ESPECTROSCOPÍA

Se llama espectroscopía a la medición e interpretación de la radiación electro magnética absorbida,

dispersada o emitida por átomos, moléculas u otras especies químicas. Esta interacción entre la materia y
la energía es estudiada para obtener información de las muestras ya que esos fenómenos están asociados
con cambios en los estados de energía de las diferentes especies y son diferentes de acuerdo a su
estructura y a su concentración.
Es decir, que se puede obtener información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición de una
muestra.

La muestra con sus analitos en estado fundamental, se estimula o excita con alguna forma de energía,
pasando entonces los analitos a un estado excitado, tomando esa energía incidente.
Entonces, disponiendo de los instrumentos adecuados podemos analizar la energía que emite al volver al
estado fundamental (espectroscopías de emisión) o se puede medir la energía absorbida (espectroscopía
de absorción), en función de la longitud de onda y generar los espectros de emisión o absorción según
corresponda.

Históricamente el término espectrometría designaba a la rama de la ciencia que estudiaba la resolución de

la luz (o sea la radiación visible) en las longitudes de onda que la componen, es decir el estudio de
espectros.
Con el tiempo el término se amplió al estudio no sólo de la luz, sino también otro tipo de radiación
electromagnética, como ser rayos X, radiación ultravioleta, infrarrojo, microondas y radiofrecuencias, y
aún aquellas que no corresponden a radiaciones electromagnéticas, como ser espectroscopía acústica,
masas o electrónica.

Podemos clasificar los métodos espectrométricos según:

1. la naturaleza de la excitación medida
El tipo de espectrometría depende de la cantidad física medida. Normalmente, la cantidad que se
mide es una intensidad de energía absorbida o producida. Se pueden distinguir estos tipos de
espectrometría según la naturaleza de la excitación:

* Electromagnética. Interacciones de la materia con radiación electromagnética como la luz.

* De electrones. Interacciones con haces de electrones. En este caso la medida implica la energía cinética
del electrón como variable
* De masa. Interacción de especies cargadas con campos magnéticos y/o eléctricos, dando lugar a un
espectro de masas. El término "espectroscopia de masas" está anticuado, ya que la técnica es
principalmente una forma de medida, aunque produzca realmente un espectro para la observación. Este
espectro tiene la masa (m) como variable, pero la medida es esencialmente la correspondiente a la energía
cinética de la partícula.
* Acústica. Generado por la aplicación de frecuencia de sonido.
* Dieléctrica. Generado por la frecuencia de un campo eléctrico aplicado en forma externa.
* Mecánica. Frecuencia de un estrés mecánico externo, por ejemplo una torsión aplicada a un trozo de
material.

2. Según el proceso de medida

La mayoría de los métodos espectroscópicos se diferencian en atómicos o moleculares según si se
aplican a átomos o moléculas. Junto con esta diferencia, se pueden distinguir los siguientes tipos de
espectrometría según la naturaleza de su interacción:
* De absorción. Usa el rango de los espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia absorbe.
Incluye la espectrometría de absorción atómica y varias técnicas moleculares, como la espectrometría
infrarroja y la resonancia magnética nuclear (RMN).
* De emisión. Usa el rango de espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia irradia (emite). La
sustancia primero debe absorber la energía. Esta energía puede ser de una variedad de fuentes, que
determina el nombre de la emisión subsiguiente, como la luminiscencia. Las técnicas de luminiscencia
moleculares incluyen la fluorescencia.

¿Pero que es una radiación electromagnética?

La luz, o la radiación electromagnética puede ser descripta como una onda caracterizada por
perturbaciones eléctricas y magnéticas en ángulos rectos con la dirección de propagación. Para los fines de
nuestro estudio, sólo consideramos la componente eléctrica.
La figura es una representación tridimensional de una radiación monocromática (es decir, de una única
longitud de onda, polarizada en el plano ( es decir que las oscilaciones tienen lugar en un solo plano)

La frecuencia υ es directamente proporcional a la Energía:

E= hυ
Donde h es la constante de Planck, 6,625 x 10-27erg.seg/molécula
La longitud de onda λ, ( la distancia lineal entre dos máximos o mínimos sucesivos de una onda ) la velocidad v y υ
están relacionadas por:
v= υλ
En el vacío, la velocidad de propagación de una onda es independiente de la longitud de onda, y alcanza un valor
máximo (2,99792 x 1010 cm/seg ) mientras que en el aire sólo difiere mínimamente, por lo que para los fines
prácticos se toma el valor de 3 x 1010 cm/seg.
Cuando la radiación pasa a través de un cuerpo que contiene materia, la velocidad de propagación disminuye ya que
interactúa con los electrones o moléculas del medio y dado que la frecuencia se mantiene constante porque sólo
depende de la fuente, la longitud de onda dela radiación debe disminuir.

ESPECTROMETRIA DE ABSORCION
La absorción es un proceso mediante el cual una especie química situada en un medio transparente atenúa
selectivamente ciertas frecuencias de radiación electromagnética.
Según la teoría cuántica, cada partícula elemental tiene un conjunto irrepetible de estados de energía, de los
cuales el de mínima energía, es el estado fundamental. (a temperatura ambiente, la mayoría de las
partículas elementales, se encuentran en ese estado).
Cuando un fotón de radiación incide sobre una partícula elemental, es probable que se absorba si y sólo sí, la
energía del fotón corresponde exactamente a algunos de los desniveles de energía entre el estado
fundamental y alguno de los estados superiores de energía de esa partícula. En esas condiciones, la energía
del fotón se transfiere a la partícula, que pasa a un estado de mayor energía, llamado estado excitado.
M + hυ M*
Después de un corto período de tiempo la especie excitada, se relaja a su estado inicial, transfiriendo su
exceso de energía a otras partículas del medio( relajación no radiante ).
M* M + calor

La espectrometría de absorción se refiere a una variedad de técnicas que emplean la interacción de la

radiación electromagnética con la materia. En la espectrometría de absorción, se compara la intensidad de un
haz de luz medida antes y después de la interacción con una muestra. Las palabras transmisión y remisión se
refieren a la dirección de viaje de los haces de luz medidos antes y después de la absorción. Las
descripciones experimentales por lo general asumen que hay una única dirección de incidencia de la luz
sobre la muestra, y que un plano perpendicular a esta dirección pasa por la muestra. En la transmisión, la luz
es dispersada desde la muestra hacia un detector en el lado opuesto de la muestra. En la remisión, la luz es
dispersada desde la muestra hacia un detector en el mismo lado de la muestra. La radiación remitida puede
estar formada por dos clases de radiación: reflexión especular (cuando el ángulo de reflexión es igual al
ángulo del frecuencia) y reflexión difusa (en todos los demás ángulos).

Otro descriptor asociado con la espectrometría de absorción es la variedad de longitudes de onda de

radiación que se usa en el haz de luz incidente. Por ejemplo, se habla de espectrometría infrarroja o de
microondas, que son a su vez ejemplos de espectrometría de absorción. También se encuentran referencias a
otros rangos de longitud de onda, como la espectrometría de rayos X, que por lo general denotan una
espectrometría de emisión.

La espectrometría UV-visible se refiere a técnicas donde se mide cuánta luz de una longitud de onda
particular (color) es absorbida por una muestra. El color a menudo puede correlacionarse con la presencia
y/o la estructura de una sustancia química particular, y ya que la absorbancia es una medida fácil y barata de
hacer, la espectrometría de absorbancia se usa ampliamente en cálculos cuali-cuantitativos y estructurales.
Por ejemplo, el ADN absorbe luz en el rango ultravioleta (por eso la luz del sol es peligrosa), y por tanto la
cantidad de ADN en una muestra puede ser determinarse midiendo la absorbancia de la luz ultravioleta.

La relación entre el color visible y el color de absorbancia es complicada; una muestra que parece roja no
absorbe en el rojo, sino que absorbe en otras longitudes de onda (colores) de modo que la luz que pasa por la
muestra se enriquece en rojo.

La palabra "color" se usa para indicar que la espectrometría de absorbancia no sólo trata con la luz en rango
visible (fotones con una longitud de onda de aproximadamente 400 a 700 nanómetros), sino también con
longitudes de onda que están fuera del rango de la visión humana (infrarrojo, ultravioleta, rayos X). Sin
embargo, los principios son bastante similares tanto para la luz visible como para la no visible.

LEY DE BEER LAMBERT

b
Cuando consideramos la
intensidad de la radiación
Io I
que incide sobre una cuba P2 P3
de vidrio de longitud b, P1
que contiene sólo un solvente, P4
una cierta proporción de la
misma se reflejará al incidir
en la cara P1 (aunque sea pequeña). En el trayecto en el vidrio (P1..P2) puede haber una cierta absorción
debido a la transparencia de la cuba, así como absorción por solvente en el trayecto P2..P3, repitiéndose la
absorción entre P3 y P4 al atravesar la pared posterior de la cuba.
Por lo tanto, denominamos Transmitancia al cociente entre la relación de energía emergente y de energía
incidente:
T = I / Io
Y Absorbancia, a la siguiente relación

A = log Io/I = -log Io/I = -log T

Esa absorbancia es proporcional a la concentración del analito en estudio, a la longitud del camino óptico y a
una constante de proporcionalidad, característica de cada sustancia, llamada absortividad.

Por lo tanto, A = a b(longitud del camino óptico ) c

Donde a es la absortividad expresada en litro/(cm x g) con la concentración expresada en g/l y si
multiplicamos y dividimos por el PM del analito nos queda
 A= a PM b (c/PM) donde c/PM es la concentración en moles /l. y donde (a

ᵋ
PM) = la absortividad molar, o sea la absorbancia de un mol de analito.

APLICACIÓN DE LA LEY DE BEER A MEZCLAS

La absorbancia total es la suma de las absorbancias individuales de cada analito presente en la muestra. Es
decir,
A total= A1 + A2+ ….+ An= b ( Ԑ1c1 + Ԑ2 c2 + …. + Ԑncn )

Supongamosque pudiéramos realizar la absorbancia de las soluciones puras X e Y

Tendriamos para la solución X que
Io Ix
-Ax
10 = Ix/Io

Análogamente para la solución Y sería

10-Ay = Iy/Io
Y en una mezcla

Io Ix Iy

Iy/Ix = 10-Aypero Ix es 10-AxIo luego Iy/Io = 10-Ay 10-Ax = 10-(Ay+Ax)

El resultado es el mismo si hacemos primero Iy y luego Ix.

La forma práctica de realizar la medición es la siguiente:
1) Se realizan mediciones de una solución conocida de cada analito en forma independiente, a
diferentes longitudes de onda para construir un espectro de A vs λ (cabe señalar que con el
mismo camino óptico) A es directamente proporcional a Ԑ (ya que la concentración es conocida),
por lo cual nos queda también un gráfico Ԑ vs λ.
2) Se eligen del gráfico, dos longitudes apropiadas (en las cuales la A de x e y, serán muy diferentes
entre sí, o lo que es lo mismo las absortividades molares de cada analito son diferentes) y se mide
la absorbancia de la muestra desconocida (que tiene a x e y) a cada longitud de onda elegida.
3) Luego tendremos A1 y A2 medidas a las dos longitudes de onda elegidas.
4) Finalmente podemos expresar las absorbancias como

A1= Ԑx1Cx + Ԑy1Cy

A2= Ԑx2Cx + Ԑy2Cy
Donde Ԑx1…… Ԑy2 son las absortividades molares de X e Y a λ1y λ2
Todos los valores se conocen salvo los de Cx y Cy, por lo cual tenemos dos ecuaciones con dos incógnitas,
resolubles.

El éxito del método depende de la elección de λ1y λ2de forma tal que la especieX tenga una gran
absortividad molar al mismo tiempo que la especie Y tenga una muy pequeña en λ1y al revés en λ2.

Independientemente de ello, en el gráficoԐ vs λ, los espectros se cruzarán quizás más de una vez. Esos
puntos donde las absortividades molares de cada analito son iguales a esas longitudes de onda, se denominan
puntos isosbésticos, que debemos evitar trabajar en ellos.
LIMITACIONES A LA APLICACIÓN DE LA LEY DE BEER.
Podemos clasificarlas en:
a) Limitaciones reales
La ley de Beer es aplicable sólo a soluciones diluidas (menores a 0,01 M), ya que, a concentraciones
altas, las distancias medias de las partículas absorbentes disminuyen hasta un punto en que cada partícula
afecta la distribución de cargas de sus vecinas, y dado que el grado de interacción depende de la
concentración, la existencia de esta fenómeno causa desviaciones de la relación lineal entre
concentración y absorbancia.
Además como el Ԑ depende del índice de refracción y éste a su vez de la concentración, no es cierto que
Ԑ permanezca constante para cualquier concentración de analito.

b) Limitaciones instrumentales
La ley de Beer debe ser efectuada con radiación monocromática, y esta es muy difícil de lograr, dado
que aún con los mejores monocromadores en los equipos de análisis rutinario, se obtiene una banda de
radiación.
Si en el ancho de banda provisto por el equipo, logramos abarcar un ancho espectral en el cual no haya
demasiada variación en la absorbancia en función de la longitud de onda, la desviación en la ley será
menospreciable.

c) Limitaciones químicas
Se pueden encontrar desviaciones químicas cuando el analito presenta asociación, disociación o reacción
con el solvente para dar productos de absorción diferentes de los del propio analito.

Resumiendo,

Reales Concentración alta

Radiación no monocromática
Instrumentales Radiación parásita
Errores de Lectura
Dimerizaciones
DESVIACIONES Influencia del equilibrio Ácido base
Complejos
Químicas
Influencia de la Temperatura
Influencia del Solvente
Impurezas de los reactivos
Personales Falta de capacitación

INSTRUMENTACIÓN PARA ESPECTROSCOPIA

Los instrumentos utilizados para el estudio de la absorción o emisión de la radiación electromagnética como
función de la longitud de onda, son llamados Espectrómetros o más frecuentemente Espectrofotómetros. Los
principios ópticos y electrónica empleados en los instrumentos son los mismos para espectroscopía UV,
Visible o IR, sin embargo, hay ligeras diferencias en componentes específicos del instrumento para cada
región del espectro electromagnético.
Los componentes esenciales de un espectrofotómetro son:
1. Una fuente estable de energía radiante
2. Un sistema de lentes, espejos y aberturas (Slits), que definan, colimen (hagan paralelo) y enfoquen el haz
de radiación y un monocromador que separe la radiación de bandas estrechas de longitud de onda.
3. Un componente transparente a la radiación que contenga la muestra
4. Un detector de radiación o transductor que recibe la señal de radiación electromagnética y la convierte en
una señal eléctrica de magnitud proporcional a la intensidad de la radiación recibida.
5. Un sistema amplificador que produzca o genere una señal eléctrica mucho mayor a la señal recibida
6. Un sistema de lectura tal como: Una escala de aguja, un registrador, un sistema de dígitos o una
computadora, que transforme la señal eléctrica en una señal que el operador pueda interpretar.
7. El diagrama de estos componentes es el siguiente:
FUENTES DE RADIACION: Estas consisten de materiales que son excitados a niveles de mayor energía,
por medio de descargas eléctricas de alto voltaje o por calentamiento.
Cuando los electrones del material regresan del estado excitado al estado basal, emiten energías
características correspondientes a E, la diferencia en energía entre el estado basal y el estado excitado.
Una fuente de radiación ideal, sería aquella que emitiese un espectro de igual intensidad sobre la región de
interés, sin embargo la intensidad de ésta varía con la longitud de onda.
Sí el voltaje que suministra energía eléctrica a la fuente varía, la intensidad en la relación emitida por ésta
fuente también se altera, y esto afecta las lecturas las cuales son efectuadas a intervalos.
En instrumentos de doble haz la radiación que emerge de la fuente es dividido en dos:
El haz de referencia y el haz de muestra. El transductor, el cual recibe las dos señales compensa por los
efectos de variación de voltaje o de intensidad en la fuente misma cancelando de ésta manera los efectos
inherentes a la misma.
Las fuentes de radiación utilizadas en espectroscopía son continuas o de líneas. Las primeras tienen amplio
campo de aplicación en métodos espectroscópicos basados en absorción molecular. Las fuentes de línea son
empleadas en espectroscopia de absorción atómica.
FUENTES DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA: Las lámparas de hidrógeno y deuterio son las fuentes más
comunes de radiación UV. Estas consisten de un par de electrodos en un tubo de vidrio con ventanas de
cuarzo, y que además contiene hidrógeno o deuterio gaseoso. Cuando se aplica un alto voltaje a los
electrodos, ocurre una descarga de electrones, lo cual excita las moléculas de gas y éstas pasan a niveles
energéticos superiores. Cuando los electrones de los átomos del gas regresan a su estado basal emiten
radiación, la cual es continua en el rango de 180 a 350 nm.
FUENTES DE RADIACIÓN VISIBLE: La lámpara de tungsteno es la fuente más barata y más satisfactoria
en espectroscopia visible e infrarroja. El filamento de tungsteno es calentado por medio de una fuente de
corriente directa o por una batería. Los filamentos de tungsteno, los cuales alcanzan una temperatura de
aproximadamente 2900ºC, emiten radiación continua de 350 a 2500 nm.
FUENTES DE RADIACIÓN INFRARROJA: El Globar y la lámpara de Nernst son las fuentes primarias de
radiación infrarroja. El Globar es una barra de carburo de silicio que se calienta aproximadamente a 1200ºC.
Este emite radiación en el rango de 1 a 40 µm y es muy estable. La lámpara de Nernst es una barra hueca de
óxidos de itrio y de zirconio calentados aproximadamente a 1500ºC. Esta lámpara emite radiación continua
entre 0.4 y 20 µm y no es tan estable como el Globar, pero éste último requiere de enfriamiento con agua.

MONOCROMADORES
Como se indicó anteriormente, las fuentes de radiación emiten en forma continua sobre un determinado
rango de longitudes de onda. El uso de bandas angostas de longitudes de onda de radiación tienen las
siguientes ventajas:
a) La radiación en bandas angostas permite la resolución de bandas de absorción que son muy cercanas entre
sí.
b) Con bandas angostas un pico puede ser medido a su máximo de absorción incrementando así la
sensibilidad.
c) Las bandas angostas de absorción tienden a seguir mejor la Ley de Beer.
Con la finalidad de resolver el haz policromático en bandas angostas de longitudes de onda se emplean
filtros y monocromadores.
FILTROS.
Los filtros y monocromadores son utilizados para obtener radiación de un rango angosto de longitudes de
onda (radiación casi monocromática).
Los filtros son materiales de un vidrio especial, el cual contiene sustancias que le dan color al vidrio y que
absorben una parte de la radiación y transmiten otra. Estos filtros transmiten radiación en anchos de bandas
de 20 a 50 nm aproximadamente.

MONOCROMADORES.
Los monocromadores tienen capacidad de resolución de ancho de banda 35 a 0.1 nm.
Los componentes de un monocromador son:
1. Una abertura que permita el paso de la radiación policromática de la fuente.
2. Un colimador que puede ser una lente o un espejo.
3. Un medio de dispersión que puede ser un prisma o una rejilla.
4. Lentes de enfoque o espejos.
5. Una abertura de salida.
Todos los monocromadores tienen: una abertura de entrada; unos lentes colimadores o un juego de espejos
para producir un haz paralelo de radiación; un prisma o rejilla como elemento de dispersión y un elemento
de enfoque, el cual proyecta una serie de imágenes sobre una superficie plana (el plano focal).
Adicionalmente, la mayoría de los monocromadores tienen ventanas en las aberturas de entrada y salida para
proteger los componentes del monocromador del polvo y los humos corrosivos que puedan existir en el
ambiente.
En la Figura 2 se muestra el diseño óptico de dos monocromadores típicos, uno empleado como medio de
dispersión de la radiación de un prisma y el otro una rejilla de dispersión.
Con propósitos de ilustración se muestra una fuente de radiación que solo emite dos o tres longitudes de
onda λ1>λ2>λ3. La radiación llega al monocromador a través de una abertura rectangular (slit de entrada), es
colimada y posteriormente incide con un cierto ángulo sobre la superficie del elemento dispersor (prisma o
rejilla). En el prisma la refracción en las dos caras de éste, genera la dispersión angular de la radiación. En la
rejilla la dispersión ocurre como consecuencia del fenómeno de difracción.
En ambos casos, la radiación ya dispersada se enfoca sobre el slit de salida, pero únicamente sale del
monocromador radiación de longitud de onda λ1. De ésta manera, de la radiación policromática generada por
la fuente, solamente una porción de ésta incidirá sobre la muestra.
Sería deseable tener un ancho de banda sumamente pequeño (y un monocromador puede hacerlo), sin
embargo, mientras menor sea el ancho de banda menor será la cantidad de fotones que lleguen al detector y
consecuentemente la sensibilidad del instrumento se ve disminuida. El ancho de banda se puede seleccionar
con la abertura (slitwidth) y esto generalmente se hace en forma empírica.

FiguraDos tipos de monocromadores. (a) Monocromador de prisma tipo Bunsen. (b)

Monocromador de rejilla tipo Czerney-Turner. λ1>λ2.
PRISMAS.
El prisma, tal y como se ha mencionado con anterioridad separa la radiación policromática en bandas
angostas y a diferentes ángulos. Para dirigir la radiación de longitud de onda seleccionada a la abertura de
salida (slit) se hace girar el prisma por medio de un mecanismo acoplado para este fin.
Para una alta resolución de la radiación prolicromática (buena separación angular de la radiación de
diferentes longitudes de onda), se requiere que la dispersión sea lo mayor posible. La dispersión se defina
como la variación en ángulo de dispersión con respecto a la variación en longitud de onda. Esta es la mayor
desventaja de un prisma; la dispersión en un prisma es mayor para longitudes de onda cercanas a sus bandas
de absorción, y como la mayoría de los primas absorbe radiación UV, la dispersión se incrementa para
longitudes de onda cortas. Por ejemplo el prisma de cuarzo exhibe excelente dispersión a longitudes de onda
cercanas a 200 nm, sin embargo la dispersión y la resolución es baja en la vecindad de los 700 nm. En forma
general, mientras menor sea la longitud de onda que incide en el prisma mayor es su resolución.
En términos de resolución, el prisma es más efectivo a longitudes de onda cercanas a su banda de absorción,
sin embargo bajo estas circunstancias la energía transmitida por el prisma se ve disminuida, y los
requerimientos del detector pueden no satisfacerse, siendo necesaria incrementar la abertura de la ventana
del monocromador (slit) y se pierde resolución en el análisis.
Todo lo anterior sirve para hacer comprender el equilibrio que debe existir entre el prisma y los demás
componentes del espectrofotómetro.

MATERIALES DEL PRISMA.

El material del que está hecho el prisma debe ser trasparente a la radiación utilizada y un excelente medio
dispersor.
Para el UV pueden ser utilizados prismas de sílice o de cuarzo. Para el Visible e Infrarrojo cercano, el vidrio
ordinario con plomo muestra buenas cualidades. Para el Infrarrojo se utilizan sólidos iónicos cristalinos,
siendo uno de los más utilizados el Cloruro de Sodio.
REJILLAS.
Las rejillas como medio de dispersión de la luz son muy superiores a los prismas. Hasta hace poco años una
de las desventajas de este tipo de dispersor era su costo. Actualmente se ha desarrollado la tecnología para la
elaboración de rejillas de difracción en grandes cantidades y con aceptable calidad, lo cual ha traído como
consecuencia un menor precio y un desplazamiento casi total a la utilización de rejillas de difracción como
elementos de resolución de haces policromáticos.
Una de las desventajas de las rejillas dispersoras es la producción de radiación extraña, así como de
espectros de segundo y tercer orden, pero estos efectos pueden ser minimizados con el uso de filtros y una
adecuado diseño del instrumento.
En los instrumentos más modernos y de mejor calidad la rejilla de difracción han sustituido casi por
completo el uso de los prismas como monocromadores.
LENTES Y ESPEJOS.
La radiación es colimada y enfocada por lentes y espejos. El material de los lentes debe ser por supuesto
trasparente a la radiación utilizada.
En el Infrarrojo se utilizan espejos, ya que la mayoría de los materiales no son suficientemente trasparentes a
la radiación Infrarroja y causan significantes pérdidas de energía. También en espectroscopía Visible y UV
se emplean con frecuencia los espejos como elementos o partes del monocromador.
SELECCIÓN DE LONGITUD DE ONDA
Para seleccionar la longitud de onda a la cual trabajaremos, debemos seleccionar una concentración tal que
tengamos un desarrollo de color apreciable en forma visual, y tratando que sea la menor concentración
posible. De esa manera nos aseguraremos que se cumpla la ley de Beer.
A partir de esa muestra realizaremos mediciones de la misma a distintas longitudes de onda, variando la
misma en incrementos de 20 nm, comenzando en 200 nm y final en 700 nm.
Con los resultados obtenidos, graficaremos la absorbancia en función de la longitud de onda, obteniéndose
un gráfico de forma similar al precedente. El valor de λ que tenga la mayor absorbancia, será el λ al cual
trabajaremos.

MUESTRA
RECIPIENTES DE MUESTRA.
Las muestras para espectroscopia UV, Visible o IR pueden ser líquidas o gaseosas. Para UV es necesario
utilizar celdas de cuarzo, ya que el vidrio absorbe radiación UV; para Visible pueden utilizarse cuarzo o
vidrio común.
Las celdas en UV y Visible pueden ser cilíndricas o cuadradas, y se prefieren éstas últimas por tener mejor
óptica. Las celdas deben de estar marcadas para que el paso del haz de radiación sea siempre en el mismo
lugar de la celda y de ésta manera compensar por imperfecciones ópticas en las paredes de la celda.
SOLVENTES.
El solvente de la muestra, la cual es responsable de la absorción de la radiación, debe disolver
completamente la especie y ser trasparente a la región que se está estudiando.
En espectroscopia de flama el recipiente de muestra se puede considerar la flama misma, la cual además de
proporcionar la energía necesaria para la atomización de los elementos tiene la función de sustentar
momentáneamente los átomos formados.
El solvente en una flama son los gases ahí producidos y que simultáneamente aparecen con la especie
absorbente.
SISTEMAS DE DETECCIÓN
Los detectores modernos general una señal como resultado de los fotones que llegan y chocan con él. Esta
señal activa una aguja, envía una señal digital a un microprocesador y/o activa un graficador.
El ruido, como ya se ha mencionado anteriormente, se refiere a una señal de fondo generada por la vecindad
del instrumento con otros aparatos y/o por cambios mismos en el sistema electrónico en el detector.
Un buen instrumento debe reunir los siguientes requerimientos:
a) El ruido debe ser mínimo para que no interfiera con la señal recibida.
b) El tiempo de respuesta debe ser corto.
c) Debe ser estable durante un largo período de tiempo.
d) La señal percibida debe ser fácilmente amplificada.
DETECTORES PARA UV Y VISIBLE.
Los fotones con radiación de longitud de onda en visible y UV, poseen suficiente energía para causar la
fotoeyección de electrones cuando chocan en superficies que han sido tratadas con compuestos específicos.
La absorción de estos fotones también puede causar que los electrones que se encuentran en la banda no
conductora pasen a la banda de conducción, si el material sobre el que inciden los fotones es un
semiconductor. Ambos procesos general una corriente eléctrica que es directamente proporcional al poder
radiante de los fotones absorbidos. Los detectores que utilizan este sistema se denominan detectores
fotoeléctricos y son clasificados como fototubos y celdas fotovoltáicas.
FOTOTUBOS.
Un fototubo consiste de:
a) un cilindro al alto vacío (con una ventana de cuarzo para UV),
b) un cátodo semicilíndrico, el cual tiene en su superficie un compuesto, con propiedades tales que los
electrones de ésa substancia se pueden desprender con relativa facilidad. Este compuesto generalmente es un
óxido de un metal alcalino (litio, sodio, potasio, etc.) o alcalinotérreos (calcio, bario, estroncio, etc.) y
c) un ánodo que es un alambre metálico. A este sistema se le aplica una diferencia de potencial de
aproximadamente 90 volts.
La Figura 4 representa un sistema de detección a base de fototubo.
La radiación que atraviesa la celda de muestra o de referencia pasa a través de una ventana de vidrio pyrex o
cuarzo del cilindro, y choca con la superficie fotoemisiva del cátodo. Los fotones son absorbidos y
transfieren su energía a los electrones débilmente ligados a la superficie del material. Estos electrones son
desprendidos del cátodo y son colectados por el ánodo, generándose un flujo de corriente en el circuito y la
corriente generada es directamente proporcional al poder radiante de la radiación incidente.

La corriente en el fototubo es función de la diferencia de voltaje entre el cátodo y el ánodo y de la longitud

de onda de la radiación incidente. Si este llega en un amplio rango de longitudes de onda la corriente
generada en el fototubo se desvía de la linearidad.
La intensidad de corrriente en el fototubo es de alrededor de 10-11 amperes, por lo que se coloca una
resistencia para aumentar la señal que entra al amplificador. El ruido en el fototubo se produce debido a la
emisión de fotones del cátodo al ánodo que siempre existe, aún y cuando no llegue energía radiante al
fototubo. Este ruido aumenta con la temperatura y con el área del cátodo.
TUBO FOTOMULTIPLICADOR.
Cuando incide radiación sobre una superficie fotoemisiva se genera un desprendimiento de electrones de
dicha superficie. Si estos electrones desprendidos se aceleran por medio de un campo eléctrico y chocan con
otra superficie fotoemisiva, se desprenden más electrones que el primer caso. Si este proceso se repite una y
otra vez, se tendrá un efecto multiplicador de los fotones. Este es el principio de un tubo fotomultiplicador el
cual se representa en la figura siguiente.
Después de 9 pasos de amplificación, un fotón original ha originado un desprendimiento de
aproximadamente 106 electrones. Los fototubos son utilizados primordialmente para percibir señales de baja
intensidad. Su desventaja más grande es el costo elevado de este componente electrónico.

FOTOCELDAS.
Las celdas fotovoltaicas son utilizadas para detectar y medir la radiación en la región visible y su rango de
detección es aproximadamente el del ojo humano. Estas consisten de una hoja de cobre o hierro, la cual sirve
como electrodo, sobre la cual está depositada una capa de un material semiconductor tal como óxido de
cobre (I) o selenio. La superficie exterior del semiconductor es cubierta por una capa trasparente de oro,
plata o plomo, el cual sirve como segundo electrodo o electrodo colector. El sistema está protegido por una
cubierta trasparente.
Cuando incide radiación de suficiente energía sobre el semiconductor, los enlaces covalentes de este son
rotos con el resultado de que se forman huecos y electrones en el semiconductor. Para compensar este efecto
los electrones emigran hacia la película metálica y los huecos al electrodo que sirve de base al
semiconductor. Los electrones liberados emigran a través del circuito externo para interaccionar con los
huecos del segundo electrodo y el resultado es el flujo de una corriente, cuya magnitud es proporcional a la
intensidad de la radiación recibida. Esta corriente es lo suficientemente grande para ser medida con un
galvanómetro o microamperímetro, por lo cual en estos instrumentos generalmente el sistema de lectura es
una aguja conectada a ungalvanómetro.
El uso de fotoceldas adolece de las desventajas de que no tiene buenos límites de sensibilidad, además de
que se desgasta por fatiga con el tiempo y pierde sus características originales. Cuando los requerimientos de
sensibilidad no sean muy estrictos y para trabajo ordinario es recomendable equipos con este sistema de
detección debido a su bajo costo.

AMPLIFICACIÓN Y LECTURA DE LA SEÑAL

La señal electrónica generada por un detector de radiación, debe ser convertida a una señal que el operador
del instrumento pueda leer e interpretar fácilmente. Este proceso se efectúa con amplificadores,
amperímetros, potenciómetros y graficadorespotenciométricos.
AMPLIFICADORES.
Un amplificador toma una señal de entrada del detector y por medio de una serie de procesos electrónicos
produce una señal de salida que es mucho mayor a la de la entrada. El factor de amplificación que es
llamado “la ganancia del amplificador”, es la relación entre la señal de salida y la señal de entrada.
Generalmente estas señales son voltajes.
SISTEMA DE LECTURA.
Una vez que la señal de energía radiante ha sido trasformada en una señal eléctrica y amplificada
posteriormente, dicha señal pasa a un sistema de lectura.
En algunos equipos, la señal eléctrica amplificada se procesa para darle movimiento proporcional a una
aguja, la cual indica la absorbancia o transmitancia registrada, en una escala que contiene el aparato. En esta
escala, la absorbancia tiene como límites de 0 a infinito, mientras que la transmitancia varía de 0 a 100%; la
escala de absorbancia es logarítmica y la de transmitancia es lineal.
En instrumentos más modernos, la escala de absorbancia o de transmitancia se presenta en números
digitales. También es posible a través de algunas funciones que el procesador contiene, obtener la lectura
directamente en concentración.
El sistema digital más moderno, tiene la ventaja de que la lectura de la señal está libre de errores de criterio e
interpretación del operador.
Frecuentemente es conveniente obtener un registro de la señal en función del tiempo o al hacer variar la
longitud de onda por ejemplo, para obtener un espectro de absorción de una especie química. En este caso,
lo más conveniente es registrar la señal continuamente y obtener de ella una gráfica que indique la variación
de la propiedad en función del tiempo.
INSTRUMENTO DE HAZ SENCILLO.
En este tipo de instrumentos se requiere de calibrar el aparato a cero de absorbancia (o 100% de
transmitancia) con el blanco. Una vez ajustado se retira la celda con el blanco y se colocan las muestras y
estándares que sí contienen la especie absorbente y se efectúa la lectura correspondiente.
Estos equipos requieren de componentes estables y de alta calidad en la fuente, detector y amplificador. Los
parámetros de ajuste iniciales (cero y 100% de transmitancia o cero a ∞ de absorbancia), deben permanecer
estables durante periodos más o menos largos y hacer reajustes de estos parámetros periódicamente, si el
instrumento se va a utilizar más de 30 minutos. Este tipo de espectrofotómetros es más barato que los de
doble haz, y se pueden utilizar ampliamente si los resultados que se desean obtener no requieren de muy alta
precisión.
INSTRUMENTOS DE DOBLE HAZ.
En estos aparatos el haz es dividido, e incide tanto en la celda que contiene el blanco como en la celda que
contiene la muestra. El detector compara estas dos señales continuamente o muchas veces en un segundo y
efectúa la lectura relacionando la lectura de la muestra con la lectura del blanco. De esta manera se
compensan las fluctuaciones que pudiesen existir por: ruido, variación de voltaje, variación en la intensidad
de la fuente luminosa, etc. Obviamente estos instrumentos son más complicados y costosos. En la figura se
muestra un diagrama de un espectrofotómetro de doble haz.

FLUORESCENCIA
Existen tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí llamados: fluorescencia y fosforescencia
molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos, las moléculas de analíto se excitan para dar una especie
cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo
Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes moleculares.El proceso de
emisión de radiación como consecuencia de la desactivación de una molécula se denomina genéricamente
luminiscencia, mientras que el término fotoluminiscencia se refiere al caso particular en el que la excitación
tenga lugar por absorción de fotones. Cuando la energía de excitación es de otro tipo, se originan otras
modalidades de luminiscencia: así, la quimio-luminiscencia es un fenómeno análogo a la fluorescencia,
excepto en el hecho de que la energía de excitación proviene de una reacción química. Cuando la quimio-
luminiscencia tiene lugar en un ser vivo, como por ejemplo, en la luciérnaga, recibe el nombre de
bioluminiscencia. Por otra parte, la tribo-luminiscencia (del Griegro, tribo = frotar) se produce al liberarse
la energía almacenada en ciertas sustancias cristalinas, como azúcar, y como consecuencia de su rotura.

Las moléculas tienen varios estados referidos a los niveles de energía. La espectroscopia de fluorescencia se
preocupa fundamentalmente de estados electrónicos y vibratorios. Generalmente las especies estudiadas
poseen un estado fundamental electrónico o estado estacionario (un bajo estado electrónico) de interés, y un
estado electrónico excitado de una energía superior. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay
varios estados vibratorios. En espectroscopia de fluorescencia, las especies son las primeras en ser excitadas
mediante la absorción de un fotón desde su de estado electrónico fundamental, a uno de los diversos estados
vibratorios en el estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan a la molécula
excitada la perdida de energía vibratoria hasta que alcanza el menor estado vibratorio del estado electrónico
excitado. La molécula luego vuelve a declinar a uno de los varios niveles de vibración del estado electrónico
fundamental emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden decaer en cualquiera de los
varios niveles vibratorios en el estado fundamental, los fotones emitidos tendrán entonces diferentes
energías, y de este modo diferentes frecuencias. Por tanto, por el análisis de las diferentes frecuencias de luz
emitidas en la espectroscopia de fluorescencia junto con sus intensidades relativas, la estructura de los
diferentes niveles vibratorios puede ser determinada.
Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación de varias etapas
mecanísticas. Como muestran las flechas verticales rectas del gráfico, dos de estas etapas, fluorescencia y
fosforescencia, conllevan la emisión de un fotón de radiación. Las otras etapas de desactivación, indicadas
por flechas onduladas, son procesos no radiantes. El camino más propicio hacia el estado fundamental es
aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado. Por ello, si la desactivación por fluorescencia es
más rápida que los procesos no radiantes, se observa tal emisión.
Por otro lado, si la desactivación no radiante tiene una constante de velocidad más favorable, la
fluorescencia desaparece o es menos intensa

La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitación se consigue mediante la absorción de

fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a los dos fenómenos con el término más general de
fotoluminiscencia.
La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones electrónicas responsables de la
fluorescencia no conllevan un cambio en el espín del electrón. Como consecuencia, la fluorescencia presenta
una vida corta cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia están acompañadas por un cambio en el espín del electrón,
que hace que la radiación se mantenga durante un tiempo fácilmente detectable, después de haber acabado la
irradiación – a menudo varios segundos después o más. En la mayoría de los casos, la emisión
fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de mayor longitud de onda que la
radiación utilizada para su excitación.
Uno de los aspectos más atractivos de la luminiscencia es su inherente sensibilidad, con límites de detección
que suelen ser de uno a tres órdenes de magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopia de
absorción. Los límites de detección características son del orden de partes por billón.
Debido a su alta sensibilidad, los métodos luminiscencia cuantitativos suelen sufrir serios efectos de
interferencia procedentes de la matriz de la muestra.
Por esta razón las medidas luminiscentes se suelen combinar con las extraordinarias técnicas de
cromatografía y electroforesis.
En general los métodos luminiscentes se aplican menos que los métodos de absorción en los analitos
cuantitativos debido a que el número de especies que absorben radiación ultravioleta / visible es mucho
mayor que el de especies que presentan fotoluminiscencia tras la absorción de radiación en esta región del
espectro.
Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere una revisión del spín del electrón y de
los estados excitados singulete / triplete.
- Espín del electrón:
El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber dos electrones con los cuatro
números cuánticos iguales. Esta restricción requiere que no haya más de dos electrones en un orbital, y
además, los dos deben tener los estados de espín opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los espines están
apareados. Debido al apareamiento de espines, la mayoría de las moléculas no presentan un campo
magnético neto y se dice, por tanto, que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni repelidas por campos
magnéticos permanentes.
Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un momento magnético
y, consecuentemente, son atraídos cuando se encuentran en un campo magnético; por ello, se dice que los
radicales libres son paramagnéticos

Estados excitados singulete/triplete

Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los electrones están apareados se llama
singulete y cuando la molécula se expone a un campo magnético no se produce un desdoblamiento de
niveles de energía. Por otro lado, el estado fundamental para un radical libre, es un estado doblete, porque el
electrón impar puede tomar dos orientaciones en un campo magnético, lo que comunica ligeras diferencias
de energía al sistema.
Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía superior, se forma un estado
singulete o triplete. En el estado singulete excitado, el espín del electrón promocionado continua apareado
con el electrón del estado fundamental; sin embargo, en el estado triplete los espiones de los dos electrones
se han desapareado y, por tanto, están paralelos. Estos estados pueden representarse como sigue, donde las
flechas representan la dirección del espín.

π* π* π*

π π π

Singulete fundamental Triplete excitado

Singulete excitado

Como se comentó anteriormente, mientras una molécula está en un estado excitado, puede tener lugar un
cambio de espín en un electrón, con lo que se adquiereel estado triplete. Este proceso de transformación de
un estado singulete a un estado triplete se denomina cruzamiento entre sistemas.
Una vez adquirido el estado triplete, la molécula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos
de relajación vibracional, y posteriormente emitir un fotón para retornar finalmente al estado fundamental.
Esta emisión se denomina fosforescencia.
Debido a que las transiciones entre estados de diferentes multiplicidades están "prohibidas", la emisión
fosforescente se produce con un cierto retraso respecto a la absorción (entre 10–3 y 10 segundos). Por ello,
con frecuencia, puede ser observada a simple vista después de cesar la radiación de excitación. Sin embargo,
como consecuencia del mayor tiempo de vida del estado triplete, los procesos de desactivación en forma de
energía no radiante pueden competir más eficazmente con la fosforescencia que con la fluorescencia. Por
esta razón, la fosforescencia casi nunca se observa a temperatura ambiente, siendo necesario operar en
condiciones criogénicas para que se reduzca la probabilidad de desactivación por choques*.
A modo de resumen, puede decirse que los procesos de desactivación de una especie en forma de energía no
radiante son los más probables, seguidos de la emisión fluorescente, y los menos probables son los
correspondientes a la fosforescencia. Esto hace que los métodos absorciométricos sean más numerosos que
los fluorimétricos, y éstos, a su vez, más que los basados en el empleo de la fosforescencia.

Influencia del pH.

El espectro de fluorescencia de muchos compuestos aromáticos conteniendo grupos funcionales ácidos o
básicos es sensible al pH. Los cambios en la emisión de los compuestos de este tipo provienen del número
de especies resonantes diferentes que están asociadas con las formas ácidas o básicas de las moléculas. Así,
por ejemplo, la anilina, en medio neutro y alcalino presenta fluorescencia en la región visible, pero dicha
fluorescencia desaparece en medio ácido. La razón está en que el ion anilinio (forma ácida) tiene las mismas
formas resonantes que el benceno y solo presenta fluorescencia, como él, en la región ultravioleta, mientras
que la anilina tiene tres estructuras resonantes adicionales.

Influencia de la temperatura. La temperatura es una variable importante en fluorimetría analítica,

observándose una disminución de la fluorescencia al aumentar aquella. El cambio en la fluorescencia es
normalmente del 1 % por ºC, si bien, en algunos compuestos, como el triptofano o la rodamina B puede ser
hasta del 5 %. La disminución de la emisión fluorescente con la temperatura se debe a que el aumento de la
frecuencia de choques a temperatura elevada incrementa la probabilidad de desactivación en forma de
energía no radiante. Por otra parte, el aumento detemperatura hace disminuir la viscosidad del disolvente, lo
cual, también aumenta la probabilidad de desactivación mediante colisiones.

Instrumentación
Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los métodos espectroscópicos, los componentes
principales de un fluorímetro son: una fuente de radiación, un sistema selector de longitudes de onda (filtro o
monocromador), una célula conteniendo la muestra, y un detector. Sin embargo, una diferencia importante
entre la fluorimetría (también la fosforimetría) y los demás métodosespectroscópicos es la presencia de dos
filtros (o dos monocromadores); uno para seleccionar la longitud de onda de excitación y otro para la de
emisión.

Existen dos tipos generales de instrumentos:

• Fluorímetro de filtro: El uso de estos filtros sirve para aislar la incidencia de luz y la fluorescencia de la
luz.
• Espectrofluorómetros: Utiliza una red de difracción de monocromador es para aislar la incidencia de la luz
y la florescencia de la luz.

Ambos tipos de filtros usan el siguiente esquema: La luz procedente de una fuente de excitación pasa a
través de un filtro o un monocromador y golpea la muestra. Una porción de la luz incidente es absorbida por
la muestra y algunas de las moléculas en la muestra fluorescente. La luz fluorescente es emitida en todas las
direcciones. Algunas de estas luces fluorescentes pasan a través de un segundo filtro o un monocromador y
alcanzan un detector, el cual es usualmente colocado a noventa grados de la incidencia del haz de luz para
minimizar el riesgo de la transmisión o reflejo de la incidencia de la luz buscada en el detector. Varias
fuentes de luz pueden ser usadas como fuentes de excitación, incluyendo láseres, fotodiodos y lámparas;
faros de Xenón y lámpara de vapor de Mercurio, en particular. Un láser solo emite luz de gran irradiación a
una longitud de onda muy estrecha, típicamente por debajo de 0.01 nm, el cual hace una excitación del
monocromador o filtro necesario.
La desventaja de este método es que la longitud de onda del láser no puede ser cambiada por una muy
grande. Una lámpara de vapor de mercurio es una línea de lámpara, esto significa que emite luz cerca del
pico de la longitud de la onda. Por el contrario un arco de xenón tiene continua emisión del espectro con
poca intensidad en el rango de 300-800 nm y suficiente irradiación para la medida justo un poco más por
encima del de 200 nm.
Debido a la presencia de dos monocromadores, pueden registrarse dos tipos de espectros: el espectro de
excitación (intensidad de fluorescencia observada en función de la longitud de onda de excitación a una
determinada longitud de onda de emisión) y el espectro de emisión (intensidad de la emisión fluorescente en
función de la longitud de onda de emisión, a longitud de onda de excitación fija). Esto es, si se fija la λex y
se mide la radiación emitida a las diferentes λem se obtiene el espectro de emisión. En cambio, si se
mantiene constante la λem y se van variando las λex , se obtiene el espectro de excitación. Este es
ligeramente diferente del espectro de absorción, pero muy semejante a él.
Como se mencionó anteriormente, la fluorescencia pude ser medida con un ángulo de 90° con respecto a la
excitación de la luz. Esta geometría se usa en vez de colocar el sensor en la línea de excitación de la luz a un
ángulo de 180°, evitando la interferencia de la trasmisión de la excitación de la luz. Un monocromador no es
perfecto y podría trasmitir alguna luz perdida o dispersa, es decir, la luz con otras longitudes de onda que las
del destino. Un único ideal monocromador sería el que transmita la luz en un rango específico y que tenga
una gran longitud de onda independiente de la transmisión. Cuando se mide un ángulo de 90°, la luz es
dispersada por simples causas de luz difusa. Estos resultados dan una mejor relación señal-ruido y
disminuye el límite de detección aproximadamente en un factor de 10.000, cuando se compara con la
geometría del ángulo de 180°. Además, la fluorescencia puede ser también medida desde adelante, con el
cual es algunas veces, o bien, turbia o muestras opacas.

El detector puede ser uni-canalizado o multi-canalizado. El detector uni-canalizado puede detectar

solamente una longitud de onda a la vez, mientras que el multi-canalizador detecta la intensidad de todas las
longitudes de ondas simultáneamente, haciendo la emisión del monocromador o del filtro, innecesaria. Los
diferentes tipos de detectores tienen ventajas y desventajas. La mayoría de los fluorímetros son versátiles
con un par de monocromadores y una fuente de excitación de luz continua, estos pueden grabar la excitación
de espectro y la fluorescencia del espectro, la longitud de onda de la excitación de la luz se mantiene
constante, preferiblemente como una gran longitud de onda de absorción, y la emisión del monocromador
explorará el espectro. Para medir la excitación del espectro, la longitud de onda pasa a través de la emisión
del filtro o el monocromador es explorado. La excitación del espectro generalmente es idéntica a la
absorción del espectro, como la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorción.

APLICACIONES Y MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES

Es inherente a los métodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a intervalos de concentración más
bajos que las medidas espectrofotométricas de absorción y se encuentran entre las técnicas analíticas más
sensibles de las que puedan disponer los científicos. El aumento de sensibilidad surge del hecho de que el
parámetro relacionado con la concentración en fluorimetría y en fosforimetría F se puede medir
independientemente de la potencia de la fuente Po. Por el contrario, una medida de absorbancia requiere la
evaluación de Po y de P, ya que la absorbancia, que es proporcional a la concentración, depende de la
relación entre estas dos cantidades. La sensibilidad de un método fluorimétrico puede mejorarse aumentando
Po o mediante la amplificación adicional de la señal de fluorescencia. Por el contrario, en
espectrofotometría, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en P y, por ello, no afecta a la A.
Por tanto, los métodos fluorimétricos tienen, generalmente, sensibilidades que son de uno a tres órdenes de
magnitud superiores a los correspondientes de absorción. Por otro lado, la precisión y la exactitud de los
métodos fotoluminiscentes son habitualmente más pobres que las de los procedimientos
espectrofotométricos en un factor entre, quizás, dos y cinco. Generalmente, los métodos fosforescentes son
menos precisos que sus correspondientes métodos fluorescentes.

Análisis de datos
A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia va a ser generalmente proporcional a la
concentración de fluoróforo. En oposición a la espectroscopia UV / visible ‘estándar’ , los espectros
indistintamente del dispositivo, no son fáciles de conseguir. Varios factores influyen y distorsionan el
espectro, y son necesarias correcciones para conseguir espectros ‘verdaderos ’, es decir, espectros, obtenidos
indistintamente del dispositivo. Los diferentes tipos de distorsiones van a ser clasificados aquí como
cualquier instrumento o pariente de la muestra. Primeramente, la distorsión raíz del instrumento es discutida.
Para empezar, la intensidad de luz de la fuente y características de la longitud de onda varían con el tiempo
durante cada experimento y entre cada experimento. Además, la no lámpara tiene una intensidad constante
en todas las longitudes de onda. Para corregir esto, un disociador de rayo llamado monocromador o filtro
puede ser aplicado después de la excitación, el cual se utiliza para dirigir una porción de luz a un detector
referencia.
Adicionalmente, el rendimiento de transmisión de monocromadores y filtros tiene que ser tomado en cuenta.
Este puede también cambiar a lo largo del tiempo. El rendimiento de la transmisión del monocromador
también varía dependiendo de la longitud de onda. Este es el motivo por el cual un detector de referencia
opcional debe ser ubicado después del monocromador de excitación o filtro. El porcentaje de fluorescencia
adquirido por el detector es también supeditado al sistema. Además, el rendimiento del detector cuántico, es
decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre diferentes detectores, con longitud de onda y con el
tiempo, como el detector inevitablemente se deteriora.
Dos otros temas que deben ser considerados incluyen la óptica utilizada para controlar la radiación y los
medios de retener o contener el material de la muestra (llamada cubeta o celda). Para más mediciones UV
visible, y NIR, el uso de cubetas de precisión de cuarzo es necesario. En los dos casos, es importante
seleccionar materiales que tienen relativamente una pequeña absorción en la gama de longitudes de onda de
interés. El cuarzo es ideal, porque este transmite desde 200 nm-2500 nm; un cuarzo de mayor grado puede
incluso transmitir hasta más de 3500 nm, mientras que las propiedades de absorción de otros materiales
pueden enmascarar la fluorescencia de la muestra.
La corrección de todos estos factores instrumentales para obtener un espectro ‘estándar’ es un proceso
tedioso, el cual solamente es aplicado en práctica cuando es estrictamente necesario. Este es el caso de
mediciones del rendimiento cuántico o cuando se encuentra la longitud de onda con la mayor intensidad de
emisión.
Como fue mencionado previamente, se presentan distorsiones de la muestra. Por tanto también se deben
tener en cuenta algunos aspectos de la muestra. Primeramente, la fotodescomposición puede decrecer la
intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo. La dispersión de la luz debe tenerse también en cuenta.
Otros aspectos de tener en cuenta son los efectos internos del filtro. Estos incluyen la reabsorción. La
reabsorción sucede porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe las longitudes de onda en
las cuales el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, algunos o todos los fotones emitidos por el
fluoróforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto interno del filtro ocurre debido a concentraciones
elevadas de moléculas absorbentes, incluyendo el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de la luz
excitada no es constante en toda la solución. Y, derivadamente, sólo un pequeño porcentaje de la luz de
excitada alcanza los fluoróforos que son visibles por el sistema de detección. Los efectos internos del filtro
cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y por lo tanto esto debe ser considerado cuando se
analiza el espectro de emisión de luz fluorescente.

ESPECTROSCOPIA DE ATOMOS
La espectroscopía atómica se puede dividir en tres clases:
1. Espectroscopía de Emisión Atómica (EEA)
2. Espectroscopía de Absorción Atómica (EAA)
3. Espectroscopía de Fluorescencia Atómica (EFA)
ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN EN FLAMA.
La espectroscopia de emisión enátomos se basa en medir la intensidad de una línea de emisión específica del
elementoque se desea determinar. Cuanto mayor sea la intensidad de ésta línea mayor es suconcentración.
En los instrumentos de EEA, la flama atomiza y excita los componentes de la muestra.
Estos emiten radiación electromagnética de diferentes longitudes de onda que sonseparadas en el
monocromador y la línea de interés llega al detector, al amplificador yfinalmente al sistema de lectura.
Las relativamente bajas temperaturas de la flama, limitan la aplicación práctica de la EEAen flama a los
elementos más fáciles de excitar, o en bajos potenciales de ionización, como son los elementos alcalinos
(Li,Na,K,Rb,Cs) y los alcalinotérreos (Ca,Mg,Sr,etc.).
ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA EN FLAMA: La espectroscopia deabsorción
atómica (EAA), tiene como fundamento la absorción de radiación de unalongitud de onda determinada. Esta
radiación es absorbida selectivamente por átomosque tengan niveles energéticos cuya diferencia en energía
corresponda en valor a laenergía de los fotones incidentes. La cantidad de fotones absorbidos, está
determinadapor la ley de Beer, que relaciona ésta pérdida de poder radiante, con la concentración dela
especie absorbente y con el espesor de la celda o recipiente que contiene los átomos absorbedores.

Fundamento teórico
El átomo consiste de un núcleo y de un número determinado de electrones que llenan ciertos niveles
cuánticos. La configuración electrónica más estable de un átomo corresponde a la de menor contenido
energético conocido como “estado fundamental”.
Si un átomo que se encuentra en un estado fundamental absorbe una determinada energía, éste experimenta
una transición hacia un estado particular de mayor energía. Como este estado es inestable, el átomo regresa a
su configuración inicial, emitiendo una radiación de una determinada frecuencia.
La frecuencia de la energía radiante emitida corresponde a la diferencia de energía entre el estado excitado
(E1) y el estado fundamental (Eo) como se encuentra descrito en la ecuación de Planck:

h = constante de Planck
υ = frecuencia
c = velocidad de luz
λ = longitud de onda
Según la teoría atómica, el átomo puede alcanzar diferentes estados (E1, E2, E3, …) y de cada uno de ellos
emitir una radiación (λ1, λ2, λ3, …) característica, obteniéndose así un espectro atómico, caracterizado por
presentar un gran número de líneas discretas. En absorción atómica es relevante solamente aquella longitud
de onda correspondiente a una transición entre el estado fundamental de un átomo y el primer estado
excitado y se conoce como longitud de onda de resonancia.
De la ecuación de Planck, se tiene que un átomo podrá absorber solamente radiación de una longitud de
onda (frecuencia) específica. En absorción atómica interesa medir la absorción de esta radiación de
resonancia al hacerla pasar a través de una población de átomos libres en estado fundamental. Estos
absorberán parte de la radiación en forma proporcional a su concentración atómica.
La relación entre absorción y concentración se encuentra definida en la Ley de Lambert-Beer.
Como la trayectoria de la radiación permanece constante y el coeficiente de absorción es característico para
cada elemento, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de las especies absorbentes.
Instrumentación
Los componentes básicos de un equipo de absorción atómica son:

1) Una fuente de radiación que emita una línea específica correspondiente a lanecesaria para efectuar una
transición en los átomos del elemento analizado.
2) Un nebulizador, que por aspiración de la muestra líquida, forme pequeñas gotaspara una atomización más
eficiente.
3) Un Quemador, en el cual por efecto de la temperatura alcanzada en la combustióny por la reacción de
combustión misma, se favorezca la formación de átomos apartir de los componentes en solución. Estos dos,
nebulizador y quemador los podemos resumir en un atomizador.
4) Un sistema óptico que separe la radiación de longitud de onda de interés, detodas las demás radiaciones
que entran a dicho sistema.
5) Un detector o transductor, que sea capaz de transformar, en relación proporcional,las señales de
intensidad de radiación electromagnética, en señales eléctricas ode intensidad de corriente.
6) Una amplificador o sistema electrónico, que como su nombre lo indica amplifica laseñal eléctrica
producida, para que en el siguiente paso pueda ser procesada concircuitos y sistemas electrónicos comunes.
7) Por último, se requiere de un sistema de lectura en el cual la señal de intensidadde corriente, sea
convertida a una señal que el operario pueda interpretar(ejemplo: transmitancia o absorbancia). Este sistema
de lectura, puede ser unaescala de aguja, una escala de dígitos, un graficador, una a serie de datos quepueden
ser procesados a su vez por una computadora, etc.

La fuente radiante más común para las mediciones de absorción atómica es la lámpara de cátodo hueco, que
consiste en un cilindro relleno con un gas inerte dentro del cual se encuentra un cátodo (construido del metal
a analizar) y un ánodo. Al aplicar un cierto potencial a través de los electrodos esta fuente emite el espectro
atómico del metal del cual está construido el cátodo.
El atomizador con llama está compuesto de un nebulizador y un quemador. La solución de la muestra es
convertida primero a un fino aerosol, y luego llevada a la llama que entrega la energía suficiente para
evaporar el solvente y descomponer los compuestos químicos resultantes en átomos libres en su estado
fundamental.

NEBULIZADOR
Cuando una solución acuosa de sales inorgánicas disueltas es aspirada y dirigida haciauna flama, en esta
ocurre una serie de eventos que conducen a la formación de átomosen la misma.
El quemador de premezclado o de flujo laminar mostrado en la Figura 5 tiene la siguiente
secuencia de pasos en su operación: inicialmente la muestra líquida (en la cual están
disueltos los componentes en forma de iones positivos y negativos) debe ser conducida al
quemador. Para esto se hace uso del efecto Venturi. Este efecto se crea cuando el oxidante (por ejemplo,
aire) se introduce a través de un tubo diseñado se manera tal quese genera un vacío lo cual produce la
succión de la muestra líquida a través del tubocapilar.
Este mismo efecto Venturi favorece la formación de pequeñas gotas en forma de rocío,cuando la solución se
hace impactar sobre un cuerpo sólido de diseño y geometríaadecuada. El combustible necesario,
(generalmente acetileno) se introduce directamentea la cámara del nebulizador por medio de un conducto
adicional.
Debido a que el oxidante que se introduce a través del nebulizador para el efecto Venturino es suficiente
para una adecuada combustión, el resto requerido se introduce también ala cámara del nebulizador por
medio de un conducto adicional. El resultado es que elquemador lleva finalmente una mezcla oxidante (aire)
y combustible (acetileno) quetransportan pequeñas gotas de rocío de la muestra aspirada.
Otras de las líneas conectadas a la cámara del nebulizador es el tubo de drenaje. Lafinalidad de este es
desechar las gotas que por su tamaño grande condensan en eldeflector de flujo o esfera de impacto.
La eficiencia y el grado en que la solución aspirada forma pequeñas gotas de rocío essumamente importante
ya que la reproductibilidad y la sensibilidad de esta técnicadepende en gran parte de este paso en la
operación del nebulizador.

Las mezclas de gases más usados para producir la llama adecuada son: aire/propano, aire/acetileno y óxido
nitroso/acetileno. Generalmente, la elección dependerá de la temperatura requerida para la disociación de los
compuestos y de las características químicas del elemento a determinar.
En los atomizadores sin llama-atomización electrotérmica con horno de grafito- el vapor atómico se genera
en un tubo de grafito calentado eléctricamente, en cuyo interior se ubica la muestra. Estos atomizadores
presentan diversas ventajas, como una alta eficiencia en generar vapor atómico, permite el empleo de
pequeños volúmenes de muestra y análisis directo de muestras sólidas.
Las pequeñas gotas formadas, son arrastradas por el flujo de gases (oxidante ycombustible) que también
entran a la cámara de mezclado del nebulizador y quesustentan la reacción de combustión en el quemador.
Únicamente las partículas que tienen tamaños menores de 10 mm, lo que representa solo una pequeña
fracción delvolumen de muestra aspirada llega finalmente al quemador, más del 90% de la soluciónes
desechada a través de un tubo de drenaje en que el nebulizador tiene para este fin.
La intención de esto es evitar que partículas demasiado grandes alcancen el quemador.
Cuando esto ocurre, debido a que el tiempo de residencia de la gota en la parte máscaliente de la flama es de
únicamente milésimas de segundo, si la gota es demasiadogrande, no se alcanzan a formar átomos a partir de
esta, y es muy probable que seoriginen falsas absorbancias y que la flama sea demasiado ruidosa tanto desde
el puntode vista audible como electrónico.

QUEMADOR
Con las gotas de solución que alcanzan a llegar al quemador ocurren los siguienteseventos:
1. El solvente es vaporizado y se forman los cristales de las sales metálicas queoriginalmente se encontraban
en solución como iones positivos y negativos. Lanaturaleza de las sales formadas dependen principalmente
de la constante deproducto de solubilidad del compuesto que cristaliza.
2. Una vez formadas las sales, estas son descompuestas por efecto de la temperatura.
Y el elemento es reducido al estado metálico sólido.
3. Posteriormente el metal pasa del estado líquido al estado gaseoso y finalmente setiene en un vapor
atómico que es capaz de absorber radiación de longitudes de ondabien definidas.
4. Si la temperatura es los suficientemente alta y/o el elemento metálico es de bajopotencial de ionización,
parte de los átomos del elemento pierden uno o más de suselectrones y se ioniza parcialmente y esto no es
conveniente.
TIPOS DE QUEMADORES.
Existen dos tipos de arreglos nebulizador/quemador; depremezclado o flujo laminar y de consumo total. El
quemador de premezclado es el quese utiliza más ampliamente en los modernos equipos de EAA, y se le
llama de premezclado, debido a que el oxidante y elcombustible se combinan en la cámara del nebulizador y
llegan como una mezcla alquemador. El flujo de la mezcla gas/aerosol, es el tipo de flujo laminar, por lo que
tambiénse le llama quemador de flujo laminar. En este tipo de nebulizador, como ya se hamencionado con
anterioridad, solamente un pequeño volumen de muestra (las gotas derocío más pequeñas) llega al quemador
y el resto se vierte hacia el drenaje.
El quemador de consumo total o quemador de inyección directa, es aquel en el cual eltotal de la muestra
aspirada se hace llegar a la flama. Aunque aparentemente este tipo dequemador es superior al de
premezclado, por no desperdiciar nada de muestra, se tienenuna serie de desventajas con este quemador de
consumo total, que lo hacen objetable.
Las principales desventajas son: que se produce mucho ruido, hay radiaciones emitidaspor efecto de la flama
y la señal es muy inestable. La ventaja aparente de tener una señalmás intensa al tener una mayor cantidad
de muestra en el quemador, es contrarrestadapor el hecho de que en el flama no se alcanza la secuencia de
pasos necesarios para laatomización, por el tamaño relativamente grandes de las gotas que llegan al
quemador, yestas partículas no volatilizadas desestabilizan el entorno de flama

Aplicaciones
La EAA constituye una de las técnicas más empleadas para la determinación de más de 60 elementos,
principalmente en el rango de μg/ml-ng/ml en una gran variedad de muestras. Entre algunas de sus múltiples
aplicaciones tenemos el análisis de: aguas, muestras geológicas, muestras orgánicas, metales y aleaciones,
petróleo y sus subproductos; y de amplia gama de muestras de industrias químicas y farmacéuticas.
La espectroscopia de absorción atómica con llama es el método más empleado para la determinación de
metales en una amplia variedad de matrices. Su popularidad se debe a su especificidad, sensibilidad y
facilidad de operación. En este método la solución muestra es directamente aspirada a una llama de flujo
laminar. La llama tiene como función generar átomos en su estado fundamental, de los elementos presentes
en la solución muestra. Temperaturas cercanas a los 1,500–3,000°C son suficientes para producir la
atomización de un gran número de elementos, los que absorberán parte de la radiación proveniente de la
fuente luminosa.
Otros sistemas han sido descritos con el fin de mejorar la eficiencia de la atomización, en los cuales de
deposita la muestra sólida o como suspensión en un accesorio especial para introducirlo a la llama (navecilla
de tantalio, cubeta de Delves).
Desde el inicio, en 1955, de la espectroscopia de absorción atómica como método de análisis, hubo un nuevo
ímpetu de desarrollar sistemas de atomización con llama, además de existir un interés continuo en conocer el
mecanismo mediante el cual la solución muestra es convertida a vapor atómico en la llama. El resultado fue
el desarrollo de un quemador con un cabezal de ranura, obteniéndose de este modo un camino óptico
alargado a través de la llama, lo que proporciona una mayor sensibilidad al método. Estos quemadores
emplean generalmente una cámara de premezclado de combustible/oxidante en combinación con un sistema
para aspirar la solución muestra a la llama.
El número de átomos generados en su estado fundamental en la etapa de atomización determinará la
cantidad de radiación absorbida.
En un sistema continuo la solución muestra es aspirada por arrastre con el gas comburente a través de un
nebulizador para generar un aerosol fino dentro de una cámara donde se mezcla con los gases combustible y
comburente auxiliar. Un deflector de flujo, ubicado en la cámara de premezclado, permite que las gotitas
más grandes impacten contra él, caigan al fondo de la cámara y se escurran por el tubo de drenaje. El aerosol
compuesto por las gotitas más finas es transportado hacia el cabezal del quemador, donde ocurre la
combustión y la atomización de la muestra. Una entrada de gas oxidante auxiliar directa a la cámara de
premezclado permite que los ajustes del flujo del oxidante sean efectuados por medio de la línea auxiliar,
mientras que el flujo a través del nebulizador permanece constante. De esta forma la velocidad de aspiración
de la muestra es independiente de las condiciones de la llama.
Los nebulizadores pueden ser regulados para variar la velocidad de aspiración de la solución muestra (1–4
ml/min). Estos están hechos de un material resistente a la corrosión.
Diferentes tipos de cabezales son utilizados dependiendo del tipo de llama a emplear. Estos se construyen de
titanio para darle una resistencia al calor y a la corrosión, siendo los más empleados de 10 cm de ranura
simple (llama acetileno/aire), 10 cm de ranura triple para soluciones con alto contenido de sólidos y cabezal
de 5 cm (llama acetileno/óxido nitroso).
El tiempo necesario para la atomización de una muestra dependerá de la velocidad de entrada de los gases en
la llama y se expresa con altura de la llama, de modo que la medición de la absorbancia se debe realizar en
una zona en que la atomización sea completa.
La llama debe ser en lo posible transparente, es decir, no debe absorber parte de la radiación proveniente de
la lámpara. En general, la llama debe poseer una alta eficiencia en la producción de átomos libres y ésta
debe evitar que ocurran reacciones del elemento a determinar con productos de la combustión de los gases
empleados o con otros componentes de la muestra. Al respecto, la temperatura de la llama tiene un cierto
grado de importancia, siendo a veces más valiosas las propiedades reductoras u oxidantes (según relación
entre gases combustible/comburente) de ella. La razón óptima combustible/comburente dependerá:
• del tipo de quemador;
• de los gases (combustible/comburente);
• del elemento a determinar.
Tabla 4.1. Temperatura máxima (°C) de distintas llamas
Combustible Aire Oxígeno
Gas alumbrado 1,700 2,700
Propano 1,930 2,800
Butano 1,900 2,900
Hidrógeno 2,100 2,780
Acetileno 2,300 3,100
Cianógeno 2,300 4,300
La llama aire/acetileno es la más empleada, debido a que ofrece para muchos elementos un medio ambiente
y temperatura suficientes para la atomización. La llama es completamente transparente y solamente muestra
autoabsorción bajo los 230 nm.
La introducción de la llama óxido nitroso/acetileno (2,900 – 3,000°C) permite la determinación de aquellos
elementos que nose dejan determinar con llama aire/acetileno como Al, Si, Ti, etc… Como producto de su
baja velocidad de combustión, esta llama energética ofrece un medio ambiente químico, térmico y óptimo
favorable, pero posee dos desventajas: numerosos elementos son ionizados y muestran una emisión
relativamente fuerte.
La llama hidrógeno/argón es utilizada en la determinación de As, Se, Cd y Zn. Su gran ventaja es su alta
transparencia en el ultravioleta ideal para la determinación de As y Se. Sin embargo, se debe contar con
grandes interferencias, debido a la menor temperatura de llama.
En espectroscopia de absorción atómica la concentración de un elemento en una muestra se determina por
comparación de la absorbancia de la solución muestra con la absorbancia de soluciones estándar de
concentración conocida. Si cualquier constituyente de la muestra altera uno o más pasos en el proceso de
formación de átomos en su estado fundamental en la llama, llevará a un error en la medición de la
concentración.
Las interferencias que se pueden producir en espectroscopia de absorción atómica se clasifican en: físicas
químicas, de ionización y espectrales.
Interferencias físicas
Este tipo de interferencias está relacionado con la efectividad con que la solución es transportada a la llama
y son causadas por diferencias en las propiedades físicas de las soluciones: viscosidad, tensión superficial o
presión de vapor.
Un ejemplo de estas interferencias se observa en la determinación de Mg y Cu en presencia de ácido
fosfórico. A mayor concentración de H3PO4 la viscosidad de la solución aumenta, disminuyendo la
velocidad de aspiración de ella y una fracción menor llega a la llama, produciéndose una absorbancia menor
de la muestra.
También la presencia de solventes orgánicos produce este tipo de interferencias debido a un aumento en la
eficiencia de la nebulización (menor viscosidad y menor tensión superficial), lo que produce un aumento de
la absorbancia.
Una forma de compensar este tipo de interferencia es preparar las soluciones estándar con los mismos
componentes de la matriz de la solución problema.
Interferencias químicas
Interferencia química es cualquier alteración en el número total de átomos libres formados por unidad de
volumen debido a la formación de compuestos químicos termoestables. Las causas más comunes de éstas
son:
i. Disociación incompleta de la molécula formada o formación de una sal difícil de fundir.
El efecto del fosfato en la determinación de calcio es un ejemplo de este tipo de interferencia. El
calcio con el fosfato forman el fosfato de calcio, el cual se transforma en pirofosfato de calcio, que es
relativamente estable en una llama aire/acetileno. Así la cantidad de átomos libres de calcio
generados en la llama será menor que la obtenida con una solución de calcio de igual concentración,
pero sin presencia de fosfato, provocando una disminución de la señal.
Existen otros componentes refractarios que dan también una disminución de la señal de absorción del
elemento de interés. Tal es el caso de silicatos, aluminatos y pirosulfatos de calcio, magnesio,
estroncio y bario.
ii. Reacción espontánea de los átomos libres con otros átomos o radicales presentes en el medio
ambiente.
Esta interferencia es causada por la formación de óxidos e hidróxidos u ocasionalmente carburos o
nitruros, debido a la reacción de los átomos libres con los productos de la combustión de la llama.
Aproximadamente unos 30 metales no se pueden determinar con llama aire/acetileno (ejemplo:
aluminio, silicio, boro, elementos lantánidos, etc.). La magnitud de la interferencia va a depender del
tipo de estequiometría de la llama.
Las interferencias químicas pueden ser minimizadas por las siguientes formas:
• Empleo de llamas con mayores temperaturas. Como ejemplo tenemos la llama acetileno/óxido
nitroso, la que es capaz de descomponer totalmente los compuestos refractarios.
• Agregar a la solución muestra un elemento “buffer”, el cual forma con el elemento interferente un
compuesto más estable que con el elemento a determinar. El ejemplo más conocido es la adición de
lantano o estroncio en la determinación de calcio en presencia de fosfato.
• Preparación de las soluciones estándar de modo tal que su composición sea lo más semejante con la
de la solución problema. Esta alternativa es difícil de aplicar debido a que requiere un conocimiento
completo de la muestra.
Interferencia DE IONIZACIÓN
Un átomo neutro en su estado fundamental puede ser ionizado a temperaturas elevadas. Estos iones exhiben
propiedades espectroscópicas diferentes a un átomo neutro y no pueden ser determinados por espectroscopia
de absorción atómica. Así, el número total de átomos disponibles para la absorción atómica. Así, el número
total de átomos disponibles para la absorción de la radiación por unidad de volumen disminuye, lo que
produce una pérdida de sensibilidad. Esta interferencia depende tanto de la temperatura de la llama como del
potencial de ionización del elemento en estudio.
La ionización puede ser detectada notando que la curva de calibración tiene una desviación positiva a
concentraciones altas, dado que la fracción de átomos ionizados es menor a concentraciones mayores. Estas
interferencias se pueden eliminar agregando a todas las soluciones estándar y a la muestra un exceso del
elemento que sea fácilmente ionizable en la llama, por ejemplo: el sodio, potasio, litio o cesio, o mediante el
empleo de una llama de menor temperatura.
Interferencias espectrales
En este tipo de interferencias, la radiación del elemento a determinar es directamente influenciada,
existiendo interferencias espectrales de línea e interferencias espectrales de banda:
• Las interferencias espectrales de línea ocurren cuando hay superposición de dos líneas atómicas o
cuando éstas no son resueltas por el monocromador.
 Un ejemplo para el primer caso se tiene en la determinación de trazas de zinc en una matriz de
hierro, debido a que la línea de absorción del hierro (213.86 nm) se superpone a la línea de
resonancia del zinc (213.86 nm).
El empleo de lámparas multielementales fabricadas con una combinación inadecuada de elementos
puede producir interferencias del segundo tipo, si dentro de la banda espectral del monocromador se
encuentra una línea de resonancia de otro elemento junto a la del elemento a determinar.
En general este tipo de interferencias no son frecuentes debido a la naturaleza muy específica de la
longitud de onda que se usa en espectroscopia de absorción atómica. Si se llegan a presentar se
pueden eliminar seleccionando una segunda línea de resonancia del elemento de interés
(probablemente se obtenga mayor sensibilidad o empleando una ranura del monocromador más
angosta).
• Las interferencias espectrales de banda se producen debido a la absorción de la radiación por
moléculas o radicales, y por dispersión de la radiación por sólidos. Para ambos efectos, que en
principio son distintos, se emplea el término absorción de fondo. Aquí existe una pérdida de
radiación no específica que lleva a absorbancias mayores que la absorbancia obtenida por el analito.
La señal está compuesta por la absorción del elemento a determinar más la absorción no específica.
La absorción molecular ocurre cuando una especie molecular en el atomizador posee un perfil de absorción
que se superpone al del elemento de interés. El espectro molecular del hidróxido de calcio muestra un
máximo de absorción en la línea de resonancia del bario.
Este problema es más serio en la región espectral bajo los 250 nm, donde concentraciones altas de metales
alcalinos y de otras sales muestran una alta absorción molecular.
La dispersión de la luz ocurre cuando partículas de sólidos causan una deflexión de parte de la radiación de
la fuente fuera del eje del sistema monocromador-detector. Estos problemas son relevantes con muestras
conteniendo altas concentraciones de elementos refractarios.
Los métodos más empleados en la corrección de la absorción de fondo (BG) son:
i. Método de corrección de doble línea.
En este método se realiza la medición de una línea de emisión no absorbida por el analito, cuyo valor
se resta al valor de la medición obtenida a la longitud de onda de resonancia del analito. El método
tiene la desventaja que a veces no es fácil disponer de una línea de no resonancia cercana a la línea
de resonancia del analito.
ii. Método de corrección continua de fondo.
La forma más eficaz para medir la absorción de fondo es realizar la medición empleando una
lámpara de deuterio o de hidrógeno que emite un espectro continuo bajo los 320 nm. En estos
instrumentos ambas fuentes radiantes (lámpara de cátodo hueco (LCH) y de deuterio (LD) son
moduladas a la misma frecuencia, pero desfasadas, recorriendo el mismo camino óptico a través de
la muestra en el monocromador para llegar al detector. Este observa alternadamente en el tiempo las
dos fuentes radiantes.
La electrónica del instrumento separa ambas señales y compara la absorción de ambas fuentes
entregando una señal corregida con respecto a la absorción de fondo.
METODOS DE TRABAJO
a. Calibración con un patrón.
Utilizando un patrón de la misma sustancia (recuerden las condiciones que debe cumplir un patrón) se
preparan muestras (siguiendo el mismo método que en la determinación de la muestra incógnito) a
diferentes concentraciones, y se grafica la Absorbancia obtenida para cada una de ellas en función de la
concentración.

Calibración con patrón

0.12
y = 0.0019x + 0.0006
0.1 R² = 0.9907
0.08
Absorbancia

0.06
0.04
0.02
0
0 10 20 30 40 50 60
ppm

Con el resultado de absorbancia de la muestra incógnita, entramos al gráfico, hasta interceptar la recta y
bajamos para leer la concentración.
b. Adición de Patrón.
Cuando se analizan muestras biológicas, es imposible aplicar la calibración con patrón, dada que la
matriz de las mismas para cada individuo es diferente. Por eso se hizo necesario desarrollar una
metodología que nos independizara del origen de la muestra.
Por eso se utiliza la técnica de adición patrón. Siempre respetando la cantidad de muestra incógnita en
cada tubo, se adicionan en cada tubo cantidades incrementales de patrón (empezando en el tubo 1, sin
adición de patrón). Se diluye según lo prescripto en cada técnica y luego se mide la absorbancia para
cada tubo y se grafica.

Adición de Patrón
0.12
0.1 y = 0.0016x + 0.0148
R² = 0.9879
0.08
Absorbancia

0.06
0.04
0.02
0
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60
-0.02
ppm

El valor de muestra incógnita se halla, ya sea prolongando la recta más probable hasta la intersección del eje
x (sin considerar el valor negativo del resultado) o igualando a 0 la ecuación de la recta que nos aparece en
el gráfico.
 EJERCITACION DE ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION UV-VISIBLE
Marque la respuesta correcta.
1) Una posible fuente de error en las determinaciones utilizadas, pueden ser:
a. 2 celdas de distinto camino óptico
b. El solvente utilizado.
c. El analito investigado.
d. Todas las anteriores.
2) Para que una técnica analítica, sea validada, debe:
a. Ser sensible.
b. Ser reproducible fácilmente.
c. Ser característica.
d. Todas las anteriores.
3) La absortividad molar es igual a
a. La pendiente de la curva λ vs c.
b. La absorbancia de un mol de analito.
c. La absortividad que corresponde a la concentración de un mol de solvente.
d. La pendiente de la curva A vs c para un camino óptico de 1 cm.
4) Un error en la curva A vs λ puede deberse a:
a. Diferencias en el camino óptico.
b. Suciedad en la pared lateral de la cuba de medición.
c. Altas concentraciones de analito
d. Todas las anteriores
5) Dados los siguientes gráficos, de una determinación espectrofotométrica, ¿cuál fue la diferencia
metodológica en M y N?
M N
0.35 0.45
0.3 0.4
0.35
0.25
0.3
Absorbancia

Absorbancia

0.2 0.25
0.15 0.2
c c
0.15
0.1
0.1
0.05 0.05
0 0
0 50 100 150 0 50 100 150
Concentración en ppm Concentración en ppm

a. Soluciones más diluidas en M que en N

b. En M se descontó el blanco
c. Se usaron diferentes soluciones reguladoras, a pH 4 y 7 respectivamente
d. Ninguna de las anteriores
6) Se tienen dos espectros de un mismo analito, corridos a diferentes longitudes de onda. ¿Cuál elegiría y por
qué?
a. A, porque tiene mejor resolución
b. B, porque tiene mejor precisión
c. A, porque tiene mejor sensibilidad
d. Ninguno de los dos. Justifique
A
 0.6

0.5

0.4

Absorbancia
0.3

0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120
Concentración en ppm

B
0.35

0.3

0.25
Absorbancia

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120
Concentración en ppm

7) Se obtuvieron los siguientes valores de oxihemoglobina (PM 66500 g/mol) a pH 7 y a 575nm de longitud de
onda.
Conc g/100ml %T A
0.030 53,5
0.050 35,1
0.071 22,5
0.102 12,3
a) Completar el cuadro anterior
b) Indicar si se cumple la Ley de Beer (hacer la representación gráfica), y calcular cuál es la absortividad molar
de la oxihemoglobina.
c) ¿Cuál es el rango lineal de aplicabilidad de dicha representación?
d) calcular la concentración de analito en g/100ml de una muestra que tiene una transmitancia de 30%
e) Si una muestra tiene una absorbancia de 0.993 ¿se puede determinar la concentración de la misma?¿ qué
debería hacerse para poder aplicar los datos de la curva de calibración obtenida en a)?
 8) La furosemida es un diurético que se administra en casos de hipertensión y tiene el siguiente espectro de

absorción:
Presenta un máximo a 271nm. Cuando se prepararon patrones de este fármaco, los valores obtenidos de
absorbancia fueron:

Concentración Molar abs

0.00001 0.197
0.00002 0.395
0.00003 0.590
0.00004 0.790
0.00005 0.985

Si una tableta de 100 mg conteniendo este analito se disuelve completamente en NaOH y se lleva a 100ml. De esta
solución diluída se tomó 1 ml y se llevó a 50ml. Al analizar esta muestra diluída se obtuvo una absorbancia de 0,475
con una cubeta de 1cm.
a) calcular la concentración del fármaco en la solución de NaOH.
b) Calcular el % m/m de fármaco en la tableta.

9) Completar las cantidades que faltan en la siguiente tabla:

10) La transmitancia de la solución resultante de disolver la muestra que contiene el compuesto X se diluye a
250 ml.El compuesto X origina color y se puede determinar espectrofotométricamente. Utilizando 4
patrones de concentración conocida, y una muestra dan los siguientes resultados:

a) Construya la curva de trabajo y hallar el % X en la muestra desconocida.

b) Usando sólo el dato del patrón 4 y el de la incógnita, calcule el % X de la muestra, suponiendo que se
cumple la Ley de Beer.
c) Idem b) pero usando el patrón 3.
d) Explicar los resultados obtenidos en base de un análisis de la curva de calibración.
11) Para cuantificar albúmina, a 2 ml de solución de buffer citrato ( reactivo 1 ) se le agregan 50 ul de muestra o
patrón y se le agregan 0,5 ml de solución de verde de bromocresol 0,6 m M ( reactivo 2 ) midiendo en
espectrofotómetro a 570 nm. Si en estas condiciones un patrón de 5 g/dl arroja una absorbancia de 0,500 y
una muestra dio 0,300, complete la totalidad de los casilleros en blanco

Tubo Agua Muestra Patrón Rvo 1 Rvo 2 Concent. Abs

Blanco
Patrón 5 g/dl 0,500
Muestra 0,300

Si una muestra de clara de huevo de codorniz es diluída previamente 1:20 y luego de proceder para la
cuantificación de albúmina arrojó una absorbancia de 0,200, entonces la concentraciónde albúmina en la
clara de huevo es…….

12) Para la determinación de cobre en cervezas mediante espectroscopía de absorción atómica, se utiliza el
método de adiciones estándar. Para ello se toma una muestra de 5ml de cerveza desgasificada y se preparan
5 estándares por adición sucesiva de diversas cantidades de Cu sobre un volumen final de 25 ml de dilución,
de forma que se tienen las siguientes diluciones:

MUESTRAS ABSORBANCIA
Muestra 0,0070
Muestra + 0,2 ppm de Cu 0,0177
Muestra + 0,4 ppm de Cu 0,0275
Muestra + 0,6 ppm de Cu 0,0376
Muestra + 0,8 ppm de Cu 0,0481
Calcular la concentración de Cu en la muestra de cerveza.

13) Para la determinación de aluminio en muestras de agua de río se aplicó el método de adición de estándar. En
todos los casos se utilizó un volumen de la muestra de 10 mL, y a las cuales se les adiciono una solución
patrón (S) de aluminio 0,15 mM. Finalmente, todas las soluciones se diluyeron a un volumen de 25 mL y se
obtuvieron los resultados siguientes:
Solución Señal
Muestra sola 5,0
Muestra + 2 mL de S 10,1
Muestra + 4 mL de S 15,1
Muestra + 6 mL de S 20,0
Determine la concentración de Al en la muestra a partir de:
a) Una gráfica de la señal medida, en función de la concentración del estándar y considere el efecto de
dilución.
b) Una gráfica de la señal medida, en función del volumen del estándar añadido.

14) En la determinación de cinc en muestras de agua potable, se utilizó la espectroscopia de absorción atómica
yse obtuvieron los datos siguientes:
Patrones Zn,(ng/mL) Señal Absorbancia
0,1 0,15
0,2 0,30
0,3 0,45
0,4 0,60
0,5 0,75
0,6 0,90
0.8 1,01
M1 0,5
M2 0,39
 M1 y M2 corresponden a las señales obtenidas para las muestras de agua potable. Para el análisis se
tomaron 10mL de las muestras de agua potable, y se diluyeron a un volumen final de 25 mL. Construya la curva
decalibración y determine la cantidad de Zn en las muestras. Recuerde considerar el factor de dilución.

15) Para la determinación de Cu en una aleación se pesa 1,843 g de muestra, se disuelve y se afora a 500 mL. Se
miden 25 mL de esta solución y se diluye hasta un volumen final de 250 mL. De esta última solución se miden 10 mL
y se afora hasta 100 mL, la cual presenta una absorbancia de 0,045. Por otra parte, se mezclan 10 mL de la última
solución diluida, con 20 mL de una solución patrón que contiene 0,5 ppm de Cu por ml y se diluye a 100 mL. Esta
solución presenta una absorbancia de 0,098. Determine el % de Cu en la muestra. R: 0,13 %

16) Un indicador ácido-base bicolor tiene una forma ácida que absorbe a una longitud de onda de 410 nm, con
una absortividad molar de 347 L/mol*cm. Mientras que la forma básica del indicador tiene una banda de absorción
con un máximo a 640 nm y una absortividad molar de 100 L/mol*cm. Por otra parte, la forma ácida no absorbe
significativamente a 640 nm y la forma básica no presenta absorción significativamente a 410 nm. Una pequeña
cantidad del indicador se añadió a una solución acuosa y se determinó que los valores de absorbancia son 0,118 y
0,267 a 410 y 640 nm, respectivamente. Se utilizo una celda de 1cm. Asuma que el indicador tiene un pKIn de 3,90 y
calcule el pH de la solución acuosa. R: pH=4.80.