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Etapas de La Micropropagacion
Etapas de La Micropropagacion
Etapas de La Micropropagacion
Recomendaciones:
• Realizar riego frecuente, según la especie
y nunca regar sobre las plantas, esto con
el propósito de evitar la proliferación de
agentes patógenos como hongos, virus o
bacterias.
• Aplicación de medidas fitosanitarias como
uso de fungicidas, bactericidas entre otros
productos que prevengan daños por
agentes externos al vigor de la planta.
• Fertilización aplicar los fertilizantes adecuados en la dosis correcta para mantener
las plantas en el mejor estado posible, así mismo tener el crecimiento más rápido
posible de los órganos donadores, además de mantener plantas fuertes y
resistentes a enfermedades manteniendo el adecuado estado fisiológico de las
plantas.
• Realizar tratamientos de revigorización en las plantas para promover la juvenilidad
y acelerar el crecimiento de los órganos donadores del explante.
fase I establecimiento de los cultivos
el principal objetivo durante esta etapa es establecer cultivos viables y axénicos. El éxito
este arraigado a la calidad del explante que será usado. Los principales procesos a
controlar durante esta etapa son la selección, el aislamiento y la esterilización de los
explantes. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los
obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, ya sean yemas axilares o adventicias,
embriones o semillas en plantas herbáceas y aquellos tejidos meristemáticos que
determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leñosas. En este
sentido, es importante señalar que el empleo de yemas adventicias (también llamadas
yemas formadas de novo) está asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de
variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagación basados en la
regeneración a partir de yemas axilares o embriones somáticos. La obtención de cultivos
axénicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos preventivos como curativos.
Una acción preventiva la constituye el empleo de métodos de verificación de patógenos
en los explantes. Esto puede realizarse mediante análisis específicos para las
enfermedades del cultivo, tales como DASELISA o PCR, análisis generales para
patógenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de
bacterias y hongos y métodos específicos para la detección e identificación de patógenos
intracelulares como virus, viroides y bacterias. La realización de estos análisis
directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos ventajas.
En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los síntomas más
marcados de la enfermedad, en segundo lugar, la carga de patógenos es mayor y por lo
tanto la precisión del sistema de detección aumenta. Por otro lado, las plantas enfermas
pueden tratarse con técnicas adecuadas para la eliminación de patógenos como la
termoterapia, la quimioterapia a través de la aplicación de antibióticos, desinfectantes,
antivirales y el cultivo de meristemas. La desinfección superficial incluye varios pasos: el
lavado de los explantes con agua corriente, el empleo de etanol al 70% por 1 minuto,
seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo)
con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetración y actividad.
Posteriormente, los explantes deben ser enjuagados al menos tres veces con agua
destilada estéril. Algunos patógenos permanecen latentes y se expresan cuando son
transferidos a un medio de cultivo nuevo. En general, estos patógenos incluyen los
patógenos superficiales del material vegetal, los patógenos endógenos y los patógenos
propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1 también pueden observarse infecciones
por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de
esterilización y por patógenos endógenos latentes dentro del sistema vascular, resultado
de una esterilización inefectiva de los explantes. Estos patógenos latentes podrían
manejarse mediante el empleo de bacteriostáticos o antibióticos en el medio de cultivo.
Desinfección
• Lavado del material con agua corriente, eliminación de las partes muertas e
infectadas de la planta. Introducción de la porción de planta en alcohol diluido al
80% durante unos segundos.
• Sumergir la planta en una solución de hipoclorito de sodio o Ca con un agente
humectante durante 10-30 minutos.
• Enjuague del material con agua estéril para eliminar la solución de hipoclorito de
sodio. El enjuague debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, y suele
realizarse en tres veces sucesivas de unos 2 minutos cada una.
Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal:
• Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
• Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min.
• Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).
Contaminante
Cualquier microorganismo introducido accidentalmente en un cultivo o en un medio
de cultivo, el contaminante puede competir con las células que se cultivan, inhibir su
crecimiento o reemplazarlas por completo.
Principales causas de contaminación
Esterilización superficial inadecuada
Manipulación fallas en los procedimientos en laboratorio
Géneros de hongos más frecuentes:
• Aspergillus
• Candida
• Cladosporium
• Microsporium
Géneros de bacterias más frecuentes:
• Agrobacterium
• Bacillus
• Enterobacter
• Pseudomonas
• Lactobacillus
uso de fungicidas y antibióticos: en la planta madre, en el explante
en el medio de cultivo No se recomienda la adición de antibióticos al medio para
controlar la contaminación bacteriana porque no son efectivos en la mayoría de los
casos, aunque algunos autores señalan que su adición es necesaria cuando el
tejido tiene infecciones sistémicas / endógenas.
Oxidación fenólica Aspecto común que presentan los tejidos vegetales como
resultado de una herida. La oxidación por compuestos fenólicos suele manifestarse
por un oscurecimiento del tejido y generalmente precede a la inhibición del
crecimiento y, en los casos graves, a la necrosis y muerte del tejido.
Durante las primeras semanas de aclimatación, se debe evitar una excesiva pérdida de
agua por transpiración, bien colocando sobre cada plántula un frasco de cristal invertido,
o cultivándolas dentro de mini-invernaderos, túneles de plástico, o en invernaderos con
sistema de niebla.
Las plantas obtenidas mediante multiplicación in vitro difieren anatómica y
fisiológicamente de las plantas cultivadas en el campo o invernadero. Las condiciones
peculiares del cultivo in vitro sobre determinadas características de las plantas, que
posteriomente afectarán a su adaptación a condiciones ex vitro, son:
▪ Alta humedad relativa: las plantas poseen una cutícula poco desarrollada y
estomas no totalmente funcionales.
▪ Aportación de hidratos de carbono: las plantas tienen un metabolismo heterótrofo
y capacidad fotosintética reducida.
▪ Enraizamiento en el medio de cultivo: las raíces no desarrollan pelos absorbentes.
▪ Desarrollo en condiciones asépticas: las plantas carecen de asociaciones
simbióticas (p.e. micorrizas) y son poco resistentes al ataque de microorganismos.
▪
Algunos de estos problemas, como la escasez de pelos radicales, pueden paliarse en
ocasiones utilizando medios líquidos. La reducción de la concentración de agar y/o de
sales en el medio de cultivo puede favorecer también el enraizamiento y posterior
aclimatación a tierra de las plántulas. La transferencia a condiciones de cultivo ex
vitro debe ser, por lo tanto, gradual y habrá que adoptar siempre una serie de
precauciones destinadas principalmente a evitar la deshidratación de las plantas y a que
contraigan cualquier tipo de infección.
Recomendaciones
• Inducir correctamente la creación de una planta autótrofa que sea capaz de
sobrevivir por si misma.
• Realizar una esterilización adecuada de los sustratos a utilizar para prevenir la
aparición de hongos
• Uso optimo de luz y humedad en las plantas para evitar problema en su
desarrollo.
Bibliografía
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Plant propagation by tissue culture, 3rd edition.
Gisbert, C. (2011).Establecimiento de cultivos in vitro a partir de semillas o de material
de campo. Polimedia ETSIAMN.
Miguel C, Marum L. (2011). An epigenetic view of plant cells cultured in vitro:
somaclonal variation and beyond. Journal of Experimental Botany.
Roca, W.M., D.I. Arias y R. Chávez. 1991. Métodos de conservación in vitro de
germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura.