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GBE

Polimorfismos de inversión cromosómica en dos linajes

simpátricos de ascidias
Yutaka Satou * 1,† , Atsuko Sato2,3,4,† , Hitoyoshi Yasuo5,† , Yukie Mihirogi2 , John Bishop3 , Manabu Fujie6
, Mayumi Kawamitsu6 , Kanako Hisata7 , y Noriyuki Satoh7

1Departamento de Zoología, Graduate School of Science, Universidad de Kioto, Sakyo, Kioto, Japón

2Departamento de Biología, Universidad de Ochanomizu, Otsuka, Bunkyo-ku, Japón

3Marine Biological Association of the UK, The Laboratory, Citadel Hill, Plymouth, Reino Unido

4Graduate School of Life Sciences, Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

5Sorbonne Universite', CNRS, Laboratoire de Biologie du D'eveloppement de Villefranche-sur-mer (LBDV), Villefranche-sur-mer, Francia
6Sección de Secuenciación de ADN, Universidad de Posgrado del Instituto de Ciencia y Tecnología de Okinawa, Onna, Okinawa, Japón.

7Unidad de Genómica Marina, Universidad de Posgrado del Instituto de Ciencia y Tecnología de Okinawa, Onna, Okinawa, Japón.

*Autor corresponsal: Correo electrónico: yutaka@ascidian.zool.kyoto-u.ac.jp.

Recibido: 8 de enero de 2021; Revisado: 24 de marzo de 2021; Aceptado: 1 de abril de 202129032021
†Estos autores han contribuido a partes iguales a este trabajo.

Resumen
Los reordenamientos cromosómicos pueden reducir la aptitud de los heterocigotos e impedir así el flujo de genes. Por lo tanto,
estos reordenamientos pueden desempeñar un papel en la adaptación local y la especiación. En particular, las inversiones se
consideran una de las principales causas potenciales de especiación cromosómica. Existen dos linajes de ascidias del género
Ciona, estrechamente relacionados y parcialmente simpátricos, a los que en el presente estudio denominamos animales de tipo A y
tipo B. Aunque estos cordados invertebrados son de tipo A y tipo B, en la mayoría de los casos son de tipo A y tipo B,
respectivamente. Aunque estos cordados invertebrados están en gran medida aislados reproductivamente, pueden encontrarse
híbridos en poblaciones salvajes, lo que sugiere la existencia de barreras precigóticas incompletas. Aunque el genoma de los
animales de tipo A ha sido descifrado y ampliamente utilizado, el genoma de los animales de tipo B no ha sido descifrado a nivel
cromosómico. En el presente estudio, secuenciamos los genomas de dos individuos de tipo B procedentes de distintos lados del
Canal de la Mancha (en la zona de simpatría con los individuos de tipo A) y los comparamos a nivel cromosómico con el
genoma del tipo A. Aunque las estructuras generales estaban bien conservadas entre el tipo A y el tipo B, los
alineamientos cromosómicos revelaron muchas inversiones que diferenciaban estos dos tipos de Ciona; es probable que
las frecuentes inversiones hayan contribuido a la separación entre estos dos linajes. Además, las comparaciones de los
genomas entre los dos individuos de tipo B revelaron que el tipo B presentaba altas tasas de polimorfismos de inversión y
polimorfismos de nucleótidos, por lo que el tipo B podría estar en proceso de diferenciación en múltiples tipos o especies nuevas.
Nuestros resultados sugieren un importante papel de las inversiones en la especiación cromosómica de estos reproductores
de transmisión.
Palabras clave: Ciona, genomas, especiación cromosómica.

1936; Dobzhansky y Pavlovsky 1958; Carson 1973;

Introducción
Rieseberg 2001; Wellenreuther y Bernatchez 2018). Tales
Los reordenamientos cromosómicos, especialmente las reordenamientos suprimen localmente la recombinación
inversiones, tienen un papel importante en el origen de la meiótica en heterocigotos y
nueva diversidad biológica (Sturtevant y Dobzhansky

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evitando así el flujo de genes en las regiones pueden reducir la aptitud de los heterocigotos y
reordenadas. Esta prevención del flujo genético puede convertirse así en una barrera reproductiva. Las inversiones,
promover la adaptación local, lo que puede facilitar la en particular, se han estudiado en muchos organismos,
heterosis. Además, los reordenamientos cromosómicos como plantas terrestres, insectos, aves y mamíferos (Carson
1973; Noor et al. 2001;

© Autor(es) 2021. Publicado por Oxford University Press en nombre de la Sociedad de Biología Molecular y Evolución.
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons de Reconocimiento No Comercial (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/),
que permite la reutilización, distribución y reproducción no comercial en cualquier medio, siempre que se cite adecuadamente la obra original. Para la reutilización comercial, póngase
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junio de 2023
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Polimorfismos de inversión
cromosómica
GBE

Significado
Se considera que los reordenamientos cromosómicos, especialmente las inversiones, desempeñan un papel
importante en la adaptación local y la especiación en diversos taxones. En el presente estudio, secuenciamos los
genomas de dos individuos de una especie de ascidias (un cordado invertebrado) y hallamos altas tasas de
polimorfismos de inversión y polimorfismos de nucleótidos. Además, los alineamientos con los cromosomas de
un ascidiano estrechamente emparentado revelaron muchas inversiones que diferencian estos dos linajes de
ascidianos. Nuestro estudio plantea la posibilidad de que las inversiones hayan desempeñado un papel importante
en la especiación cromosómica de las ascidias y proporciona recursos genómicos para investigar los
reordenamientos cromosómicos en la adaptación local y la especiación.

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recolectados en los lados norte y sur del Canal de la
Hoffmann y Rieseberg 2008; Lemaitre et al. 2009; Ayala et Mancha, donde los animales de tipo A y B se encuentran
al. 2013; Twyford y Friedman 2015; Kupper et al. 2016; en simpatría, para estudiar los reordenamientos
Tuttle et al. 2016). cromosómicos en estos animales.
Mientras tanto, muchos animales acuáticos obtienen
la fertilización mediante la dispersión pasiva de esperma
transportado por el agua. Este modo reproductivo difiere
de la fecundación interna copulatoria observada en
insectos, aves y mamíferos en aspectos que podrían tener
importantes consecuencias para la diversidad genética y
la especiación (Pogson 2016). Las ascidias, que son
corales de invertebrados marinos, proporcionan un sistema
modelo ideal para estudiar la evolución cromosómica en
animales acuáticos que desovan al vuelo, ya que se han
descodificado secuencias del genoma en dos especies
del género Ciona (C. intestinalis y C. savignyi) (Dehal et al.
2002; Vinson et al. 2005; Satou et al. 2008).
La especie C. intestinalis contiene al menos dos especies
crípticas, que han sido identificadas mediante genómica
comparativa, mitogenómica y estudios ecológicos
(Suzuki et al. 2005; Kano et al. 2006; Caputi et al. 2007;
Iannelli et al. 2007; Nydam y Harrison 2011). Estos dos
tipos de animales, "tipo A" y "tipo B", presentan una
susceptibilidad diferente a la tempera- tura y diferencias
morfológicas (Sato et al. 2012; Sato et al. 2015; Malfant
et al. 2017). Un estudio reciente (Brunetti et al. 2015) ha
propuesto reconocerlas como especies distintas y llamar a la
primera C. robusta y a la segunda C. intestinalis. Sin
embargo, para evitar posibles confusiones, dado que el
primer genotipo de Ciona que se publicó (tipo A) se
denominó
C. intestinalis (Dehal et al. 2002; Satou et al. 2008),
utilizaremos "tipo A" y "tipo B" en el texto siguiente.
Estos dos tipos de Ciona ocupan regiones
geográficas distintas; el tipo A vive principalmente en el
Pacífico y el Mediterráneo, y el tipo B solo en el Atlántico
Norte. Existe una pequeña zona simétrica en el oeste del
Canal de la Mancha y el sur de Bretaña, donde se
encuentran con baja frecuencia híbridos naturales de
animales de tipo A y tipo B (Sato et al. 2012;
Bouchemousse et al. 2016). A continuación, presentamos
los ensamblajes cromosómicos de dos individuos de tipo B

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Resultados
Satou et al. y debate GBE
Estimación del tamaño del genoma de dos individuos de
tipo B
Para obtener los ensamblajes a nivel cromosómico de los
dos individuos de tipo B, muestreados en Roscoff
(Francia; espécimen R) y Plymouth (Inglaterra; espécimen
P), primero estimamos que los tamaños de sus ge-
nomas eran de 124 y 136 Mb, dentro de los cuales 95
y 91 Mb eran únicos respectivamente, utilizando
lecturas de secuenciación corta de Illumina a partir del
ADN espermático de estos dos especímenes mediante un
método de perfil k-mer (tabla suplementaria S1,
Material suplementario en línea). Así pues, aunque los
tamaños de estos ge- nomas son diferentes, es probable
que esta diferencia se deba principalmente a secuencias
repetidas.
Un informe anterior estimó que los genomas de la
línea HT de tipo A y de dos individuos salvajes
capturados de tipo A tienen una longitud de 114- 120
Mb (Satou et al. 2019). A partir de los mismos
conjuntos de datos (DRA002218 y DRA008508) (Satou et
al. 2015, 2019), estimamos que sus longitudes únicas
son de 94-98 Mb. Por lo tanto, es probable que los
individuos de tipo A y tipo B tengan regiones no repetidas
de longitud similar.
Aunque se ha estimado que la tasa de
heterocigosidad de los animales de tipo A es del 1,1-
1,2% (Dehal et al. 2002; Satou et al. 2012), las de los
especímenes R y P fueron del 3,0% y el 3,6%,
respectivamente. Por tanto, nuestros datos indicaban
que los genomas de los animales de tipo B eran más
heterocigotos que los de los animales de tipo A, lo que
concuerda con los datos del transcriptoma, que indican que
las secuencias exónicas de los animales de tipo B son
más polimórficas que las de los animales de tipo A
(Roux et al. 2013).

Construcción de conjuntos para dos individuos de tipo B

Para construir los ensamblajes cromosómicos de los dos
individuos de tipo B, empleamos la estrategia mostrada en
la figura suplementaria 1A, Material suplementario en
línea. First, for each specimen, we built contigs from
long Nanopore reads with the NECAT assembler (Chen
et al. 2021) and polished obtained contigs with Illumina
reads using the Nextpolish soft- ware (Hu et al. 2020). Las
longitudes totales de los contigs superaron con creces el
tamaño estimado del genoma. Debido a que las dos
especies son diploides y a que las alineaciones entre
contigs de hecho

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Polimorfismos de inversión
cromosómica
GBE

Cuadro 1
Estadísticas básicas de los fragmentos y
andamiajes
Muestra R Muestra P

Contigs Andamios Contigs Andamios

Longitud total de nucleótidos (pb) 140,229,552 140,258,052 140,852,390 140,915,890
El número de "N "s en contigs/scaffolds (bp) 436 28,936 525 64,025
Número de contigs/scaffolds 92 35 234 107
Longitud total de nucleótidos en los cromosomas N.A. 134,327,883 N.A. 128,639,392
N50 (pb) 2,616,637 9,879,317 1,343,034 8,719,396
L50 19 6 34 7

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N90 (pb) 921,931 6,498,296 342,918 5,508,368
L90 53 13 113 14
Puntuación BUSCO Completar 92.8% 92.9% 93.6% 93.7%
Fragmentado 0.8% 0.9% 1.2% 1.1%
Falta 6.4% 6.2% 5.2% 5.2%

mostraron muchos solapamientos, apartamos dichos S4, Material suplementario en línea).

solapamientos utilizando el software purge_dups (Guan et al. También asignamos 318 genes de factores de
2020), y obtuvimos contigs no solapados. Ambos conjuntos transcripción y moléculas de señalización del genoma de tipo
de contigs tenían 140 Mb de longitud (tabla 1). Los contigs A a los genomas de los especímenes R y P, porque estos
apartados se guardaron para estudiar los haplotipos. En lo genes estaban bien anotados (fig. suplementaria S5,
sucesivo, llamaremos a los primeros conjuntos de contigs los Material suplementario en línea). Como era de esperar a
conjuntos de contigs principales, y a los segundos los partir de los alineamientos genómicos, los cromosomas
conjuntos de contigs de haplotipos. A continuación, los dos
conjuntos de contigs principales se alinearon con los
cromosomas de tipo A (Satou et al. 2019). La mayoría de
los contigs se alinearon con posiciones únicas del genoma
tipo-A (fig. suplementaria S2, Material suplementario en
línea).
Las alineaciones de los contigs más largos de los
especímenes R y P con el genoma de tipo A se muestran
en las figuras 1A y B. Aunque se observaron pequeñas
inversiones y una posible inserción, los contigs completos
se alinearon con los cromosomas 10 y 8, respectivamente.
Estas observaciones indican que las estructuras
genómicas se conservan globalmente entre los animales
de tipo A y los de tipo B. Por lo tanto, construimos
andamiajes a partir de los alineamientos mostrados en
la figura suplementaria S2, Supplementary Material
online.
N50, N90 y otros valores relacionados mejoraron
considerablemente en los conjuntos de andamiaje
resultantes (tabla 1). El programa BUSCO (Simao et al.
2015) indicó que más del 93% de los "genes metazoos"
se incluyeron en los conjuntos para las muestras R y
P. Cabe destacar que todos estos genes de metazoos
hallados por BUSCO se encontraban en los cromosomas,
y no en contigs no asociados a los cromosomas.
También confirmamos que los animales que utilizamos
eran del tipo B mediante análisis filogenéticos moleculares
utilizando cinco loci que se ha informado que son
divergentes entre dos tipos (Nydam y Harrison 2011) (los
alineamientos se muestran en las figs. suplementarias. S3 y

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Las posiciones de los genes reguladores se
Satou et al.
conservaron en gran medida, aunque se encontraron
dos posibles inversiones y una posible translocación
GBE
intercromosómica (véase más adelante el análisis de
estas variaciones estructurales). Entre estos genes,
317 y 311 genes fueron mapeados con éxito en los
cromosomas de los especímenes R y P, respectivamente.
Así pues, >98% de los genes están presentes en los
cromosomas ensamblados de estos especímenes.

Comparaciones entre los genomas de los animales

de tipo A y de tipo B
Para comparar los genomas de los animales de tipo B y de la
línea HT de tipo A a nivel de nucleótidos, dividimos las
secuencias genómicas completas en fragmentos de 500
pb de longitud y los alineamos con las secuencias
genómicas de diferentes animales mediante el programa
BLAT (Kent 2002) con parámetros predeterminados (fig.
suplementaria S6, Material suplementario en línea).
Estos fragmentos eran más alineables entre los
animales de tipo B que entre los animales de tipo A y los
de tipo B, y las identidades de nucleótidos dentro de los
fragmentos alineados eran mayores entre los animales de
tipo B que entre los animales de tipo A y los de tipo B. Estas
observaciones indican que el genoma de tipo B es más
similar al de los animales de tipo A que al de los de tipo
A. Estas observaciones indican que los genomas de tipo B
son más parecidos entre sí que con el genoma de tipo
A.
A continuación, utilizamos un conjunto de modelos de
genes que habíamos creado previamente para el
genoma de tipo A (Satou et al. 2019) y mapeamos
exones, intrones, regiones de 1 kb aguas arriba y regiones
intergénicas (incluidas las regiones de 1 kb aguas arriba)
en los genomas de tipo B mediante BLAT (Kent 2002).
Las proporciones de nucleótidos alineados con éxito
indican que los exones están más conservados entre
los genomas tipo A y tipo B que los intrones y las
regiones intergénicas (fig. 1C). Aunque las identidades de
los nucleótidos alineados fueron casi las mismas entre
los exones, intrones, regiones ascendentes y regiones
intergénicas (fig. 1D), el número de huecos encontrados
en los alineamientos mostró grandes diferencias (fig.
1E). Así pues, los exones están muy conservados entre
los animales de tipo A y los de tipo B, mientras que las
regiones intergénicas varían mucho entre los dos tipos.

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Polimorfismos de inversión
cromosómica
GBE

A (C. robusta) cromosoma 10 B

(C. robusta) cromosoma 8

C. intestinalis tipo A

0 3M 4M 5M 6M 7M 8M

C. intestinalis tipo A

0 4M 5M 6M 7M 8M
0 1M 2M 3M 4M 5M 6M 0 1M 2M 3M

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el contig más largo el contig más largo
para el espécimen R para el espécimen P (3.8M)
(6,1M)

C D E
1 0 0 % 100% 18
94.5% 94.1% 94.0% 93.9% 17.0
16
cartografiadas y los genomas
% de identidad entre las secuencias

80% 77.2% 80%

huecos medios por secuencia

14

12
60%
% de nucleótidos

60%
10
47.1%
mapeados

39.3% 8
de tipo B

cartografiada
40% 35.0% 40%
6
4.96
20% 20% 4
3.01
2
0.54
0% 0% 0
exón

intergénico
región
intrón

exón

exón
intergénico
región

intergénico
región
intrón

intrón
aguas arriba

aguas arriba

aguas arriba
región

región

región
(1 kb)

(1 kb)

espécimen Respécimen P (1 kb)

FIG. 1.-Comparaciones entre secuencias genómicas de dos animales de tipo B y un animal endogámico de tipo A. (A, B) Alineaciones de los

contigs más largos de los especímenes (A)R y (B) P con los cromosomas de tipo A. La punta de flecha indica una inserción en el espécimen R y las flechas
indican inversiones en el espécimen P. Una punta de flecha indica una inserción en el espécimen R, y las flechas indican inversiones. Las alineaciones de
todos los contigs con cromosomas de tipo A se presentan en la figura suplementaria S2, Supplementary Material online. (C-E) Los exones, intrones,
regiones de 1 kb aguas arriba y regiones intergénicas que incluyen regiones de 1 kb aguas arriba del genoma de la línea HT de tipo A se
mapearon con los genomas de los especímenes R y P. Se muestran las proporciones de nucleótidos mapeados (C), las identidades de nucleótidos
en las regiones mapeadas (D) y el número medio de huecos por secuencia (E).

Ocurrencia de inversiones cromosómicas en los suplementario en línea). Esto contrasta con los extensos
genomas de tipo B reordenamientos intracromosómicos entre los animales de
tipo A y C. savignyi (Hill et al. 2008; Satou et al. 2019).
Para examinar las variaciones estructurales, mapeamos
el conjunto de modelos de genes KY del genoma de
tipo A en los genomas de los especímenes R y P. De los
14.072 modelos de genes, 8.479 y 8.524 modelos se
mapearon con puntuaciones altas en los genomas de
tipo B de los especímenes R y P, respectivamente. El
orden de los genes en estos tres genomas estaba muy
conservado, mientras que también se detectaron
variaciones estructurales (fig. suplementaria S7, Material

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las
Para identificar las translocaciones, buscamos en
Satou et al.
secuencias genómicas bloques que contuvieran tres
o más genes que no se encontraran en las posiciones
GBE
esperadas del genoma tipo A. Encontramos dos
pequeñas translocaciones intercromosómicas entre los
genomas del espécimen P y el tipo A, que también se
confirmaron con la alineación genómica (figs.
Encontramos dos pequeñas translocaciones
intercromosómicas entre los genomas del espécimen P y el
tipo A, que también se confirmaron con la alineación
genómica (figs. suplementarias S7-S9 y tabla S2,
Material suplementario en línea). Por el contrario, no
encontramos tales translocaciones entre los genomas
del espécimen R y el tipo A.
Del mismo modo, para identificar las inversiones,
buscamos en las secuencias genómicas bloques que
contuvieran tres o más genes que estuvieran
mapeados en sentido inverso al orden en el genoma
de tipo A. Encontramos 21 y 20 inversiones en el

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Polimorfismos de inversión
cromosómica
GBE

espécimen R, Chr 7 espécimen R, Chr 3 E espécimen R, Chr 1

A C
4 M7 M 2,75M3 ,25 M 4M 6M
espécimen P,

espécimen P,

espécimen P,
Chr7

Chr3

Chr1

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haplotipo contigs
espécimen R,

espécimen R,

espécimen R,
haplotipo contig

haplotipo contig
eje y 100
escala del

escala del

C. intestinalis tipo A espécimen P, M b

Kb

eje y
escala del

espécimen P,
1 Mb
eje y

no se ha obtenido

1
(C. robusta) haplotipo contig

(C. robusta) haplotipo contig

C. intestinalis tipo A espécimen P,

ningún contig de
haplotipos
C. intestinalis tipo A
(C. robusta)

tipo-A
tipo-A
R: Chr7 R: Chr3
R: Chr1
Haplotipos R/P
12 3 4 56 7 8 9 1011 12
tipo-A
P:
P: Chr7 P: Chr3
haplotipos
Chr1 R/P
Haplotipo R
1 3 2 4 57 6 8 9 1110 12
11/12
10/12

B D F
9/10
9/11
1/2
1/3

3/4
2/4

5/6
5/7

7/8
6/8
espécimen

espécimen

espécimen

10 kb 10 kb 10 kb
8 kb 8 kb 8 kb
R

2 kb 2 kb 2 kb

10 kb 10 kb 10 kb
espécimen

espécimen

espécimen

8 kb 8 kb 8 kb
2 kb 2 kb 2 kb
P

FIG. 2.-Verificación experimental de tres inversiones. Alineaciones genómicas de regiones de los cromosomas (A) 7, (C) 3 y (E) 1 del espécimen R con

las regiones cromosómicas correspondientes del espécimen P, los contigs de haplotipos correspondientes de los especímenes R y P y los
cromosomas tipo A correspondientes. Las alineaciones de avance a avance se muestran en magenta y las de avance a retroceso en cian. Las
ilustraciones bajo los alineamientos indican las posiciones de los cebadores PCR para la verificación experimental de la disposición genómica de estas
regiones. Estos cebadores se utilizaron para examinar qué conjunto proporcionaba una amplificación específica. Los productos PCR para los cromosomas

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(B) 7, (D) 3 y (F) 1 se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
Satou et al. GBE

8 Genome Biol. Evol. 13(6) doi:10.1093/gbe/evab068 Publicación anticipada 2 de abril de 2021

Polimorfismos de inversión
cromosómica
GBE
genómica para las mismas tres inversiones (fig. 3A-F). Para los
genomas de los especímenes R y P, respectivamente (fig. sitios de inversión en los cromosomas 3 y 7, todas las
suplementaria S7, Material suplementario en línea). muestras eran homocigotas y todos los haplotipos estaban
Entre ellos, 15 sitios eran comunes, y los 11 restantes eran en la misma dirección (fig. 3). Las direcciones de estos dos
específicos del espécimen R o P (fig. suplementaria S10 y sitios de las ocho muestras eran las mismas que las del tipo
tablas S3 y S4, Material suplementario en línea). Así pues, A. Para el sitio de inversión en el cromosoma 1, encontramos
nuestros datos indican que existen variaciones un individuo heterocigoto, que fue recogido en Plymouth (fig.
estructurales no sólo entre los animales de tipo A y los de 3F). La di- rección de este sitio en seis de los otros siete
tipo B, sino también entre los especímenes R y P. homocigotos

Variaciones estructurales entre los genomas de los

animales de tipo B

junio de 2023
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Para verificar experimentalmente las variaciones
estructurales entre las especi- mens R y P, nos centramos
en una inversión en el cromosoma 7 porque contenía el
mayor número de genes sobre un
región de ~900-kb (fig. 2A). Encontramos con- tigos de
haplotipos derivados de R que eran estructuralmente
diferentes del cromosoma del espécimen R, pero iguales
a los cromosomas del espécimen P y del tipo A. Esta
observación indicaba la posibilidad de que el genoma del
espécimen R sea heterocigótico en esta región. Esta
observación indicaba la posibilidad de que el genoma del
espécimen R fuera heterocigoto en esta región. La PCR
genómica utilizando cuatro cebadores que flanquean los
sitios de unión (fig. 2A) demostró que el espécimen R era
efectivamente heterocigoto en esta región y que el
espécimen P era homocigoto (fig. 2B).
También confirmamos experimentalmente una inversión en
el cromosoma 3, al que se asignaron siete genes. Los
alineamientos genómicos indicaron que el espécimen P
era heterocigoto, mientras que los dos haplotipos del
espécimen R compartían la misma estructura con el tipo A
(fig. 2C). Un análisis PCR demostró que el espécimen P
era efectivamente heterocigoto en esta región (fig. 2D).
Dado que las variaciones pequeñas o las variaciones en
regiones genómicas donde raramente se codifican genes o
donde se codifican genes menos conservados pueden no
detectarse con el método anterior, inspeccionamos
manualmente las alineaciones genómicas de los dos
especímenes de tipo B con el genoma de tipo A (fig.
suplementaria S2, Material suplementario en línea), y
encontramos nueve inversiones adicionales (tabla
suplementaria S5, Material suplementario en línea).
Cuatro y dos inversiones eran específicas del espécimen
R y del espécimen P, respectivamente. Verificamos
experimentalmente una de las nuevas inversiones
identificadas en el cromosoma 1 (~250 kb) (fig. 2E y F).
Es decir, el espécimen R era heterocigoto y el espécimen
P era homocigoto para esta inversión (invertida con
respecto al genoma tipo A).
Para entender la prevalencia de las inversiones que
encontramos en las poblaciones de tipo B, recogimos ocho
especímenes salvajes en Roscoff y Plymouth, RO1-RO4 y
PL1-PL4, respectivamente, y realizamos una PCR

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 genes candidatos, que están contenidos en las
En
Satoulosetespecímenes
al. de tipo B, el número de inversiones
fue opuesto al de los de tipo A. Así pues, los ani- males de
GBE
regiones invertidas, se enumeran en las tablas
suplementarias S4 y S5, Material suplementario en
tipo B presentan polimorfismos de inversión. Cabe línea. Dado que las regiones intergénicas son más
destacar que es probable que el número de inversiones variables que las regiones codificantes (fig. 1C-E), es
en las poblaciones de tipo B esté infravalorado en los posible que también estén implicados cambios no sólo en
análisis actuales, porque nuestros análisis sólo utilizaron las regiones codificantes, sino también en los elementos
órdenes de genes y alineaciones genómicas de 3 kb o reguladores.
más de longitud y porque nuestros análisis se limitaron a
dos especímenes de tipo B.
Por otra parte, no es probable que las poblaciones de
animales de tipo A conserven en gran medida
polimorfismos de inversión, por las dos razones
siguientes. En primer lugar, solo se identificó una
inversión (en el cromosoma 4) de la línea HT mediante
una comparación entre el genoma de la línea HT y la
versión KH del genoma derivada de un individuo de tipo A
diferente (Satou et al. 2019). En segundo lugar, el mapeo
de los datos del ensayo Hi-C, que se de- rivan de
animales salvajes, con el genoma de la línea HT identificó
solo una inversión en la misma ubicación en el cromosoma
4 (Satou et al. 2019). Por lo tanto, es probable que los
animales de tipo B tengan más polimorfismos de
inversión que los de tipo A.
Las inversiones pueden reducir la aptitud de los híbridos
postzigóticamente y reducir la eficiencia de la
recombinación meiótica en los heterocigotos (Zetka y Rose
1992; Dresser et al. 1994; Lamb et al. 2007; Massip et al.
2010; Kirkpatrick et al. 2012; Ederveen et al. 2015). Si la
menor aptitud de los híbridos contribuye realmente a la
separación entre animales simpátricos de tipo A y de
tipo B, la elevada tasa de polimorfismo de inversión en las
poblaciones de tipo B puede indicar que este grupo
puede estar separándose en otros subtipos. De hecho,
las altas tasas de heterocigosidad documentadas por el
presente estudio y por estudios anteriores (Tsagkogeorga
et al. 2012; Roux et al. 2013) indican una alta diversidad
de nucleótidos en los animales de tipo B, lo que apoya
esta idea.
Las inversiones suprimen localmente la recombinación
meiótica en heterocigotos. Las inversiones que
encontramos en el presente estudio son relativamente
pequeñas (3 kb ~ 873 k; tablas suplementarias S3 y S5,
Material suplementario en línea). Dado que se estima que la
tasa de recombinación en Ciona es de 25-49 kb/cM (Kano
et al. 2006), estas inversiones corresponden a 0,06-35 cM.
Aunque el cruce doble puede producir altos niveles de flujo
génico (cambio de alelos durante la meiosis en la oogénesis
heterocariotípica) en regiones cen- trales de inversiones
largas (Navarro et al. 1997), las inversiones que
encontramos son relativamente pequeñas y, por tanto,
no se esperan altos niveles de flujo génico. Como
resultado, las inversiones pueden desempeñar un papel
en la prevención del flujo génico en regiones invertidas
entre animales de tipo A y tipo B, y esta prevención puede
promover la adaptación local y la especiación (Noor et
al. 2001; Rieseberg 2001; Wellenreuther y Bernatchez
2018). A saber, es posible que una región invertida
contenga genes implicados en la adaptación local o la
especiación y que estos genes estén protegidos de los
flujos de genes entre animales de tipo A y tipo B. Los

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Polimorfismos de inversión
cromosómica
GBE

junio de 2023
Descargado de https://academic.oup.com/gbe/article/13/6/evab068/6209075 por un invitado el 13 de

FIG. 3. -Inversiones en animales salvajes. (A-F) PCRs genómicas para tres posiciones genómicas en los cromosomas (A, D) 7, (B, E) 3, y (C, F) 1 utilizando

ADN de animales recogidos en (A-C) Roscoff y (D-F) Plymouth. Los cebadores fueron los mismos que los utilizados en la figura 4, y los pares de
cebadores se muestran debajo de las fotografías. Como controles, también se incluyen las PCR genómicas realizadas con ADN de los especímenes R y P.
(G-I) Los resultados de la PCR genómica para las tres posiciones anteriores se ilustran respectivamente con la disposición en el genoma de tipo A.
Nota: Se solicita la sustitución de figuras.

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1
Satou et al. GBE
eliminar los huecos, los alineamientos se utilizaron para
Aunque la importancia de las inversiones se ha construir árboles filogenéticos moleculares por el método
documentado en insectos (Sturtevant y Dobzhansky de máxima verosimilitud con el programa PhyML
1936; Dobzhansky y Pavlovsky 1958; Carson et al. (Guindon y Gascuel 2003). Los árboles se probaron con
1967; Carson 1973; Noor et al. 2001; Ayala et al. 2013), 100 pseudoreplicados bootstrap.
aves (Kupper et al. 2016; Tuttle et al. 2016) y
mamíferos (Lemaitre et al. 2009), nuestros datos destacan Secuenciación del genoma
la probable importancia de las inversiones en la especiación En la secuenciación por nanoporos para la muestra R,
de Ciona, un invertebrado cuya maduración se rige por un kit de secuenciación por ligadura 1D, SQK-LSK109
interacciones de gametos acuáticos. Además, nuestros (Oxford Nanopore
datos genómicos proporcionan una plataforma para
diseccionar las bases moleculares de la especiación a

junio de 2023
Descargado de https://academic.oup.com/gbe/article/13/6/evab068/6209075 por un invitado el 13 de
nivel de secuencia de nucleótidos. De hecho, las
variaciones estructurales que encontramos incluyen
pequeñas variaciones que probablemente son imposibles de
encontrar mediante análisis citológicos.
En ausencia aparente de factores extrínsecos precigóticos y
postcigóticos.
barreras góticas a la hibridación, hay una tasa muy baja de
hibridación contemporánea entre los tipos A y B en simpatría
(Sato et al. 2012; Malfant et al. 2017). La explicación de esto
se ha buscado en varias barreras postzigóticas intrínsecas
sugeridas, incluyendo incompatibilidades genómicas en
híbridos de segunda generación (incompatibilidades
Dobzhansky-Muller) (Roux et al. 2013; Bouchemousse et
al. 2016; Malfant et al. 2018) e incompatibilidad
mitocondrial-nuclear (Ohta et al. 2020). Sugerimos que la
influencia de los grupos de ligamiento asociados con
inversiones cromosómicas frecuentes es un factor
contribuyente adicional, como se argumentó para la evolución
cromosómica de las especies de Ciona basándose en la
comparación de los genomas de C. intestinalis tipo A (C.
robusta) y C. savignyi (Satou et al. 2019).

Materiales y métodos
Materiales biológicos
Se obtuvieron dos ejemplares de C. intestinalis de tipo B de
poblaciones salvajes cercanas a las estaciones marinas de
Roscoff y Plymouth, respectivamente, para la
secuenciación del genoma. También se recogieron otros
animales salvajes en estos lugares.
Para confirmar que los animales que utilizamos para la
secuenciación genómica eran del tipo B, utilizamos
secuencias genómicas de cinco loci, Fgf4/5/6 (esta
anotación genética era probablemente incorrecta, porque
las secuencias encontradas en la base de datos pública
estaban todas mapeadas en una región dentro de un intrón
del gen receptor de Fgf), Foxa.a (fkh), Jade, Patched y
Vesicular acetylcholine transporter (vAChTP); se ha
informado de que estos loci son divergentes entre los dos
tipos (Nydam y Harrison 2011). Las secuencias recuperadas
de la base de datos pública de nucleótidos se alinearon
mediante el programa Clustal Omega (Sievers et al. 2011)
y, a continuación, se ajustaron manualmente. Tras

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 secuencias de los cebadores se muestran en la tabla
Technologies)
Polimorfismos de para
genoma
cromosómica
preparar una biblioteca. El ADN del
inversión
se esquiló con Megarupter (Diagenode) y se se realizó con Primestar Gxl (Takara Bio).
GBE
suplementaria S7, Material suplementario en línea. La PCR

secuenció en un PromethION con una celda de flujo

R9.4.1. En la secuenciación Nanopore para el
espécimen P, se utilizó un kit de secuenciación rápida
(SQK- RAD004, Oxford Nanopore Technologies) para
preparar una biblioteca, y la biblioteca se secuenció en
un MinION con una celda de flujo R9.4.1. Para la
secuenciación Illumina, se extrajo el ADN genómico de las
muestras R y P utilizando cloroformo de fenol e InnuPure
C16 touch con smart DNA prep Kit (Analytik Jena). Se
utilizó NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for
Illumina (New ENGLAND BioLabs) y KAPA HyperPlus
Library Preparation Kit (Roche). Para la secuenciación se
utilizó la plataforma Illumina (Hiseq2500 y NovaSeq6000).
Para la secuenciación PacBio RSII se utilizó un kit de
preparación de plantillas SMRTbell Template Prep Kit 1.0
(Pacific Biosciences) para preparar una biblioteca, que se
secuenció utilizando un secuenciador PacBio RSII que
empleaba la química P6- C4 con películas de 360
minutos de duración.
El ensamblaje de los contigs se realizó utilizando el
programa NECAT con los parámetros predeterminados
(Chen et al. 2021). A continuación, los contigs se
pulieron utilizando Nextpolish (Hu et al. 2020) con
lecturas de Illumina obtenidas de los mismos
especímenes. Los posibles contigs haplotípicos se
identificaron utilizando el programa purge_dups (Guan et al.
2020); para el espécimen R, se utilizaron lecturas de
PacBio, y para el espécimen P, se utilizaron las lecturas de
Illumina antes mencionadas. Los contigs se alinearon con
el genoma de un animal tipo A criado (HT-line) (Satou et al.
2019) utilizando Nucmer (Kurtz et al. 2004). Tras la
inspección manual, se unieron los contigs. Se
insertaron 500 "N" entre contigs.

Estimación del tamaño del genoma

Los tamaños de los genomas de los especímenes R y P se
estimaron contando todos los posibles 21-mers con Jellyfish
(Marcais y Kingsford 2011) y analizándolos con
Genomescope (Vurture et al. 2017).

Alineaciones genómicas
Se realizaron alineaciones por pares entre el genoma
de tipo A y el genoma del espécimen R o P con Nucmer
(Kurtz et al. 2004). Se eliminaron las alineaciones cortas
de <1.000 bases. Las regiones codificantes completas, los
exones individuales, los intrones, las regiones upstream y
las regiones intergénicas se dedujeron del conjunto de
modelos de genes KY, que se hicieron para el genoma
de tipo-A (Satou et al. 2019), y estas secuencias de
nucleótidos se mapearon con BLAT (Kent 2002). El orden
de los genes en el genoma tipo-A se comparó con el
orden de los genes mapeados en los genomas tipo-B.

Validación experimental de las inversiones

Para confirmar las inversiones encontradas en los
ensamblajes genómicos, realizamos la PCR. Las

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3
Satou et al. GBE
mosomes. BMC Genomics 16:89.
Material complementario
Los datos suplementarios están disponibles en Genome
Bio logy and Evolution online.

Agradecimientos
Este estudio ha sido financiado en parte por el Centre Nati
onal de la Recherche Scientifique (CNRS), la Universidad
de la Sorbona, la Fondation ARC pour la Recherche sur le
Cancer (Gra nt No. PJA 20131200223), la Agence

junio de 2023
Descargado de https://academic.oup.com/gbe/article/13/6/evab068/6209075 por un invitado el 13 de
Nationale de la Recherche (Grant No. ANR-17-CE13-
0003-01) a H.Y. y, por Ray Lankester Investigatorship
from the Marine Biological Association of the UK, Japan
Society for the promotion of Science (Grant No.
17K15167), and Human Life I nnovation Center at
Ochanomizu University a A.S.

Disponibilidad de datos
Los datos subyacentes a este artículo están disponibles en
las bases de datos DRA/SRA y DDBJ/EMBL/GenBank en
https://www. ddbj.nig. ac.jp/index-e.html y se puede
acceder a ellos con D RR253163- DRR253180,
BNKA01000001-BNKA01000306, y
BNJZ01000001–BNJZ01000518. Los da ta restantes
están disponibles en el artículo y en su Material
suplementario en línea.

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