CLASES 10. Cultivo in Vitro

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU
FACULTAD DE AGRONOMIA
FITOMEJORAMIENTO GENERAL
23/12/2020
CULTIVO IN VITRO EN EL
FITOMEJORAMIENTO
M. Sc. Doris Marmolejo Gutarra

TOTIPOTENCIA
 Capacidad de regeneración de una planta entera a partir de

explantos (tejidos vegetales), de una célula o un grupo de células en
cultivos in vitro.
Cultivo de explantos
In vitro
CULTIVO IN VITRO
 Consiste en cultivar TEJIDOS VEGETALES Y CÉLULAS en medios de

cultivo.
 Es decir, permite regenerar plantas funcionales a partir de tejidos

embrionarios, fragmentos de tejidos, callos, células aisladas o
protoplastos.
TERMINOLOGIAS Y TECNICAS
EXPLANTO
Porción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo in vitro.
ESTERILIZACION
Procedimiento para la eliminación de microorganismos.
AUTOCLAVE
Para la esterilización del tubo y/o placa petri conteniendo el medio y el explanto, bajo presión (121°C,
10 - 20 min).
REQUERIMIENTOS PARA ASEPSIA
Desinfección de superficie del explanto: Hipoclorito comercial diluido, evita desarrollo de

microorganismos.
Cámara de flujo laminar: área de trabajo, mantenida

estéril por el flujo continuo.
CAMARA DE CULTIVO
 Receptáculo diseñado que permite el control de algunas

variables del ambiente físico.
 Generalmente se controla la temperatura, la iluminación y el

fotoperiodo; y con menos frecuencia la humedad del aire y
su composición.
Control de temperatura
 Se efectúa mediante un sistema de refrigeración-

calefacción, controlados a través de un termostato.
 El medio MS, o Murashige y Skoog (1968), utilizado para la regeneración de
plantas.
 El medio B5 o de Gamborg et. al. (1968), o sus derivados, para el cultivo de

células y protoplastos, también en regeneración de plantas.
PRINCIPALES HORMONAS VEGETALES DE
CRECIMIENTO
HORMONAS REGULADORAS DE CRECIMIENTO
(Producidas por las plantas)
(Aplicaciones exógenos)
 ACIDO ABSCÍSICO
 GIBERELINAS
 AUXINAS
 ETILENO
 CITOQUININAS
1. ACIDO ABSCÍSICO (ABA)
Funciones:
 Causa latencia y abscisión de yemas.
 Permite desarrollo y maduración de embriones somáticos, impidiendo su germinación precoz.
 Función de protección en plantas frente al estrés hídrico, reduce la transpiración a corto plazo y a largo
plazo induce la síntesis de proteínas aumentando la tolerancia a la desecación.
 La aplicación exógeno de ABA sobre hojas produce el cierre rápido de los estomas.
2. ACIDO GIBERÉLICO
Induce al crecimiento del tallo, en plantas con roseta y en variedades de plantas de porte bajo.
Promueve la elongación celular previa a la fase de división, en células jóvenes de los meristemos
subapicales.
Induce a la floración en variedades tardías.
Inhibe la floración en angiospermas leñosas y en los frutales, en coníferas inducen floración precoz.
Suplen los requerimientos de luz o frío que precisan muchas semillas para germinar.
Promueve la germinación tras la dormición producida por el ABA.
3. ETILENO
 Coordina y regula numerosos procesos del crecimiento y de la senescencia de las plantas.
 Actúa coordinando las distintas respuestas fisiológicas, no solo ante situaciones adversas, sino
también ante una variedad de estímulos y procesos del desarrollo.
4. AUXINAS
 Promueve dominancia apical.
 Favorece el enraizamiento de esquejes en cultivo in vitro.
 Promueve extensión y elongamiento de plántulas.
 Promueve formación de raíces adventicias
 Inducen la reorientación de microfibrillas de celulosa de células que han dejado de crecer
promoviendo su elongación.
5. CITOQUININAS
Favorecen la embriogénesis.
Controlan el crecimiento de brotes y hojas.
Están implicadas en el control de la senescencia y en algunas especies puede producir el
reverdecimiento de hojas que están ya amarillas.
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (explantos)
 Los EXPLANTOS provienen de tejidos vegetales, como: tallos, hojas, raíces,

pecíolos, hipocótilos, embriones o meristemos, etc.
A B C D E
Figura 1. Regeneración de plantas in vitro mediante el cultivo de tejidos.
A) Fuente del explanto de tejido. B) Cultivo del explanto en medio de agar.

C) Producción del callo. D) Plántula regenerada. E) plántula trasplantada en
suelo estéril.
TECNICAS DEL CULTIVO
IN VITRO
1. Reproducción comercial
 Numerosas especies
ornamentales son cultivadas
In vitro, para ser vendidas
como plántulas formadas en
medios artificiales de cultivo, en
frascos o tubos, para luego ser
trasplantados a macetas.
Aplicaciones comerciales
 La propagación in vitro es a gran escala.
 Se práctica en el caso de plantas ornamentales: orquídeas, azucenas, narcisos, claveles, dalias,

crisantemos, etc.
 En otros cultivos hortícolas, como la papa, el espárrago, la fresa, etc.
 También en varias plantas herbáceas y ornamentales que producen muy poca semillas.
2. Producción de plantas libres de virus
 El cultivo in vitro de meristemos, producen plantas libres

de virus en frutales, papa, hortalizas y otros cultivos.
 Debido a que el MERISTEMO carece de tejidos

vasculares por donde generalmente se propagan los
virus que van contaminando a la planta.
 Además, el meristemo ápical tiene mayor velocidad de

crecimiento ganando al virus.
Figura 3. Cultivo de meristemo apical.
A) Meristemo apical en el que se observa la sección que se va separar. B) Meristemo apical separado
creciendo en medio de agar. C) Plántulas regenerada a partir de meristemo apical separado. D) plántula
transferida a suelo estéril. E) Planta libre de virus creciendo en suelo natural.
 Secuencia de la regeneración de bananos a través del cultivo de
Meristemos.
3. CONSERVACION IN VITRO DE GERMOPLASMA
 El material genético conservado en banco in vitro, es a

corto, mediano y largo plazo en un espacio más reducido y a
menor costo.
Limitación del crecimiento
Se debe lograr el mínimo crecimiento de las plántulas

conservadas in vitro, a través de la reducción de las sales
minerales, o el uso de inhibidores osmóticos como el manitol.
 Las colecciones de las especies de reproducción clonal y de

semillas recalcitrantes, son conservadas en BANCOS DE
CULTIVO IN VITRO, utilizando en el medio de cultivo
retardadores del crecimiento (cicoccel y el ácido abscísico).
 En la conservación de germoplasma no utilizar el regulador
de crecimiento 2,4,D; ya que produce variación genética
(CALLOS).
Callos
 Proliferaciones de células que presentan una variación
somaclonal (variación genética) en los explantos.
CRIOCONSERVACIÓN
(-196ºC en NL).
 Conservación por congelamiento a largo plazo de germoplasma

vegetativo.
 Conservación mediante la combinación del cultivo de meristemos

apicales con la crioconservación.
 Facilita el intercambio de material fitogenético libre de patógenos a nivel
internacional.
Contenedor
4. Cultivo de óvulos y embriones
4.1. Cultivo de óvulos

Procedimiento muy complejo debido a que, la manipulación del material es
difícil.
El óvulo es una estructura delicada, muy pequeña, altamente hidratada,
que puede ser dañada con suma facilidad.
Es necesario realizar la microcirugía con rapidez para evitar que los tejidos
sufran desecación durante el proceso.
4.2. Cultivo de embriones
 Los embriones híbridos que resultan de cruzas entre especies diferentes,

suelen ser débiles e incapaces de sobrevivir a causa de la inadecuada nutrición
por el endospermo.
 Los embriones interespecíficos pueden abortar o disminuir de volumen poco

después de que se ha formado el cigoto y no llegan a formar semillas viables.
 Es posible salvar estos embriones inmaduros mediante el RESCATE DE

EMBRIONES y lograr que crezcan, germinen y se desarrollen en plántulas
mediante el cultivo de embriones. (Ver fig. 4).
Figura 4. Cultivo de embriones. A) Proembrión separado de tres a cinco días después

de la polinización. B) Proembrión cultivado en agar sólido. C) Desarrollo de la plántula
a partir del embrión. D) Plántula transplantada en suelo.
“Rescate de embriones”
 Consiste en aislar los embriones de una planta y cultivarlos
en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales
que les permita concluir su desarrollo normal y germinar.
 Rescatar los embriones abortivos derivados de la

hibridación interespecífica o intergenérica.
5.1. CULTIVO DE ANTERAS
 Consiste en cultivar in vitro anteras que contienen

microsporas o granos de polen inmaduros en un
medio nutritivo con el propósito de obtener plántulas
haploides.
 Al duplicar el número cromosómico de la plántula

haploide (COLCHICINA), se obtendrá una planta
diploide totalmente homocigótica, que se conoce
como “haploide duplicado” o “doble haploide” (líneas
puras).
FACTORES QUE AFECTAN LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS HAPLOIDES MEDIANTE
CULTIVO DE ANTERAS
 Muchas especies, requieren cultivar anteras en el momento de la

formación de las microsporas, en la primera división
 En algunas especies, se cultivan pedúnculos florales que han sido

aislados en un medio nutritivo, esto aumenta la producción de
plántulas.
 La formulación óptima del medio nutritivo varía con la especie y en

ocasiones con los genotipos dentro de la especie.
6. Producción de variación somaclonal
 En la multiplicación vegetativa in vitro, se utiliza en el medio de

cultivo el regulador de crecimiento 2,4,D. Es una Auxina que induce
a la formación de callos, produciéndose así la variación somaclonal.
Figura 62. variación Somaclonal. A) Planta haploide a partir de la cual se obtuvo el
tejido cultivado. B) Cultivo en suspensión de células provenientes de la planta haploide.
C) Célula mutantes en el cultivo de suspensión. D) Agregado de células mutantes. E)
Planta haploide que presenta el carácter mutante.
Aspectos favorables de la variación somaclonal
 La variación somaclonal ocurre en el 15% de las plantas regeneradas.

Las mutaciones espontáneas son 1/1000 000.
 Las plantas somaclonales pueden estabilizarse en una generación, mientras que las mutaciones
requieren varias generaciones y retrocruzas.
 La regeneración de plantas actúa como un filtro que elimina casi todos los cambios deletéreos.
CAUSAS Y MANIFESTACIONES
La variación somaclonal puede causar una variación temporal o una variación genética.
POTENCIAL PARA MEJORAMIENTO
El principal beneficio de la variación somaclonal, es la obtención de variabilidad genética.

Los somaclonales mutantes pueden enriquecerse durante el cultivo in vitro en: resistencia a
enfermedades, herbicidas y tolerancia a estres quimicos.
En el futuro la variación somaclonal será muy útil para incorporar nuevos caracteres a una variedad, o
para modificar caracteres de una variedad.
7. Obtención de híbridos somáticos
 Se obtiene mediante la fusión de dos protoplastos

pertenenientes a especies diferentes.
 Caso:
papa x tomate
Protoplastos
Son células desprovistas de la pared celular, que

adopta una forma globosa en medio líquido.
Son obtenidos de preferencia a partir del mesófilo de
la hoja, también a partir de suspensiones celulares.
Las paredes celulares son quitadas por medio de
enzimas hidrolíticas y ajustando la pared osmótica para
que la membrana plasmática no se rompa.
8. Ingeniería Genética (trangénicos)
 Consiste en la transferencia de ADN de una especie

donadora a otra receptora por medio de un plásmido
bacteriano, virus u otro vector, o mediante
microinyección o algún instrumento biobalística.
 Las plantas que reciben el nuevo ADN se dice que son

TRANSFORMADOS, y se consideran como plantas
transgénicas (GM).
 La selección de plantas transgénicas se realiza en

cultivo in vitro.
Maíz Bt

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M. Sc. Doris Marmolejo Gutarra

 Capacidad de regeneración de una planta entera a partir de

 Consiste en cultivar TEJIDOS VEGETALES Y CÉLULAS en medios de

 Es decir, permite regenerar plantas funcionales a partir de tejidos

REQUERIMIENTOS PARA ASEPSIA

Desinfección de superficie del explanto: Hipoclorito comercial diluido, evita desarrollo de

Cámara de flujo laminar: área de trabajo, mantenida

 Receptáculo diseñado que permite el control de algunas

 Generalmente se controla la temperatura, la iluminación y el

 Se efectúa mediante un sistema de refrigeración-

 El medio B5 o de Gamborg et. al. (1968), o sus derivados, para el cultivo de

HORMONAS REGULADORAS DE CRECIMIENTO

(Producidas por las plantas)

 Causa latencia y abscisión de yemas.

 Permite desarrollo y maduración de embriones somáticos, impidiendo su germinación precoz.

 Coordina y regula numerosos procesos del crecimiento y de la senescencia de las plantas.

 Los EXPLANTOS provienen de tejidos vegetales, como: tallos, hojas, raíces,

Figura 1. Regeneración de plantas in vitro mediante el cultivo de tejidos.

A) Fuente del explanto de tejido. B) Cultivo del explanto en medio de agar.

 La propagación in vitro es a gran escala.

 Se práctica en el caso de plantas ornamentales: orquídeas, azucenas, narcisos, claveles, dalias,

 En otros cultivos hortícolas, como la papa, el espárrago, la fresa, etc.

 El cultivo in vitro de meristemos, producen plantas libres

 Debido a que el MERISTEMO carece de tejidos

 Además, el meristemo ápical tiene mayor velocidad de

Figura 3. Cultivo de meristemo apical.

 El material genético conservado en banco in vitro, es a

Limitación del crecimiento

Se debe lograr el mínimo crecimiento de las plántulas

 Las colecciones de las especies de reproducción clonal y de

 Conservación por congelamiento a largo plazo de germoplasma

 Conservación mediante la combinación del cultivo de meristemos

4. Cultivo de óvulos y embriones

4.1. Cultivo de óvulos

 Los embriones híbridos que resultan de cruzas entre especies diferentes,

 Los embriones interespecíficos pueden abortar o disminuir de volumen poco

 Es posible salvar estos embriones inmaduros mediante el RESCATE DE

Figura 4. Cultivo de embriones. A) Proembrión separado de tres a cinco días después

 Rescatar los embriones abortivos derivados de la

 Consiste en cultivar in vitro anteras que contienen

 Al duplicar el número cromosómico de la plántula

 Muchas especies, requieren cultivar anteras en el momento de la

 En algunas especies, se cultivan pedúnculos florales que han sido

 La formulación óptima del medio nutritivo varía con la especie y en

6. Producción de variación somaclonal

 En la multiplicación vegetativa in vitro, se utiliza en el medio de

 La variación somaclonal ocurre en el 15% de las plantas regeneradas.

POTENCIAL PARA MEJORAMIENTO

El principal beneficio de la variación somaclonal, es la obtención de variabilidad genética.

 Se obtiene mediante la fusión de dos protoplastos

Son células desprovistas de la pared celular, que

 Consiste en la transferencia de ADN de una especie

 Las plantas que reciben el nuevo ADN se dice que son

 La selección de plantas transgénicas se realiza en

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