Las señales permiten gobernar el comportamiento y la localización de las células embrionarias primitivas.

A medida que
las células proliferan, van dando forma a un pequeño embrión, luego a un feto y más tarde a un organismo adulto. El
normal funcionamiento de un organismo dependerá de una adecuada localización de las células comprometidas en las
diversas actividades específicas, para lo que se requieren señales en el interior celular, señales entre células vecinas y,
más tarde, complejas señales entre poblaciones celulares que pueden encontrarse distantes. Una adecuada coreografía
de todas las señales conduce al desarrollo de un organismo normal. Las células que pierden la capacidad de responder a
las señales que reglan el comportamiento social, se hacen anárquicas y seguramente provocaran problemas en el
organismo.
Las células afectadas tienen daños genéticos causados principalmente por exposición a agentes químicos, radiaciones,
ciertos virus y, en ocasiones, son consecuencias de alteraciones genéticas heredadas. Se ha demostrado que estos
agentes exacerban la plasticidad dinámica del DNA y lo desestabilizan al extremo, hasta llevarlo a incluir errores
peligrosos dentro del plan genético. Se concluye en que, durante la transformación cancerosa, los daños genéticos
terminan alterando las señales celulares y el recambio del tejido afectado. El cáncer es una enfermedad en las señales
celulares donde las células alteradas se ven “aventajadas” respecto de las normales, puesto que empiezan a crecer de
forma autónoma, olvidando el comportamiento social. Algunos autores consideran que las células cancerosas “micro-
evolucionan” en el ambiente del tejido alterado, creciendo desmedidamente y acumulándose formando un tumor, para
luego diseminarse hacia otros territorios. La gran mayoría de los canceres suelen ser el resultado de una prolongada y
silenciosa exposición a agentes carcinogénicos que llevan a la acumulación de daños genéticos.
Por otro lado, los cultivos celulares constituyen una herramienta básica de aplicación fundamental en el campo médico,
el veterinario, la investigación y en la industria. El aporte que los cultivos celulares han dado a todos los campos de la
biología es impresionante. Con el cultivo de células in vitro se ha logrado obtener un determinado tipo de célula, con
una alta reproducibilidad, grupos de células o de estructuras celulares, por lo que ha sido importante en el
establecimiento de relaciones estructurales y funcionales en algunos organismos. Los cultivos celulares han servido para
la producción de una amplia variedad de proteínas como los compuestos químicos de la sangre, hormonas, anticuerpos
monoclonales, y de sustancias de gran significancia a nivel terapéutico, como el interferón producido a partir de cultivos
continuos transformados (líneas celulares), permitiendo el surgimiento de una industria biotecnológica altamente
competitiva.
Establecer un cultivo conlleva un grado de complejidad determinado por su adaptación a condiciones similares a las que
se tienen in vivo, siendo fundamental para los medios utilizados la suplementación de suero, aminoácidos y antibióticos.
Se puede afirmar que el desarrollo de los cultivos de tejidos ha sido de gran impacto en el desarrollo de las ciencias
biológicas. Con éstos se ha logrado determinar y clasificar tanto tumores humanos como animales, así como la detección
temprana de desórdenes genéticos a nivel embrionario. Igualmente han sido básicos en el diagnóstico viral y en la
producción a gran escala de antígenos para la elaboración de vacunas. Mediante los cultivos celulares se pueden valorar
los efectos tóxicos de diferentes pesticidas usados en la actividad agrícola y pecuaria. Existen investigaciones que no se
podrían realizar sin el soporte de los cultivos celulares, como en el caso de animales transgénicos, donde se pretende
que organismos desarrollados expresen genes nuevos, mediante la inserción de genes extraños en células receptoras.
Producir células implica un alto grado de preparación por parte del recurso humano especializado, para dar el adecuado
manejo a los conceptos básicos de esterilidad, así como destreza en la detección de problemas (requerimientos de un
cultivo en particular, estabilidad de algunos reactivos, etc.) y la identificación de estos a través del tipo de efecto que
pueden generar en un determinado cultivo celular.

1
 Tipos de cultivo celular
Los cultivos celulares son el producto de la colección de células de diferentes órganos, colocadas en condiciones
especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicación, manteniendo para esto todas sus funciones metabólicas de
una manera semejante a las que tenía en el organismo. Los cultivos de células animales se han clasificado de acuerdo a
su capacidad de adherencia, y por si han sido aisladas recientemente de un órgano o si provienen de células que han
sufrido modificaciones.
De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer formando monocapa o en
suspensión respectivamente, lo que está muy asociado con el tipo de célula de la cual derivan: por lo general las células
provenientes de órganos, crecen en monocapa; igualmente existen células que pueden crecer indistintamente tanto en
monocapa como en suspensión, por ejemplo son las células HeLa que son células transformadas derivadas de cultivos en
monocapa.
Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original tomado de un órgano recién
sacrificado, se llaman cultivo primario. Cuando éste cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le
confiere capacidad ilimitada de multiplicación, reciben el nombre de líneas celulares.

CLASIFICACIÓN SEGÚN ORIGEN DE LAS CÉLULAS

Cultivo primario
Es el cultivo derivado de un tejido u órgano cuando se hace crecer un conjunto de sus células in vitro. Son cultivos con
una gran heterogeneidad celular y se denominan con la sigla Ro. Las distintas poblaciones celulares se pueden purificar
aunque no es un proceso fácil de lograr. Cuando las células se adhieren, el cultivo de puede “saturar” de células que
proliferan, por lo que se requiere diluirlo en el proceso conocido como repique primario.
Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas celulares:
 Conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas.
 Sus cromosomas tienen un número diploide (2n).
 Su crecimiento in vitro es limitado.
 Hay inhibición de crecimiento por contacto.
Dentro de las desventajas está la de una mayor probabilidad de que las células presenten virus adventicios o latentes, lo
que implica el desarrollo de la adecuada tecnología para el control de calidad.

2
Línea celular
La línea celular es un conjunto de células que se adaptaron al crecimiento in vitro. Es lo que surge del repique primario
de un cultivo primario, por lo que se lo denomina con la sigla R1. Los siguientes cultivos que surjan del repique de R1
recibirán el nombre Rn siendo n el número de repiques por el cual paso dicha línea celular (R2, R3, etc.)
Cuando las células del cultivo primario no fueron correctamente purificadas o aisladas de otros tipos celulares, sólo las
más adaptables sobreviven. Ejemplos claros son los fibroblastos que desplazan a los demás tipos celulares por adaptarse
rápidamente.
El cultivo se repica 1 o 2 veces por semana; entre cada repique se producen aproximadamente 2-3 ciclos de duplicación
de la población. Cuando las células son “normales” (provenientes de tejidos u órganos sanos) vemos que luego del
repique 5, las células tardan más en crecer y en proliferar. Si el cultivo continuo, a partir del repique 10-15 comienza a
verse los procesos de senescencia (envejecimiento) y quiescencia (menor crecimiento). Luego el cultivo se agota y
muere, siendo este un fenómeno normal y natural.
Se dice que “somos mortales porque nuestras células son mortales”. En los años ´60, Hayflick utilizó cultivos de células
provenientes de embriones y de personas avanzadas en edad de ambos sexos y comprobó que independientemente del
sexo, los cultivos provenientes de células viejas tenían menor cantidad de repiques máximos. Las conclusiones que
obtuvo fue que las células se dividen 50 a 70 veces y luego mueren, a lo que llamo límite celular, proceso íntimamente
relacionado con el acortamiento de los telómeros durante cada replicación del DNA.
Es necesario remarcar que, aunque una línea celular provenga de un tejido u órgano determinado, las células se
adaptaron al crecimiento in vitro, por lo que nunca van a formar un tejido. Las líneas celulares actúan como MODELO
CELULAR. Los resultados obtenidos en cultivo in vitro no puede correlacionarse directamente al modelo in vivo, sino que
deben extrapolarse correctamente.

Crisis celular
Este es el fenómeno celular que ocurre luego del repique 10-15 en el cual las células comienzan a morir. Cuando el
cultivo “revive” a partir de islotes de células que se adaptaron a la crisis, debemos suponer que estas son inestables
genéticamente y debemos reconfirmar el tipo celular con el que se está trabajando a partir del estudio de marcadores.
De esta manera podremos conocer cuán diferenciada o qué tipo de célula sobrevivió.
Cuando las células sobrepasan los 20-30 repiques debemos reconocer que se supero el límite celular de Hayflick, por lo
que la línea queda inmortalizada y pasa a llamarse línea celular continua.

Línea continua
Cuando la línea continúa creciendo (>R50) se la llama línea continua o inmortalizada. Las líneas celulares continuas
están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron.
Pueden provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario
mediante transfección con oncogenes o con tratamiento con carcinogenéticos o por simple adaptación, lo que les
confiere un nuevo fenotipo.
Este tipo de cultivo tiene la característica de ser aneuploides, de no tener inhibición por contacto y de crecer de manera
indefinida. Estas son las líneas que se comercializan y son estables en el tiempo, pero que no se las puede tomar como
modelo de células normales, dado que sufrieron cambios fenotípicos y genotípicos que le permitieron sobrevivir (tienen
características cancerosas).

Transformación
El cambio de un cultivo primario a línea celular continua se denomina transformación. En este proceso hay cambios
genotípicos y fenotípicos que le permiten superar la mortalidad celular, la senescencia y la quiescencia. Generalmente se
producen cambios en genes de señalización que autorregulan el crecimiento celular y la proliferación, tal y como se
observa en las células cancerosas. Se dice que hay cambios a nivel molecular muy significativos.
 Transformación in vitro: Cambio hereditario que ocurre en un linaje celular en cultivo de modo espontaneo o
por exposición a agentes carcinógenos, que conducen a la adquisición de propiedades alteradas. Una

3
 transformación puede inducirse a través de hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no
fisiológicos como el DMS.
 Transformación neoplásica in vitro: Adquisición de células en cultivo con la propiedad de originar una neoplasia
cuando se la inocula en animales de experimentación.

Metástasis:
Capacidad de la célula de propagarse de un foco canceroso a un órgano distinto de aquel en que se inició, es decir, para
formar un núcleo de crecimiento secundario luego de dirigirse a un sitio diferente. Se habla también de generación de
núcleos carcinogénicos sin contigüidad atómica. Este es el caso extremo del proceso de transformación.

CLASIFICACIÓN SEGÚN CAPACIDAD DE ADHERENCIA

Los cultivos pueden generar en suspensión, en semianclaje, en monocapa y de forma tridimensional, según:
Cultivo en suspensión Cultivo en semianclaje Cultivo en monocapa
Capa de células crecidas sobre
superficie. Hay células que para
Células que crecen en medio crecer necesitan una superficie de
líquido. En general son del tipo adhesión y en general presentan un
hematopoyéticas, transformadas o Ejemplos: macrófagos que morfología de fibroblasto o epitelial,
de tumores malignos, y presentan viven en suspensión pero son derivadas de sarcomas y
una morfología redondeada. pueden extenderse o carcinomas, como las células
hibridomas productoras de epiteliales, los fibroblastos y los
anticuerpos monoclonales. tumores sólidos.

El procedimiento de cambio
de medio consiste en: Adhesión
Proliferación
-1- Centrifugar el cultivo para
obtener un pellet de Extensión
Saturación células.
-2- Descartar el sobrenadante Proliferación
Repique y cambio de
medio (medio viejo).
-3- Resuspender en medio Confluencia
nuevo

Cultivos en suspensión
Las Líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad
de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período de adaptación. Existe evidencia experimental
que los sistemas en suspensión también requieren de matrices que son macromoléculas protectores a la superficie
celular. Dichas macromoléculas se encuentran en el suero el cual, junto con el medio de cultivo, proporciona un sistema
balanceado de nutrientes.
Aunque el cultivo en monocapa es ideal para la elaboración de productos extracelulares, el cultivo en suspensión es
deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un
determinado tipo de célula. El proceso de cultivo continuo ofrece el mejor modelo cuando se trata de producir cultivos a
una mayor escala de operación.

4
Cultivos en semianclaje
Estos cultivos están formados por células que pueden crecer de formas solubles o adheridas diferencialmente, o que
tienen períodos de crecimiento en suspensión y periodos de anclaje al sustrato.

Cultivos tridimensionales
Son aquellos que buscan mantener la característica o arquitectura del tejido in vivo. Los sistemas tridimensionales
permiten estudiar la proliferación y morfología epitelial y su interacción con otras células como son las del tejido
conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones
intercelulares.

Cultivo en monocapa
Las células exhiben una variedad de comportamientos sociales, lo que hace que su multiplicación sea inhibida cuando
establecen contacto entre sí, permitiendo la formación de una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de
crecimiento. Las células provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en ésta condición, dada su
estabilidad genética y su naturaleza diploide normal. Este tipo de crecimiento también alude a la necesidad de las
células de adherirse y extenderse en el sustrato para poder sobrevivir.
Los recipientes para el cultivo de células en monocapa son cajas de Petri o frascos para el cultivo de tejido (T25 o T75),
entre otros, que pueden ser de material de plástico o de vidrio, ambos previamente tratado, y que permiten el
desprendimiento de las células para transferirlas cuando se utilizan agentes proteolíticos como la tripsina.
Cuando se requiere la producción de éste tipo de cultivo en una escala mayor, se debe incrementar el área de la
superficie de crecimiento, siendo ideal utilizar botellas en rotación. Mediante éste sistema, las células pueden crecer en
toda la parte interna de la pared de la botella, usando un aparato que permite la rotación a una baja velocidad; de esta
forma una botella de 1 litro que requiere 100 ml de medio, confiere una superficie de crecimiento de 500 cm 2. Otra
forma de aumentar el número de células adherentes por volumen, es utilizando microperlas (microportadores), que son
compuestos en base a dextranos o a vidrio, las que flotan cuando se emplean en cultivos con agitación, lo que le da una
mayor disponibilidad de superficie para el crecimiento celular: con 100 ml de medio, se logra una superficie de 0.24m2.
Los pasos del crecimiento en monocapa son:

La confluencia es la etapa en las cuales

las células saturan la placa y ocupan toda
la superficie posible. La subconfluencia
es el momento óptimo para repicar y se
lo considera como el 75% del
cubrimiento total de la superficie de
crecimiento. En la etapa de
subconfluencia las células se encuentran
en crecimiento exponencial.

Una forma rápida y sencilla de sincronizar los cultivos es golpear suavemente para despegar las células hijas y lavar, de
modo que sólo nos quedamos con las células que no se estaban dividiendo (y que comenzaran a dividirse en el mismo
momento).

Extensión sobre el sustrato de cultivo en monocapa:

Sólo luego de adherirse y extenderse, la célula toma la forma de la estirpe de la que proviene; de lo contrario mantiene
una forma redondeada. Las formas celulares más importantes son:

5
Los tipos más observados en las líneas celulares son:

El proceso de adhesión y extensión sucede en 3-4hs dependiendo del tipo celular. La adhesión lleva aproximadamente
90 min mientras que la extensión un poco más de tiempo. El rasgo característico de este último proceso es la “pérdida
de refringencia” por el cual la célula deja de verse brillante o luminosa en el microscopio de contraste de fases. Cuanto
más esferoide es la célula más refringente se ve y cuando se extiende esta refringencia se pierde.

VER TERMINOLOGÍA USADA EN CULTIVO DE CÉLULAS, TEJIDOS Y ORGANOS

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 Células transformadas in vitro
Propiedades de las células transformadas:
-1- Alteraciones morfológicas.
-2- Cambios de membrana.
-3- Alteraciones de adhesividad, motilidad y MEC.
-4- Pérdida del control del crecimiento.
-5- Anormalidades genéticas y cromosómicas.

Alteraciones morfológicas:
 No forman monocapas simples, presentan crecimiento criss-cross, apilamiento y redondeamiento de las células
por problemas en la inhibición del crecimiento por contacto.
 Disminución de la extensión sobre el sustrato dado que sus mutaciones le permiten generar las señales de
supervivencia sin necesidad de contacto al mismo.
 Mayor separación celular, observando la presencia de límites, según:

 Incidencia exagerada de microvellosidades y filopodios, lo que refleja un mayor dinamismo del citoesqueleto.
 Aumento de la basofilia citoplasmática: aumenta la afinidad por colorantes basófilos, que reaccionan con los
componentes ácidos de las células (ADN – ARN). Un ejemplo es la hematoxilina que al ser básico reacciona con
los componentes ácidos del núcleo de las células normales. En las células transformadas se observa una mayor
presencia de ARN citoplasmático y de ribosomas libres, por lo que este también se tiñe. Esto se debe a que en
las células transformadas se genera proteínas de consumo interno en gran cantidad para autosatisfacer las
demandas de crecimiento.

 Aumento del número de vacuolas.

 Disminución de contactos focales: por lo que las células no se adhieren.
 Heterogeneidad de tamaño y forma.
 Aumento de la relación de tamaños núcleo/citoplasma: en las células normales diferenciadas el DNA está muy
empaquetado en su forma de cromosomas densos, dado que sólo expresan algunos genes y en determinado
momento. En cambio, las células transformadas presentan núcleos más grandes y DNA en su forma laxa, porque
están expresando muchos genes a la vez; además se observan mayor cantidad de nucléolos. Según:

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  Anormalidades nucleares: aumento del tamaño y del número de nucléolos. Los nucléolos son las zonas de
empaquetamiento del ARN ribosomal y de formación de ribosomas que se necesitan en gran cantidad para
expresar muchas proteínas.
 Desorganización del citoesqueleto, es mucho más dinámico.

Cambios de membrana:
 Alteraciones de glicoproteínas y glicolípidos de la superficie celular.
 Aumento de la fluidez de membrana.
 Perturbaciones en la permeabilidad y el transporte activo.
 Cambio en la carga neta de la superficie celular.
 Reducción de la comunicación con el MEC.
 Pérdida o reaparición de antígenos: muestra antígenos nuevos o re-expresa antígenos embrionarios.

Alteraciones de adhesividad, motilidad y MEC:

 Reducción de los fenómenos de adhesión.
 Menor aglutinidad.
 Mayor migración o movilidad.
 Alteración en síntesis de colágeno, fibronectina y laminina.
 Disminución de proteoglicanos sulfatados.
 Modificación de las integrinas (receptores de adhesión).

Pérdida del control de crecimiento:

 Crece indefinidamente in vitro, superando el límite celular.
 Pérdida del control de crecimiento dependiente de la densidad celular.
 Menor dependencia de factores exógenos.
 Secreción de factores de crecimiento de forma que autoestimula su duplicación.
 Menores requerimientos para comenzar la síntesis de DNA.
 Crecimiento independiente del anclaje.
 Agregados celulares.
 Aumento de la eficiencia de plaqueos/repiques.

Otras modificaciones:
 Pérdida de la diferenciación.
 Cambios en el metabolismo.
 Modificación de enzima degradativas secretadas y de la superficie celular.
 Resistencia a compuestos citotóxicos.

Tipos de tumores
Los distintos tipos de cáncer pueden definirse como el crecimiento alterado de un tejido, causado por la continua
proliferación de células anormales con capacidad de destruir otros tejidos. No se la considera una única enfermedad,
sino un grupo de enfermedades que comparten similares mecanismos moleculares y celulares. La palabra tumor alude a
cualquier bulto que aparece en el cuerpo. Los tumores se clasifican como benignos o malignos dependiendo de si
pueden invadir localmente o generar metástasis en órganos distantes. Los tumores benignos son los tumores que no
pueden diseminarse por invasión o metástasis; por lo tanto, limitan su crecimiento al sitio original. Los tumores malignos
son los capaces de propagarse por invasión y metástasis, están compuestos por células agresivas que pueden destruir
tejidos normales vecinos o diseminarse para formar nuevos focos de células anómalas.
Por definición, el término "cáncer" se aplica solamente a los tumores malignos. Los cánceres son capaces de propagarse
por el cuerpo debido a dos mecanismos: invasión y metástasis. La invasión es la migración y la penetración directa por

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las células cancerosas en los tejidos vecinos. La metástasis es la capacidad de las células de penetrar en los vasos
sanguíneos y linfáticos, circular a través de la circulación, y después crecer en un nuevo foco, como tejidos normales de
otra parte del cuerpo. La expresión neoplasia se refiere a este crecimiento descontrolado de las células anormales. El
cáncer se designa entonces como una neoplasia maligna, constituida por células agresivas con capacidad de extenderse
a otros tejidos del organismo.
Característica Tumores benignos Tumores malignos

Diferenciación Bien diferenciado. La estructura Falta de diferenciación, anaplasia.

recuerda al tejido de origen. Estructura con frecuencia atípica.
Crecimiento in vitro Lento y progresivo. Puede regresar a Errático. Puede ser lento o rápido y
su forma normal. Presentan mitosis sufrir “crisis de crecimientos”. Las
escasas y normales. mitosis son numerosas y anormales.
Invasión local Ausente. Crecimiento expansivo, que Presente. Infiltración de tejidos
no infiltra tejidos normales vecinos. normales vecinos.
Metástasis No Si.
La hiperplasia o aumento del número de células suele ser el cambio inicial, seguido por la displasia, que implica signos
inequívocos de anomalías proliferativas, y luego por la metaplasia, donde se ven cambios morfológicos y funcionales de
las células. La nomenclatura oncológica se basa en la identificación de las células enfermas y toma como referencia el
tipo celular del cual deriva originariamente la población transformada.

Carcinomas
Canceres de origen epitelial. Los carcinomas constituyen la mayoría de las células transformadas de cultivos continuo,
dado que son las que mejor se adaptan al crecimiento in vitro.
Tumores benignos Tumores malignos

Epitelio de revestimiento Epitelioma o papiloma Carcinoma

Epitelio glandular Adenoma Adenocarcinoma

Sarcomas
Canceres de origen mesenquimal.
Tumores benignos Tumores malignos

Tejido conectivo Fibroma Fibrosarcoma

Tejido adiposo Lipoma Liposarcoma
Tejido cartilaginoso Condroma Condrosarcoma
Tejido óseo Osteoma Osteosarcoma
Vasos sanguíneos Hemangioma Angiosarcoma
Vasos linfáticos Linfagioma Linfagiosarcoma
Músculo liso Leiomioma Leimiosarcoma
Músculo
Rabdomioma Rabdomiosarcoma
esquelético

Neoplasias hematológicas
Canceres líquidos o en sangre.

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 Tumores benignos Tumores malignos

Células hemopoyéticas Estas células en su forma normal ya tienen Leucemias

características invasivas y metastásicas, por lo
Tejido linfoide que no hay tumores benignos. Linfomas

El sufijo “oma” se aplica a los tumores benignos. Las neoplasias malignas derivadas de células epiteliales se denominan
genéricamente “carcinomas” y las derivadas del mesénquima embrionario de llaman “sarcomas”. Los “gliomas” son los
tumores del sistema nervioso central. También existen los “tumores mixtos”, compuestos por más de un tipo celulares
o derivado de más de una capa embrionaria.

Requerimientos de los cultivos en

monocapa
Requerimiento ¿Qué aporta? Más utilizados Aclaraciones

MEM (medio
Las células de tejido epitelial transformado (carcinomas)
esencial mínimo);
requieren MEM que aporta la fuerte de carbono en forma de
Medio de Nutrientes y D-MEM (contiene
glucosa o un azúcar simple, sales sencillas y sales inorgánicas
cultivo cofactores más sales); RMPI
formadoras de buffers. Las células normales requieren medios
(medios
enriquecidos para crecer.
enriquecidos)
Se utiliza en concentraciones de 5-10% v/v suero/medio. El
suero aporta proteínas, hormonas, factores de crecimiento,
Estimulo lípidos, glúcidos, entre otros.
proliferativo, SFB (suero fetal
Suero El suero es la fracción líquida de la sangre coagulada. Se
de adhesión y bobino)
decomplementa (elimina residuos del sistema inmune)
de spreading
calentando el suero, para eliminar la actividad lítica celular.
Se utiliza el suero fetal por ser el más enriquecido.
Se agrega una FN en exceso porque las células transformadas
Fuente de generan mucho DNA, RNA y proteínas. Se utiliza en una
Glutamina Glu
nitrógeno concentración final de 2mM o 1% v/v. El stock debe ser 100X, es
decir, 200mM.

Previene la Gentamicina o Se agregan en concentración de aproximadamente 80ug/ml.

Antibióticos
contaminación estreptomicina Son antibióticos de alto espectro.
Hormonas o
Estímulos Es para favorecer el crecimiento de líneas dificultosas. La
Suplementos Factores de
específicos hormona más usada es la insulina.
crecimiento
Los requerimientos fisiológicos generales son 37°C, pH de 7.4, 5% de CO2 y humedad cercana a la saturación.
El medio de cultivo aporta nutrientes esenciales balanceados cuantitativamente que incluyen: aminoácidos, hidratos de
carbono, iones inorgánicos y vitaminas. El suero tiene una composición no cuantitativa que aporta componentes con
actividad promotora del crecimiento celular. El papel de suero es el establecimiento y mantenimiento de líneas y
cultivos celulares; cuando estos se han establecido en medios libre de suero, el crecimiento celular requiere el agregado
de hormonas y otros factores de crecimiento que están involucradas en transporte de nutrientes, mantenimiento de
balance de energía celular, control de síntesis de macromoléculas y factores que estimulan la formación del producto
deseado. Muchos de los factores suplementados son purificados del mismo suero, lo cual hace que cultivos a gran escala
con medio libre de suero no sean rentables.

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Los medios de cultivo definidos (sin suero) están compuesto por elementos cuya composición química y concentración
están perfectamente determinados.
 MEM: medio esencial mínimo, 27 factores esenciales para el crecimiento celular.
 D-MEM: medio esencial mínimo modificado.
 HamF12: MEM + albúmina, transferrina, insulina y piruvato de sodio.
Los medios de cultivo no definidos (con suero o hidrolizados proteicos): tienen componentes cuya composición química
y concentración no están determinados. Los más utilizados son:
 Medios de mantenimiento: células con metabolismo basal (MEM + 2% de suero)
 Medios de crecimiento: activación del ciclo celular (MEM + 10% de suero)

Cinética de cultivo
Usamos como ejemplo los tiempos observados para una línea celular prototipo (epitelial transformada), según:

Adhesión Spreading Proliferación Confluencia

( 60-90 min) (3-4 hs) (TD~20 hs) (72-96 hs)

Como nosotros consideramos el cultivo en monocapa, los procesos de adhesión y spreading son indispensables para la
proliferación. El tiempo de duplicación (TD) depende de las propiedades de la línea celular y del medio de cultivo.

ADHESIÓN:

Los métodos más utilizados para medir la cinética de adhesión pueden ser de dos tipos: métodos directos o indirectos.
Los primeros hablan del número específico de células adheridas pero generalmente traen apareado un gran error,
mientras que los segundos estiman el número de células adheridas, según:
 Método directo: Lavar el cultivo para eliminar las células libres y observar al microscopio de contraste de fases.
Se realiza este procedimiento a diferentes tiempos y así se construye la gráfica. Método efectivo con gran error
asociado.
 Método directo 2: Lavar el cultivo para remover las células libres, luego despegar las células usando el método
de tripsinización y contar las células (ahora libres) en un contador. Este método también es efectivo y da el
número de células real que se adhirieron pero también aporta un error significativo.

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  Método indirecto: Lavar el cultivo para remover las células libres, agregar un colorante que ingrese a las células
y medir absorbancia. A mayor absorbancia, mayor será la cantidad de células adheridas. El más utilizado es el
cristal violeta que es un colorante vital que sólo ingresa a las células vivas.
 Método indirecto 2: Lavar el cultivo para remover las células libres, agregar un marcador radiactivo como el
cromo (Cr55) y medir en un contador de centelleo. Este es un método más sensible que el anterior porque
permite reconocer menores cantidades de células, pero es más peligroso para el operador.
Además, el proceso de adhesión depende del sustrato utilizado: el plástico que es un sustrato artificial puede ser
comparado con respecto a moléculas naturales como la fibronectina o el colágeno. Depende que ensayo se deba
realizar, hay que tener en cuenta que cuando las condiciones son lo más cercanas a lo in vivo, se obtienen resultados
que reflejan lo verdaderamente ocurrido. Ejemplo:

SPREADING:
Este hace referencia al complejo mecanismo en el cual la célula se extiende formando muchos contactos adhesivos con
el sustrato. La cinética de spreading responde a:

En cultivo de células transformadas se observa que del porcentaje de células adheridas,

el 100% tiende a extenderse sobre el sustrato, ya se natural o artificial. La cuantificación
de este proceso es mucho más complicada dado que depende del cambio morfológico
de las células, por lo que debe realizarse directamente observando al microscopio.
Puede tomarse como alternativa la pérdida de refringencia por parte de las células
extendidas, pero siempre se realiza el conteo directo.

PROLIFERACIÓN:
Luego de la adhesión y la extensión se produce el proceso de proliferación. Este depende del tiempo de duplicación (RD)
que es un parámetro poblacional que expresa cuanto tiempo lleva duplicar la cantidad de células (pasar de 10 a 20
células, por ejemplo). Este parámetro no está relacionado con el tiempo de mitosis porque es un fenómeno particular de
cada célula y el TD hace referencia a toda la población celular. El tiempo de duplicación se calcula descartando las fases
de latencia y de confluencia. La cinética de proliferación es:

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  Fase de latencia (lag): la célula se acomoda para proliferar, proceso que incluye la adhesión y la proliferación,
entre otros mecanismos de adaptación para el crecimiento en cultivo. Dura como mucho un overnight.
 Crecimiento exponencial (log): puede durar entre dos o tres días. A partir de esa zona de la curva se puede
calcular el tiempo de duplicación, que es de aproximadamente 20hs.
 Confluencia: el cultivo se extiende en toda la placa ocupando toda la superficie disponible, por lo que el
crecimiento disminuye. Se dice que se llega a la fase de quiescencia o plato. El momento ideal para repicar un
cultivo es en la sub-confluencia (75% del cubrimiento), justo antes de terminar la fase log.
Formas de cuantificar el número de células:
 Recuento directo: al ser un método artesanal trae asociado un gran error. Se lavan los Wells para sacar las
células no adheridas y se cuenta las adheridas en una cámara de recuento de células. De esta manera se obtiene
el número efectivo de células.
 Recuento indirecto: estos métodos estiman el número de células.
 Medida de la masa células: a más masa, mayor número de células.
 Cuantificación de proteínas por el método de Lowry: a mayor cantidad de proteínas, mayor número de
células.
 Medidas de metabolismo: se mide a actividad enzimática por el método denominado MTT. Aquí se le da un
sustrato a las células que al interaccionar con una deshidrogenasa cambia de color. La medida se realiza por
absorbancia. A mayor absorbancia, mayor número de células. El problema de este método es que las
células expuestas a MTT se mueren, por lo que surgió el denominado MTS que permite una medida en
solución sin matar a las células. Ambos métodos se realizan a diferentes tiempos por 72 horas.
 Medida de radiactividad basada en timidina tritiada: las células que estén por ingresar en la mitosis van a
estar duplicando su DNA por lo que van a incorporar la timidina tritiada. A mayor radiactividad, mayor
número de células. Es un método muy sensible, pero no funciona en líneas celulares que duplican su DNA
todo el tiempo de manera incontrolada, porque acarrea mucho error.
A continuación se muestra un ejemplo dónde el recuento indirecto da un resultado que no es verdadero:

Fórmula de crecimiento sigmoidea:

𝑵𝑫 = 𝒍𝒐𝒈𝟏𝟎 𝑵𝒇/𝑵𝒐 × 𝟑. 𝟑𝟑

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 𝑵𝒇
𝑵𝒐 =
𝟐𝑵𝑫
𝑵𝑫 = 𝒍𝒂𝒑𝒔𝒐 /𝑻𝑫
No es el número inicial de células, Nf es el número final de células, ND es el número de duplicaciones dadas en un lapso
de tiempo manejado por el operador. TD es el tiempo de duplicación de la población celular (es un parámetro que
depende de la línea celular, de las condiciones del cultivo y de la proporción de suero, a mayor suero menor TD). Como
Nf corresponde al número de células finales a las que el cultivo se satura, es un atributo de la línea celular y depende del
tamaño, de la forma y de las estructura de las células. Además se relaciona directamente con la densidad de saturación
o DS que son las células por unidad de área. Entonces para calcular Nf debo conocer el área de la superficie donde los
voy a hacer crecer.
Wells:  x radio2
𝑵𝒇𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 𝑫𝑺 × 𝒔𝒖𝒑 Frascos: base x altura
𝑵𝒇𝒓𝒆𝒂𝒍 = 𝟎. 𝟓𝟎 𝑵𝒇𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 2
Placa de 96: 0.3 cm2
T25: 25 cm
𝑵𝒇𝒆𝒙𝒑𝒆𝒓𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒂𝒍 𝒑𝒂𝒓𝒂 = 𝟎. 𝟕𝟓 × 𝑵𝒇𝒓𝒆𝒂𝒍 2
Placa de 24: 2 cm2
T75: 75 cm
𝒖𝒔𝒂𝒓 𝒆𝒏 𝒄á𝒍𝒄𝒖𝒍𝒐𝒔 Placa de 6: 10 cm2

Esterilidad del cultivo eucariota

Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura básica en la cual se disponga de áreas
independientes para llevar a cabo la preparación y esterilización de medios y reactivos, un espacio independiente para el
proceso de lavado y preparación de material y un área propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares. Dentro
de la infraestructura física básica se debe contar con sistemas de refrigeración y congelación, incubadoras, centrífugas,
balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar. Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material
plástico y de vidrio y con sistemas de esterilización apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material
utilizados.
Los cultivos eucariotas se contaminan fácilmente porque las propias células actúan como reservorio para virus y porque
el medio de cultivo es propicio para el crecimiento de otros organismos que se duplican a mayor velocidad y matan a las
células eucariotas, como las bacterias o los hongos. Los contaminantes más usuales son:
 Bacterias: por ello se adicionan antibióticos al medio de cultivo.
 Virus: específicos de cada línea celular.
 Hongos: es un tipo de contaminación relativamente frecuente que no se da tan rápido como las bacterianas
(que en 1 día ya se advierte su presencia) porque tardan 2 o 3 días en ser visibles.
 Parásitos: es muy difícil observar este tipo de contaminaciones, pero suele darse cuando se guarda el cultivo en
una estufa que los contenga.
 Micoplasmas: se los conoce como “enfermedades venéreas del cultivo celular” porque cuando se producen son
muy complicadas de observar y de tratar. No son contaminaciones evidentes en un principio porque no
producen cambios en la línea, pero a largo plazo puede observarse disminución del crecimiento celular,
acidificación del medio, gasto muy rápido de los componentes del medio, las células eucariotas comienzan a
flotar, etc. pero no mata al cultivo. Por esto se deben usar antibióticos como tetraciclinas, que pueden ser
tóxicos para nuestras células; o hacer controles del stock cada 3 meses por fluorescencia (se usa un reactivo que
se une a Micoplasmas) o por PCR (cuantificando expresión de genes específicos de micoplasmas).
Se define como esterilización al proceso por el cual se eliminan los microorganismos de un objeto o sustancia. La
desinfección es proceso por el cual se detiene el desarrollo celular de los microorganismos, elimina la mayor parte de
éstos pero no sus esporas.

Esterilización por calor

A. Calor húmedo: se utiliza el autoclave para materiales especiales como plásticos y soluciones inorgánicas. Nunca
se debe autoclavar el medio de cultivo o el material biológico (proteínas, SFB, azúcares) porque se caramelizan.
Las condiciones usuales son 121°C por más de 20 minutos a una presión de 1.2atm.

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 B. Calor seco: se utilizan hornos para materiales especiales como los vidrios. Las condiciones usuales son: 160°C
por 2hs o 180°C por 1h.
C. Incineración por flameo: se realiza dentro del flujo laminar para el material de cirugía, como las pinzas o tijeras.

Esterilización por radiación

A. No ionizante: la más usual es la luz UV que se expone en cabinas o ambientes pequeños. La superficie del flujo
laminar se esteriliza por radiación UV cuando se la mantiene prendida por 20 minutos aproximadamente. En
este caso sólo se descontamina la superficie, pero no los laterales o debajo de los materiales dentro del flujo.

B. Ionizante: la radiación gamma se usa para esterilizar los materiales plásticos en las grandes empresas que los
venden como plásticos de uso en cultivo celular.

Esterilización por agentes químicos

Los más utilizados son el óxido de etileno, un gas que permite la esterilización de quirófanos, maquinas, salas de cultivo
y grandes ambientes, y el alcohol 70% que se utiliza en dicha proporción porque se demostró que atraviesa con mayor
facilidad la membrana bacteriana.

Esterilización por filtración

En este caso se pasa una solución liquida por una membrana que retiene la carga bacteriana, por lo que el tamaño de
poro que se considera esterilizante es de 0.22 uM. Se pueden añadir pre-filtros para disminuir la carga bacteriana de
0.45 uM. Las membranas son de nitrocelulosa o de acetato de celulosa. Se utilizan para esterilizar medios de cultivo,
soluciones de sueros, de azucares, de antibióticos o de suplementos. Como el suero es muy viscoso no se puede filtrar
fácilmente, las opciones son: comprarlo estéril o esterilizarlo una vez que se ha diluido en el medio de cultivo.

Flujos laminares
Son campanas que mantienen un flujo de aire esterilizado por filtrado (con pre-filtro y filtro). El flujo laminar impide que
ingrese aire del exterior no filtrado y mantiene la esterilización de las muestras. La cabina tiene un ambiente estéril,
pero no es esterilizante. Su función es proteger de contaminación al operador, producto y medio ambiente.
Generalmente se usan los filtros HEPA que retienen con un 99% de eficiencia las partículas de hasta 0.3 uM.
Se pueden clasificar según el nivel de bioseguridad que ofrezcan. La elección del mismo depende de la peligrosidad del
material de experimentación.

Flujo horizontal: clase I

Protegen al material pero son muy inseguros para el operador. Generalmente no tienen vidrio de separación.

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Flujo vertical: clase II
Presenta un elevado grado de bioseguridad para el operador y para la muestra. Se usa para todo tipo de muestras
excepto para patógenos muy riesgosos, caso en el que se requieren cabinas de seguridad clase III o clase IV.
Generalmente los flujos verticales tienen una rejilla en la mesada que genera una barrera de aire que impide el ingreso
del aire exterior por el lugar de trabajo. Se debe trabajar tranquilo para evitar las turbulencias y mantener un flujo
constante.

Dentro del tipo II hay diferentes sub-clasificaciones, según:

Sistemas cerrados: clase III

Son sistemas totalmente cerrados de alta seguridad donde el operador solo accede al producto mediante guantes.
Protege a la muestra, al operador y al ambiente.

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Organización del lugar de trabajo:

Nunca se deben pasar

los brazos por encima del
material del trabajo.

Técnicas de cultivo celular

¿Por qué estudiar células in vitro?
 Es una fuente “homogénea” de un tipo celular dado.
 No hay un nivel de organización “real” lo que permite estudiar los procesos de forma simplificada, pero hay que
saber extrapolar luego los resultados.
 Es más simple y barato que criar animales.
 Provee material de trabajo virtualmente ilimitado.
 La mayoría de las líneas celulares utilizadas están disponibles comercialmente, los resultados obtenidos son
comparables con los de otros grupos que usaron esa misma línea celular comercial.
El mantenimiento de los cultivos celulares depende de los cambios periódicos del medio (sino baja el pH y se agotan los
nutrientes por el crecimiento celular), del volumen de medio utilizado y de los subcultivos realizados. La preservación
celular se realiza con la técnica de congelación y descongelación.

La viabilidad celular se analiza por conteo directo o indirecto, según los métodos previamente descriptos. El objetivo es
conservar las células por largos períodos de tiempo, disminuir los riesgos de contaminación y probabilidad de pérdida de
caracteres deseados por los sucesivos pasajes.

Cultivo primario
 Explante primario:
Se coloca un trozo de tejido de aproximadamente 1mm directamente en una placa de cultivo (con o sin
agregados). Se espera a que las células comiencen a replicarse y se alejen de los márgenes del tejido. Suele
usarse cuando hay poco material de partida.
 Disgregación mecánica y/o enzimática:
Se disgrega un trozo de tejido con tijeras o pinzas o con enzimas digestivas y se siembra este producto de
disgregación para que las células se adhieran.

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Sustratos
 Plásticos tratados:
Son plásticos especiales con cargas negativas dispersas, pero con carga positiva neta que facilita la unión de
algunos tipos celulares.
 Coating:
Se pueden utilizar coberturas proteicas de laminina, colágeno o fibronectina que simulan las condiciones in vivo.
Suelen utilizarse porque proveen un “entorno 3D” (ejemplo: cordones vasculares). Ejemplo:

Células HUVEC Células HUVEC en matrigel

Condiciones físicas del medio

 Temperatura:
Para células de mamíferos se utilizan 37°C y para vertebrados de sangre fría una temperatura entre 18 y 25°C.
 Gaseo:
Se utiliza un ambiente con 5%CO2 como estándar, lo cual pretende emular el buffer de la sangre. Este %
depende del tipo de buffer que lleve el medio de cultivo (HEPES o bicarbonato). Además, se debe usar un
volumen pequeño de medio de cultivo para que el intercambio gaseoso sea favorable y llegue al fondo del
frasco (donde están pegadas las células).

 Humedad:
Es importante que el medio de cultivo no se evapore para no alterar la osmolaridad del mismo. Por ello se
mantiene una atmósfera húmeda con una solución 1X de CuSO4.

Medios utilizados:
Los medios poseen vitaminas, aminoácidos, minerales y carbohidratos necesarios para el crecimiento celular; además de
tener un pH y osmolaridad controlado. Suelen poseer indicadores del viraje de pH como el rojo fenol que pasa de rojo
(en medio básico) a amarillo (en medio ácido). El pH fisiológico es 7.4, pero los medios se preparar a un pH de 8-8,4
porque el metabolismo celular los acidifica. Se debe considerar que el rojo fenol tiene acción “estrogénica” por lo que no
es un buen indicador de pH cuando se comprueba la acción de hormonas en la línea celular.
 Medios de crecimiento: MEM, D-MEM o RPMI con SFB y otros componentes.
 Medios de congelación: SFB con 10% DMSO o medio sin suero con 5%DMSO. Este último es una sustancia
anticristalizante.

Técnicas básicas:

CONGELACIÓN
La congelación sirve para tener un back up de células en caso de que el ensayo salga mal, para asegurar un stock de la
línea celular y mantener a la línea joven y para ahorrar placa. La regla general es: congelar lenta y progresivamente –
descongelar bruscamente.

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 La congelación rápida lleva a la formación de más cristales
intracelulares y la congelación lenta produce una mayor
deshidratación celular. El rápido puede llevar al estallido celular
y la lenta al achicamiento celular. En cualquiera de los casos, la
congelación lenta se prefiere por sobre la rápida.
Como agentes criopreservantes se usan:
-1- Glicerol: baja toxicidad y baja eficiencia.
-2- DMSO: mayor toxicidad y mayor eficiencia. Si se usa en
la concentración justa, funciona muy bien en cultivo
eucariota.

Procedimiento:

DESCONGELACIÓN
Para descongelar se sacan los crioviales del tanque de N2 y se lo pasa a un tacho de tergopol o plástico blando con agua
tibio (25-35°C). La descongelación tiene que ser un proceso rápido para evitar que los cristales del medio se derritan
antes que los cristales intracelulares.

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REPIQUE O DILUCIÓN

RECUENTO
Para el recuento de células se usa el azul tripan, un colorante vital que tiñe las células muertas (las vivas lo bombean al
exterior). Al observar al microscopio las células vivas se ven blancas y refringentes mientras que las muertas se ven
azules y opacas. Se utilizan dos soluciones: A es una solución salina (medio osmótico favorable) y B es el stock de azul
tripan.

Cálculo del número de células:

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 -1- Obtener promedio de cuadrantes:

𝑛° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑛° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑛° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑛° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 + 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 + 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 + 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 1 2 3 4
4

-2- Multiplicar por factor de dilución:

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 × 2 = 𝐴

-3- Multiplicar por factor de corrección de volumen:

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝑛° 𝑑𝑒 = 𝐴 × 1 × 104 = 𝐵
𝑚𝑙

-4- Multiplicar por la cantidad de ml total de la solución (Q):

𝑛° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 = 𝐵 × 𝑄

El porcentaje de viabilidad es la cantidad de células muertas sobre la cantidad de células vivas. Es aceptable como
máximo un 10% de viabilidad. Las células eucariotas se centrifugan a 800-1000 rpm por 8 minutos generalmente.

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