruz, 2006).

Estos órganos pueden ser filiformes y hasta orbiculares, membranosas o

coriáceas e incluso pueden almacenar agua (Dressler, 1981). En algunas especies
como las pertenecientes al género Trichocentrum, donde los pseudobulbos son
diminutos, las hojas cumplen el papel de almacenar agua y de reservas alimenticias
(Hágsater et al., 2005; De la Cruz, 2006). Las hojas suculentas presentan una inversión
importante de recursos para la planta y por lo general son funcionales durante varios
años. Una estrategia alternativa es la producción de hojas delgadas relativamente poco
costosas que mueren y caen al finalizar cada temporada de crecimiento (Hágsater et
al., 2005).

~5~
 La flor está constituida por tres sépalos generalmente coloreados, al igual que
los pétalos y pueden estar libres o más o menos unidos formando un tubo. El sépalo
dorsal difiere generalmente en la forma de los laterales, los cuáles son más o menos
oblicuos y pueden estar libres uno del otro o adheridos frecuentemente por la base,
(Fig. 2). Se componen de 3 pétalos, dos son semejantes morfológicamente y el tercero
llamado labelo está modificado, su posición inferior corresponde al giro del pedicelo o
de éste y el ovario (resupinación) (Hágsater et al., 2005).

Figura 2. Morfología básica de la flor en orquídeas: Género Cymbidium

El labelo generalmente difiere en forma, tamaño y coloración de los otros

pétalos, la superficie interna generalmente está adornada con papilas o lamelas y la
base puede ser pequeña o muy amplia formando un nectario. Las flores de las
orquídeas por lo general son hermafroditas y portan tanto órganos sexuales masculinos
(estambres y sus anteras) como femeninos (ovario, estilo y estigma), para constituir una
estructura única llamada columna o ginostemio.

~6~
 En muchas especies un lóbulo estigmático llamado rostelo, se proyecta sobre la
superficie estigmática que permite adherir los polinios a los insectos. La antera puede
estar dividida y contener 2, 4, 6 y 8 polinios y se ubica en una cavidad llamada
clinandrio. Tienen ovario ínfero con 1-3 divisiones que puede ser inconspicuo o notorio
(Hágsater et al., 2005).

Entre las características más notables de las orquídeas está el tamaño y

estructura de las semillas. Tienen un peso promedio de 3 a 14 µg y miden de 0.4 a 1.25
mm de longitud y de 0.08 a 0.27 mm de ancho, la semilla contiene un pequeño embrión
esférico o piriforme dentro de una testa membranosa, frecuentemente transparente o
bien pigmentada. La mayoría de las especies tienen embriones relativamente
indiferenciados, sin cotiledones, ni endospermo, lo cual se considera una característica
de grupos avanzados evolutivamente.

El número de semillas producido por fruto varía con el género y la especie,

fluctúan de 1 300 a 4 000 000 (Chávez, 1980; Arditti, 1992), Chávez (1980) reportó para
frutos de Bletia urbana entre 92 625 y 117 200 semillas.

Hay algunas semillas que presentan un embrión relativamente diferenciado que

incluye un cotiledón rudimentario, como en Sobralia macrantha y otras que no tienen
embrión diferenciado y carecen de cotiledón o se presenta incipiente y sin endospermo,
por lo que las reservas nutritivas se encuentran almacenadas en las células del
embrión, además al suspensor se le atribuye parte del papel de la nutrición (Arditti,
1967).

Germinación de las Semillas de Orquídea

El proceso de germinación es similar en todas las especies de Orquídea (Arditti,

1992), este comienza con el hinchamiento del embrión (imbibición) y rompimiento de la
testa (Estadio 2), el embrión se elonga para formar una estructura globular llamada
protocormo (Estadio 3) (Harrison, 1977; Leroux et al., 1995) en éste, se forma una
depresión en la superficie más alta y los pelos absorbentes comienzan a crecer de la
epidermis.

~7~
 Un primordio foliar (Estadio 4) emerge de esta depresión a medida que el
protocormo sigue creciendo y una segunda (Estadio 5) y tercera hoja se forman
precedidas por el desarrollo de la raíz (Estadio 6). El tiempo requerido para cada uno
de estos estadios varía de acuerdo a la especie de orquídea (Knudson, 1922 en Baker
et al., 1987).

En las semillas de orquídea, los tres primeros estadios de germinación suceden

secuencialmente sólo por la presencia de agua y de sus propias reservas, pero la
progresión en los estadios superiores depende de la presencia de un hongo simbionte.
Sin una fuente externa de glúcidos el protocormo es incapaz de producir los azucares
necesarios para la organogénesis; el protocormo sobrevive gracias a la lenta utilización
de sus reservas lipídicas y proteínicas (Arditti, 1966; Harrison, 1977; Harrison y Arditti,
1978, Arditti et al., 1990, Leroux et al., 1995, Stacanto et al.,1998), pues hay evidencias
que indican que las semillas no poseen glioxisomas, los organelos necesarios para el
metabolismo de los lípidos en la obtención de carbohidratos (Harrison, 1977; Leroux et
al., 1995; Stacanto et al., 1998). Esto explica la necesidad de las semillas de orquídea
de una fuente externa de carbohidratos; por tal motivo, en su hábitat natural establecen
una relación simbiótica con un hongo micorrízico (Arditti, 1966, 1979; Harrison, 1977;
Harrison y Arditti, 1978, Arditti et al., 1990, Leroux et al., 1995, Stacanto et al., 1998).

El proceso de germinación, aunque con algunas diferencias, es similar entre la

mayoría de las orquídeas (Arditti, 1993). Este proceso inicia con la absorción de agua
por el embrión, posteriormente esta estructura se hincha y ensancha, sus células se
alargan, se vacuolan por lo que el embrión asume una forma esférica (etapa de esférula
pequeña), después estas células hacen presión constante con la testa hasta romperla.

Las células del embrión inician con síntesis de clorofila, utilizan el material
alimenticio almacenado de la semilla, y una vez iniciado el crecimiento, continúa con la
absorción de la materia orgánica del sustrato y comienza la diferenciación de los
órganos, se desarrollan rizoides a partir de la epidermis y a su vez se desarrolla el
domo meristemático en la base del ápice (Shushan, 1959).

~8~
 Conforme esta estructura aumenta en tamaño se forma una masa globular de
células (protocormo) con una depresión en su superficie superior. El primordio foliar
emerge a partir de esta depresión conforme el protocormo continúa su desarrollo Una
segunda y una tercera hoja se forman precedidas por el desarrollo de la raíz, se forma
clorofila en las hojas o en otros órganos. (Fig. 3). El tiempo requerido para cada uno de
estos eventos varía de acuerdo a las especies (Arditti, et al,. 1979; Baker et al., 1987).

Figura 3. Estadios ontogénicos de Laelia sp. Según Seaton y Ramsay (2005).

~9~
Reproducción
Todas las orquídeas requieren para su germinación y desarrollo una asociación
con hongos micorrízicos (Otero y Bayman, 2009). La micorriza orquideoide se
caracteriza porque la mayoría de los hongos que participan en la asociación son del
género Rhizoctonia, la cual establece una asociación particular con las orquídeas, ya
que la planta en su estado de semilla es totalmente dependiente de los nutrientes que
le suministra el micosimbionte para lograr una exitosa germinación (Bernard, 1909;
Arditti, 1992; Otero y Bayman, 2009). En las células corticales de las raíces el hongo
origina una estructura denominada “pelotón” que es un enrollamiento hifal (Hadley y
Williamson, 1972).

Un estudio realizado por Knudson (1946), demostró que es posible la

germinación asimbiótica de embriones de orquídeas in vitro, sin la presencia del hongo,
mediante el cultivo en un medio que contenga minerales y azúcares. La reproducción
sexual de las orquídeas por los métodos convencionales de propagación presenta
problemas ya que la semilla es tan pequeña que contiene muy pocas o ninguna reserva
alimenticia.

Cultivo in vitro

El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una definición genérica que incluye el

cultivo de protoplastos, células, tejidos, órganos y plantas. Estos diferentes tipos de
cultivo tienen como factor común el crecimiento en condiciones asépticas, en un medio
nutritivo, generalmente gelificado, y en condiciones ambientales controladas y por lo
tanto óptimas (Estopa, 2005).

~ 10 ~
Cultivo in vitro de Orquídeas

Tradicionalmente las orquídeas se han propagado asexualmente mediante

división de plantas. Sin embargo, se ha demostrado que es posible obtener un gran
número de plantas a partir de la germinación de semillas utilizando métodos de cultivo
in vitro (Arditti y Ernst, 1993).

Diversos medios nutritivos han sido desarrollados para el cultivo in vitro de

orquídeas, estos han sido ampliamente aplicados en varias especies de esta familia, los
medios se han enriquecido, y mejorado, registrándose resultados para su propagación.
Una producción masiva de orquídeas se justifica con el uso de esta técnica ya que las
orquídeas tienen un alto valor biológico, ecológico y comercial, mediante este proceso
se puede mantener una producción anual contínua, además de que están libres de
patógenos, lo cual es muy útil si se piensa en exportación y en estudios de
conservación.

La propagación in vitro de orquídeas se ha establecido a partir de segmentos de

plántulas adultas, principalmente en medios de cultivo semisólidos (George y
Sherrington, 1984).

Desde que Knudson desarrolló un método de cultivo in vitro asimbiótico para la

germinación de semillas de orquídeas, este método tuvo un papel muy importante y
significativo para la propagación de especies de orquídeas y de híbridos (Yoneo, 1991).

La técnica de germinación asimbiótica ha sido utilizada en muy diversas

especies de orquídeas con fines de propagación, así como para estudiar el desarrollo
de las plántulas. Harrison y Arditti en 1978; Manning y Staden en 1987 y Gravel en
1989 reportaron que ésta técnica ha permitido obtener conocimientos sobre las
características morfofisiológicas y ontogénicas de protocormos y plántulas de ciertos
grupos durante la germinación in vitro.

~ 11 ~
Medios de cultivo

En 1946, Knudson demostró que las semillas de orquídea podían germinar en

ausencia del hongo micorrízico que las coloniza, cultivándolas in vitro en un medio de
cultivo adicionado con sales minerales y azúcares. Knudson logró germinar semillas de
Cattleya, Epidendrum, Laelia y otras orquídeas.

Sin embargo, varios autores han demostrado que no siempre es posible que
una especie de orquídea determinada logre germinar y se desarrolle en un medio de
cultivo dado. Por tal motivo un gran número de autores ha propuesto una serie de
medios de cultivo para géneros de orquídea específicos. Dentro de los medios más
importantes están: Knudson B (1922); Knudson C (1946); Murashige y Skoog (1962)
entre otros (Ballard, 1987; George et al., 1987; Pierik, 1990; García et al., 1993).

Un medio de cultivo consta de sales inorgánicas, vitaminas, aminoácidos,

azúcares y reguladores de crecimiento. Existen diferentes tipos de medios de cultivo
disponibles; sin embargo, algunos son específicos para ciertas especies.

El medio de cultivo utilizado para la germinación asimbiótica es más complejo

que para la germinación simbiótica, ya que todos los nutrientes orgánicos e inorgánicos
y los azúcares deben estar disponibles para la orquídea en una forma apropiada,
puesto que ya no existe la intermediación del hongo (McKendrick, 2000).

Cuando se inicia el proceso de germinación para una nueva especie es

aconsejable probar con diferentes medios de cultivo a una concentración total y parcial
para determinar cuál es el mejor medio para dicha especie (McKendrick, 2000).

Según Thompson (1989), el medio de cultivo puede ser preparado utilizando

cada uno de los ingredientes básicos o bien con una mezcla de sales basales
comerciales.

~ 12 ~
Medios Nutritivos

Se han descrito un gran número de medios nutritivos para el cultivo de

vegetales in vitro. Merino (1987), señala que el éxito que se obtenga en un cultivo de
tejidos vegetales depende del uso del medio nutritivo adecuado, como también del
empleo de tejidos viables, incubación, calidad de reactivos, asepsia, etc. Usando las
sustancias químicas necesarias y las combinaciones apropiadas de nutrientes, así
como su forma química adecuada, ha sido posible establecer cultivos para casi todas
las partes de una planta en diversas especies vegetales.

Al utilizar las sustancias químicas necesarias y las combinaciones apropiadas

de nutrientes, así como su forma química adecuada, es como ha sido posible
establecer cultivos para casi todas las partes de una planta en diversas especies
vegetales.

Sales inorgánicas

La composición mineral o sales inorgánicas se definen en forma precisa en

cada uno de los medios nutritivos y está dada tanto por macroelementos (N, P, K, S, Mg
y Ca) como por microelementos (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Mo, Al, I y Fe). Estos nutrientes
deben estar en una concentración tal que permita el adecuado crecimiento celular.

Los requerimientos de nitrógeno son generalmente provistos por una mezcla de

nitrato y amonio en concentraciones variables. Cuando estas fuentes son
suplementadas en forma individual se afectan, generalmente en forma negativa, tanto el
crecimiento del cultivo como la producción de metabolitos (Ertola et al., 1994).

~ 13 ~
 Muchas células vegetales son sensibles a los niveles de fosfatos en el medio.
Habitualmente, los fosfatos son almacenados en la vacuola y adquiridos desde allí para
el crecimiento, mientras que la síntesis de metabolitos comienza al agotarse el fosfato
vacuolar (Ertola et al., 1994).

El hierro es esencial para el crecimiento celular. Se aconseja la utilización del

quelato Fe-EDTA que aumenta la solubilidad del hierro.

La naturaleza y concentración de los micronutrientes empleados en los medios

de cultivo surgen principalmente de resultados empíricos al evaluar la capacidad de
cada elemento que afectan en el crecimiento. Los principales micronutrientes son el
boro, el manganeso, el iodo y el zinc. No hay un estudio sistemático de su influencia en
el crecimiento y la productividad.

Con el fin de optimizar las necesidades nutricionales de las diferentes especies

de plantas se han realizado investigaciones dando como resultado la formulación de
varias mezclas salinas; como es el caso de las fórmulas de Kao & Michayluk (1975) y
Mitra y colaboradores (1976), que incluyen altas concentraciones de macronutrientes,
como el nitrógeno en forma de NH4, N03 y KN03; a diferencia, de la fórmula de Knudson
(1946) empleada principalmente para orquídeas.

Carbohidratos
Los carbohidratos además de ser una fuente de carbono y energía para el
embrión son el estímulo disparador para su desarrollo morfogénico durante la
germinación (Luna y Barba, 1993). Es importante señalar que en general se habla de
carbohidratos genéricamente sin señalar la importancia del tipo, los requerimientos
temporales de los mismos (Arditti y Ernst, 1984), y la concentración de estos en el
medio, estos factores pueden afectar el crecimiento heterotrófico de los cultivos, debido
a que el azúcar es la única fuente de carbono y energía para el crecimiento (Kubota y
Toyoki, 1991).

~ 14 ~
 Los carbohidratos pueden ser empleados esterilizados por filtración, utilizando
membranas a baja presión, o en autoclave (Arditti & Ernst, 1984; Juárez, 1994). La
esterilización en autoclave del medio de cultivo hidroliza la sacarosa y posiblemente
otros azucares y actualmente no está claro como las semillas de orquídeas utilizan o les
afectan los oligosacáridos una vez que estos son esterilizados (Ernst et al., 1971).

La inexistencia de reservas lipídicas en los embriones de orquídeas, puede

explicar el requerimiento de un suplemento exógeno de carbohidratos simples solubles
para que la semilla germine (Harrison y Arditti, 1978). Además, la disponibilidad de
diferentes fuentes exógenas de carbono, son necesarias para la germinación de las
semillas de orquídeas y el temprano desarrollo de las plántulas bajo las condiciones
simbióticas o asimbióticas, por lo menos hasta que las plantas comiencen a ser
autótrofas. Dicho proceso no ha sido completamente investigado (Tsuitsui y Tomita,
1990).

Las semillas de diferentes especies de orquídeas tienen la capacidad de utilizar

para su germinación varios carbohidratos, aunque es común que muestren alguna
preferencia por algún carbohidrato en especial; en diversos estudios se ha demostrado
que hay especies que germinan in vitro únicamente si está presente un determinado
carbohidrato o cuando existe una mezcla entre algunos de ellos (Arditti, 1967).

Los carbohidratos que se utilizan comúnmente como promotores de la

germinación son: fructuosa, glucosa, sacarosa, maltosa, manitol, rafinosa y melecitosa
(Ernst et al., 1971).

Los carbohidratos D-hexosas y sus pequeños oligosacáridos pueden ser

usados para la germinación de semillas de orquídea, siendo la D-galactosa la
excepción ya que es tóxica para ellas (Arditti, 1979).

~ 15 ~
 Las semillas de orquídea pueden germinar y desarrollarse en un medio que
contenga azúcares relativamente simples, ya que en la naturaleza las semillas son
incapaces de utilizar largas moléculas sin la ayuda de un hongo que pueda romper
estas moléculas y transformarlas en azúcares más simples como por ejemplo la
fructosa y la glucosa (Ernst et al., 1971; Bechtel et al., 1986; Leroux et al., 1995).

Carbón Activado
El carbón activado es un agente antioxidante, que influye en todo proceso del
cultivo así como en la aclimatización exitosa de las plantas. El carbón activado se
caracteriza por una alta proporción de área-peso, ésto le confiere alta adsorción de
substancias. Provee aireación y adsorbe el etileno, adsorbe e inactiva el 5-
hidroximetilfurfural, inhibe compuestos fenólicos y carboxílicos producidos por los
cultivos (Arditti y Ernst, 1993).

Materiales inertes de soporte

Merino (1987), señalan que el agar es el material de soporte más ampliamente
usado en el cultivo de tejidos, pues provee al medio de un excelente gel húmedo que
sirve como soporte al inóculo. Sin embargo, fisiológicamente no es inerte, puesto que
es una fuente de cantidades variables de sustancias inhibidoras o estimulantes del
crecimiento. Otros agentes gelificantes usados algunas veces en lugar del agar son la
poliacrilamida y la sílica gel.

En medio líquido se usa papel filtro, como puente o plataforma así como la fibra
de vidrio; se recomienda añadir carbón activado, ya que en bajas concentraciones
ayuda a adsorber sustancias que se forman como desecho en los medios de cultivo.

~ 16 ~
Género Barkeria (Knowles y Wetc., 1838)

Género relativamente pequeño con aproximadamente 15 especies,

esencialmente mexicano, aunque un par de especies se encuentran en Centroamérica.
Presenta flores atractivas por lo que ha sido buscado por los cultivadores de orquídeas.
Hierbas epífitas o litófitas; tallos angostos, cubiertos por vainas; hojas deciduas,
distribuidas a lo largo o en la mitad apical de los pseudobulbos, lanceoladas a ovadas;
inflorescencia apical, racimosa, multiflora; ovario pedicelado; flores vistosas, rosadas a
violeta-púrpura, o blancas; sépalos y pétalos similares, subiguales, los pétalos más
anchos; labelo libre o unido a la columna en su porción basal, entero; disco
ornamentado; columna paralela o divergente al labelo, con alas membranosas o
carnosas, extendidas a cada lado del estigma; antera terminal, bilocular-polinios 4,
cerosos, subiguales; cápsula elipsoide a cilíndrica (Halbinger, 1972; Thien y Dressler
1970).

Clasificación taxonómica

REINO: Plantae
DIVISIÓN: Magnoliophyta
CLASE: Liliopsidae
SUBCLASE: Liliidae
ORDEN: Orchidales
FAMILIA: Orchidaceae
SUBFAMILIA: Epidendroideae
GÉNERO: Barkeria
ESPECIE: B. uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb.
Basónimo: Pachyphyllum uniflorum Lex.
Sinónimos: Barkeria elegans Knowles & Westc., 1838
Epidendrum elegans (Knowles & Westc) Rchb.f., Ann. 1872.

~ 17 ~
Descripción Botánica Barkeria uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb.

Planta herbácea cespitosa, de 12 a 2cm de alto; pseudobulbos fusiformes,

delgados, de 2.5 a 5 cm de largo, de 2 a 3.5 mm de diámetro, formados por 3 ó 4
entrenudos, cubiertos por vainas escariosas, tubulares, blanquecinas, de 1 a 2 cm de
largo; hojas 4, distribuidas a lo largo del seudobulbo, deciduas, lámina lanceolada, de 3
a 7 cm de largo, de 0.5 a 1 cm de ancho, aguda.

Inflorescencia apical, racimosa, erecta, de 10 a 20 cm de largo, pedúnculo

rollizo, delgado, de 3 a 7.5 cm de largo, cubierto completamente por brácteas
escariosas, tubulares, agudas, brácteas florales mucho más pequeñas que el ovario,
amplexicaules, oblongo-triangulares, de 3 a 7 mm de largo, de 1.5 a 2 mm de ancho,
agudas.

Flores de 3 a 5, simultáneas, resupinadas, de color violáceo claro, el labelo con

la mitad apical de color magenta, la columna con manchas rojas en la parte dorsal,
antera amarillenta; ovario rollizo, largo, de 15 a 30 mm de largo, de 1 a 2 mm de
diámetro; sépalo dorsal extendido, elíptico, de 15 a 30 mm de largo, de (5)10 a 15 mm
de ancho, obtuso, 7-nervado.

Sépalos laterales extendidos, lanceolados, de 20 a 32 mm de largo, de 6 a 12

mm de ancho, agudos, 7-nervados; pétalos extendidos, cortamente unguiculados,
elípticos, de 18 a 30 mm de largo, de 10 a 17 mm de ancho, agudos, 7-nervados.

Labelo unido a la columna hasta una cuarta parte en su porción basal, entero,
pandurado a obovado, de 21 a 29 mm de largo, de 13 a 23 mm de ancho, redondeado,
disco 3-carinado, las carinas prolongándose más allá de la mitad de la lámina,
prominentes.

~ 18 ~
 Columna tubular, recta, de 13 a 15 mm de largo, de 1.5 a 2 mm de ancho, con 2
alas membranáceas, elípticas, obtusas a los lados del estigma; antera transversalmente
semiorbicular; Cápsula elipsoide, 6-quillada, de 24 mm de largo, 13 mm de grosor, con
un rostro de 11 mm de largo. (García-Cruz et al., 2003). (Fig. 4).

Distribución
Endémica de México, Cuenca del Rio Balsas y Llanura costera del Pacifico,
Nayarit, Jalisco, Michoacán, Estado de México, Guerrero y Oaxaca, reportada para
Puebla y Morelos. (Soto Arenas et al., 2008) (Fig. 5).

Figura 5. Distribución de Barkeria uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb.

Ecología
Crece en bosques tropicales caducifolios a una altitud que va de los 670 a 1300
msnm. Florece de octubre a enero con una mayor floración en noviembre. En el Estado
de Michoacán se le conoce con el nombre “Corpus” y en Guerrero como “Tepalegua”.
(Soto Arenas et al., 2008)

~ 19 ~
Figura 4. Barkeria uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb (Soto Arenas et al., 2008)

~ 20 ~
Estado de Conservación

No Amenazada. Está muy extendida, forma poblaciones muy grandes y tolera la

perturbación, pero se ha colectado en grandes cantidades para abastecer su demanda
hortícola, siendo una orquídea de corta duración por lo que es siempre demandada.
(Soto Arenas et al., 2008). (Fig. 6).

Figura 6. Barkeria uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb

~ 21 ~
CULTIVO IN VITRO DEL GÉNERO Barkeria

Navarrete-Valencia y colaboradores (2011) obtuvieron la inducción de brotes y

la regeneración de plantas de la especie Barkeria uniflora a partir de tejido de hojas de
plántulas germinadas in vitro. Al utilizar una combinación de 10 mg.L-1 de ácido α-
naftalenacético (ANA) y 0.1 mg.L-1 de N 6-bencil amino purina (BAP), obteniendo un
porcentaje promedio de ocho plantas con dos hojas y una raíz por cada explante
cultivado.

Arenas y Aguirre (2012) reportan la germinación de Barkeria scandens a partir

de semillas inmaduras, obteniendo un porcentaje de germinación de 45.84 % en medio
KC, 45.81 % en KC con almidón de papa, 44.23 % en medio MS con aditivo orgánico y
38.16 % en MS a la mitad de su concentración.

Villafuerte (2013) cultivó in vitro secciones longitudinales de protocormos de

Barkeria whartoniana y secciones de hoja y tallo de B. scandens, logrando la
regeneración de plantas completas, mediante la inducción de embriogénesis somática.
Para la germinación de las semillas de B. whartoniana se empleó el medio de cultivo
MS, obteniéndose 90% de germinación. Los explantes empleados para ambas
especies, fueron cultivadas in vitro, en medio MS y MS 50%, adicionados con distintas
concentraciones (0, 0.5, 1 mg.L-1) de (ANA) y (0, 1, 2, 2.5 mg.L-1) de (BAP); así como,
con 50 mg.L-1 de ácido ascórbico, ácido cítrico y 1 g/L de carbón activado. La inducción
de los embriones somáticos se corroboró mediante el análisis estructural (histológico).

~ 22 ~
 JUSTIFICACIÓN

Las actividades humanas y asentamientos urbanos han inducido un uso

indiscriminado de recursos naturales, generando efectos negativos en la biodiversidad,
con la destrucción de los hábitats. El deterioro de la cubierta vegetal, ha provocado
entre otros efectos la perdida y disminución de especies vegetales (Ramamoorthy et al.,
1998).

México ha reconocido la urgente necesidad de proteger su flora, en particular

de la Orchidaceae por la depredación general ocasionada por colectores profesionales
y aficionados, esto además de la destrucción general de sus hábitats, ha causado un
enorme decrecimiento en las poblaciones naturales.

La Orchidaceae es importante desde varios puntos de vista: 1) ecológica y

biológicamente porque es una familia altamente especializada y 2) la belleza de sus
flores, ha motivado al comercio ilegal de especies.

Debido a la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar
en forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación asimbiótica bajo
condiciones in vitro (Damon et al., 2004; Pedroza et al., 2005; Yamazaki y Kasumitzu,
2006; Pedroza y Mican, 2006; Haddix et al., 2006; Steele, 2007). Sin embargo, cada
especie de orquídea tiene diferentes necesidades de nutrientes para germinar, por lo
que hay que investigar cual es el medio de germinación adecuado para cada una de
ellas.
Barkeria uniflora (Lex.) es una especie epífita con flores de gran belleza que se
ha visto afectada por la alteración de su hábitat, propiciado por la intensa actividad
humana y por la extracción de ejemplares adultos con fines de ornato o comerciales.
Una alternativa potencial no sólo para mantener sino incrementar el número de
individuos de ésta y otras plantas es el Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV), que ha
demostrado obtener altas tasas de multiplicación a partir de un explante inicial.

~ 23 ~
 Con base a las potencialidades de producción masiva de plantas de la técnica
de cultivo in vitro, se plantea el presente estudio con la orquídea de la especie Barkeria
uniflora aunado a la necesidad de generar conocimiento científico del desarrollo
asimbiótico y como una estrategia de conservación con la finalidad de reducir la presión
en las poblaciones silvestres de esta especie.

HIPÓTESIS

Si las semillas cultivadas in vitro de diferentes especies de orquídeas, así como

las de Barkeria whartoniana y B. scandens germinan asimbióticamente, ésto es sin la
presencia del hongo, sobre un medio de cultivo preparado con el tipo y concentración
adecuados de sales inorgánicas y carbohidratos, entonces se espera que las semillas
de Barkeria uniflora germinen al utilizar medios nutritivos con diferente composición y
concentración de sales minerales adicionados con una fuente exógena de
carbohidratos simples como estímulo para desarrollar plántulas completas.

~ 24 ~
 OBJETIVO GENERAL

 Establecer un protocolo para la germinación in vitro de Barkeria uniflora.

OBJETIVOS PARTICULARES

 Determinar el medio de cultivo más apropiado para la germinación de Barkeria

uniflora.

 Establecer la respuesta morfogénica del embrión durante su germinación

asimbiótica in vitro con diferentes carbohidratos.

 Evaluar el porcentaje de plántulas con al menos una raíz verdadera (Estadio 8)

en cada carbohidrato.

 Determinar cuál concentración de sales minerales genera mayor respuesta en la

germinación de Barkeria uniflora.

 Determinar que carbohidrato es el mejor estímulo para inducir el desarrollo

morfogénico durante la germinación de Barkeria uniflora.

~ 25 ~
 MATERIAL Y MÉTODO

Material Biológico

Para llevar a cabo la germinación in vitro se utilizaron semillas de Barkeria

uniflora obtenidas del Banco de Semillas de la Unidad de Investigación en Biología
Vegetal de las FES Zaragoza, colectadas el 15 de Diciembre de 2012, en el Municipio
de Luvianos, Estado de México.

Evaluación de Viabilidad

Para eliminar la posibilidad de utilizar semillas con baja respuesta, se determinó la

viabilidad de estas, por medio del método bioquímico del TTC (cloruro de
trifeniltetrazolio) (Moreno, 1984; Vujanovic et al, 2000; Ortiz, 2001). Se tomaron tres
lotes de semillas que fueron colocados en sobres de papel filtro (2x2 cm). Los sobres
fueron sumergidos en una solución de hipoclorito de sodio al 0.5 % de cloro disponible
adicionado con una gota de jabón líquido durante 10 minutos, una vez pasado el tiempo
se enjuagaron con agua destilada estéril, para después colocarlos en una solución de
tetrazolio al 1 % durante 24 horas en oscuridad a una temperatura de 23° C ± 2° C.

Una vez transcurrido el tiempo los sobres fueron retirados de la solución de

tetrazolio y se enjuagaron con agua destilada estéril. Las semillas dentro de los sobres
se observaron bajo el microscopio estereoscópico y se tomaron al azar dos lotes de 50
semillas, de las cuales se contaron las teñidas para posteriormente calcular el
porcentaje de viabilidad de éstas mediante un rango que iba desde el color rojo, naranja
y rosa (Moreno, 1984).

~ 26 ~
Medios de Cultivo
Se utilizaron tres medios nutritivos con sales inorgánicas analíticas, Kao y
Michayluk (KM), Murashige & Skoog (MS) y Knudson C (Anexo 1), en las siguientes
concentraciones: 100 %, 75 % y 50 %, cada uno adicionados con vitaminas (tiamina 2
ml/L, niacina 2.5 ml/L, piridoxina 0.5 ml/L y myo-inositol 100mg/L), 5 g/L de Agar-gel
como agente gelificante y carbón activado como antioxidante. El pH de los medios de
cultivo fue ajustado a 5.7, una vez preparado el medio se vacío a los frascos de cultivo
y se esterilizó en autoclave durante 20 min a 120°C, a una presión de 20 lb/pulg.

Carbohidratos Experimentales
La fuente de carbono exógena experimental para la germinación asimbiótica de
las semillas de Barkeria uniflora fueron sacarosa, fructosa, glucosa, maltosa y galactosa
en una concentración de 30 g/L. Las semillas se expusieron a los medios
suplementados con los carbohidratos experimentales durante 98 días de cultivo, para
determinar cuál o cuáles promovieron la morfogénesis de hojas y raíces en los
embriones.

Se obtuvo un total de 54 tratamientos con 5 repeticiones cada uno, dando un total de

270 frascos de cultivo. Se evaluaron 60 semillas por tratamiento estableciendo un
cuadrante en el frasco, el cual fue el mismo durante toda la evaluación. Cuadro 1

Testigo
100 %
KM
Sacarosa

Fructosa 270
KC 5 repeticiones
75 %
FRASCOS
Glucosa

MS Galactosa

50 % Maltosa

~ 27 ~
Desinfestación y siembra de semillas

Se realizaron un total de 270 sobres de papel filtro (2x2 cm), y en cada sobre se
colocaron aproximadamente 200 semillas de Barkeria uniflora asegurando los sobres
con un clip metálico. Las semillas en los sobres se desinfestaron en una solución de
etanol al 70 % durante 5 minutos, para después transferirlas a una solución de
hipoclorito de sodio al 0.5 % de cloro disponible adicionado con una gota de jabón
líquido durante 10 minutos y por último se enjuagaron con agua destilada estéril.

El proceso de siembra se llevó a cabo en la sala de cultivo la cual previamente

se desinfectó, al igual que todas las superficies de contacto utilizando etanol al 70 %,
incluyendo la campana de flujo laminar y todo el material utilizado para la siembra.

Cada sobre con semillas se abrió y se colocó dentro del frasco, para dejar
expuestas las semillas y en contacto con los medios de cultivo.

Los 270 frascos con las semillas se colocaron en la sala de incubación a una
temperatura de 25° C ± 2° C, con una intensidad luminosa de 4670 lux y un fotoperiodo
de 16 horas luz por 8 de oscuridad.

~ 28 ~
Evaluación de la Germinación
Para evaluar la germinación y el desarrollo de los diferentes estadios, en cada
uno de los tratamientos, se consideró la descripción A de estadios descritos y
propuestos por Batigyna y colaboradores (2003), Espinosa (2004) y Shimura y Koda
(2004).

El criterio para establecer que se inició la germinación fue a partir del estadio 2
ó semilla hinchada y verde. Durante 98 días se registró semanalmente el porcentaje de
estadios para cada replica, la suma de los porcentajes de cada réplica dió el total o 100
% de los individuos evaluados.

Evaluación del Índice de Desarrollo

Los cambios ontogénicos del embrión de las semillas de B. uniflora, durante el
proceso de la germinación, fueron registrados en cada una de las repeticiones por
tratamiento cada siete días durante 98 días para establecer la ontogenia del embrión
durante su germinación; así como, para calcular el índice de desarrollo o I.D.
considerando ocho estadíos ontogénicos.

~ 29 ~
 El índice de desarrollo es un indicador que refleja el estadio ontogénico de los
embriones durante el proceso de germinación de las semillas y se calcula con la
sumatoria de los porcentajes obtenidos a partir del número de individuos registrados en
cada estadio ontogénico (ex) entre el total de individuos en la muestra (e) y multiplicado
por el valor del estadio ontogénico (x), de acuerdo con la siguiente fórmula:

Dónde:

x = Valor del estadio ontogénico

ex = Número de individuos registrados en ese estadio ontogénico

e = Total de individuos de la muestra

Evaluación del estadio 8 a los 98 días de cultivo

Se determinó el porcentaje de plántula con raíces (estadio 8) a los 98 días de
iniciada la siembra en cada uno de las repeticiones por cada uno de los tratamientos de
exposición.

Diseño estadístico
A los datos obtenidos del porcentaje de germinación, del índice de desarrollo
durante la germinación de semillas, del estadío de desarrollo más avanzado presentes
a los 98 días se les aplicó un análisis de varianza (ANDEVA), utilizando el programa
estadístico computarizado Statgraphics Centurión XVI versión 16.1.15, para conocer si
existieron diferencias significativas entre los tratamientos empleados durante el tiempo
de cultivo (Cuadro 2).

~ 30 ~
 Semillas de Barkeria uniflora

Desinfestación de semillas

Siembra de semillas in vitro

KM KC MS

100 % 75 % 50 %

Sacarosa, Fructosa, Testigo

Glucosa, Maltosa, Galactosa.

Incubación con fotoperiodo de

16 h luz por 8 de oscuridad

Registro semanal durante 98 días

Evaluación Evaluación del

de la Evaluación del Índice máximo estadio

Germinación de Desarrollo de desarrollo 98

días

Análisis estadístico
ANDEVA
Cuadro 2. Metodología General
~ 31 ~
 RESULTADOS

Viabilidad

La evaluación de la viabilidad permitió estimar de manera rápida la condición

biológica de la semilla, la prueba con TTC se basa en la reacción de ciertas enzimas de
las células vivas con la sal de este reactivo, donde se da la reducción del tetrazolio
formándose un compuesto rojo llamado formazán (Moreno, 1984).

El máximo porcentaje de viabilidad registrado para las semillas de Barkeria

uniflora fue de 80 % de embriones teñidos, donde el rango de coloración varió del rojo,
anaranjado y rosa. (Fig. 7).

Figura 7. Embriones teñidos de Barkeria uniflora, evaluación de la viabilidad con TTC.

~ 32 ~
Germinación de semillas de Barkeria uniflora

El ANDEVA del porcentaje de germinación obtenido por el efecto de los

carbohidratos experimentales sobre la germinación in vitro de las semillas de Barkeria
uniflora, a través del tiempo, independientemente del medio nutritivo y su
concentración, demostró que existieron diferencias significativas (valor-P<0.0000).
(Anexo 2)

Al comparar las medias de los porcentajes de germinación obtenidos de las

semillas en cada uno de los azúcares experimentales, independientemente del tiempo
de cultivo, se comprobó que la galactosa fue diferente estadísticamente al resto de los
tratamientos con carbohidratos y con 0 % de germinación (Anexo 2.1)

La germinación de las semillas de B. uniflora, considerada como el momento en

que los embriones estaban hinchados con coloración verde y rompiendo la testa
(estadio 2) (Fig. 8), comenzó a los 7 días posteriores del cultivo con porcentajes que
iban desde el 76 % hasta el 90 %, excepto aquellas sobre galactosa.

Figura 8. Embrión verde hinchado

rompiendo la testa de Barkeria uniflora

~ 33 ~
 A partir de los 14 días y hasta el final del cultivo se registró el mayor porcentaje
de germinación, con un valor de 99 %, en aquellas semillas cultivadas en el medio de
cultivo sin carbohidrato (Testigo) y con carbohidratos excepto con galactosa donde
siempre fue 0 % (Fig. 9).

Figura 9. Germinación asimbiótica in vitro de Barkeria uniflora en los carbohidratos experimentales

(Fructosa (FR), Galactosa (GA), Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE)),
independientemente del medio nutritivo y concentración de sales.

~ 34 ~
 Cuadro 3. Estadios ontogénicos registrados durante el desarrollo de la
germinación in vitro de semillas de Barkeria uniflora.

Valor del Estadio Índice de Desarrollo Estadio

Semilla sin
germinar
1 100

2 200 Embrión
hinchado y
verde

3 300 Protocormo

4 400 Protocormo
con primordio
foliar

5 500 Protocormo
con una hoja

6 600 Protocormo
con dos hojas

7 700 Protocormo
con tres hojas

8 800 Planta con

raíces

~ 35 ~
Índice de Desarrollo
El ANDEVA del índice de desarrollo obtenido, durante la germinación de las
semillas de Barkeria uniflora por el efecto del tiempo de cultivo, de los medios nutritivos,
concentraciones de sales inorgánicas y los carbohidratos experimentales, mostró que
existieron diferencias significativas (Valor-P<0.0000) con un 95 % de confianza (Anexo
3).

Al comparar las medias de los índices de desarrollo obtenidos en cada uno de

los tiempos de cultivo, independientemente del medio nutritivo, de la concentración de
sales y de los carbohidratos (Anexo 3.1), se comprobó que fueron estadísticamente
diferentes entre sí, excepto los índices obtenidos a los 91 y 98 días de cultivo donde los
valores fueron iguales estadísticamente entre sí, como lo muestra la figura 10.

Figura 10. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación in vitro a través del
tiempo de cultivo.

Se observó que a los 7 días de cultivo el valor promedio del índice de desarrollo
fue de 171 lo que indica que un 71 % de las semillas ya habían germinado (estadio 2) y
solo un 29 % permanecían sin germinar (estadio 1). A los 14 días de cultivo el valor del
índice de desarrollo fue de 220, este valor reflejó que el 80 % de los embriones se
hincharon (estadio 2) y un 20 % de embriones ya se habían diferenciado en
protocormos (estadio 3).

~ 36 ~
 El resto de los embriones hinchados continúo su desarrollo y fue hasta los 42
días de cultivo cuando se obtuvo un valor promedio de 301 lo que evidenció que el 99
% de los embriones hinchados se habían desarrollado en protocormos o estadio 3.
Finalmente, 98 días después de la siembra, el 90 % de estos protocormos desarrollaron
un primordio foliar alcanzando el estadio 4 con un valor promedio del índice de
desarrollo de 410; mientras que, el 10 % restante de los protocormos desarrolló una
hoja (estadio 5).

Al comparar las medias de los índices de desarrollo obtenidos en cada uno de

los medios nutritivos, independientemente del tiempo de cultivo, de la concentración de
sales y de los carbohidratos, se observó que fueron diferentes estadísticamente entre sí
(Anexo 3.2) (Fig. 11).

El medio de cultivo donde se alcanzó un mayor índice de desarrollo de las

semillas fue en el medio KM con un valor de 393 donde el 93 % de los protocormos
desarrollaron un primordio foliar (estadio 4), seguido por el medio MS con un índice de
336 donde solo el 36 % de los protocormos desarrollaron el primordio foliar y por último
en el medio KC solo el 20 % de los embriones hinchados se desarrollaron en
protocormos con un índice de 220.

Figura 11. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación in vitro en los medios
nutritivos.

~ 37 ~
 Al graficar las medias de los índices de desarrollo para cada uno de los medios
nutritivos a través del tiempo, independientemente de la concentración de las sales y de
los carbohidratos empleados, se comprobó que la respuesta del desarrollo de los
embriones, durante la germinación de las semillas de Barkeria uniflora fue diferente
para cada medio durante el cultivo, como se muestra en la Fig. 12.

De acuerdo a la figura 12, en el medio nutritivo Knudson C (KC) al final del

tiempo de cultivo, 98 días, se alcanzó el valor promedio del índice de desarrollo de 242,
esto indicó que el 58 % de los embriones de Barkeria uniflora permanecieron hinchados
(estadio 2) y el 42 % alcanzó el estadio de protocormo (estadio 3).

En el medio nutritivo Murashige & Skoog (MS) el índice de desarrollo a los 14

días fue de 234, donde el 66 % de los embriones se hincharon (estadio 2) y el 34 % se
diferenciaron en protocormo (estadio 3), este porcentaje del estadio 3 aumentó a los 35
días al registrar un índice de desarrollo de 305.

Figura 12. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación in vitro en tres medios
nutritivos a través del tiempo de cultivo.

~ 38 ~
 Para los 77 días de cultivo estos protocormos en el medio MS ya habían
generado un primordio foliar, alcanzando el estadio 4 con un índice de desarrollo de
406. A los 98 días de cultivo el valor del índice de desarrollo fue de 436, donde el 64 %
de los protocormos presentaron primordio foliar, pero un 36 % ya habían desarrollado
la primera hoja (estadio 5).

Como se puede observar en la figura 12, el medio nutritivo Kao y Michayluk

(KM) fue el que promovió el mayor desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora
durante su germinación, ya que para los 56 días de cultivo el 80 % de los protocormos
ya presentaban un primordio foliar, con un valor del índice de desarrollo de 420 y un 20
% de los protocormos pudieron alcanzar el estadio de protocormo con una hoja,
finalmente a los 98 días de cultivo el 58 % de los protocormos desarrollaron una hoja
(estadio 5), con un valor del índice de desarrollo de 552, mientras que el 42 % siguió su
desarrollo alcanzando el estadio de protocormo con dos hojas (estadio 6).

La comparación de medias de los índices de desarrollo obtenidos en cada una

de las diferentes concentraciones de sales nutritivas, independientemente del tiempo
de cultivo, del medio nutritivo y los carbohidratos (Anexo 3.3) demuestra que al cultivar
las semillas con un 50 % de la concentración de las sales el valor del índice de
desarrollo de 345 fue mayor y diferente estadísticamente a los valores de las dos
concentraciones restantes entre los cuales no existieron diferencias significativas (Fig.
13).

Figura 13. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación in vitro en las diferentes
concentraciones de sales.
~ 39 ~
 En la figura 13 se aprecia que en la concentración de sales al 50 % el valor del
índice de desarrollo corresponde a 345 lo que indica que el 55 % de las semillas
permanecen como protocormos y el 45 % de estos han desarrollado primordio foliar; en
las concentraciones 100 % y 75 %, los valores del índice de desarrollo fueron 300 y 305
respectivamente, lo que indica el desarrollo de protocormos (estadio 3) principalmente.

La comparación de medias de los índices de desarrollo obtenidos en cada uno

de los carbohidratos experimentales, independientemente del tiempo de cultivo, del
medio nutritivo y de las concentraciones (Anexo 3.4) indica que el mayor valor del
índice de desarrollo, y diferente estadísticamente, se obtuvo al utilizar la maltosa como
carbohidrato experimental; mientras que con la galactosa se obtuvo el menor índice de
desarrollo (Fig. 14).

Figura 14. Desarrollo durante la germinación in vitro de semillas de Barkeria uniflora en los carbohidratos
experimentales (Fructosa (FR), Galactosa (GA), Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo
(TE)).

En la figura 14 se puede observar que la galactosa fue el carbohidrato

experimental que inhibió el desarrollo de los embriones durante la germinación de
Barkeria uniflora, ya que el valor del índice de desarrollo de las semillas obtenido fue de
100 e indica que el 100 % de las semillas permanecieron sin germinar o estadio 1.

~ 40 ~
 Al término de los 98 días de cultivo se evaluó la viabilidad de las semillas
expuestas a la Galactosa. El porcentaje de viabilidad registrado fue de 0 %, ya que los
embriones observados carecían de tinción.

Se pudo observar que en el Testigo, con ausencia de carbohidratos, se obtuvo

un índice de 200 donde el 100 % de los embriones se hincharon alcanzando el segundo
estadio de desarrollo.

El desarrollo obtenido sobre la sacarosa y la glucosa fue igual estadísticamente,

con valores de 351 y 367 respectivamente, lo que indicó que el 51 % y el 67 % de los
protocormos, cultivados en sacarosa y glucosa respectivamente, presentaban ápice
foliar (estadio 4).

La fructosa fue el segundo carbohidrato donde se generó una mayor repuesta

morfogénica con un valor del índice de desarrollo de 411, lo que indica que el 11 % de
los protocormos generaron una hoja. La Maltosa fue el carbohidrato donde se generó la
mayor respuesta morfogénica, ya que el valor promedio del índice de desarrollo fue de
470, donde el 70 % de los protocormos desarrollaron una hoja y el 30 % permanecieron
en estadio de protocormo con primordio foliar.

Índice de Desarrollo en el Medio Murashige & Skoog

Al efectuar el ANDEVA para el índice de desarrollo obtenido, durante la

germinación in vitro de las semillas de Barkeria uniflora, por efecto del medio Murashige
& Skoog (MS), mostró que existieron diferencias significativas (Valor-P<0.0000) en el
tiempo de cultivo, en la concentración de sales y los carbohidratos experimentales, así
como entre sus interacciones con un 95% de nivel de confianza (Anexo 3.5).

~ 41 ~
 Al realizar la comparación de las medias de los índices de desarrollo obtenidos
en cada uno de los tiempos de cultivo con el medio MS, independientemente de la
concentración de sales y de los carbohidratos (Anexo 3.6), se comprobó que fueron
estadísticamente diferentes entre sí, excepto los índices obtenidos a los 42 y 49 días de
cultivo que resultaron estadísticamente iguales entre sí; así mismo, los registrados a los
56 y 63 días, como a los de 84, 91 y 98 días de cultivo, como lo muestra la figura 15.

Figura 15. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación in vitro en el medio
Murashige & Skoog a través del tiempo de cultivo.

En la figura 15 se aprecia que el mayor índice de desarrollo se obtuvo a los 98

días de cultivo con un valor de 436, donde el 36 % de los protocormos desarrollaron
una hoja (estadio 5) y el 64 % permanecieron con primordio foliar (estadio 4); sin
embargo, este valor fue igual estadísticamente a los obtenidos a los 84 y 91 días de
cultivo con 426 y 435 respectivamente, lo cual demuestra que a los 84 días de cultivo el
26 % de los protocormos generaron una hoja y a los 91 días el 35 %. Estos valores del
índice de desarrollo obtenidos en los tres últimos días de cultivo fueron diferentes
estadísticamente al resto de los valores obtenidos.

~ 42 ~
 Al realizar la comparación de medias para el índice de desarrollo obtenidas en
cada una de las concentraciones de sales (100 %, 75 % y 50 %) del medio nutritivo MS,
independientemente del tiempo de cultivo y de los carbohidratos, se observó, que con
la concentración de 50 % el valor del índice de desarrollo obtenido, 382, fue mayor y
diferente a los valores de las dos concentraciones restantes los cuales resultaron
iguales estadísticamente (Anexo 3.7) (Fig. 16).

Figura 16. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante la germinación in vitro por el efecto de
la concentración de sales del medio nutritivo Murashige & Skoog.

En la figura 16 se muestra que con 50 % de la concentración de las sales del

medio MS el 82 % de los protocormos presentan primordio foliar, con el 100 % y 75 %
de la concentración solo el 27 % y el 1% respectivamente generan primordio foliar.

El efecto de la concentración de sales del medio nutritivo MS se aprecia en la

figura 17, se observa que a los 7 días de cultivo entre el 72 % y 75 % de las semillas
de Barkeria uniflora, en las tres concentraciones de sales, presentaron embriones
verdes e hinchados (estadio 2). El valor del índice de desarrollo se incrementó a los 14
días de cultivo, lo cual reflejó que el 15 % de los embriones verdes e hinchados en la
concentración al 75 % de las sales se habían desarrollado en protocormos (estadio 3);
mientras que, con 100 % y 50% se desarrollaron 33 % y 54 % respectivamente.

~ 43 ~
 Figura 17. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación in vitro en diferentes
concentraciones de sales del medio nutritivo Murashige & Skoog a través del tiempo de cultivo.

A los 35 días de cultivo solamente las semillas cultivadas en el medio MS al 50

% de la concentración de sales presentaron un 37 % de protocormos con primordio
foliar (estadio 4), el valor del índice de desarrollo obtenido fue 337. A los 56 días de
cultivo, el valor del índice de desarrollo, para la concentración de 50 % de sales MS se
incrementó, obteniendo un valor de 432, el cual indicó que el 32 % de los protocormos
presentaban una hoja (estadio 5) y el 68 % permanecía con primordio foliar (estadio 4),
en las concentraciones de 100 % y 75 % el valor del índice fue de 352 y 304
respectivamente, lo cual refleja que con 100% de sales, en este tiempo, el 52 % de
protocormos presentaban primordio foliar; mientras que con 75 % solo el 4 %. Al final
del cultivo (98 días), en la concentración de 50 % el valor del índice fue de 502, el cual
refleja que el 2 % de los protocormos desarrollaron dos hojas y el 98 % permaneció con
una hoja. Como se puede observar la concentración de 50 % de sales del medio MS, se
obtiene una mayor respuesta morfogénica seguida por el MS al 100 % con un índice de
desarrollo de 423 y en la concentración de 75 % se mantuvo la menor respuesta
morfogénica llegando a un valor de 383.

~ 44 ~
 Al realizar las comparaciones múltiples de los índices de desarrollo obtenidos en
cada uno de los carbohidratos utilizados, independientemente del tiempo de cultivo y de
la concentración de sales del medio MS se observa que los valores de todos los índices
fueron diferentes estadísticamente. (Anexo 3.8) (Fig. 18).

Figura 18. Desarrollo durante la germinación in vitro de semillas de Barkeria uniflora en medio MS
expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA), Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

La Galactosa no induce el desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora puesto

que el valor del índice fue de 100, resultando menor y diferente estadísticamente al
resto. En el Testigo los embriones se hinchan logrando el segundo estadio de
desarrollo.

La Sacarosa estimula el desarrollo de 52 % de protocormos (estadio 3) y un 48

% de protocormos con primordio foliar obteniendo un índice de desarrollo de 348. La
Glucosa también tiene el mismo efecto estimulante en las semillas obteniendo un índice
de desarrollo de 393, 7 % de protocormos (estadio 3) y 93 % de protocormos con
primordio foliar (estadio 4). Se puede observar que la maltosa y fructosa tienen el
mismo efecto estimulante para las semillas, considerando a estos dos carbohidratos
grupos homogéneos y estadísticamente similares, ya que los protocormo de Barkeria
uniflora desarrollan una hoja (estadio 5).

~ 45 ~
Índice de Desarrollo en el Medio Kao y Michayluk

Al realizar el ANDEVA para el índice de desarrollo obtenido durante la

germinación in vitro de las semillas de Barkeria uniflora por efecto del medio Kao y
Michayluk (KM), se observó que existieron diferencias significativas (Valor-P<0.0000)
en el tiempo de cultivo, en la concentración de las sales y en los carbohidratos
empleados. (Anexo 3.9)

Al realizar la comparación de las medias de los índices de desarrollo obtenidos

en cada uno de los tiempos de cultivo con el medio KM, independientemente de la
concentración de sales y de los carbohidratos, se comprobó que fueron
estadísticamente diferentes entre sí (Fig. 19) (Anexo 3.10).

Figura 19. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante la germinación in vitro en el medio KM.

Se aprecia en la figura 19 el índice de desarrollo promedio obtenido en las

semillas de Barkeria uniflora sembradas en el medio de cultivo KM, a los 7 días del
cultivo el valor del índice de desarrollo fue de 159 esto indicó que el 59 % de las
semillas ya habían comenzado el proceso de germinación encontrándose en el estadio
2.

~ 46 ~
 Para los 14 días del cultivo 67 % de los embriones permanecieron hinchados y
verdes, (estadio 2); mientras que, el 33 % de los embriones se desarrollaron en
protocormos (estadio 3), el valor del índice de desarrollo fue de 233.

A partir de los 35 días el índice de desarrollo fue de 333, el 67 % permaneció

como protocormos (estadio 3) y un 33 % de protocormos que generaron su primordio
foliar (estadio 4). A los 56 días de cultivo el 80 % de los protocormos tenían un
primordio foliar (estadio 4), mientras que el 20 % generaron la primera hoja (estadio 5),
el valor del índice de desarrollo fue de 420

El índice de desarrollo se incrementó para los 84 días de cultivo, llegando a un

valor de 525, donde se observó el desarrollo de la primera hoja en los protocormos (75
% de ellos), para estos días de cultivo el 25 % de los protocormo habían desarrollado la
segunda hoja. Para los 98 días solo incrementó el valor del índice de desarrollo hasta
llegar a 552. Obteniendo un 52 % de protocormos con dos hojas.

Al realizar la comparación de medias para el índice de desarrollo obtenido en

las semillas sembradas en el medio KM en concentraciones de 100 %, 75 % y 50 %, se
pudo observar que no existieron diferencias significativas entre las concentraciones de
las sales inorgánicas (Fig. 20). (Anexo 3.11).

Figura 20. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación en las diferentes
concentraciones de sales del medio KM.

~ 47 ~
 Como se puede observar en la figura 20, las tres concentraciones de sales del
medio KM tienen el mismo efecto estimulante para el desarrollo morfogénico de las
semillas de B. uniflora puesto que el valor del índice oscila 374 y 412, resultando
estadísticamente iguales, con los cuales se induce el desarrollo de protocormos con
ápice foliar principalmente y protocormos con una hoja.

Figura 21. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación en las diferentes
concentraciones de sales del medio KM, a través del tiempo.

En la figura 21 se aprecia a los 7 días de cultivo que las semillas comienzan con
el proceso de germinación ya que para las tres concentraciones se observó más del 50
% de los protocormos hinchados. A los 14 días, para las tres concentraciones ya se
había establecido por completo el estadio 2; sin embargo, se observó el desarrollo del
estadio 3 o protocormo en los siguientes porcentajes 100 % (16 %), 75 % (38%) y 50 %
(45 %).

A los 28 días de cultivo en las sales diluidas a la mitad de su concentración, el

estadio 3 se estableció por completo, para las concentraciones de 100 y 75 % siguió
aumentando el número de protocormos pero sin llegar al 100 %.

~ 48 ~
 Para los 56 días de cultivo el porcentaje de protocormos con primordio foliar
para el KM al 50 % fue de 39 %, el 61 % se encontraba en el estadio 5, para el 75 %
el valor del índice era de 403 (estadio 4). Para el KM al 100 % se observó un 95 % de
protocormos con un primordio foliar.

El valor del índice de desarrollo se incrementó para los 63 días, en el KM al

50% se alcanzó el estadio 5 o protocormos con una hoja, el valor del índice de
desarrollo fue de 502. Mientras que en el KM al 75 % el 61 % de los protocormos
estaban en el estadio 4 y el 39 % ya habían alcanzado el estadio 5. Para el KM al 100
% solo el 20 % de los protocormos habían desarrollado una hoja.

A los 98 días de cultivo el estadio 5 se estableció por completo pero se pudo

observar el desarrollo de la segunda hoja en los protocormos y este porcentaje vario
para cada concentración. En el caso del KM al 100 % se generó un 35 %, para el 75 %
un 57 % y para el KM al 50 % un 64 %, siendo esta concentración la que generó el
mayor porcentaje de protocormos con dos hojas.

La comparación de medias para el índice de desarrollo obtenido con respecto a

los carbohidratos utilizados independientemente de la concentración de sales del medio
KM y del tiempo, refleja que el valor del índice para la sacarosa, maltosa, glucosa y
fructosa es mayor y diferente al resto (Fig. 22) (Anexo 3.12).

Figura 22. Desarrollo durante la germinación in vitro de semillas de Barkeria uniflora en medio KM expuestas a
Fructosa (FR), Galactosa (GA), Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

~ 49 ~
 Como se observa en la figura 22 no hubo diferencias significativas entre cuatro
azucares (maltosa, fructosa, glucosa y sacarosa), ya que las cuatro tuvieron el mismo
efecto estimulador para el desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora, los estadios
alcanzados por las semillas para los cuatro carbohidratos fue el de protocormo con una
hoja (estadio 5) y protocormo con dos hojas (estadio 6).

Sin embargo, para el Testigo se observa que los embriones únicamente se

hinchan y toman una coloración verde, (estadio 2). La galactosa no induce el desarrollo
morfológico de las semillas de Barkeria uniflora ya que posteriormente de los 98 días de
cultivo las semillas permanecen en el estadio 1.

Índice de Desarrollo en el Medio Knudson C

Al realizar el ANDEVA para el índice de desarrollo en la germinación de las

semillas de Barkeria uniflora sembradas en el medio de cultivo Knudson C, se observó
que existieron diferencias significativas (Valor-P<0.0000) entre el tiempo de cultivo, la
concentración de las sales y los carbohidratos empleados. (Anexo 3.13).

Al realizar la comparación de las medias de los índices de desarrollo obtenidos

en cada uno de los tiempos de cultivo, independientemente de la concentración de
sales y de los carbohidratos (Anexo 3.14), se comprobó que fueron estadísticamente
diferentes entre sí (Fig. 23)

~ 50 ~
 Figura 23. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación en medio KC a través
del tiempo de cultivo.

Se aprecia en la figura 23 el índice de desarrollo promedio obtenido en las

semillas de Barkeria uniflora sembradas en el medio de cultivo KC, a los 7 días del
cultivo el valor del índice de desarrollo fue de 181 el 81 % de las semillas comenzaron
el proceso de germinación al hincharse y tornarse de color verde, estadio 2. Para los
28 días, se alcanzó el 100 % de embriones hinchados y verdes. El valor del índice de
desarrollo fue de 201.

Los embriones siguieron su desarrollo hasta los 98 días de cultivo, donde se

observó el incremento del índice de desarrollo hasta alcanzar un valor de 242, para este
tiempo el 58 % de los embriones aún se encontraban en el estadio 2 y el 42 % de los
embriones desarrollaron protocormos.

~ 51 ~
 Se observa en la figura 24 que al realizar la comparación de medias para el
índice de desarrollo obtenido en las semillas sembradas en el medio KC en las
concentraciones de 100 %, 75 % y 50 %, (Anexo 3.15). El medio nutritivo KC a la mitad
de su concentración es el que genera mayor respuesta morfogénica en las semillas de
B. uniflora, puesto que el valor del índice fue de 240, resultando mayor y
estadísticamente diferente al resto de las concentraciones.

Figura 24. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación en las diferentes
concentraciones de sales del medio KC.

Figura 25. Desarrollo de las semillas de Barkeria uniflora durante su germinación en las diferentes
concentraciones de sales del medio KC, a través del tiempo.

~ 52 ~
 El efecto de la concentración de sales del medio KC a través del tiempo,
independientemente de los carbohidratos experimentales se aprecia en la figura 25,
donde a los 7 días de cultivo las semillas ya habían comenzado el proceso de
germinación ya que en las tres concentraciones se observó que más del 50 % de los
embriones se hincharon y tomaron una coloración verde. (Fig. 25).

Para los 14 días de cultivo se alcanzó el 100 % de embriones hinchados y

verdes, (estadio 2), en las concentraciones de 100 y 75% con un índice de desarrollo de
200 y 201 respectivamente. Mientras que en el medio KC al 50 %, el 82 % de los
embriones habían alcanzado este estadio.

El valor del índice de desarrollo siguió aumentando y para los 28 días en las
tres concentraciones se pudo observar el estadio 2. El estadio máximo alcanzado por
las semillas después de los 98 días de cultivo fue en el medio KC a una concentración
de 50% donde el 88 % de los embriones se desarrollaron en protocormo, seguido por el
medio KC al 75 % de concentración de sales con un porcentaje de protocormos de 38
% y al 100 % con un 6 %.

La comparación de medias para el índice de desarrollo con respecto a los

carbohidratos utilizados independientemente de la concentración del medio KC y del
tiempo, muestra que se generaron diferencias, excepto en el valor del índice de las
semillas sin exposición a un azúcar y para las expuestas a glucosa y sacarosa, cuyos
valores son iguales entre sí. (Fig. 26) (Anexo 3.16).

~ 53 ~
Figura 26. Desarrollo durante la germinación in vitro de semillas de Barkeria uniflora en medio KC
expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA), Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

La maltosa es el carbohidrato que genera mayor estimulo en el desarrollo de las

semillas de Barkeria uniflora ya que al estar expuestas a este carbohidrato el 80 %
alcanzó el estadio de protocormo con primordio foliar con un índice de desarrollo de
380. Seguido por la Fructosa con la cual se el 68 % de los protocormos formaron un
primordio foliar.

La sacarosa, glucosa y el testigo tuvieron el mismo efecto estimulador para el

desarrollo morfogénico, ya que en los tres los embriones se hincharon y se pusieron
verdes, se obtuvo un índice de desarrollo de 200. Posteriormente de los 98 días de
cultivo, las semillas que se encontraban expuestas a la galactosa no se desarrollaron,
pues que estas permanecieron en el estadio 1.

~ 54 ~
Respuesta Morfogénica en los diferentes Carbohidratos

Medio MS al 100 %
La respuesta morfogénica de las semillas de B. uniflora durante el cultivo en los
tratamientos con el medio nutritivo MS al 100 % de su concentración adicionado con
cada uno de los carbohidratos experimentales se pudo observar (Fig. 27) que el mayor
índice de desarrollo se obtuvo a partir de los 91 días en aquellas semillas expuestas a
maltosa donde se desarrollaron un 46 % de plántulas competas (estadio 8). Seguido
por la fructosa en la cual se generaron un 93 % de plántulas con tres hojas (estadio 7).
Las semillas expuestas a glucosa y sacarosa llegaron al estadio 4 (protocormo con
primordio foliar), las semillas expuestas al medio MS sin ningún azúcar se hincharon
pero no siguieron su desarrollo, y las sembradas en galactosa después de los 98 días
no tuvieron respuesta alguna (estadio 1).

Figura 27. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en MS al 100 %, expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA),
Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

~ 55 ~
Medio MS al 75 %

Para el caso de las semillas sembradas en el medio MS al 75% se observa que

existieron diferencias significativas entre los carbohidratos utilizados, como lo muestra
la figura 26. El valor del índice de desarrollo más alto fue de 746 obtenido en la maltosa
donde se observaron plántulas completas (estadio 8). (Fig. 28)

Las semillas expuestas a la fructosa lograron después de los 98 días de cultivo

un porcentaje de 66 % de protocormos con primordio con una hoja (estadio 5), mientras
que el 34 % continúo en el estadio 4.

El estímulo logrado por la sacarosa permitió que los protocormos desarrollaran

un primordio foliar (estadio 4), el valor alcanzado fue de 400. Mientras que en la glucosa
el 86 % de las semillas alcanzó el estadio de protocormo con primordio foliar. El índice
de desarrollo obtenido en el testigo fue de 200, semillas hinchadas y en la galactosa no
se induce respuesta morfogénica.

Figura 28. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en MS al 75 %, expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA),
Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

~ 56 ~
Medio MS al 50 %

En la figura 29 se puede observar que las semillas expuestas a fructosa desde

los 77 días completaron su desarrollo obteniéndose plantas completas (estadio 8). En la
maltosa se obtienen un valor del índice de desarrollo de 740, logrando un 40 % de
plantas completas (estadio 8). Las semillas sembradas en glucosa también muestran
buen desarrollo logrando alcanzar el estadio 7 (planta con tres hojas).

La respuesta morfogénica de las semillas expuestas a la sacarosa fue de 480, donde el

80 % alcanzaron el estadio de protocormo con una hoja (estadio 5), el estadio 2
prevaleció en el testigo y la galactosa no induce respuesta morfogénica.

Figura 29. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en MS al 50 %, expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA),
Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

Medio KM al 100 %
La respuesta morfogénica obtenida en la maltosa y sacarosa fue la misma
ambas promueven la formación de plantas con tres hojas (estadio 7) y plantas
completas (estadio 8), el valor del índice de desarrollo fue de 780 y 766
respectivamente. (Fig. 30)

~ 57 ~
 La fructosa y la glucosa tienen el mismo efecto inductor de la respuesta
morfogénica y del desarrollo, ya que al final de los días de cultivo ambas alcanzaron un
80 % de planta con tres hojas (estadio 7).

Figura 30. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en KM al 100 %, expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA),
Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

Medio KM al 75 %

A los 98 días de cultivo se aprecia que las semillas expuestas a la fructosa,

glucosa y maltosa, terminan su desarrollo generándose plantas completas (estadio 8).
El valor del índice de desarrollo alcanzado en las semillas sembradas en el medio
adicionado con sacarosa fue de 666, donde se observó un 66 % de plantas con tres
hojas (estadio 7). (Fig. 31)

~ 58 ~
Figura 31. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en KM al 75 %, expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA),
Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

Medio KM al 50 %
En la figura 32 se observa que desde los 91 días de cultivo las semillas
expuestas a la fructosa y glucosa finalizan su desarrollo ya que se generaron plantas
completas (estadio 8). Las semillas sembradas en sacarosa y maltosa también
alcanzaron el último estadio pero en un menor porcentaje el cual fue de 40 %. La
galactosa no induce la respuesta morfogénica de las semillas de Barkeria uniflora ya
que las semillas permanecen en el estadio 1 hasta el final del cultivo.

Figura 32. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en KM al 50 %, expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA),
Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

~ 59 ~
Medio KC al 100 %
Se aprecia en la figura 33 que el estadio más alto que se pudo alcanzar fue el
de protocormo con un valor del índice de desarrollo de 326, en las semillas sembradas
en el medio adicionado con Maltosa. En la fructosa, glucosa, sacarosa y el testigo los
embriones se hinchan y se ponen verdes pero no siguen con su desarrollo. Mientras
que la galactosa tiene un efecto negativo en las semillas de Barkeria uniflora.

Figura 33. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en KC al 100 %, expuestas a Fructosa (FR),
Galactosa (GA), Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

Medio KC al 75 %

El máximo estadio morfogénico alcanzado se obtiene en el medio KC

adicionado con maltosa donde se observaron protocormos con una hoja (estadio 5),
con un índice de desarrollo de 464. (Fig. 34).

En la fructosa, glucosa, sacarosa y el testigo los embriones se hinchan y se

ponen verdes pero no siguen con su desarrollo.

~ 60 ~
 Figura 34. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en KC al 75 %, expuestas a Fructosa (FR),
Galactosa (GA), Glucosa (GL), Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

Medio KC al 50 %
Para el caso de las semillas sembradas en el medio KC al 50 % se observa que
existieron diferencias significativas entre los carbohidratos utilizados, como lo muestra
la figura 35. El valor del índice de desarrollo más alto fue de 666 obtenido en la maltosa
donde se observó un 66 % de plántulas con tres hojas (estadio 7). El estímulo logrado
por la fructosa permitió que las semillas alcanzaran un 26 % de protocormos con
primordio foliar y un 74 % de protocormos al final del cultivo.

Figura 35. Respuesta morfogénica de Barkeria uniflora en KC al 50 %, expuestas a Fructosa (FR), Galactosa (GA), Glucosa (GL),
Maltosa (MA), Sacarosa (SA) y Testigo (TE).

~ 61 ~
Plantas Completas a los 98 días de cultivo

El análisis de varianza demostró que existieron diferencias significativas (Valor-

P<0.0000) entre el tipo de medio de cultivo utilizado y el carbohidrato al que estuvieron
expuestas las semillas, estos factores tuvieron un efecto estadísticamente significativos
sobre el porcentaje de plantas completas con un 95 % de confianza. (Anexo 3.1.7).

Al comparar las medias de los porcentajes de plantas completas demostró que

existieron diferencias significativas entre el tipo de medio de cultivo utilizado y el
carbohidrato al que estuvieron expuestas las semillas. El medio de cultivo donde se
alcanzó el porcentaje de plantas completas (estadio 8) (Fig. 40) más alto fue en el KM
con un valor de 54 %, seguido por el medio MS donde se obtuvo un 35 % y el menor
porcentaje se aprecia en el medio KC con un 5% de plantas completas. (Fig. 36) (Anexo
3.18).

Figura 36. Desarrollo de plantas completas de Barkeria uniflora en los diferentes medios nutritivos.

~ 62 ~
 En el medio nutritivo KC se observó, que la adición de maltosa es la que genera
el mayor porcentaje de plantas completas con un valor de 29 %, seguido por la fructosa
con un 6 %, los demás azúcares no generan plantas completas. (Fig. 37)

Figura 37. Porcentaje de plantas completas de Barkeria uniflora en el medio KC y en los carbohidratos
expuestos.

La interacción del medio KM con los diferentes carbohidratos, demuestra que la

fructosa, maltosa y sacarosa tienen el mismo efecto estimulante en la formación de
plantas completas, ya que al adicionar estos carbohidratos al medio se obtiene un
porcentaje de 83 %. Seguido por la glucosa con un 78 % y el testigo y la galactosa no
generan plantas completas. (Fig. 38)

Figura 38. Porcentaje de plantas completas de Barkeria uniflora en el medio KM y en los carbohidratos
expuestos.

~ 63 ~
 En el medio nutritivo MS se observó, que la adición de maltosa es la que genera
el porcentaje más alto de plantas completas el valor alcanzado fue de 84 %, seguido
por la fructosa donde su generaron un 69 % de plantas completas, mientras que con la
adición de glucosa se alcanzó un 36 % y con sacarosa un 21 %. (Fig. 39)

Figura 39. Porcentaje de plantas completas de Barkeria uniflora en el medio MS y en los carbohidratos
expuestos.

Fig. 40 Planta con raíces de Barkeria uniflora.

~ 64 ~
 DISCUSIÓN

La prueba de viabilidad con tetrazolio permitió determinar la condición

fisiológica de los embriones de las semillas de Barkeria uniflora, esta prueba se basa en
la respiración de las semillas viables, al momento de respirar liberan enzimas
deshidrogenasas, el hidrogeno liberado por la reacción de la deshidrogenasa en los
tejidos vivos se combina con la sal del tetrazolio que es incolora para formar un
pigmento rojo (formazán) tiñendo a los embriones vivos de las semillas de Barkeria
uniflora. Es claro que los embriones no coloreados indican poca actividad de las células
embrionarias o muerte (Moreno 1984; Ortiz, 2001).

La viabilidad de las semillas expuestas a galactosa fue nula, Ernst y

colaboradores (1971) reportan que la galactosa es tóxica para la germinación
asimbiótica in vitro de las semillas de orquídea, provocando la inhibición de éstas.

De acuerdo con Arditti y Ernst (1993), los porcentajes de germinación de

orquídeas epifitas alcanzados sobre un medio asimbiótico son mayores al 50%; Santos
y colaboradores (2005), reportan un porcentaje de germinación de 70 a 90% para Laelia
albida utilizando el medio de Knudson C, suplementado con extracto de papa.
Schneiders y colaboradores (2012) reportaron 45% de germinación para Cattleya
forbessii en el medio MS y 90% para Cattleya harrisoniana en MS adicionado con 2.5
gL-1 de carbón activado, a los 30 días de cultivo.

Resultados obtenidos con orquídeas del estado de Tabasco: Trichocentrum

ascendens, Trichocentrum carthagenense, Oncidium sphacelatum y Trichocentrum
lindenii, han obtenido resultados aceptables con promedios de germinación de semillas
de un 70 a 90% (Mayo et al., 2008).

~ 65 ~
 Lo cual concuerda con los resultados obtenidos en el presente trabajo, donde
bajo condiciones in vitro se obtuvo un porcentaje de germinación de 99%. Villafuerte
(2013), reportó que al utilizar el medio MS, se obtenía un alto porcentaje de
germinación mayor al 90% en las semillas de Barkeria whartoniana y B. scandens.

Lee y Lee (1991) reportaron que la germinación en semillas de orquídeas

ocurre entre los 30 y 60 días de cultivo. De acuerdo con Cortes, 2006; Neyra y Rosas,
1998 reportan que para Laelia speciosa el proceso de germinación inicia a los siete días
de cultivo. Esto concuerda con los resultados obtenidos para este estudio en semillas
de Barkeria uniflora donde se pudo observar que a los 7 días ya se ha alcanzado un
80% de germinación y para los 14 días de cultivo se logra el mayor porcentaje de
germinación 99%. Resultados similares se obtuvieron para Barkeria scandens donde se
logró la germinación de semillas a los 15 días posteriores de la siembra, (Arenas y
Aguirre, 2012).

Como se puede observar en la Figura 5 la germinación se lleva a cabo en casi

todos los carbohidratos a los que se expusieron las semillas de Barkeria uniflora,
también se pudo observar que en el Testigo donde no se encuentra la adición exógena
de un azúcar también se logra la germinación. Estos resultados nos indican que el
estímulo de un carbohidrato no es fundamental para el inicio del proceso germinación
(Harrison y Arditti, 1978; Ernst y Rodríguez, 1984; Leroux et al., 1995; Neyra y Rosas,
1998; Cortes, 2006). Esto nos hace inferir que es indistinto el hecho de que haya
carbohidrato o no para que se dispare el proceso de germinación, ya que las semillas
sólo necesitan humedad para iniciar dicho proceso.

Ernst y colaboradores (1971) reportaron que la adición de galactosa al medio

de cultivo llega a inhibir el crecimiento de las orquídeas, lo cual concuerda con los
resultados de este estudio ya que las semillas de Barkeria uniflora expuestas a
galactosa no germinan. Nambiar et al., 2012, observaron que la galactosa no promueve
la formación de cuerpos parecidos a protocormos en el híbrido de Dendrobium.

~ 66 ~
 No existe comparación alguna entre la germinación in vitro y la germinación en
condiciones naturales, ya que en condiciones naturales sólo germinan una de 5 000 a
una de 20 000 semillas, dependiendo del sitio (Hágsater et al 2005), por lo que se
puede decir que en la germinación in vitro existe una mayor ventaja en la germinación,
ya que todos los factores ambientales que inciden en la germinación ex vitro, se pueden
controlar en el laboratorio.

Al realizar la comparación de las medias de los valores del índice de desarrollo

se obtuvo que existieron diferencias significativas entre los medios de cultivo
empleados independientemente de la concentración de las sales y los carbohidratos a
los que se expusieron las semillas de Barkeria uniflora.

Álvarez (2012), reporta que el medio KM adicionado con carbón activado

incrementa el desarrollo de plántulas a partir de protocormos con una hoja en
Trichocentrum pachyphyllum. Rodríguez (2013), observó que el medio de cultivo KM
adicionado con carbón activado favorece el desarrollo ontogénico de las plántulas de
Epidendrum radicans. Estos resultados coinciden con los obtenidos en el presente
estudio donde se demuestra que la germinación y desarrollo de Barkeria uniflora se ve
favorecido en el medio de cultivo KM.

López-Roberts y colaboradores (2007) obtuvieron en Epidendrum sp. después

de 42 días de cultivo, el estadio de protocormo con primordio foliar en los medios de
cultivo MS. Arenas y Aguirre (2008), reportan que para Barkeria scandens las semillas
alcanzan el estadio de protocormo con primordio foliar a los 50 días en medio MS. Sin
embargo, en el presente estudio con B. uniflora el desarrollo de protocormos con
primordio foliar en el medio MS invirtió 40 días más ya que se alcanza este estadio
hasta los 98 días de cultivo.

Aparentemente, la necesidad elevada de nutrimentos en el cultivo in vitro

responde al hecho de que la plántula no es capaz de asimilar eficientemente los
nutrimentos disponibles en el medio de cultivo (Romero-Tirado, 2007), ya que necesita
una micorriza para su adecuada asimilación de nutrientes.

~ 67 ~
 Al utilizar las sales basales, de los medios nutritivos, diluidas a la mitad de su
concentración fueron las que generaron una mayor respuesta para la germinación in
vitro de B. uniflora independientemente del medio de cultivo usado, estos resultados
concuerdan con los obtenidos por Massaro y colaboradores, (2012) en Epidendrum
secundum sembradas en medio MS a la mitad de su concentración.

En diferentes especies de orquídeas de Tabasco se han obtenido resultados

aceptables con promedios de germinación de 90 % empleando el medio MS al 50 % de
su concentración. (Mayo et al., 2008).

Estos resultados se deben a que las orquídeas epífitas como es el caso de

Barkeria uniflora están acostumbradas a recibir nutrientes diluidos en pequeñas
cantidades pero de forma constante. (Menchaca y Moreno 2011).

Al exponer las semillas de B. uniflora a diferentes fuentes exógenas de

carbohidratos se pudo observar que la maltosa tiene un efecto positivo en la
germinación y en el desarrollo de las semillas de esta especie, lo cual concuerda con
George et al., 2008, quien reporta que la maltosa sirve como una fuente de carbono y
como un agente osmótico superando a la sacarosa.

Existen pocos reportes sobre el uso de la maltosa como fuente exógena de

azúcar, Abu y colaboradores 2005, reportan el uso de este carbohidrato en la
generación de cuerpos parecidos a protocormos (PLB´s) a partir de callo en
Doritaenopsis.

Comparando a la maltosa con la sacarosa, la hidrólisis de sacarosa se produce

a un ritmo más rápido en comparación con la tasa de absorción de los azúcares en el
tejido de la planta, mientras que la maltosa se hidroliza más lentamente, lo que ayuda a
la absorción de este azúcar en las plantas ( Yu et al., 2000).

~ 68 ~
 La fructosa es una fuente de carbono y energía para el embrión, siendo el
estímulo disparador para su desarrollo morfogénico durante su germinación (Luna y
Barba, 1993), esto concuerda con los resultados obtenidos ya que las semillas de
Barkeria uniflora alcanzan el estadio de protocormo con primordio foliar al ser
expuestas a este azúcar.

Murdad et al., 2010, reportaron en Phalaenopsis gigantea un índice de

desarrollo de 537, para las semillas expuestas al estímulo de fructosa seguido por la
glucosa (495) y sacarosa (493), resultados muy similares con los obtenidos en este
trabajo.

Como se observa en la Figura 10, las semillas que se exponen a la galactosa

no germinan, esto concuerda con lo reportado por Ernst y colaboradores (1971),
expone que la D-galactosa llega a ser toxica para las semillas de orquídea, ya que
retrasa el crecimiento de las plantas, rompe el tonoplasto de las células y se invagina la
envoltura nuclear, lo que sugiere que este azúcar altera los factores responsables del
mantenimiento de la permeabilidad de la membrana.

Las semillas de Barkeria uniflora que fueron sembradas en medio MS registran

un mayor desarrollo y crecimiento a una concentración del 50 % de las sales
inorgánicas, seguidas por las sembradas al 100 %. Y el desarrollo ontogénico se ve
favorecido por la maltosa y la fructosa, (Figura 11 y 12). Estos resultados coinciden con
los obtenidos por Aguilar-Morales y López-Escamilla (2013), donde el medio MS al 50
% favoreció la germinación de Laelia speciosa en un tiempo de 10 días y en MS al 100
% este proceso comienza a los 16 días.

Romero-Tirado (2007), reportan que en Laelia anceps género muy cercano a

Barkeria, el medio MS al 100 % y MS al 50 % favorece el desarrollo de plántulas
vigorosas, con dos o más raíces y mayor biomasa para la germinación.

Estos resultados se deben a que el Medio MS es rico en sales minerales, lo que

favorece el desarrollo de plántulas de Barkeria uniflora, incluso cuando se utilizó a la
mitad de su concentración.
~ 69 ~
 Álvarez (2012), observó el desarrollo de características morfológicas favorables,
como vigor, pigmentación y tamaño, en las plántulas de T. pachyphyllum cultivadas en
el medio KM. Rodríguez (2013), indica que el medio KM, adicionado con carbón
activado, favorece el desarrollo ontogénico de las plántulas de Epidendrum radicans.

Lo que concuerda con los resultados obtenidos en las semillas sembradas en el

medio KM, donde la germinación y desarrollo se favorece en la concentración de 50 y al
75 % de las sales del medio. El estímulo de la maltosa, fructosa, glucosa y sacarosa fue
similar ya que todas inducen el desarrollo de Barkeria uniflora (Figura 15 y 16).

Romero-Tirado, 2007. Reporta que para Laelia anceps se genera solo un 5 %

de plantas en medio KC al 100 y 50 %. Estos resultados coinciden con los reportados
en el presente estudio, donde se observó que el medio KC indujo la germinación pero
genera poca respuesta morfogénica en las semillas de Barkeria uniflora, esto se debe a
que el medio KC esta formulado especialmente para la germinación de orquídeas
(Arditti & Ernst 1993), pero este medio es muy pobre en sales minerales, lo que no
favorece el desarrollo de las orquídeas en este.

Los resultados obtenidos en la respuesta morfogénica durante la siembra de las

semillas de Barkeria uniflora, expuestas a diferentes fuentes exógenas de
carbohidratos. Demostraron que la maltosa y la fructosa inducen una mejor respuesta
morfogénica en los embriones de esta especie, llegando a formar plantas completas al
término de los 98 días de cultivo, sin embargo los demás carbohidratos también son
una buena fuente de energía y de inducción de la morfogénesis.

Lo que concuerda con lo reportado por Neyra y Rosas (1998), para Laelia
speciosa, donde la fructosa y la glucosa inducen el desarrollo morfogénico del embrión.

Así mismo, Buentello y Sánchez (1998), reportan que la sacarosa promueve el

desarrollo del embrión y de plántulas con raíces en Laelia speciosa. Cortes, 2006,
menciona que la Fructosa como fuente exógena de carbón y de energía induce el
desarrollo morfológico del embrión en las semillas de Laelia speciosa.

~ 70 ~
 Nambiar y colaboradores (2012), obtienen un mayor peso fresco de cuerpos
parecidos a protocormos PLB´s de Dendrobium, en medios adicionados con Fructosa
seguida de Glucosa y Sacarosa.

Esto se debe a que los azúcares, especialmente glucosa y sacarosa estimulan

el crecimiento de las células. Tanto la glucosa y la sacarosa juegan un papel esencial
en la aceleración del proceso de la división celular mediante la mejora específicamente
la expansión celular y el fomento de la acumulación de reservas en los embriones de
las plantas Borisjuk et al., 2003.

Al final de los días de cultivo de Barkeria uniflora se pudieron observar plantas

completas (estadio 8), éstas se encontraron en casi todos los tratamientos y en los
diferentes carbohidratos a las que se expusieron, siendo en el testigo y la galactosa en
donde no se formaron.

Estos resultados coinciden con los obtenidos por Arena y Aguirre (2012), donde
pudieron observar plantas completas de Barkeria scandens a los 97 días de cultivo.
Cortes, 2006, obtiene mayor número de plantas completas en medios adicionados con
fructosa.

Villafuerte (2013) obtuvo plantas completas de Barkeria whartoniana a partir del

cultivo in vitro de secciones longitudinales de protocormos en medio MS y MS al 50 %
a los 180 días de cultivo y de B. scandens mediante el cultivo in vitro de secciones de
diferentes tipos de explante (tallo y hoja) en medio MS y MS al 50 % después de 180
días.
Neyra y Rosas, 1998 reportan que en el medio donde se mantiene constante el
estímulo de fructosa y glucosa se obtiene un mayor porcentaje de plantas completa.
Álvarez, 2012, reporta la generación de plantas completas de Trichocentrum
pachyphyllum a los 90 días en medio KM y Peters.

~ 71 ~
 CONCLUSIONES

 El proceso de germinación de las semillas de Barkeria uniflora inicia a los 7 días

y alcanza su máximo porcentaje a los 14 días.

 Los medios de cultivo que inducen el máximo porcentaje de germinación de

Barkeria uniflora son aquellos suplementados con Maltosa, Fructosa, Glucosa y
Sacarosa.

 El medio de cultivo donde se induce en menor tiempo el proceso de germinación

y el desarrollo de plántulas de B. uniflora es el Kao y Michayluk (KM), seguido
por el Murashige & Skoog (MS) y por último el Knudson C (KC).

 Al utilizar cualquiera de las sales basales de los medios nutritivos diluidas a la

mitad de su concentración se promueve el mayor desarrollo durante la
germinación de las semillas de B. uniflora.

 El máximo porcentaje de plantas completas se desarrollan en el medio KM con el

estímulo de Fructosa, Maltosa y Sacarosa y en MS con Maltosa.

 El proceso de germinación de B. uniflora se inhibe al adicionar Galactosa en el

medio de cultivo e induce la perdida de viabilidad.

 La Maltosa y Fructosa, como fuente exógena de carbono y de energía, son el

mejor estímulo disparador para el desarrollo morfogénico de plántulas con hojas
y raíces de Barkeria uniflora.

 Se estableció un protocolo para la germinación in vitro de Barkeria uniflora, con

el cual se logró un 99 % de germinación y un 84 % de plantas completas.

~ 72 ~
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ANEXOS

Anexo 1. Composición de las sales inorgánicas analíticas de los medios nutritivos.

Compuestos Murashige & Skoog Kao y Michayluk Knudson C

-1
(MS)
mg l (KM) (KC)

NH4NO3 1650 600 -

KNO3 1900 1900 -

CaCl2.2H2O 332.2 453 -

MgSO4 370 146.55 250

KH2PO4 170 170 250

(NH4)2SO4 - - 500

Ca(NO3)24H2O - - 1000

H3BO3 6.2 3 -

MnSO4.4H2O 22.3 10 5.682

ZnSO4.7H2O 8.6 2 -

Na2MoO4 0.25 0.25 -

CuSO4.5H2O 0.025 0.025 -

CoCl2.6H2O 0.025 0.025 -

Kl 0.83 0.75 -

FeSO4.7H2O 27.85 27.8 25

Na2EDTA.2H2O 37.27 37.3 -

KCl - 300 -

~ 83 ~
Anexo 2 Resultados
Análisis de varianza para el porcentaje de Germinación.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES
A:TIEMPO 20400,7 13 1569,28 58,16 0,0000
B:CARBOHIDRATO 3,08703E6 5 617406, 22882,64 0,0000
INTERACCIONES
AB 8245,2 65 126,849 4,70 0,0000
RESIDUOS 58927,4 2184 26,9814
TOTAL (CORREGIDO) 3,1746E6 2267

Anexo 3 Análisis de varianza para ID por todos los tratamientos.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES
A:TIEMPO 1.18391E7 13 910697. 675.80 0.0000
B:MEDIO 1.1662E7 2 5.83098E6 4326.96 0.0000
C:[] SALES 897119. 2 448559. 332.86 0.0000
D:CARBOHIDRATO 3.66459E7 5 7.32918E6 5438.72 0.0000
INTERACCIONES
AB 3.85781E6 26 148377. 110.11 0.0000
AC 365690. 26 14065.0 10.44 0.0000
AD 6.70277E6 65 103120. 76.52 0.0000
BC 339768. 4 84942.1 63.03 0.0000
BD 7.38154E6 10 738154. 547.76 0.0000
CD 653856. 10 65385.6 48.52 0.0000
ABC 176622. 52 3396.58 2.52 0.0000
ABD 2.67445E6 130 20572.7 15.27 0.0000
ACD 399344. 130 3071.88 2.28 0.0000
BCD 1.29029E6 20 64514.4 47.87 0.0000
ABCD 912209. 260 3508.5 2.60 0.0000
RESIDUOS 2.03756E6 1512 1347.59
TOTAL (CORREGIDO) 8.78359E7 2267

Anexo 3.1 Pruebas de Rangos Múltiples para ID por Tiempo.

TIEMPO Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

7 162 171.679 2.88418 X
14 162 220.735 2.88418 X
21 162 241.037 2.88418 X
28 162 253.605 2.88418 X
35 162 283.599 2.88418 X
42 162 301.321 2.88418 X
49 162 310.136 2.88418 X
56 162 335.802 2.88418 X
63 162 350.519 2.88418 X
70 162 365.235 2.88418 X
77 162 381.352 2.88418 X
84 162 397.556 2.88418 X
91 162 408.321 2.88418 X
98 162 410.42 2.88418 X

~ 84 ~
Anexo 3.2 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Medio nutritivo.

MEDIO Casos Media Grupos Homogéneos

KC 756 220.439 X
MS 756 336.476 X
KM 756 392.652 X

Anexo 3.3. Prueba de Rangos Múltiples para ID por Concentración de Sales.

[] SALES Casos Media Grupos Homogéneos

100% 756 300.259 X
75% 756 304.78 X
50% 756 344.528 X

Anexo 3.4 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos.

CARBOHIDRATO Casos Media Grupos Homogéneos

GA 378 100.0 X
TE 378 199.27 X
SA 378 351.423 X
GL 378 367.177 X
FR 378 411.254 X
MA 378 470.011 X

Anexo 3.5 Análisis de varianza para el ID por Medio MS.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES
A:TIEMPO 4.62787E6 13 355990. 243.51 0.0000
B:[ ] SALES 857752. 2 428876. 293.36 0.0000
C:CARBOHIDRATO 1.56934E7 5 3.13867E6 2146.94 0.0000
INTERACCIONES
AB 302518. 26 11635.3 7.96 0.0000
AC 3.18814E6 65 49048.2 33.55 0.0000
BC 1.01782E6 10 101782. 69.62 0.0000
ABC 546499. 130 4203.84 2.88 0.0000
RESIDUOS 736812. 504 1461.93
TOTAL (CORREGIDO) 2.69708E7 755

~ 85 ~
Anexo 3.6 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Tiempo (MS).
TIEMPO Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
7 54 173.926 5.20315 X
14 54 234.648 5.20315 X
21 54 254.667 5.20315 X
28 54 270.37 5.20315 X
35 54 305.685 5.20315 X
42 54 323.741 5.20315 X
49 54 327.704 5.20315 X
56 54 360.593 5.20315 X
63 54 369.481 5.20315 X
70 54 386.815 5.20315 X
77 54 406.37 5.20315 X
84 54 425.556 5.20315 X
91 54 434.815 5.20315 X
98 54 436.296 5.20315 X

Anexo 3.7 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Concentración de Sales (MS).

[ ] SALES Casos Media Grupos Homogéneos

75% 252 301.095 X
100% 252 326.544 X
50% 252 381.79 X

Anexo 3.8 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos (MS).

CARBOHIDRATO Casos Media Grupos Homogéneos
GA 126 100.0 X
TE 126 199.683 X
SA 126 348.778 X
GL 126 393.325 X
FR 126 476.5 X
MA 126 500.571 X

Anexo 3.9 Análisis de varianza para el ID por Medio KM.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES
A:TIEMPO 1.07883E7 13 829868. 392.19 0.0000
B:[ ] SALES 182461. 2 91230.5 43.12 0.0000
C:CARBOHIDRATO 2.3062E7 5 4.61239E6 2179.81 0.0000
INTERACCIONES
AB 112889. 26 4341.87 2.05 0.0018
AC 5.3954E6 65 83006.2 39.23 0.0000
BC 477649. 10 47764.9 22.57 0.0000
ABC 370587. 130 2850.67 1.35 0.0129
RESIDUOS 1.06644E6 504 2115.96
TOTAL (CORREGIDO) 4.14557E7 755

~ 86 ~
Anexo 3.10 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Tiempo (KM).
TIEMPO Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
7 54 159.852 6.25975 X
14 54 233.111 6.25975 X
21 54 268.815 6.25975 X
28 54 289.259 6.25975 X
35 54 333.037 6.25975 X
42 54 359.926 6.25975 X
49 54 381.815 6.25975 X
56 54 420.222 6.25975 X
63 54 454.0 6.25975 X
70 54 473.63 6.25975 X
77 54 497.981 6.25975 X
84 54 525.111 6.25975 X
91 54 547.778 6.25975 X
98 54 552.593 6.25975 X

Anexo 3.11 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Concentración de Sales (KM).

[ ] SALES Casos Media Grupos Homogéneos

100% 252 373.504 X
75% 252 392.897 X
50% 252 411.556 X

Anexo 3.12 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos (KM).

CARBOHIDRATO Casos Media Grupos Homogéneos
GA 126 100.0 X
TE 126 198.317 X
SA 126 505.492 X
GL 126 508.524 X
FR 126 514.437 X
MA 126 529.143 X

Anexo 3.13 Análisis de varianza para el ID por Medio KC.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES
A:TIEMPO 280718. 13 21593.7 46.45 0.0000
B:[ ] SALES 196674. 2 98336.8 211.53 0.0000
C:CARBOHIDRATO 5.27209E6 5 1.05442E6 2268.11 0.0000
INTERACCIONES
AB 126906. 26 4881.01 10.50 0.0000
AC 793683. 65 12210.5 26.27 0.0000
BC 448677. 10 44867.7 96.51 0.0000
ABC 394467. 130 3034.36 6.53 0.0000
RESIDUOS 234304. 504 464.889
TOTAL (CORREGIDO) 7.74752E6 755

~ 87 ~
Anexo 3.14 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Tiempo (KC).
TIEMPO Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
7 54 181.259 2.93412 X
14 54 194.444 2.93412 X
21 54 199.63 2.93412 X
28 54 201.185 2.93412 X
35 54 212.074 2.93412 X
42 54 220.296 2.93412 X
49 54 220.889 2.93412 X
56 54 226.593 2.93412 X
63 54 228.074 2.93412 XX
70 54 235.259 2.93412 XX
77 54 239.704 2.93412 X
84 54 242.0 2.93412 X
98 54 242.37 2.93412 X
91 54 242.37 2.93412 X

Anexo 3.15 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Concentración de Sales (KC).

[ ] SALES Casos Media Grupos Homogéneos

100% 252 200.73 X
75% 252 220.349 X
50% 252 240.238 X

Anexo 3.16 Prueba de Rangos Múltiples para ID por Carbohidratos (KC).

CARBOHIDRATO Casos Media Grupos Homogéneos

GA 126 100.0 X
GL 126 199.683 X
TE 126 199.81 X
SA 126 200.0 X
FR 126 242.825 X
MA 126 380.317 X

Anexo 3.17 Análisis de varianza para el porcentaje de plantas completas a los 98 días de cultivo.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES
A:MEDIO 72142,9 2 36071,5 108,31 0,0000
B:CARBOHIDRATO 106570, 5 21314,0 64,00 0,0000
INTERACCIONES
AB 49439,9 10 4943,99 14,85 0,0000
RESIDUOS 53951,6 162 333,034
TOTAL (CORREGIDO) 294160, 179

Anexo 3.18 Prueba de Rangos Múltiples para el porcentaje de plantas completas a los 98 días de cultivo.

MEDIO Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

KC 54 5,85185 2,48341 X

MS 54 35,1852 2,48341 X
KM 72 54,1667 2,15069 X

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