Parcial 1 - Ecologia de Suelos - Basto Caraballo

METODOLOGÍA DETALLADA PARA DETERMINAR LA MICROBIOLOGIA
DEL SUELO
Presentado por: Camila Basto Caraballo
Ecología de suelos
Los estudios realizados sobre la microbiología del suelo han aumentado gradualmente en los
últimos años debido al rápido avance de la ciencia y el interés que ha surgido en indagar y
caracterizar los suelos para su uso especialmente en el ámbito agrícola. En la actualidad, los
laboratorios dedicados al análisis de muestras ambientales han buscado mejorar su
competitividad implementando técnicas y mecanismos para análisis de toda muestra
ambiental; entre ellas las muestras de suelo, entendiendo que estas requieren ciertas
condiciones especiales desde su recolección in situ hasta el análisis dentro de condiciones
controladas en el laboratorio. (Solano, Y. 20161)
Indicadores biológicos y bioquímicos del suelo
• Bacterias: La función básica de las bacterias es la descomposición y mineralización
de los residuos orgánicos, de donde obtienen su fuente energética y alimenticia.
Mediante su metabolismo liberan al medio sustancias como enzimas, proteínas,
reguladores de crecimiento, metabolitos y algunos nutrientes. Los beneficios de las
bacterias para los cultivos se relacionan con un incremento en la cantidad de raíces
y un aporte importante de elementos básicos para el desarrollo y producción. El
número de bacterias tiene una estrecha relación con algunas propiedades físicas del
suelo, como la textura, estructura, porosidad, aireación y retención de humedad, ya
que su actividad se beneficia con una mayor disponibilidad de oxígeno,
principalmente en aquellos suelos con poca compactación y sin excesos de agua.
(www.fontagro.org) Dentro de las propiedades químicas que favorece la actividad
de las bacterias se encuentra un pH cercano a la neutralidad, una baja acidez, altos
contenidos de materia orgánica y alta disponibilidad de algunos elementos
necesarios para su metabolismo, como N, Ca y Mg. También es importante tomar en
cuenta los factores que pueden afectar negativamente las poblaciones de bacterias,
dentro de éstos está la presencia de otros organismos antagónicos y de sustancias
contaminantes en el suelo, así como la aplicación de agroquímicos.
(www.fontagro.org)
• Hongos: La función básica de los hongos es la descomposición y mineralización de
los residuos orgánicos frescos o recién incorporados al suelo, por esto se les conoce
como descomponedores primarios que mediante su metabolismo libera gran
cantidad de enzimas capaces de destruir compuestos de estructuras complejas, 15
para así obtener su fuente energética y alimenticia. Además, liberan al medio
proteínas, reguladores de crecimiento, metabolitos y algunos nutrientes. Los
beneficios de los hongos para los cultivos se relacionan con un incremento en la
cantidad de raíces, una protección al ataque de fitopatógenos y un aporte importante
de elementos básicos para el desarrollo y producción. Al igual que las bacterias y
actinomicetos, la disponibilidad de oxígeno en el medio es importante, ya que el
número de hongos del suelo tiene una estrecha relación con propiedades físicas
relacionadas con la función filtrante del suelo: textura, estructura, porosidad,
aireación y retención de humedad. En cuanto a parámetros químicos, se favorece la
actividad de los hongos a un pH del suelo medianamente ácido, una acidez
intercambiable intermedia, altos contenidos de materia orgánica y alta
disponibilidad de elementos esenciales. Organismos antagónicos y sustancias
contaminantes son factores que también afectan la actividad de los hongos en el
suelo. (www.fontagro.org) Los ciclos de algunos nutrientes mayoritarios, como el
carbono, demuestran que la biomasa microbiana es clave en la dinámica de los
nutrientes esenciales en el sistema edáfico; por ello, algunos autores afirman que la
biomasa microbiana y su actividad en el suelo puede ser empleada como índice de
comparación entre sistemas naturales o como indicador de las variaciones sufridas
en el equilibrio de un suelo debido a la presencia de agentes nocivos o su manejo
productivo (Doran et al., 1994). Es decir, que los parámetros microbiológicos, y por
lo tanto bioquímicos, sirven para indicar posibles cambios netos en el equilibrio del
suelo que no podrían detectarse con métodos tradicionales (Brookes, 1985; Doran et
al., 1994; García y Hernández, 2000).
Algunos autores (Nannipieri,1984; Brookes,1985; Doran et al.,1994) recomiendan
indicadores sencillos de medir y de interpretar. Los más comunes que se utilizan son, entre
otros, la biomasa microbiana, la respiración del suelo y las relaciones con la materia
orgánica y el estado fisiológico del suelo, donde se ve involucrada la energía en los procesos
orgánicos. En cuanto a la biomasa microbiana, este indicador expresa la cantidad de
microflora presente en el suelo a través de la extracción del carbono microbiano. El mismo
se ve afectado por la agroclimatología que sufren las muestras in situ, es decir la humedad,
el calor, la biodiversidad de residuos orgánicos al ecosistema y por sustancias agresivas a
la actividad microbiana. (Acuña et al., 2006). (Ochoa C; Urroz F, 20112)
Al realizar una búsqueda en la Alianza Mundial por el Suelo, se encontró que los análisis de
suelo más relevantes en cuanto a la biota del suelo son-.
1. Biomasa microbiana
2. Respiración del suelo
3. Actividad enzimática
Por lo que no se puede generalizar un solo estudio para determinar la microbiología del suelo,
teniendo en cuenta esto, se buscaron metodologías para la medición de esas cuatro variables
que se puedan aplicar en el centro tecnológico de la universidad de la Salle CTAS.
1. BIOMASA MICROBIANA:
Cuando usamos el término biomasa nos referimos a la cantidad de masa de material
vivo y se expresa como gramos o calorías (julios) por ml o g de muestra. Mide la
cantidad de energía que se almacena en un segmento determinado de una comunidad
biológica. Para cuantificar la biomasa de una población/comunidad microbiana
disponemos de diferentes métodos. Alguno de estos métodos es muy sencillo y no
requiere manipulaciones complejas; otros métodos son más complejos, siendo
necesarias medidas indirectas. Veremos algunos casos sencillos.
Uno método directo y sencillo de cuantificación de la biomasa de una población es la
estimación del peso seco por g ó ml de muestra. Se requieren una balanza (precisión
g x 0,001), un cestillo para colocar la muestra que puede elaborarse con papel de
aluminio y una mufla para secar la muestra.
Este método es válido, y muy utilizado, con cultivos puros (de levaduras, etc.); pero
su utilización con muestras naturales (sedimentos, muestras de agua de mar, etc.) es
problemática.
Otro método de determinación de biomasa, válido para poblaciones naturales, pero
más complejo y laborioso, es la determinación de la biomasa a través del biovolumen.
En este método, en preparaciones para microscopia fotónica, de epiflluorescencia,
etc. Se determina la longitud, anchura o diámetro de un número determinado de
microorganismos de esa muestra. Los microorganismos de la muestra se asimilan a
figuras geométricas más o menos complejas y se calcula el biovolumen de cada uno
de ellos. Aplicaremos la siguiente ecuación:
Biomasa (µg C/ml) = N * Bv * F
Siendo:
N, el número de microorganismos enumerados por ml de muestra.
Bv, el biovolumen expresado como µm 3 por microorganismo
F, factor de conversión, µg de Carbono por µm 3 .
En la bibliografía se encuentran diferentes valores de F calculados tanto para cultivos
puros como para muestras naturales, fundamentalmente de sistemas acuáticos
2. RESPIRACIÓN DEL SUELO:
La determinación de la respiración basal del suelo se efectúa bajo las condiciones de

incubación en laboratorio, sin la aplicación extra de nutrientes, bajo una temperatura
constante (20-25 0C) y un contenido óptimo de agua en las muestras de suelos (aprox.
50-60 % del máximo de la capacidad de retención de agua) (Isermeyer, 1952; Alef
1991). Durante el periodo de incubación se mide la formación de bióxido de carbono
(CO2), como también respectivamente el consumo de oxígeno (O2). Antes de la
incubación las muestras de suelos se preincubaron por un tiempo de 24 h. Para evitar
anomalía ocasionadas por el alza de la actividad microbiana después de haber pesado
las muestras y de ajustar el contenido de humedad de la misma (Jenkinson, 1988).
Reactivos:
NaOH (0,5 M; p.a Merck 6498)
HCL (1,0 M; Titrisol, Merck 9970)
BaCl2 (Solución saturada; p.a. Merck 1719)
Fenolftaleína (0.1 g in 100 ml 60% Etanol; Merck 7227)
Ejecución y determinación:
200 g de suelo (correspondiente al suelo seco en horno) con humedad de
campo se pesaron en cilindros, antes de regular el contenido de agua al 50%
de su capacidad de retención hídrica. El suelo se colocó en recipientes de
incubación con cerrojos (tapas) de 3 litros y se preincubaron en un cuarto
oscuro por 24 horas y a 29 °C. Transcurrido este tiempo se colocó en el fondo
de los recipientes de incubación un frasco de Gerber con 20 ml de agua para
humedecer el aire interno y un frasco con 20 ml de una solución de 0,5 M
NaOH para la absorción del bióxido de carbono formado (CO2).
A continuación, se incubó el suelo por 2 días seguidos para la medición de la
respiración basal a 29 °C en condiciones oscuras. Tras haber terminado la
incubación se procedió al análisis de las muestras. Los frascos herméticos
cerrados con la solución de NaOH se conservaron en un desecador que
contiene absorbente de soda cálcica (Hidróxido de sodio) antes de iniciar la
titulación, para evitar la contaminación con CO2 del ambiente.
Para la determinación del CO2 se tomaron de los 20 ml de NaOH dos alícuota
de 1 ml y se aplicó un 1 ml de solución saturada de BaCl2, así como también
3 gotas de fenolftaleína (punto de cambio pH 8,3).
Con la aplicación de BaCl2 se precipita el CO2 absorbido como BaCO3.
2 NaOH + CO2 > Na2CO3 + H2O

Na2CO3 + BaCl2 > BaCO3 + 2 NaCl
Con una bureta y una solución de 0,5 M HCL se tituló la cantidad no

consumida de NaOH hasta el punto cambio del indicador de fenolftaleína.
Cálculos y evaluación:
Para el nivel de pH hasta 8,3:
CO2-C (µg g-1 Suelo) = (B - S) x M x E x A / Dw
B = HCl-Consumido por la muestra cero (µl)

S = HCl-Consumido por las muestras de suelo (µl)
M = Mol de la solución de HCl
E = Factor de conversión del Carbono (6)
A = Alícuota de la solución de NaOH
Dw = Peso seco de la muestra de suelo (g).
La estimación de la respiración del suelo brinda la información sobre la dinámica de su biota
y, por lo tanto, de los procesos metabólicos que en él se desarrollan; tales procesos varían en
función de factores biofísicos del suelo y del uso de la tierra, por lo cual su medición es un
indicador de la actividad de la biomasa microbiana presente. La actividad microbiana se
desarrolla en función de factores intrínsecos y extrínsecos al sistema suelo, por lo cual
constituye un indicador de la dinámica del suelo y de la salud del recurso, pues una buena
actividad microbiana puede ser el reflejo de óptimas condiciones físicas y químicas que
permitan el desarrollo de los procesos metabólicos de bacterias, hongos, algas y
actinomicetos y de su acción sobre los substratos orgánicos. (Mora R, 2006)
3. ACTIVIDAD ENZIMATICA
El método para medir la actividad enzimática de la fosfatasa se basa en la
determinación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado cuando el suelo es
incubado a 37 °C durante 1 hora con una solución tamponada (pH 6,5 para la
fosfomonoesterasa ácida y pH 11 para la alcalina) de p-nitrofenilfosfato. Sin
embargo, en este trabajo se alteraron las temperaturas de incubación según lo indicado
en la Tabla 4 a fin de estudiar el efecto de la temperatura. El método colorimétrico
para medir el p-nitrofenol liberado se basa en el hecho de que las soluciones alcalinas
de este compuesto tienen color amarillo (en medio ácido, pH.
Procedimiento:
Se coloca la cantidad de suelo (<2mm) Equivalente a 0,5gr de suelo seco en
un tubo de 10mL. se añaden 2-mL de solución de tampón MUB (preparado
al tomar 200 mL de una solución stock y enrasado a 1 L; solución stock: 12,2
g de trishidroximetilaminometano (THAM), 11,6 g de ácido maleico, 14 g de
ácido cítrico, 6,28 g de ácido bórico y 488 mL de hidróxido de soido 1 M
enrasado a 1 L de agua desitilada) y 0,5 mL de la solución de p-nitrofenil
fosfato 0,025 M, se agita el tubo unos segundos para mezclar perfectamente
el contenido y se tapa. A su vez se deben realizar controles sin adición de la
solución de p-nitrofenil fosfato, que se añadirá después del enfriamiento. Se
incuba a la temperatura a estudiar en un baño de agua durante 1 hora. Después,
se introduce en la nevera durante 15 minutos.
Una vez enfriado el medio de reacción, se añade en cada tubo, en este orden:
0,5 mL de cloruro de calcio 0,5 M y 2 mL de hidróxido de sodio 0,5 M y se
agita para que la suspensión se mezcle completamente. A continuación se
añaden 5 mL de agua destilada y se centrifuga (4000 r.p.m. durante 4
minutos). Por último se mide la intensidad del color de los filtrados en un
espectrofotómetro a 400 nm. El contenido en p-nitrofenol de las muestras se
calcula por referencia a una recta de calibrado preparada con patrones de p-
nitrofenol (Figura 11). Para preparar la recta patrón, se pipetean 0,5 mL de
varias soluciones de p-nitrofenol entre 0 y 500 μg mL-1, añadir 2 mL de agua
destilada y, a continuación, se procede a añadir 0,5 mL de cloruro de calcio
0,5 M, 2 mL de hidróxido de sodio 0,5 M, 5 mL de agua destilda, se centrifuga
y se mide la absorbancia a 400 nm.
La actividad fosfatasa ácida se calcula usando esta ecuación, calculando a
continuación la diferencia entre muestras y controles:
μmoles de p-nitrofenol g-1 suelo seco
h-1= (M /P)·(1/hora)·fd1·fd2·fd3 Donde: M = μg mL-1 de p-nitrofenol en el
extracto, según la recta de calibración.
P = g de suelo húmedo.
fd1 = 1 μmol p-nitrofenol / 139 μg p-nitrofenol.
fd2 = 100 g suelo / (100-Humedad) g de suelo seco.
fd3 = factor de dilución; sólo si ha sido necesaria la dilución para la lectura
BIBLIOGRAFIA
1. ADAPTACIÓN DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS PARA EL ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO DE SUELOS EN EL LABORATORIO AMBIENTAL Y DE
ALIMENTOS NANCY FLÓREZ GARCÍA S.A.S. Universidad de Pamplona, Facultad
de Ciencias Básicas departamento de Microbiología pamplona norte de Santander
(junio, 2016).
2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD MICROBIANA COMO INDICADOR
BIOLÓGICO EN SUELOS AGRÍCOLAS DEL OCCIDENTE DE NICARAGUA.
Clarisa Neret Ochoa Morales. Br. Francisco Alberto Urroz Gutiérrez. (marzo 2011)
3. COMO ABORDAR Y RESOLVER ASPECTOS PRÁCTICOS DE MICROBIOLOGÍA.
Departamento Inmunología, Microbiología y Parasitología Universidad del País
Vasco; Arana, I. Orruño, M. Barcina, I.
4. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DETERMINADAS EN SUELOS BAJO MANEJO
AGRÍCOLA SOSTENIBLE. Universitas Miguel Hernandez. García, I. (2017),

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METODOLOGÍA DETALLADA PARA DETERMINAR LA MICROBIOLOGIA

La determinación de la respiración basal del suelo se efectúa bajo las condiciones de

2 NaOH + CO2 > Na2CO3 + H2O

Con una bureta y una solución de 0,5 M HCL se tituló la cantidad no

CO2-C (µg g-1 Suelo) = (B - S) x M x E x A / Dw

B = HCl-Consumido por la muestra cero (µl)

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