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Inmunodifusion Radial - Inserto - Diffu - Plate
Inmunodifusion Radial - Inserto - Diffu - Plate
Inmunodifusion Radial - Inserto - Diffu - Plate
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inmunes (generalmente el anticuerpo) uniformemente en una descongelar. Si aparece turbidez, clarificar por centrifugación. b) Graficar los diámetros de los sueros de referencia contra el
capa de agarosa y luego introduciendo el otro reactivo en Otros materiales biológicos se centrifugan y procesan igual logaritmo de sus respectivas concentraciones.
pocillos cavados en el gel. El antígeno difunde radialmente en que el suero. Las muestras de sueros pueden necesitar ser c) Trazar la recta que mejor una a los tres puntos.
la mezcla gel-anticuerpo y se forma un disco o anillo visible en diluidas para entrar en el rango de resolución de la placa, para d) Interpolar el valor de la muestra desconocida.
un punto que depende de la relación estequiométrica antígeno- ello utilizar solución fisiológica. En el caso de muestras e) No es necesario trazar una curva cada vez que se procesa
anticuerpo. A medida que más antígeno difunde, el anillo se pediátricas la concentración generalmente es menor, por lo una nueva muestra. Sin embargo, debe efectuarse la
redisuelve y reaparece a una distancia mayor del pocillo. Este tanto deben concentrarse las muestras al doble o bien realizar lectura en el mismo tiempo en que se leyeron los sueros de
aumento en el diámetro de precipitación continúa hasta que 2 siembras en un período máximo de 30 minutos. Dejar secar referencia. Si se efectúa una nueva siembra con más de
antígeno y anticuerpo reaccionan completamente. después de la primera siembra. una semana de diferencia respecto a la calibración es
Mientras que el precipitado se está expandiendo (16 a 20 3- Placas: úselas en un área libre de polvo para evitar la recomendable introducir un testigo en cada corrida.
horas) la relación entre el diámetro del anillo y el logaritmo de la contaminación.
concentración de antígeno es aproximadamente lineal. Al NOTA: la tabla de valores se confecciona sobre un gran
completarse la reacción, la relación entre el diámetro al Desarrollo de la reacción número de placas de cada lote utilizando un programa
cuadrado y la concentración es lineal. 1- Abrir la placa para permitir que se evapore el exceso de estadístico por computación para trazar la mejor recta. Sólo es
El sistema Diffu-Plate permite el desarrollo de 3 métodos para humedad, si lo hubiera. válida para el número de lote indicado. Variaciones en los
el análisis de los resultados ya sea en: 2- Sembrar 5 µl de muestra o control utilizando micropipetas parámetros del ensayo, como volumen de muestras,
A- Determinaciones de rutina. de precisión. Colocar en el centro de la placa algodón o gasa temperatura, tiempo de incubación y utilización de la placa una
B- Determinaciones de alta precisión. humedecida, para mantener la humedad del agar. Cerrar vez abierta por un lapso superior a 1 mes pueden producir
C- Determinaciones de rápida orientación. firmemente la tapa. diámetros no concordantes con los especificados en la tabla.
3- Incubar en posición invertida en cámara húmeda el tiempo Es recomendable incluir sueros controles para trazar una curva
Equipamiento necesario para el desarrollo de la técnica indicado en la Tabla en el punto Tiempo de Incubación, a de calibración.
1- Placa IDR para 12 determinaciones. temperatura ambiente.
2- Micropipetas o capilares que permitan medir 5 µl con Errores factibles en la utilización de la técnica
precisión. Lectura de los resultados 1- Debe tenerse suma precaución al sembrar, evitando
3- Sueros testigos con 1 y/o 3 niveles de la proteína a El punto final de la difusión está indicado por la aparición de un derramar muestra fuera del pocillo, romper los bordes del
determinar. anillo de bordes netos. El mismo se alcanza una vez cumplido el mismo o introducir burbujas de aire. En caso que esto
4- Regla de lectura que permita leer con una precisión de 0.1 tiempo de incubación. A partir de ese momento puede ocurra, sembrar un nuevo pocillo.
mm. efectuarse la lectura, ya que el halo no aumentará de tamaño. 2- Si una vez abierta la placa se observan signos de
5- Tabla de conversión diámetro vs. concentración (uso El cálculo de los resultados se realiza con alguno de los deshidratación o deterioro en el agar, debe ser desechada.
opcional). siguientes métodos: 3- Deben evitarse las variaciones bruscas de temperatura, ya
A- Determinación de rutina utilizando tabla de valores. que afectan la velocidad de difusión y, por lo tanto, los
Procedimiento a) Medir los halos con una precisión de 0.1 mm. diámetros de precipitación.
Preparación del material b) Interpolar el dato anterior en la tabla de valores que 4- Las placas no deben ser congeladas. Si esto ocurriera,
1- Sueros controles: se pueden presentar en un único nivel de acompaña a cada placa. deben ser descartadas.
concentración o en viales de alta, media y baja concentración.
Contiene azida sódica al 0.1% (evitar su ingestión y contacto B- Determinación de alta precisión trazando curva de cali- Evaluación de los resultados
con la piel o mucosa). Son estables hasta su fecha de bración. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios
vencimiento si se conservan entre 2º y 8ºC. La concentración a) Las tres primeras posiciones de cada placa se utilizan para valores de referencia. Los rangos que aquí se dan
de proteína específica fue obtenida por comparación con sembrar las diferentes diluciones o concentraciones de los corresponden a pacientes ambulatorios presuntamente sanos.
estándares nacionales e internacionales. Cada calibrador tiene sueros controles.
características físico-químicas similares a la del suero humano. b) Medir los diámetros de halo con una precisión de 0.1 mm. Inmunoglobulina G: Adultos: 600-1650 mg/dl.
Un índice de posible deterioro es la presencia de material c) Graficar las concentraciones de los sueros de referencia Niños: 560-1500 mg/dl.
particulado o una gran desviación de los valores esperados contra el diámetro al cuadrado de los halos de
respecto de los valores informados en la Tabla de Referencia. precipitación. Inmunoglobulina A: Adultos: 90-400 mg/dl.
d) Trazar la recta que mejor una a los tres puntos. Niños: 100-210 mg/dl.
NOTA: todos los materiales usados en este equipo fueron e) Interpolar el valor de la muestra desconocida.
testeados y resultaron negativos para HIV y HBsAg; sin Inmunoglobulina M: Adultos: 75-300 mg/dl.
embargo ninguno de estos ensayos garantiza la ausencia C- Determinación de rápida orientación. Método cinético de Niños: 40-200 mg/dl.
absoluta de agentes infecciosos; por lo tanto se sugiere que se lectura rápida.
manipulen en forma apropiada por personal capacitado. a) Tomar la lectura entre 16 y 20 horas de incubación con una IgD: 1-4.5 mg/dl.
diferencia máxima de ± 30 minutos respecto del suero de
2- Muestras: las muestras de suero deben procesarse en el día. referencia. Los diámetros de las zonas de precipitación C-3: 80-160 mg/dl.
En caso contrario, conservar a -20ºC evitando congelar y deben medirse con una precisión de 0.1 mm por lo menos.
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