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INVESTIGACIÓN DEL CEREBRO 1072 (2006) 72 – 7 8

disponible en www. ciencia directa. com

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Informe de investigación

Caracterización electrofisiológica de los receptores nicotínicos de

acetilcolina en neuronas del ganglio petroso de gato en cultivo:
Efectos de la citisina y sus derivados de bromo

Rodrigo Varasc, Viviana Valdesc, Patricio Iturriaga-Vásquezb , Bruce K. Casselsb ,

Rodrigo Iturriagac , Julio Alcayagaa,ÿ
a
Laboratorio de Fisiología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile
b
Laboratorio de Química Biodinámica, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago, Chile
C
Laboratorio de Neurobiología, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Historial del artículo: Las neuronas del ganglio petroso se despolarizan y disparan potenciales de acción en respuesta a la acetilcolina y la
Aceptado el 5 de diciembre de 2005 nicotina. Sin embargo, se sabe poco sobre los subtipos de receptores nicotínicos de acetilcolina involucrados, aunque se
Disponible en línea el 9 de enero de 2006 han identificado subunidades ÿ4 y ÿ7 en las neuronas del ganglio petroso. La citisina, un alcaloide no relacionado con la
nicotina, y sus derivados de bromo son agonistas que exhiben diferentes afinidades, potencias y eficacias en los receptores
palabras clave: nicotínicos de acetilcolina que contienen subunidades ÿ4 o ÿ7. Para caracterizar los receptores involucrados, estudiamos
Subunidad de los efectos de estos agonistas y los antagonistas de los receptores nicotínicos de acetilcolina hexametonio y ÿ-
acetilcolina ÿ7 bungarotoxina en neuronas aisladas del ganglio petroso.
cuerpo carotideo
citisinas Los ganglios petrosales se extirparon de gatos anestesiados y se cultivaron durante un máximo de 16 días.
receptor nicotínico Usando la técnica de abrazadera de parche, registramos las corrientes de células enteras provocadas por aplicaciones de
acetilcolina, citisina o sus derivados de bromo de 5 a 10 s. Los agonistas y antagonistas se aplicaron por gravedad desde
Abreviaturas: una pipeta cerca de la superficie de la neurona. Las neuronas respondieron a la acetilcolina, citisina, 3-bromocitisina y 5-
3-Br-cy, 3-bromocitisina bromocitisina con corrientes casi internas que se desensibilizaron durante la aplicación de los estímulos y se bloquearon
5-Br-cy, 5-bromocitisina de forma reversible con hexametonio 1 ÿM o ÿ-bungarotoxina 10 nM. El orden de potencia de los agonistas fue 3-
ACh, acetilcolina nAChR, bromocitisina ÿ acetilcolina ÿ citisina ÿ 5-bromocitisina, lo que sugiere que los receptores nicotínicos neuronales ÿ7
receptor nicotínico de acetilcolina homoméricos predominan en las neuronas del ganglio petroso del gato en cultivo.

PG, ganglio petroso

© 2005 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

1. Introducción rama yngeal (Alcayaga et al., 1996; Stensaas y Fidone, 1977). El

nervio del seno carotídeo transporta fibras quimiosensoriales y
El ganglio petroso (PG) es el principal ganglio sensorial que contiene mecanosensoriales desde el cuerpo carotídeo y el seno carotídeo,
el pericario de las neuronas aferentes primarias del nervio respectivamente, mientras que la rama glosofaríngea contiene fibras
glosofaríngeo, cuyos axones periféricos se proyectan a través del quimiosensoriales y mecanosensoriales de la lengua y la faringe. la
nervio del seno carotídeo o del glosofaringe. traduccion de quimica

ÿ Autor correspondiente. Fax: +56 2 271 2983.

Correo electrónico: jalcayag@uchile.cl (J. Alcayaga).

0006-8993/$ – ver portada © 2005 Elsevier BV Todos los derechos reservados. doi:10.1016/
j.brainres.2005.12.006
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estímulos implica células receptoras especializadas tanto en el cuerpo distinguir entre los subtipos de receptores colinérgicos nicotínicos ÿ7
carotídeo como en las papilas gustativas. y ÿ4ÿ2 (Houlihan et al., 2001; Slater et al., 2003).
El modelo actual de quimiotransducción en la carótida

el cuerpo afirma que las células quimiorreceptoras (glomus) liberan

uno o más transmisores, que a su vez aumentan la frecuencia de las 2. resultados
descargas sensoriales originadas en las terminaciones periféricas de
las neuronas PG (Iturriaga y Alcayaga, 2004). En respuesta a la 2.1. Corrientes evocadas por ACh en neuronas PG cultivadas
hipoxia y la hipercapnia, el cuerpo carotídeo libera acetilcolina (ACh)
de las células quimiorreceptoras (Fitzgerald et al., 1999), y varios A un potencial de reposo de membrana impuesto de ÿ60 mV, la ACh
estudios indican que la ACh modula la liberación de catecolaminas
(0,02–1 mM) provocó corrientes internas transitorias dependientes de
de las células quimiorreceptoras del cuerpo carotídeo de gatos y la dosis y desensibilizantes rápidas en 17 de 24 (71 %) neuronas PG
conejos (Hirasawa et al. ., 2002; Ishizawa et al., 1996; Iturriaga et al., en cultivo (Figs. 1 y 3A) . Para evitar los efectos de la desensibilización
2000; Shirahata et al., 1998). del receptor, se permitieron al menos 5 minutos entre las sucesivas
Las aplicaciones de ACh a las neuronas PG aisladas de rata y aplicaciones de ACh. El bloqueador nicotínico hexametonio (1 ÿM)
gato en cultivo provocan corrientes internas, despolarización y suprimió reversiblemente las corrientes de entrada evocadas por ACh
potenciales de acción, efectos imitados por la nicotina y bloqueados en todos los casos estudiados (Figs. 1A, B). La figura 1 muestra las
por el hexametonio (Koga y Bradley, 2000; Varas et al., 2000; Zhong corrientes de entrada inducidas por ACh en 3 neuronas diferentes.
y Nurse, 1997) . Además, las aplicaciones de ACh al PG de gato La superfusión durante 3 min con solución de Hanks que contenía
superfundido generan ráfagas de potenciales de acción conducidos hexametonio 1 ÿM eliminó por completo la corriente de entrada (Figs.
a lo largo del nervio del seno carotídeo, mientras que solo se observan 1A, B), un efecto que fue reversible en las 17 neuronas estudiadas.
unos pocos picos en la rama glosofaríngea en respuesta a las dosis De manera similar, el bloqueador nicotínico ÿ-bungar otoxina (10 nM)
más altas de ACh (Alcayaga et al., 1998). La respuesta neuronal bloqueó de forma reversible la corriente de entrada evocada por ACh
provocada por la ACh depende de la dosis y es antagonizada de en 5 de las 6 neuronas PG estudiadas (83 %). La Fig. 1C muestra
manera reversible por el hexametonio y la mecamilamina. De manera que la corriente de entrada provocada por la ACh (500 ÿM) en una
similar, los registros de neuronas PG de gato conectadas neurona se bloqueó de forma reversible mediante la superfusión de ÿ-
funcionalmente al cuerpo carotídeo in vitro muestran que la aplicación bungarotoxina (10 nM) durante 3 min. El efecto de bloqueo de la ÿ-
de ACh a sus somas despolariza estas neuronas, sin efecto sobre las bungarotoxina fue reversible en dos neuronas en las que la el registro
neuronas mecanosensoriales PG (Varas et al., 2003). Por lo tanto, fue estable después de un período de lavado de 10 min.
los datos electrofisiológicos indican que una población de neuronas
PG que se proyectan a través del nervio del seno carotídeo son 2.2. Corrientes evocadas por la citisina y sus derivados de bromo.
activadas selectivamente por la ACh que actúa sobre los receptores
nicotínicos de ACh ubicados en los somas de estas neuronas. La citisina y el 3-Br-cy evocaron corrientes internas transitorias
dependientes de la dosis en 15 de las 17 (88%) neuronas que
Los receptores colinérgicos nicotínicos (nAChR) están respondieron a la ACh (Figs. 3B-D). Por el contrario, 5-Br-cy solo
ampliamente distribuidos en los vertebrados, incluidas diferentes indujo corrientes en 10 de las 15 (59%) neuronas que respondieron a
regiones del sistema nervioso central y periférico (Hogg et al., 2003). la ACh, todas las cuales habían respondido a la citisina. Cabe
Los nAChR neuronales son estructuras pentaméricas resultantes del mencionar que solo aquellas neuronas que respondieron a ACh
conjunto de 12 subunidades (ÿ2–ÿ10 y ÿ2–ÿ4), de las cuales se sabe mostraron corrientes evocadas por citisina o sus derivados bromados.
que al menos los subtipos de receptores homoméricos ÿ7 y ÿ9 y La Fig. 2 muestra una comparación de las respuestas provocadas
heteroméricos ÿ4ÿ2 y ÿ2ÿ4 están presentes en otros ganglios por aplicaciones 100 ÿM de ACh, citisina, 5-Br-cy y 3-Br-cy en una
sensoriales (Genzen et al. ., 2001; Lips et al., 2002; Liu et al., 1998). sola neurona PG. Todos estos agentes produjeron corrientes internas
La composición de subunidades de los receptores heteroméricos transitorias que retrocedieron en 4 s incluso
nACh determina características como la conductancia y la cinética de cuando los agonistas todavía se estaban aplicando a la neurona.
desensibilización (Window et al., 1997), la permeabilidad al Ca2+ y Para esta concentración única de 100 ÿM, la ACh y la citisina
las afinidades agonistas y/o antagonistas. Los receptores homoméricos provocaron corrientes de amplitud similar, mientras que el 3-Br-cy
ÿ7-nACh tienen la mayor permeabilidad al Ca2+ , la cinética de produjo una corriente de entrada más grande (alrededor del 140 %) y
desensibilización más rápida de los receptores nACh y son bloqueados porella5-Br-cy provocó una corriente de entrada más pequeña (solo el 40
ÿ-bungarotoxina.
Por el contrario, los receptores heteroméricos tienen una permeabilidad %). . La superfusión de 1 ÿM de hexametonio durante 3 min bloqueó
al Ca2+ mucho más baja y en su mayoría son insensibles a la ÿ- completa y reversiblemente las corrientes evocadas por ACh, citisina
bungarotoxina (Windows et al., 1997; Gotti et al., 1997). Los estudios y 5-Br-cy, pero no logró bloquear completamente las corrientes
inmunohistoquímicos han demostrado la presencia de subunidades evocadas por 3-Br cy en concentraciones superiores a 100 ÿM (datos no mostrados
nACh ÿ7 y ÿ4 en las terminaciones nerviosas, así como en el pericario
de las neuronas PG de gato que inervan el cuerpo carotídeo, lo que 2.3. Curvas dosis-respuesta provocadas por ACh, citisina y sus
sugiere que los receptores ÿ7 y ÿ4ÿ2 predominan en estas neuronas derivados de bromo
(Ishizawa et al., 1996; Shirahata et al., 1998). Sin embargo, se sabe
poco sobre el tipo funcional de los nAChR que median la respuesta Las respuestas inducidas por concentraciones crecientes de ACh,
electrofisiológica de las neuronas PG a la ACh. En consecuencia, citisina, 3-Br-cy y 5-Br-cy se muestran en la figura 3. La ACh y la
caracterizamos las corrientes provocadas por ACh en las neuronas citisina (20 ÿM–1 mM) produjeron corrientes de entrada dependientes
PG usando el agonista de nAChR citisina y sus derivados de bromo de la dosis de amplitud similar, con una concentración umbral de 10–
3-bromocitisina (3-Br-cy) y 5-bromocitisina (5-Br-cy) para 20 ÿM y alcanzando máximos en concentraciones
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Figura 1 - Corrientes internas evocadas por ACh en tres neuronas PG de gato cultivadas. La superfusión con solución de Hanks que contiene 200 o 500
ÿM de ACh (concentración de pipeta) genera una corriente interna de inactivación rápida que se bloquea de forma reversible con hexametonio 1 ÿM (A,
B) y ÿ-bungarotoxina 10 nM (C). Vh, manteniendo el potencial de membrana a ÿ60 mV.

cerca de 0,5-1 mM (Figs. 3A, B). Las corrientes máximas evocadas por (EC50 = 16,5 ÿM) y mostró un Imax mayor (ÿ1,28 nA). Por el contrario,
las concentraciones más altas de ACh y citisina fueron del orden de 1 nA las corrientes evocadas por 5-Br-cy alcanzaron una amplitud muy
para neuronas de alrededor de 45 ÿm de diámetro. pequeña y mostraron un EC50 mucho más alto (1264 ÿM)
Sin embargo, las neuronas fueron más sensibles al 3-Br-cy, que produjo (Figura 4, Tabla 1). Por lo tanto, el orden de clasificación de las potencias
corrientes de mayor amplitud, alcanzando su máximo cerca de 50-100 fue: 3-Br-cy ÿ ACh ÿ citisina ÿ 5-Br-cy.
ÿM (Fig. 3C). Por el contrario, el 5-Br-cy solo indujo corrientes internas
muy pequeñas en una neurona de tamaño similar (Fig. 3D).

La Fig. 4 resume las curvas dependientes de la dosis para las 3. Discusión

corrientes de entrada evocadas por ACh, citisina, 3-Br-cy y 5-Br-cy en 6
neuronas. Las curvas de dosis-respuesta inducidas por ACh y citisina Los presentes resultados muestran que la ACh provocó corrientes
tenían una Imax (ÿ1.02 vs. ÿ1.12 nA) y ED50 (182 vs. 168 ÿM) similares internas transitorias en el 71% de las neuronas PG estudiadas. La
(Fig. 4, Tabla 1), pero eso fue evocado por 3-Br-cy desplazado a la proporción de neuronas sensibles a ACh encontrada aquí concuerda con
izquierda en un orden de magnitud estudios previos en ratas (Zhong y Nurse, 1997) y neuronas PG cultivadas en gatos .
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INVESTIGACIÓN DEL CEREBRO 1072 (2006) 72 – 7 8 75

Fig. 4 – Curvas dosis-respuesta para ACh (círculos rellenos), citisina

(triángulos rellenos), 3-bromocitisina (3-Br-cy, rombos rellenos) y 5-
bromocitisina (5-Br-cy, cuadrados rellenos) en 6 Neuronas PG, a un
potencial de membrana de mantenimiento de ÿ60 mV. La abscisa
corresponde a la concentración en pipeta de los agonistas.
Fig. 2 - Corrientes internas provocadas por concentraciones de 100
ÿM (en la pipeta) de ACh, citisina, 3-bromocitisina (3-Br-Cy) y 5-
bromocitisina (5-Br-Cy) en una neurona PG en cultivo. La barra indica
la duración de la superfusión de los fármacos. Vh, manteniendo el (Varas et al., 2000). Con un potencial de membrana de mantenimiento
potencial de membrana a ÿ60 mV. de ÿ60 mV, la ACh evocó una corriente de entrada casi inactivada,
cuya amplitud mostró un aumento dependiente de la dosis, con una

Fig. 3 – Corrientes hacia el interior de células enteras provocadas por concentraciones crecientes de ACh (A: 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 ÿM),
citisina (B: 10, 20, 100, 200, 500 y 1000 ÿM), 3-bromocitisina (C: 2, 5, 10, 20, 50 y 100 ÿM) y 5-bromocitisina (D: 100, 200, 500 y 1000 ÿM) en
cuatro neuronas PG cultivadas de tamaño similar (diámetro 45 ÿm). Las barras indican las aplicaciones de los agonistas.
Se aplicaron dosis sucesivas a intervalos de 5 min, a un potencial de membrana de mantenimiento (Vh) de ÿ60 mV.
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Tabla 1 – Potencia funcional de ACh, citisina y sus isósteros 3- PG in vitro provoca descargas antidrómicas en el nervio del seno carotídeo
bromocitisina (3-Br-cy) y 5-bromocitisina (Alcayaga et al., observaciones no publicadas).
(5-Br-cy) en neuronas PG de gato cultivadas La citisina tiene una afinidad micromolar baja por los nAChR
Imáx (nA) CE50 (ÿM) norte
homoméricos ÿ7 (Flores et al., 1992; Pabreza et al., 1991), pero es un
agonista completo, con mayor eficacia que la ACh en estos receptores.
Vaya ÿ1,02 182.30 2.25
ÿ1,12 167.65 1.32
De lo contrario, la afinidad nanomolar de citisina por los receptores ÿ4ÿ2
citisinas
3-Br-cy ÿ1,28 16.48 1.70 se asocia con una eficacia muy baja (0,04 %) en relación con la de la ACh
5-Br-cy ÿ0,10 1264.70 0.81 (Slater et al., 2003). Los isoésteres de bromo de la citisina han mostrado
afinidades y potencias agonistas muy diferentes en los nAChR ÿ7, ÿ4ÿ2 y
Valores estimados obtenidos ajustando las curvas dosis-respuesta a una regresión no
ÿ4ÿ4 humanos recombinantes expresados en células cultivadas y en
lineal según la ecuación I= Imax /[1+(EC50 /X) agonista. EC50 = concentración
norte
ovocitos de Xenopus (Houlihan et al., 2001; Slater et al., 2003). Según
requerida para evocar]. la
Imax = corriente
mitad máxima
de la amplitud deevocada
corrientepor cualquier
máxima. X =dado
dosis de un
agonista dado. n = coeficiente de Hill calculado (N = 6 neuronas). Houlihan et al. (2001) y Slater et al. (2003), la citisina y el 3-Br-cy son
agonistas completos en los nAChR ÿ7 pero agonistas parciales en los
nAChR ÿ4ÿ2. También muestran una alta potencia y eficacia en los nAChR
ÿ4ÿ4. La 5-bromocitisina tiene una potencia más baja y es un agonista
parcial en los nAChR ÿ7 y ÿ4ÿ4, pero no provocó ninguna respuesta en los
umbral de 10-20 ÿM, alcanzando un máximo entre 0,5 y 1 mM. Por lo nAChR ÿ4ÿ2.
tanto, nuestros datos sobre neuronas PG obtenidas de gatos adultos Por lo tanto, la citisina y sus derivados son herramientas útiles para
concuerdan con los obtenidos de neuronas PG de ratas perinatales (Koga distinguir entre los subtipos de receptores colinérgicos nicotínicos ÿ7 y
y Bradley, 2000; Zhong y Nurse, 1997). La corriente inducida por ACh se ÿ4ÿ2.
bloqueó de forma reversible con 1 ÿM de hexametonio, una concentración La citisina y sus derivados de bromo provocaron corrientes internas
mucho más baja que los 200 ÿM necesarios para bloquear la corriente de solo en las neuronas activadas por ACh, y estas corrientes fueron
entrada inducida por ACh en las neuronas PG de rata. bloqueadas por hexametonio. La citisina muestra una potencia agonista
(Zhong y Enfermera, 1997). Aún más, la ÿ-bungarotoxina 10 nM bloqueó alta (EC50 ÿ nM) en los receptores nicotínicos de ACh que contienen
la corriente inducida por ACh en el 83% de las neuronas PG estudiadas. subunidades ÿ4 y ÿ2 y mucha menos potencia (EC50 ÿ ÿM) en los nAChR
ÿ7 homoméricos (Holladay et al., 1997; Houlihan et al., 2001; Slater et al.
La proporción de neuronas del PG que se proyectan a través del al., 2003). Curiosamente, observamos que el 3-Br-cy era el agonista más
nervio del seno carotídeo representa aproximadamente del 15 al 20% del potente, con la CE50 más baja (16,2 ÿM) de todos los agonistas utilizados.
número total de neuronas en el ganglio, y solo la mitad de la proporción El orden de rango de las potencias agonistas para evocar corrientes
anterior probablemente se proyecta al cuerpo carotídeo (Alcayaga et al., internas en las neuronas PG fue: 3-Br-cyÿAChÿ citisinaÿ5-Br-cy (ver Tabla
1996; Berger , 1980; Claps y Torrealba, 1988; McDonald, 1983). Sin 1). En conjunto, con la muy baja eficacia de la citisina y el agonismo
embargo, más de dos tercios de nuestras neuronas en cultivo mostraron parcial relativamente débil de la 3-bromo citisina en los receptores que
sensibilidad a la ACh. Una posibilidad es que las neuronas del PG que se contienen las subunidades ÿ4 y ÿ2, esto sugiere que la corriente observada
proyectan a través del nervio glosofaríngeo también presenten sensibilidad aquí corresponde principalmente a los receptores nicotínicos ACh ÿ7. Se
a la ACh. Esto concuerda con la idea de que la ACh es el transmisor ha encontrado el mismo orden de potencia y eficacia relativa de la citisina
excitatorio entre las células gustativas de la lengua y las terminaciones y sus derivados de bromo para los nAChR recombinantes ÿ7 humanos
nerviosas glosofaríngeas (Landgren et al., 1954), y la observación de que, expresados en ovocitos de Xenopus o líneas celulares de neuroblastoma
cuando se marca previamente con Fluorogold aplicado a la lengua, el (Houlihan et al., 2001; Slater et al., 2003). Además, la corriente de entrada
50% de los Las neuronas PG de rata en cultivo responden a la ACh con inducida por la ACh en las neuronas PG muestra el mismo curso temporal
corrientes internas (Koga y Bradley, 2000), de manera similar a los de inactivación rápida que caracterizó la respuesta de las neuronas
resultados informados aquí. Sin embargo, también es posible que las recombinantes del ganglio de la raíz dorsal humana o de rata que expresan
condiciones de cultivo favorezcan la supervivencia de las neuronas del ÿ7 nAChR (Genzen et al., 2001; Houlihan et al., 2001).
PG que
proyecto al cuerpo carotídeo o la presencia de factores tróficos, como Nuestros registros electrofisiológicos que sugieren una contribución
NGF, puede inducir la regulación positiva de nAChR. Además, la destacada de las subunidades ÿ7 concuerdan con los estudios
modificación de la interacción trófica entre las neuronas PG y sus tejidos inmunohistoquímicos que muestran la presencia de la subunidad ÿ7 no
diana debido a las condiciones de cultivo puede inducir una sobreexpresión solo en las terminaciones nerviosas del cuerpo carotídeo, sino también en
de nAChR en las membranas de las neuronas PG en cultivo. Esta idea se los somas de las neuronas PG (Shirahata et al., 1998). Sin embargo,
apoya en la observación de que se registran escasas descargas observamos que el 59% de las neuronas sensibles a ACh (10/17) también
antidrómicas desde la rama glosofaríngea en respuesta a la ACh aplicada responden a 5-Br-cy, lo que sugiere que la corriente evocada por 5-Br cy
al PG superfundido in vitro (Alcayaga et al., 1998). se debió a la activación de nAChR diferentes al subtipo ÿ4ÿ2, por ejemplo,
ÿ4ÿ4. Una explicación alternativa es que los nAChR ÿ4ÿ2 pueden diferir
Un gran porcentaje (88%) de las neuronas PG que respondieron a la entre gatos y humanos. Sin embargo, diferentes especies han mostrado
ACh también respondieron a la citisina con corrientes internas de intensidad nAChR de composición idéntica (Itier y Bertrand, 2001; McGehee y Role,
y perfil similares a las provocadas por la ACh. Debe señalarse que una 1995), lo que sugiere que se encuentran otras combinaciones de
larga serie de informes de investigadores rusos llevó a Anichkov y Belen'kii subunidades de nAChR (como ÿ3 y ÿ2) en las neuronas PG del gato
(1963) a concluir que la citisina es “uno de los más potentes estimulantes (Hirasawa et al., 2002; Shirahata et al., 1998) puede ser funcional. Es
de los quimiorreceptores carotídeos” ya utilizar la citisina como analéptico importante notar que 5 de 15 neuronas que respondieron a ACh, citisina y
respiratorio. Además, la citisina aplicada al superfundido 3-Br-cy no respondieron a 5-Br-cy, lo que sugiere
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4.2. Análisis estadístico

que pueden existir otros subtipos de nAChR en PG cultivados en gatos
neuronas
Para comparar los efectos de la ACh, la citisina y sus derivados de bromo en las
En resumen, los presentes resultados muestran que las neuronas
curvas dosis-respuesta de la corriente de entrada (I), los datos combinados de los
PG respondieron a ACh, citisina, 3-Br- y 5-Br-citisina con corrientes de
experimentos individuales se ajustaron a la siguiente expresión logística: I = Imax /
entrada rápidas que se desensibilizaron rápidamente (durante la , EC50
1 + (EC50 / X) donde Imax = corriente máxima evocada
norte

= concentración
por un agonista
de agonista
dado,
aplicación de estímulos) y fueron bloqueadas reversiblemente por que provocó la mitad de la corriente máxima, X = concentración de agonista
hexametonio 1 ÿM o hexametonio 10 nM. ÿ-bungarotoxina. El orden de administrada por la pipeta de estímulo y n = coeficiente de Hill.
potencia de los agonistas en las neuronas PG fue: 3-Br-
Los coeficientes de correlación para las curvas ajustadas fueron superiores a 0,90
citisinaÿAChÿcitisinaÿ5-Br-citisina. Por lo tanto, nuestros resultados
(P b 0,01) para todas las condiciones estudiadas.
sugieren que los nAChR ÿ7 homoméricos predominan en las neuronas PG de gato en cultivo.

Expresiones de gratitud
4. Procedimientos experimentales
Este trabajo fue apoyado por FONDECYT (Fondo Nacional de
Se extirparon bilateralmente los ganglios petrosos de 10 gatos adultos anestesiados
Investigaciones Científicas y Tecnológicas, Chile) subvenciones
con pentobarbital sódico (40 mg/kg, ip). Los ganglios se colocaron en solución de
1040638, 1040776 y 1010951.
Hanks modificada enfriada con hielo (sin Ca2+– Mg2+), se picaron en 15–20
piezas y se disociaron enzimáticamente con agitación a 38 °C en solución de
Hanks modificada suplementada con 1 g/L de colagenasa, 0,5 g/L de tripsina y
150 000 U/L de ADNasa durante 30 a 60 min La suspensión celular se centrifugó REFERENCIAS
durante 10 min a 2000 × g y el sedimento se suspendió en una mezcla de
nutrientes F-12 suplementada con 100 mL/L de suero de caballo, 100 mL /L de
suero bovino fetal, NaHCO3 (14 mM) y factor de crecimiento nervioso (15 × 10ÿ6 Alcayaga J, Arroyo J, Font MI, Gutierrez OC 1996. El ganglio petroso del gato
g/L). Las células se sembraron en placas de Petri de 35 mm previamente adulto: conteo neuronal, área seccional y sus respectivas distribuciones. Biol.
recubiertas con poli-L-lisina (0,1 g/l) y se mantuvieron a 38 °C en una atmósfera Res. 29, 189-195.
de aire al 5% de CO2 saturada con agua . El medio de cultivo se cambió cada dos Alcayaga J, Iturriaga R, Varas R, Arroyo J, Zapata P, 1998.
días después de un retraso inicial de 3 días durante el cual los cultivos no se Activación selectiva de fibras nerviosas carotídeas por acetilcolina aplicada
perturbaron. El protocolo fue aprobado por los Comités de Ética de la Facultad de al ganglio petroso del gato in vitro. Cerebro Res. 786, 47-54.
Ciencias de la Universidad de Chile y de la Facultad de Ciencias Biológicas de la
P. Universidad Católica de Chile y cumple con los lineamientos del Fondo Nacional
Anichkov, SV, Belen'kii, ML, 1963. Farmacología de los quimiorreceptores del
de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (FONDECYT), Chile . cuerpo carotídeo. Macmillian, Nueva York.
Berger, AJ, 1980. La distribución de los cuerpos celulares aferentes y eferentes
del nervio del seno carotídeo del gato utilizando la técnica de peroxidasa de
rábano picante. Cerebro Res. 190, 309-320.
Los cultivos fueron colocados en la platina de un microscopio invertido con Claps A, Torrealba F 1988. La conexión del cuerpo carotideo: un estudio WGA
contraste de fase y superfundidos (flujo 1.2 mL/min) a temperatura ambiente con HRP en el gato. Cerebro Res. 455, 123-133.
solución de Hanks (en mM: NaCl 137, CaCl2 1.3, MgSO4 0.8, KCl 5.4, KH2PO4 Fenster CP, Rains MF, Noerager B, Quick MW, Lester RAJ, 1997. Influencia de
0.4, Na2HPO4 0,3, D-glucosa 5,6, HEPES 5 y NaHCO3 4) a pH 7,43 equilibrado la composición de las subunidades en la desensibilización de los receptores
con aire ambiente. neuronales de acetilcolina a bajas concentraciones de nicotina. J. Neurosci.
Los registros se realizaron con un amplificador de pinza de parche (PC 501-A; 17, 5747-5759.
Warner Instrument Corp., EE. UU.) y electrodos de vidrio de borosilicato de 1,5 Fitzgerald RS, Shirahata M, Wang HY, 1999. Liberación de acetilcolina del
mm de diámetro exterior (1–2 Mÿ) llenos de una solución intracelular (en mM: KCl cuerpo carotídeo del gato. Cerebro Res. 841, 53-61.
135, NaCl 5, CaCl2 1, EGTA 10, HEPES 10, pH 7,2). La formación del sello y el Flores CM, Rogers SW, Pabreza LA, Wolfe BB, Kellar KJ, 1992. Un subtipo de
avance de la membrana, de neuronas de 25 a 65 ÿm de diámetro, se llevó a cabo receptor colinérgico nicotínico en el cerebro de rata está compuesto por
en el modo de abrazadera de corriente y se controló observando la respuesta a subunidades alfa 4 y beta 2 y está regulado por el tratamiento crónico con
un paso de corriente despolarizante de 2 a 10 pA que duró 50 ms. nicotina. Mol. Pharmacol. 41,
31-37.
Las corrientes evocadas por ACh, citisina, 3-Br-Cy y 5-Br-Cy se registraron en Genzen, JR, Van Cleve, W, McGehee, DS, 2001. Raíz dorsal
el modo de sujeción de voltaje de celda completa a un potencial de retención (Vh) Las neuronas ganglionares expresan múltiples subtipos de receptores
de ÿ60 mV. Se corrigió el potencial de unión líquida entre los microelectrodos y la nicotínicos de acetilcolina. J. Neurofisiol. 86, 1773-1782.
solución del baño, y se compensaron electrónicamente la resistencia en serie y Gotti C, Fornasari D, Clementi F 1997. Receptores nicotínicos neuronales
los transitorios capacitivos. Todos los agonistas se aplicaron durante 5 a 10 s por humanos. Prog. Neurobiol. 53, 199-237.
superfusión bajo el flujo de gravedad de una pipeta cuya punta estaba ubicada a Hirasawa S, Mendoza JA, Kobayashi C, Jacoby DB,
aproximadamente 100 a 200 ÿm de la superficie de la neurona. Se aplicaron Chanrasagaran S, Fitzgerald RS, Shirahata M 2002. Diversa expresión y
hexametonio (1 ÿM) y ÿ bungarotoxina (10 nM), en solución de Hanks, durante 3 localización del gen del receptor colinérgico en el cuerpo carotídeo del gato y
min a través de una pipeta de superfusión. el ganglio petroso. Adv. Exp. Med. Biol. 536, 313-319.

Hogg RC, Raggenbass M, Bertrand D 2003. Nicotínico

4.1. Purificación de citisina y sus análogos Receptores de acetilcolina: de la estructura a la función cerebral. Rvdo
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La citisina se purificó a partir de semillas de Sophora secundiflora usando Holladay, MW, Dart, MJ, Lynch, JK, 1997. Receptores nicotínicos neuronales
metodología estándar. Se obtuvieron 3-Br-cy y 5-Br-cy tratando la citisina con algo como objetivos para el descubrimiento de fármacos. J. Med. Chem. 40,
más de 1 M equivalente de bromo en ácido acético. Los isómeros bromados se 4169-4194.
separaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice, se cristalizaron para Houlihan LM, Slater Y, Guerra DL, Peng J-H, Kuo Y-P, Lukas RJ, Cassels BK,
homogear H y 13C NMR. Bermúdez I, 2001. Actividad de citisina y sus isósteros bromados en ÿ7 ÿ4ÿ2
1
Neidad y caracterizada por y humanos recombinantes
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78 INVESTIGACIÓN DEL CEREBRO 1072 (2006) 72 – 7 8

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