Tecnológico Nacional de México

Departamento de Ingeniería Bioquímica y Ambiental

Laboratorio de Microbiología
Microbiología Sanitaria

Grupo C

PRÁCTICA No. 2

MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA

Profesor: M. C. Gabriel Márquez Rojas

Fecha de entrega: 8 de Octubre 2023

Equipo: 2

Integrantes:

19030043 Acosta Centeno Jocelin

19031717 Flores Gómez Lizeth Anahí
19032133 Gallegos Ibarra Cinthia
19031425 Guerrero Robles Jesabel Estefania
19031247 Hernández Ramírez Alex Danaé
19031680 Juárez Paredes Ana Carolina
19032101 Malagón Ruíz Karla Sofía
Introducción

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la

técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa.
En realidad, esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos
presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales,
temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de
colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma
refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.
Por otra parte, el recuento de termofílicos, psicrofílicos y psicotróficos es importante para
predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Para
obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir
fielmente y controlar cuidadosamente las condiciones. Esta técnica puede aplicarse para la
estimación de microorganismos viables en una amplia variedad de alimentos.
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio
de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que
cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite
numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de
varios factores.
El estudio y análisis de microorganismos, especialmente bacterias, desempeñan un papel
fundamental en diversos campos de la microbiología y la biología en general. La
cuantificación de bacterias es esencial para comprender su distribución, comportamiento y
potencial impacto en entornos biológicos y clínicos. En este contexto, esta práctica se
convierte en una herramienta esencial para la determinación de la población bacteriana
presente en una muestra.
La capacidad de cuantificar bacterias aerobias es importante en la investigación como en la
aplicación práctica, así como en el control de calidad en la industria alimentaria y
farmacéutica. Este método proporciona información valiosa para el monitoreo de la
contaminación ambiental, el diagnóstico de enfermedades infecciosas y la evaluación de la
eficacia de los procedimientos de esterilización.
En este reporte, se presentará el procedimiento experimental llevado a cabo para realizar la
cuenta de bacterias aerobias en placa, destacando la importancia de la técnica en la
microbiología para la calidad del resultado obtenido.
La práctica no solo tiene el propósito de permitir la adquisición de habilidades técnicas en el
laboratorio, sino también de fomentar la comprensión de la microbiología y su relevancia en
diversos campos de la ciencia y la industria. Por lo tanto, este reporte servirá como un
recurso para nosotros como estudiantes de ingeniería bioquímica.

Objetivos

● Establecer el método para estimar la cantidad de microorganismos viables presentes

en un alimento, por la cuenta de unidades formadoras de colonia en un medio sólido,
incubado aeróbicamente.
● Cuantificar la población de bacterias aerobias presentes en la muestra, expresada
como unidades formadoras de colonias.
● Familiarizarnos con las técnicas de dilución en serie, que son esenciales para obtener
concentraciones adecuadas de bacterias en las placas de cultivo.
● Aprender a realizar la siembra de muestras diluidas en placas de agar y comprender
la importancia de la esterilidad en este proceso.
● Identificar y enumerar las colonias bacterianas que se desarrollan en las placas de
cultivo después de la incubación.
● Calcular la concentración original de bacterias en la muestra original a partir de los
resultados obtenidos en las placas de cultivo.

Métodos y Materiales
Aparatos e instrumentos

- Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 ºC

- Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.

- Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro
calibrado con divisiones de 0.1 ºC y que mantenga la temperatura a 45+0.5 ºC

-Licuadora de una a dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador

peristáltico (Stomacher).

- Vasos para licuadora con tapa esterilizable o bolsas estériles para homogeneizador
peristáltico.

- Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con
termómetro calibrado.

- Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y
lente amplificador.

- Registrador mecánico o electrónico.

- Microscopio óptico.

Materiales
- Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón
de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su
volumen total.

- Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.

- Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.

- Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas, etc.

- Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán
esterilizarse mediante:

- Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o

- Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.

- El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización
repetida y éste debe ser químicamente inerte.

Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico.Cuando se indique
agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad.

Medio de Cultivo.

Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).

FÓRMULA

Preparación del medio de cultivo.

- Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total
disolución.

- Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml,

cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a
121 ± 1,0 ºC, durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC.

- Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de agua

y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de
una vez.

- En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.

- El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en

particular se requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la
técnica para ese alimento.

Preparación de la muestra

Para la preparación de la muestra seguir el procedimiento de: Preparación y dilución de

muestras de alimentos para su Análisis Microbiológico.
Procedimiento:

1.- Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición
de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las
cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por
duplicado.

2.- Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según la NOM110-SSA1-
1994, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis microbiológico, en
las cajas Petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos
de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6
de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
Dejar solidificar.

3.- Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de
esterilidad.
4.- El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta
que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

5.- Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura
que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase el cuadro
1.

3.- Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las
placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las
siguientes guías:

I.-Placas con menos de 25 colonias. - Cuando las placas corridas para la menor dilución
muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha
dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por el factor de dilución para obtener
el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe esta situación agregando la
leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 3.

II.- Placas con más de 250 colonias. - Cuando el número de colonias por placa exceda de
250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la
distribución de colonias. Contar, por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja
y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse
algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene
65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta situación agregando la
leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 4.

III.- Colonias extendidas. - Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes
formas:
a).- Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la
desintegración de un cúmulo de bacterias.

b).- Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.

c).- Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar.

d).- Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del

crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del crecimiento que por sí
mismo excede el 25% de la superficie de la caja.

e).- Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están
incluidas en d), contar cualquiera de los tipos a),b) ó c), como provenientes de una sola
fuente. En el caso de las colonias del tipo a), si la caja contiene una sola cadena, contar como
una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes
separadas, contar cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena
individualmente. Las colonias del tipo b) y c) generalmente se observan cómo crecimiento
diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos tipo d), reportarlos
como crecimiento extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y otra
dilución presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden
contar las colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5

IV.- Placas sin colonias. - Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias,
reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada,
véase el cuadro 2, ejemplo 6.

V.- Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra
con más de 250 colonias. - Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado
más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para
determinar la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 7.

VI.- Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a
250 colonias. - Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de
colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para
calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 8.

VII.- Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25
a 250 y sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro cajas incluyendo
aquélla con menos de 25 o más de 250 colonias, para calcular la cuenta en placa, véase el
cuadro 2, ejemplo 9.

VIII.- Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la
inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra.
Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos
significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dígito al número
inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128
redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y
el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400).
Resultados:

Dilución Placa Colonias

0.1 Presentó de 25 a 250

colonias donde se pudieron
observar 2 diferentes tipos
de colonias, una de ellas
puntiforme y la otra regular.
Con colonias color crema
con bordes blancos.

0.01 Solo presentó una colonia

mediana de color crema con
bordes blancos.

0.001 Presentó una colonia grande

y cinco colonias pequeñas
todas de color crema con
bordes blancos.

0.0001 Presentó cuatro colonias

pequeñas de color crema con
bordes blancos.
 0.00001 Solo presentó una colonia
pequeña transparente.

La dilución 0.1 se observó en un estereoscopio, después se tomó una muestra de la colonia

puntiforme y se realizó tinción de gram en donde se observaron diplobacilos gram positivos.
Interpretación de Resultados

Unidades formadoras de colonias, UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar triptona
extracto de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas 48 horas a 35 ºC.

Dilución Colonias contadas

0.1 286
0.01 1
0.001 6
0.0001 4
0.00001 1

La única placa que presentó crecimiento alrededor de 25 a 250 colonias fue la de

dilución 1:10 en donde la media de colonias obtenidas en esta dilución, a partir de la
siembra de un volumen de 1 mL es 286 UFC, por tanto:

( )
❑❑
UFC 286 1 3 UFC
= 10 =2860=2.86 x 10
mL 1 mL
Discusión de Resultados:
Se realizaron diluciones desde 0.1 a 0.00001 por medio de agua peptonada y se homogeneizó con
Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar) que es indicador de contaminación o
biocarga en alimentos, agua, agua residual y productos lácteos, (también conocido como Agar para
cuenta en placa), para cada dilución, se observó qué en cada dilución dieron resultados diferentes y fue
disminuyendo la formación de colonias dependiendo de la dilución, la única placa qué presentó
crecimiento con un alrededor de 25 a 250 colonias fue en la placa de la dilución 0.1 mientras las
demás placas presentaron de 1-5 colonias no tan significativas como la placa de la dilución 0.1.
Se realizó observación mediante un estereoscopio para la placa de la dilución 0.1, donde se observaron
algunas de las colonias formadas, en esta, se pudieron observar 2 diferentes tipos de colonias, una de
ellas puntiforme y la otra regular, por sus características morfologías coloniales típicas y recuperación,
se determinó, la formación de colonias.
Para la placa 0.1 presentó de 25 a 250 colonias donde se pudieron observar 2 diferentes tipos de
colonias, una de ellas puntiforme y la otra regular, con colonias color crema con bordes blancos.
Para la placa 0.01 solo presentó una colonia mediana de color crema con bordes blancos.
Para la placa 0.001 presentó una colonia grande y cinco colonias pequeñas todas de color crema con
bordes blancos.
Para la placa 0.0001 presentó cuatro colonias pequeñas de color crema con bordes blancos.
Para la placa 0.00001 presentó una colonia pequeña transparente.
Por medio del microscopio, y tinción de gram qué dió positiva donde se observaron diplobacilos qué
son dos bacilos dispuestos uno al lado del otro, qué da posible enfermedad a Lepra y sus células se
disponen en parejas, pero siempre en sentido longitudinal, es decir unidas por sus extremos y nunca
por los lados. [2]
Conclusión:
La cuenta de bacterias aerobias se realiza mediante la fracción de la flora microbiana que es capaz de
producir colonias en el medio de cultivo bajo las condiciones predominantes en la incubación de la
placa, en esta práctica se realizó un trabajo para el análisis de los microorganismos mesófilos
aeróbicos, su significado e interpretación, como su presencia en los alimentos, en este caso para el
análisis de agua (bebedero) en el Instituto Tecnológico de Celaya.
Todo esto con el fin de conocer y determinar la calidad del agua determinando cuáles son los
microorganismos que hay presentes en la misma. Dependiendo del uso que le demos a esa agua, hay
que determinar las bacterias o patógenos que puedan afectar a la salud del consumidor y producir
alguna enfermedad.
Todo esto nos ayuda para así saber y tener conciencia del consumo qué generamos de los alimentos o
productos y la posible contaminación de los alimentos.
Para conclusión de esta práctica, se generó una tinción de gram qué dió positivo y se observó
diplobacilos qué pueden producir Lepra.
 Referencias Bibliográficas:

[1] Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la

cuenta de bacterias aerobias en placa.
[2] Llop A., Valdés – Dapena M., Zuazo Silva J. L.: Microbiología y Parasitología Médicas, Ed.
Ciencias Médicas. Ciudad Habana. 2001. (T.1-T.3)