Institución Educativa:

Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla.

Decanato / Carrera:

Ciencias Biológicas / Ingeniería en Biotecnología.

Asignatura:

Laboratorio de Bioquímica de las Biomoléculas

Reporte 5:

“Cuantificación de Proteínas I: Elaboración de Curva de Patrón”

Equipo:

s/n

Presentan:

De La Rosa Arriaga Amayrani | 74600856

Rodríguez Salas Ángel David | 74600775
Román Díaz Montserrat | 74600806

Profesor:

Q.F.B. Concepción Carrión Cruz

Barrio de Santiago, Puebla a 20 de Octubre, 2020

Introducción.

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica para determinar la

concentración de un compuesto en solución, las moléculas absorben radiaciones
electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la
concentración.
El ​espectrofotómetro ​es un instrumento óptico que mide la intensidad de la luz en
relación con la longitud de onda. La energía electromagnética, recogida de la muestra, entra
en el dispositivo a través de la abertura y es separada en sus longitudes de onda
componentes por la rejilla holográfica.

La absorbencia la cantidad de luz que absorbe una muestra, es medida mediante

espectroscopia, especialmente para el análisis cuantitativo, las unidades de absorbancia se
denominan “unidades de absorbancia”. Es calculada en base a la cantidad de luz reflejada
de la muestra; si no pasa luz a través de una muestra, la absorbancia es infinita y el
porcentaje de transmisión es cero.

La ley de Beer-Lambert nos ayuda al cálculo de la absorbancia la cual se trata de un

método matemático, aplicado para expresar en qué manera la materia absorbe la luz. La
fórmula es la siguiente. A = ebc, donde:

● A: absorbancia
● e: absorbencia molar
● b: longitud del trayecto de la muestra
● c: concentración de un soluto en una solución

A continuación llevaremos la cuantificación de proteínas; las proteínas son

macromoléculas, polipéptidos naturales y uno de los componentes fundamentales y más
abundantes de las células; participan y se encuentran en los procesos y estructuras más
importantes de los organismos y muestran una gran diversidad en sus propiedades físicas.
Los componentes básicos de las proteínas son los aminoácidos; y las cadenas extensas de
aminoácidos conforman a las proteínas. ​La identificación podrá ser llevada a cabo con
ayuda del reactivo de Biuret; es un reactivo que se emplea para la determinación de
proteínas de cadena larga y de cadena corta.

La proteína utilizada para nuestra solución concentrada es la albúmina; es producida

por el hígado . La albúmina mantiene el líquido dentro del torrente sanguíneo sin que se
filtre a otros tejidos al igual que transporta varias sustancias por el cuerpo, por ejemplo,
hormonas, vitaminas y enzimas
Propósito.

Cuantificar el contenido de proteínas en diferentes muestras biológicas mediante el

método de Biuret, para el desarrollo de habilidades en el manejo de la espectrofotometría.

Resumen de video.
Antes de comenzar a realizar las lecturas con el espectrofotómetro, es necesario
realizar una serie de 5 diluciones a partir de una solución concentrada, de tal manera que
todas las diluciones serán aforadas a 10 mL, teniendo así:

​ roporción entre disoluciones y concentración de proteína.

Tabla 1. P
# Tubo Dilución Albúmina % mg/mL g/L

1 Sol. Concentrada 2 20 0.020

2 1:2 1 10 (50%) 0.010

3 1:4 0.5 5 (25%) 0.005

4 1:8 0.25 2.5 (12.5%) 0.0025

5 1:16 0.125 1.25 (6.25%) 0.00125

6 1:32 0.0625 0.625 (3.125%) 0.000625

La ​Tabla 1,​ m
​ isma que se rescata en el apartado de resultados, fue llenada
estableciendo la relación con una regla de 3 sencilla, tomando como 100% los 20 mg/mL o
el 2% respectivamente, siempre teniendo en mente la división entre el soluto y el factor de
disolución.
Una vez planteada la relación entre cada dilución se procede a realizarlas, con
ayuda de una micropipeta de 100 se miden 5 mL de la solución concentrada y se deposita
en el tubo siguiente, previamente llenado con agua destilada. Después se toma la misma
cantidad de mL pero ahora provenientes del tubo 2 hacia el tubo 3 y así sucesivamente,
agitando en el vórtex cada una de las diluciones en cuanto se les agregue el soluto, sin
olvidar cambiar la puntilla desechable entre cada dilución.

Imagen 1. ​Pipeteo de tubo 2 a 3 para Imagen 2. ​Agitado en

realizar dilución 1:4 vórtex.
 Después de que las diluciones de albúmina hayan sido realizadas, es necesario
preparar un set de tubos nuevos y añadir 2 mL de reactivo de Biuret en la misma proporción
para cada tubo, después con una puntilla nueva cada vez, se toma 1 mL de las diluciones
de albúmina previamente hechas y se añaden a los tubos que contienen el reactivo de
Biuret. Sin olvidar siempre rotular y señalar cada muestra de la manera que corresponda.
Este reactivo originalmente de color azul, reaccionará con la proteína dando un color
púrpura.

Imagen 3. ​Coloración final después de la reacción del reactivo de Biuret con la

albúmina.

De la misma manera, es necesario preparar un blanco de reactivo especial para la

calibración del espectrofotómetro, ésto con el fin de asegurar que todas las lecturas entren
en el rango ya que si se calibra con agua, aumentan las posibilidades de que el rango
elegido de calibración no sea lo suficientemente amplio para abarcar los valores de
absorbancia de la proteína. Para la preparación del blanco, se requiere colocar en un tubo
de ensayo la mezcla de 2 mL del reactivo de Biuret + 1 mL de agua y agitar con el vórtex
durante 5 minutos. Una vez terminada la preparación del blanco se vierte en una celda de
cuarzo para proceder con la calibración, donde la absorbancia se ajusta a cero en 540 nm.
El Reactivo de Biuret, compuesto de Hidróxido de Potasio y Sulfato Cúprico con tartrato de
Sodio y Potasio, indica la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con
dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.

Imagen 4. ​Blanco de Reactivo.

 Este blanco será el que nos ayude en la calibración del espectrofotómetro, eligiendo
como longitud de onda 540 nm, se llenará una celda de cuarzo completamente limpia y
excelentemente esterilizada con el blanco (previamente preparado). Y dicha celda se
insertará en el espacio designado dentro del fotómetro, después se cierra la tapa y se
selecciona “lectura de blanco”. Este paso es de vital importancia para eliminar el color del
reactivo de las lecturas, y asegurar que el valor de la medición que veamos en pantalla
corresponde sólo a la proteína.

Imagen 5. ​Calibración de espectrofotómetro con blanco de reactivo.

Ahora bien, se iniciarán las mediciones en el espectrofotómetro, recordando que es

necesario realizarlas por triplicado, es decir 3 mediciones por cada concentración de
dilución y con el reactivo de Biuret añadido, y con celdas totalmente limpias, y
transparentes, carentes de rayones o suciedad.

Imagen 6. ​Diluciones terminadas, para medición en espectrofotómetro.

Comenzando con la muestra concentrada, ésta se traslada a una celda para

insertarla en la cubeta de muestra dentro del espectrofotómetro y comenzar la primera
medición de 3. Entre cada repetición para la misma muestra, deben transcurrir 5 minutos,
en los cuáles el reactivo de Biuret seguirá reaccionando con la albúmina y nos brindará
datos más acertados acerca de su absorbancia. Mientras la muestra concentrada se deja
reposar, se procede al tubo con la dilución 1:2, la cual se vierte en una celda y se inserta en
el espectrofotómetro para su medición. Sin olvidar registrar ordenadamente los resultados
obtenidos. Una vez terminada la medición de la primera dilución (1:2) se vuelve a insertar la
celda que contiene la solución concentrada, para llevar a cabo su segunda medición de 3.
Este mismo proceso de medición, intercalando diferentes concentraciones, se seguirá hasta
completar 3 mediciones para cada concentración, de las cuales se calculará el promedio.

Imagen 7. ​Celda de dilución concentrada. Imagen 8. ​Tercera y última lectura para 1:2.

Cada que se completen 3 repeticiones de la medición con cierta dilución, el

contenido de la celda se vierte en un vaso de precipitado dónde posteriormente estarán
todos los residuos. Seguido de esto, la celda se lava con agua destilada. Todo este
procedimiento de vaciado de tubo con dilución a celda, inserción de celda en
espectrofotómetro, registrar lectura, retirar esa celda, realizar la primera lectura de la
siguiente dilución, mientras la que acaba de ser leída reposa por 5 minutos, una vez
transcurrido ese tiempo se retira la celda que esté dentro y se procede a la segunda lectura
de la primera celda que se insertó para medición, así sucesivamente hasta la tercera
repetición, desecho y lavado.

I​magen 9. ​Desecho de ​Imagen 10. ​Lavado de celda I​ magen 11. E

​ nguaje de c​ elda.
celda en vaso de pre- con agua destilada.
cipitado de residuos.
 Cuando se concluyan todas las repeticiones, se obtienen los promedios de las
mediciones de absorbancia por cada dilución, es decir el promedio de las 3 mediciones de
la dilución 1:2, el promedio de las 3 mediciones de la dilución 1:4, y así sucesivamente,
obteniendo:

Resultados.

​ roporción entre disoluciones y concentración de proteína.

Tabla 1. P
# Tubo Dilución Albúmina % mg/mL g/L

1 Sol. Concentrada 2 20 0.020

2 1:2 1 10 (50%) 0.010

3 1:4 0.5 5 (25%) 0.005

4 1:8 0.25 2.5 (12.5%) 0.0025

5 1:16 0.125 1.25 (6.25%) 0.00125

6 1:32 0.0625 0.625 (3.125%) 0.000625

Tabla 2.​ Resultados de absorbancia.

Tubo Dilución Absorbancia Absorbancia Absorbancia Absorbancia [proteína]
1 2 3 promedio (mg/ml)

1 Concentrada 0.755 0.765 0.774 0.7646 20

2 1:2 0.414 0.421 0.427 0.4206 10

3 1:4 0.156 0.158 0.159 0.1576 5

4 1:8 0.102 0.103 0.103 0.1026 2.5

5 1:16 0.066 0.066 0.066 0.066 1.25

6 1:32 0.056 0.055 0.056 0.0556 0.625

 Gráfica 1​. Curva patrón de absorbancia.

Conclusión.

De acuerdo a lo visto durante el análisis de lo establecido en el manual y, lo

comprendido durante en transcurso del procedimiento de la práctica, se obtienen las
siguientes conclusiones puntuales:

● La concentración es directamente proporcional a la absorbancia, es decir, a mayor

absorbancia mayor cantidad de soluto (más concentrada está la solución). Dicha
relación se refleja gráficamente como una línea recta.

● En contraparte, la concentración es indirectamente proporcional a la transmitancia: a

mayor transmitancia, menor concentración.

● Siempre el disolvente funge como el blanco de reactivo para la calibración adecuada

del equipo, asegurando que el rango abarque el necesario de acuerdo a la sustancia
introducida.

● Una curva patrón relaciona la absorbancia de una sustancia desconocida o conocida

a diferentes concentraciones, lo que nos ayuda a identificar el porcentaje de
concentración de esa sustancia identificada en otras soluciones, ya que cada
compuesto devuelve un largo de onda diferente con datos específicos de
absorbancia y transmitancia, así sabemos que si una sustancia cuando la midamos
en el espectrofotómetro devuelve los mismos valores se trata de esa sustancia. Por
ejemplo después de graficar la absorbancia de la albúmina a diferentes
 concentraciones podemos conocer cuál es el valor de lectura que la caracteriza, y
así cuando al analizar un suero u otro compuesto observamos los datos previamente
obtenidos, podemos determinar la cantidad de presencia de albúmina en ese suero.

● El reactivo de Biuret, que contiene CuSO4, detecta la presencia de proteínas

mediante la formación de un compuesto color violeta que es el resultado de la
formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu+2 y los pares de
electrones no compartidos del Nitrógeno presente en los péptidos (proteínas), ya
que son éstos los participantes de los enlaces peptídicos, que son los cuales tienen
un máximo de absorción de 540 nm (longitud de calibración elegida en el
espectrofotómetro). Es decir, si no hay enlace peptídico CO-NH, no habrá cambio de
color y la prueba de Biuret será negativa permaneciendo de color azul.

De manera general se rescata que el espectro es la referencia que se utiliza para

medir la longitud de onda de las ondas electromagnéticas, las cuales debido a la incidencia
de luz, reflejan distintos colores con diferentes frecuencias, donde la única que se percibe
por el ojo humano es una parte muy reducida, de la cual resalta la UV visible.

El instrumento que mide dicha longitud de onda es el espectrofotómetro, el cual a

partir de la referencia del espectro, la longitud y frecuencia nos ayuda a conocer la
concentración de diferentes soluciones y a identificar moléculas entre un rango de 400 a
700 nm​. Su uso se da únicamente con celdas de cuarzo totalmente cristalinas,
especialmente creadas para no absorber la radiación de luz emitida por el
espectrofotómetro, dejándola pasar y manteniendo la linealidad del método.

El espectrofotómetro, es un instrumento de medición que permitió que los seres

humanos tuvieran conocimiento y por ende pudieran determinar la existencia de
compuestos que se manifiestan a la luz con una longitud de onda acotada, dicho rango fue
creado a partir de la Ley de Beer, que fundamenta la relación matemática entre absorbancia
y transmitancia donde la primera es igual al logaritmo negativo de la transmitancia.

Mientras que al hablar de la albúmina, resalta su importancia biológica ya que es

una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la
principal proteína de la sangre, y una de las más abundantes en el ser humano.
Cuestionario.

1. Escribir la ecuación de regresión.

La utilizada en el método de Biuret para cuantificación de Proteínas utiliza como base la

regresión lineal para poder hacer una estructuración sencilla, pero que engloba todos los
datos posibles, y hace que el rango de error llegue a cantidades mínimas.

La fórmula general para la regresión lineal es:

y=ax+b

2. Investigar cuál es la linealidad y sensibilidad del método.

El método en mención cumple con los parámetros de desempeño analítico propuestos

respecto a linealidad del sistema y método (2-12g% y 6,4 - 9,6 g% respectivamente),
exactitud y precisión del método (en el rango 6,4 – 9,6 g%), límite detección y cuantificación
(en el rango 1mg/mL y 3 mg/mL respectivamente).

La máxima absorbancia del complejo se encuentra en 330 y 540 nm. La sensibilidad que
puede llegar a otorgarnos puede exceder los 330 nm, pero ésta suele medirse únicamente a
545 nm debido a que la presencia de interferencias es menor con respecto a otros tests.

Bibliografía.

Beas, C., Ortuño, D., & Armendáriz, J. (2009). Biología molecular: Fundamentos y
aplicaciones. McGraw-Hill Education.

Gil, M. (2019, 3 julio). Biuret: fundamento, reactivos, procedimiento, usos. Lifeder.

https://www.lifeder.com/biuret/

Longa, C. (2020, 4 abril). Espectrofotómetro. Materiales De Laboratorio Hoy.

https://materialesdelaboratoriohoy.us/plastico/espectrofotometro/

MedlinePlus. (2020, 24 marzo). Prueba de albúmina en la sangre.

https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-laboratorio/prueba-de-albumina-en-la-sa
ngre/#:%7E:text=La%20alb%C3%BAmina%20es%20una%20prote%C3%ADna,%2C
%20hormonas%2C%20vitaminas%20y%20enzimas​.