CICLO SUPERIOR DE ANATOMÍA PATOLÓGICA Y CITODIAGNOSTICO MÓDULO BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

ÁCIDOS NUCLEICOS Y ENZIMAS ASOCIADOS

2.1 LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos son macromoléculas poliméricas encargadas de almacenar, transmitir y
expresar la información genética de los seres vivos.
Estas biomoléculas, de gran importancia biológica, se encuentran en todos los seres vivos bajo
dos formas:
El ácido desoxirribonucleico (ADN), que constituye el depósito en que se almacena la
información hereditaria y se controla su transmisión a la descendencia.
El ácido ribonucleico (ARN), que se encarga de la expresión de esta información
mediante la síntesis de proteínas.
En todo este flujo de información desde el ADN hasta la última fase de su expresión, las
proteínas, toma parte una serie de enzimas específicas que lo hacen posible. El conocimiento de
estas enzimas, que han sido aisladas de todo tipo de organismos (virus, bacterias y células eucariotas),
ha supuesto un gran avance y ha llegado a tener un papel decisivo entre las herramientas que se usan
en las técnicas de biología molecular.
En los siguientes apartados se abordará las características de la estructura química de los ácidos
nucleicos, los mecanismos de la expresión genética y las enzimas asociadas, contenidos básicos que se
necesita para adquirir antes de entrar en el estudio de las diferentes técnicas de la biología molecular,
que se irán abordando en las siguientes unidades.

2.1.1. ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN QUÍMICA

Los dos tipos de ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico
(ARN), se diferencian en su estructura y composición química, pero ambos están formados por largas
cadenas de monómeros denominadas nucleótidos.
Los nucleótidos son, por tanto, las unidades estructurales que se repiten en los ácidos nucleicos y
que van a intervenir en el mecanismo molecular que hace posible la transmisión de la información
genética.
Los nucleótidos son unidades monomér icas constituidas por una base nitrogenada, una
pentosa (glúcido de cinco átomos de carbono) y una molécula de ácido fosfórico en forma de
anión fosfato.
Tanto la base nitrogenada como los grupos fosfato están unidos a la pentosa.

- La base nitrogenada
Las bases nitrogenadas son compuestos heterocíclicos planos de carbono y nitrógeno con
diferentes radicales. Pueden ser de dos tipos:
Bases púricas. Derivan de la purina y son la adenina (A) y la guanina (G).

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Bases pirimidínicas. Derivan de la pirimidina y son la citosina (C), la timina (T) y el

uracilo (U).
La adenina, la guanina y la citosina están presentes tanto en el ADN como en el ARN. La
timina solo se encuentra en el ADN y el uracilo solo se encuentra en el ARN.

- La pentosa
La pentosa es un glúcido de cinco átomos de carbono que forma parte de la estructura de un
nucleótido. Puede ser de dos tipos:
D-ribosa, en los nucleótidos que componen el ARN.
2-desoxi-D-ribosa, en los nucleótidos que componen el ADN.

- El ácido fosfórico
El ácido fosfórico es el tercer componente de los nucleótidos, en los que se encuentra en forma
de anión fosfato o grupo fosfato (de fórmula PO4 3- ). El grupo fosfato tiene una estructura tetraédrica,
con el átomo de fósforo en posición central y los cuatro átomos de oxígeno ocupando los vértices del
tetraedro. Tiene carga negativa y es el responsable de que los ácidos nucleicos también tengan carga neta
negativa.

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- Nucleósidos:
La unión de una base nitrogenada con una pentosa constituye un nucleósido.
La combinación de una base nitrogenada con D-ribosa dará lugar a ribonucleósidos y con 2-
des-oxi-D-ribosa dará lugar a desoxirribonucleósidos.
La unión entre ambos se realiza mediante un enlace N-glucosídico entre el carbono C l, de la
pentosa y el nitrógeno N9 de una base púrica o el nitrógeno N1, de una base pirimidínica, con pérdida
de una molécula de agua.
Los nucleósidos se nombran añadiendo a la base nitrogenada:
La terminación -osina en el caso de las bases púricas.
La terminación -idina en el caso de las bases pirimidínicas.
Si la pentosa es la desoxirribosa, se añade el prefijo desoxi- al nombre.

- Nucleótidos, oligonucleótidos y polinucleótidos

La unión de un nucleósido con una molécula de ácido fosfórico en forma de anión fosfato
mediante un enlace éster origina un nucleótido. El enlace se origina entre el carbono C 5´, de la
pentosa y el ácido fosfórico, con pérdida de una molécula de agua.
Los nucleótidos que contienen 2-desoxi-D-ribosa se denominan desoxirribonucleótidos y son
los integrantes del ADN.
Los nucleótidos que contienen D-ribosa se de-nominan ribonucleótidos y son los integrantes
del ARN.
Los nucleótidos se nombran eliminando la «a» final del nombre del nucleósido del que
proceden y añadiendo la terminación «5'-fosfato».
Los nucleótidos se unen entre sí por el grupo fosfato mediante un enlace fosfodiéster
entre el carbono C5´, de un nucleótido y el carbono C 3´, del siguiente nucleótido, dando lugar a
cadenas lineales polinucleotídicas que constituyen los polinucleótidos o ácidos nucleicos. Cuando el
número de nucleótidos que integran la cadena no es muy grande, se habla de oligonucleótidos.
Toda cadena de nucleótidos tiene dos extremos libres: el extremo 5 ', con un grupo fosfato unido
al C5 ´, de la pentosa del primer nucleótido y el extremo 3', con un radical hidroxilo (-OH) unido al
C3 ´, de la pentosa del último nucleótido.

Formación de la timidina a partir de timina y ribo-sa Formación del timidin-5'-fosfato a partir de la timidina y
mediante un enlace N-glucosídico entre el carbono C l ´, de ácido fosfórico mediante un enlace éster entre el carbono
la ribosa y el nitrógeno N 1´ de la timina, con pérdida de una C5´ , de la ribosa y el ácido fosfórico, con pérdida de una
molécula de agua. molécula de agua.

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NOMENCLATURA DE LOS COMPONENTES QUÍMICOS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Síntesis y esquema de un oligonucleótido por formación de enlaces fosfodiéster

2.1.2. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

Las moléculas de ácidos nucleicos, constituidas por largas cadenas de nucleótidos, se
caracterizan por las siguientes propiedades fisicoquímicas:
Son fuertemente ácidas en solución acuosa debido a los grupos fosfato.
Presentan una elevada viscosidad incluso a concentraciones bajas.
Muestran un característico pico de absorción de luz ultravioleta a una longitud de
onda de 260 nm.
Esta propiedad resulta útil para determinar su concentración: midiendo la absorbancia de
una solución a 260 nm podremos determinar su concentración en ácidos nucleicos.
Las dos cadenas de nucleótidos que forman la doble hélice de una molécula de ADN se
pueden separar elevando la temperatura o aumentando el pH (pH alcalino). Este proceso
se denomina desnaturalización y se produce por la ruptura de los puentes de

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hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. La desnaturalización es

reversible, de manera que al disminuir la temperatura lentamente o bajar el pH hasta
valores neutros, se vuelven a formar los puentes de hidrógeno entre las bases
complementarias y la molécula de ADN recupera su conformación nativa en doble hélice.
Este fenómeno se denomina renaturalización.
Dos cadenas de ácidos nucleicos con una secuencia de bases nitrogenadas
complementaria, en condiciones adecuadas de temperatura, pH y fuerza iónica, se unen
mediante puentes de hidrógeno entre las bases complementarias en un proceso
denominado hibridación.

2.2. El ADN.
El ácido desoxirribonucleico (ADN) almacena la información genética de un individuo, la
transmite a los descendientes y dirige la síntesis de las proteínas.
En los organismos eucariotas, el ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las
células como parte de los cromosomas pero también existen pequeñas cantidades dentro de las
mitocondrias y en los cloroplastos.
En los procariotas, la mayor parte del ADN se encuentra en un solo cromosoma y en una menor
proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos. También algunos virus contienen
ADN como material genético.
Los organismos pluricelulares (animales, plantas, algas y hongos) y algunos unicelulares
(protozoos y algas unicelulares) están formados por células eucariotas; es decir, células formadas
por membrana, citoplasma con orgánulos y núcleo. Los organismos eucariotas, también reciben el
nombre de eucariontes.
Los organismos más primitivos son unicelulares procariotas; es decir, están formados por una única
célula sin núcleo diferenciado. Son las bacterias y las cianobacterias. También reciben el nombre de
procariontes.
Los virus son estructuras mucho más sencillas que una célula. Están formados por un fragmento de
material genético (ADN o ARN) y una cubierta de proteínas. En algunos casos pueden tener una
envoltura lipídica.

2.2.1. Estructura del ADN

El ADN es un polímero formado por largas cadenas de desoxirribonucleótidos (la pentosa es
siempre desoxirribosa) de adenina, guanina, citosina y timina (no contiene uracilo).

- Caracterización de una molécula de ADN

Una molécula de ADN se caracteriza por:
El tamaño, determinado por el número de desoxinucleótidos que contiene. Las
moléculas de ADN que forman los cromosomas son de gran tamaño, conteniendo
varios millones de pares de bases. Los plásmidos y las moléculas de ADN mitocondrial,
en cambio, tienen un tamaño de uno pocos miles de pares de bases.
La composición, referida a la proporción de cada desoxinucleótido. Los ADN aislados de
diferentes especies de organismos varían en la proporción de desoxirribonucleótidos que
contienen.
La secuencia de bases nitrogenadas. Además de la proporción de
desoxirribonucleótidos, en los ADN aislados de diferentes especies también varía el
orden o secuencia en que se sitúan las bases nitrogenadas.
De hecho, una molécula de ADN se representa abreviadamente por su secuencia de bases
nitrogenadas colocadas en dirección 5'- 3', lo que constituye su estructura primaria.
La estructura primaria de una molécula de ADN es la secuencia de bases nitrogenadas en
el esqueleto de su cadena de desoxinucleó tidos.

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A pesar de las variaciones que hay en el tama ño, la composición de bases y la secuencia de
las moléculas de ADN de diferentes especies, todas las moléculas de ADN bicatenario tienen
una característ ica común: la cantidad de adenina es igual a la de timina y la cantidad de
citosina es igual a la de guanina. ¿A qué se debe esta regularidad? La respuesta se encuentra en el
principio de complementariedad y en la estructura secundaria del ADN.

- El principio de complementariedad
Cuando algunos nucleótidos se enfrentan, se mantienen unidos mediante puentes de
hidrógeno entre los grupos polares de sus bases nitrogenadas. Esto solo se produce entre bases
nitrogenadas complementarias en función de su tamaño y su estructura. Concretamente, son
complementarias:
La adenina y la timina, entre las que se forman dos puentes de hidrógeno
(A=T).
La citosina y la guanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno
(C≡G).
Ninguna otra combinación de bases presenta complementariedad en el ADN. Esta propiedad
de los nucleótidos se conoce como principio de complementariedad.
Para que la unión sea estable, es necesario además que los dos nucleótidos que portan las bases
complementarias sitúen sus grupos fosfato en posiciones opuestas.

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- La doble hélice
En 1953 Watson y Crick propusieron un modelo para describir la estructura del ADN que
permite explicar el principio de complementariedad y que sostiene que el ADN es una doble hélice.
La configuración en doble hélice del ADN constituye su estructura secundaria y sostiene
que el ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos que forman una doble hélice alrededor de
un eje central.
Así, las moléculas de ADN de los seres vivos son bicatenarias (ADNds), es decir, están
constituidas por dos cadenas polinucleotídicas que cumplen las siguientes condiciones:
Las dos cadenas son antiparalelas. Los enlaces 5' - 3' están orientados en sentidos
opuestos, de manera que el extremo 5' de una cadena se enfrenta al extremo 3' de la
otra.
La secuencia de bases nitrogenadas de ambas cadenas es complementaria.
Es decir, si se conoce la secuencia de una de las cadenas se puede deducir la secuencia
de la otra cadena.
Ambas cadenas se mant ienen unidas por puentes de hidrógeno entre las bases
complementarias.

Forman una doble hélice. Las dos cadenas se enrollan alrededor de un eje
imaginario formando una doble hélice.
El enrollamiento es dextrógiro (giran hacia la derecha) y plectonémico (para separar
las cadenas hay que desenrollarlas previamente). El diámetro de la doble hélice es de 2
nm.
Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior. En el exterior de la doble hélice
se sitúan las cadenas de fosfato y desoxirribosa.
Las bases nitrogenadas se sitúan en el interior como si fuesen los peldaños de una
escalera de caracol, de manera que cada peldaño estaría formado por dos bases
nitrogenadas complementarias (una de cada cadena), enfrentadas y unidas por puentes
de hidrógeno, situadas perpendicularmente al eje de la hélice y paralelas entre sí.
Un giro de la doble hélice equivale a 10 nucleótidos. La separación entre dos pares
de bases consecutivos es de 0,34 nm. Una vuelta completa de la hélice contiene diez
pares de bases y, por lo tanto, tiene una longitud de 3,4 nm.
Como consecuencia de esta composición y estructura, se puede explicar ahora la regularidad en
la composición de bases que se había anunciado: cualquier molécula bicatenaria de ADN tiene
la misma proporción de bases púricas y pirimidínicas y, más concretamente, el contenido de
adenina es igual al de timina y el contenido de guanina es igual al de citosina.
Así, la molécula del ejemplo anterior tiene 12 adeninas y 12 timinas, 9 citosinas y 9 guaninas.
Como excepción a este modelo se encuentra el material genético de algunos virus, como los
parvovirus, al estar constituido por moléculas de ADN monocatenario (ADNss).

La longitud de una molécula de ADN se expresa habitualmente en pares de bases (pb):

1 pb = 1 par de bases.
1 kpb o kb (kilobase) equivale a 1000 pb (pares de bases).
1 Mpb o Mb (mega base), 106 pb.
1 Gpb o Gb (Gigabase) = 109 pb.

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2.2.2. ORGANIZACIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE ADN

Hay diferentes localizaciones en las que se encuentran las moléculas de ADN según el organismo
de procedencia (virus, organismos procariotas, organismos eucariotas).
También se puede obtener in vitro de forma artificial, el ADN copia, muy útil para realizar
estudios de expresión génica.
Todos estos tipos de ADN presentan diferentes niveles de organización según su procedencia.

En virus de ADN
Los virus presentan la mayor diversidad en cuanto a organización de su material genético.
En el caso de los virus que contienen ADN, presentan una única molécula que puede ser lineal o
circular, bicatenaria o monocatenaria.

En organismos procariotas:
En los procariotas, el ADN se encuentra en su mayor parte en un solo cromosoma y en una
menor proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos.

- Cromosoma bacteriano
Los organismos procariotas presentan una única molécula de ADN bicatenaria y circular de
gran tamaño denominada cromosoma bacteriano, que se
encuentra en el seno del citoplasma sin membrana
nuclear que lo separe de él.
Esta molécula de ADN contiene varios millones
de nucleótidos (el cromosoma de E. coli, por ejemplo,
tiene 4200 kb) y sus extremos están unidos
covalentemente, formando un anillo que se superenrolla
para poder empaquetarse en el interior de la célula.
En el microscopio electrónico este ADN empaquetado
se observa como una estructura clara de aspecto fibrilar
que se denomina nucleoide.

Distintos aspectos del nucleoide bacteriano en bacilos y cocos al

microscopio electrónico

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- Plásmidos
Algunas bacterias, además del cromosoma bacteriano, contienen pequeñas moléculas circulares
bicatenarias de ADN, denominadas plásmidos.
Algunas características de los plásmidos son:
Están formados por unos pocos miles de nucleótidos.
Su número oscila entre uno y varios cientos.
Se replican independientemente del cromosoma bacteriano.
En los organismos eucariotas, el ADN se encuentra principalmente en el núcleo de
las células como parte de los cromosomas, ADN cromosómico nuclear, pero también
existen pequeñas cantidades dentro de las mitocondrias, ADN mitocondrial, y en los
cloroplastos, ADN de cloroplastos.
Habitualmente contienen genes de resistencia a antibióticos y factores de virulencia.

En organismos eucariotas:

- ADN cromosómico nuclear

La mayor parte del ADN de las células eucariotas se encuentra en el núcleo en forma de largas
moléculas lineales bicatenarias. El ADN no se encuentra libre sino asociado a proteínas básicas. Estas
proteínas son de dos tipos:
Histonas, proteínas con una función estructural.
No histonas, proteínas muy hetereogéneas con funciones estructurales,
enzimáticas y reguladoras.
El complejo formado por el ADN y las histonas constituye la cromatina.
Vista al microscopio electrónico, una extensión de cromatina tiene el aspecto de un collar en el
que cada cuenta es un nucleosoma.
Un nucleosoma es la estructura cilíndrica formada por un octámero de histonas sobre la que se
enrolla la doble hélice de ADN.
La molécula de ADN asociada a las histonas se denomina fibra de cromatina.

La configuración tridimensional de la molécula de ADN formando las fibras de cromatina

representa la estructura terciaria del ADN.

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Estructura terciaria del ADN eucariótico.

La fibra de cromatina, a su vez, se enrolla sobre sí misma formando un solenoide. En el

momento de la división celular mitótica, las fibras de cromatina se ordenan y experimentan varios
niveles de superenrollamiento de complejidad creciente, hasta formar el cromosoma metafásico. El
número de cromosomas es característico de cada especie.

Representación esquemática de los distintos niveles

de enrollamiento y superenrollamiento del ADN
eucariótico desde la doble hélice hasta el cromosoma
metafásico

- ADN mitocondrial
Las células eucariotas presentan también ADN en sus mitocondrias. El ADN mitocondrial
(ADNmt) consiste en una molécula bicatenaria y circular de ADN de unos miles de nucleótidos (el
ADNmt humano contiene 16,5 kb).
Algunas de las características del ADNmt son:
Contiene genes que codifican para ARN ribosómico, ARN de transferencia y enzimas
empleadas en los procesos metabólicos que tienen lugar en la mitocondria, por lo que se

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conoce también como cromosoma mitocondrial (el ADNmt humano codifica 37

genes).
Se replica de manera independiente respecto al ADN nuclear.
Su número de copias por mitocondria es muy variable, puede llegar a varios cientos.

- ADN de cloroplastos
De manera análoga al ADN mitocondrial, las células vegetales tienen también ADN en los
cloroplastos, en forma de molécula bicatenaria y circular que codifica enzimas específicas de este
orgánulo.

- ADN COPIA
El ADN copia (ADNc) es un tipo de ADN especial obtenido in vitro. No existe como tal en la
naturaleza, se obtiene en el laboratorio a partir del ARN aislado de una célula, mediante una enzima
denominada retrotranscriptasa que sintetiza ADN utilizando como molde ARN.
Esta enzima permite obtener una copia en ADN de todas las moléculas de ARN presentes en
una célula en un estado metabólico concreto, lo que constituye una herramienta muy útil para
conocer la información almacenada en el ADN con los estudios de expresión génica.

2.3. EL ARN
El ácido ribonucleico controla la síntesis de proteínas a partir de la información conte nida
en el ADN.
En los organismos eucariotas se encuentra en el núcleo, en el citoplasma y en los ribosomas
del citoplasma. Algunos virus solo contienen ARN mientras que otros tipos de virus solo
contienen ADN.

2.3.1. Estructura del ARN

El ARN es un polímero formado por largas cadenas de ribonucleótidos (la pentosa es siempre
ribosa) de adenina, guanina, citosina y uracilo (no contiene timina). Algunas moléculas de ARN (por
ejemplo los ARN de transferencia) pueden contener pequeñas cantidades de otras bases nitrogenadas,
que normalmente son derivados metilados de las cuatro bases mayoritarias.
Salvo en el caso de algunos virus,
como los reovirus, cuyo material genético es
ARN bicatenario (ARNds), el ARN de los
seres vivos es monocatenario y lineal. Sin
embargo, algunas zonas de la molécula
pueden tener secuencias complementarias,
de manera que la cadena puede plegarse para
formar regiones de doble hélice
denominadas horquillas.
Si las regiones complementarias
están separadas por una secuencia no
complementaria, en el extremo de la
horquilla se forma un bucle. En el ARN, las
bases complementarias son adenina y
uracilo, entre las que se forman dos puentes
de hidrógeno (A=U); citosina y guanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno (C≡G).

2.3.2. Tipos y organización del ARN

Existen varios tipos de ARN que podemos clasificar según su estructura y función de la
siguiente manera:

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ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ANRr) y ARN de transferencia (ARNt),

como tipos prin-cipales.
Con función reguladora de la expresión génica: ARNsi, ARNmi
Otros tipos: ARNhn, ARNsn, ARNsno

ARN mensajero
El ARN mensajero (ARNm) está constituido por múltiples moléculas lineales de diferentes
tamaños, cada una de las cuales porta la información para la síntesis de una proteína. Supone entre el
2% y el 5% del ARN total de una célula.
Concretamente, su secuencia de bases nitrogenadas, copia exacta de la secuencia de un gen de
ADN, determina la ordenación secuencial de los aminoácidos que constituyen la proteína (un codón
constituido por tres bases codifica un aminoácido). En consecuencia, el ARNm transmite la
información genética contenida en el ADN a la maquinaria celular de síntesis de proteínas.
Las moléculas de ARNm procariota son policistrónicas, es decir, portan información para la
síntesis de varias proteínas distintas. Por el contrario, las moléculas de ARNm eucariota son
monocistrónicas, es decir, contienen información para la síntesis de una única proteína.

ARN ribosómico
El ARN ribosómico (ARNr) es el mayoritario en las células (aproximadamente el 80%).
Combi-nado con proteínas forma los ribosomas, orgá-nulos citoplasmáticos responsables de la síntesis
de proteínas.
Los ARNr se clasifican según su coeficiente de sedimentación:
En las células procariotas hay tres tipos: 5S, 165 y 23S.
En las células eucariotas hay cuatro tipos: 5S, 5.8S, 18S y 28S.
Presentan múltiples regiones complementarias, por lo que tienen una estructura secundaria
muy compleja, con numerosas horquillas y bucles.

ARN de transferencia
Los ARN de transferencia (ARNt) transportan los aminoácidos hasta los ribosomas para su in-
corporación en la cadena proteica que se está sintetizando.
Consisten en cadenas cortas (70-90 nucleótidos) con una estructura secundaria en forma de
hoja de trébol constituida por cuatro horquillas y tres bucles o lazos. Esta estructura secundaria se
pliega tridimensionalmente en una estructura terciaria en forma de L o bumerán.

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El extremo 3' de todos los ARNt termina con la se-cuencia 5'-CCA-3' y es el sitio de unión del
aminoácido que portan. Otra característica es que contienen hasta un 10% de bases nitrogenadas
distintas de las habituales, como la dihidrouridina (DHU o UH2), metilguanosina (mG), dimetilguanosina
(m2G), pseudouridina (Ψ) y metilinosina (ml). Incluso pueden contener timina.
Los tres lazos son regiones funcionales de la molécula:
El lazo D (por contener dihidrouridina) es el sitio de unión de la enzima encargada de
unir el aminoácido correspondiente al extremo 3'.
El lazo T (por contener la secuencia TΨC) es el sitio de unión al ribosoma.
El lazo anticodón contiene las tres bases complementarias del codón en el ARNm que
codifica para el aminoácido que porta.

ARN con función reguladora

Se conocen varios tipos de ARN que toman parte en la regulación de la expresión génica. Son
moléculas pequeñas con secuencias complementarias de regiones específicas de ARNm. Algunas de
estas moléculas son bicatenarias (ARN interferente pequeño o ARNsi) y otras son monocatenarias
con regiones complementarias que forman una horquilla (microARN o ARNmi). Estas moléculas se
unen a las regiones complementarias del ARNm y bloquean la traducción a proteína o activan enzimas
que degradan el ARNm.

- OTROS TIPOS DE ARN

ARN heterogéneo nuclear (ARNhn). Es una mezcla de largas moléculas lineales precursoras
del ARNm (pre-ARNm). Se encuentra en el núcleo de la célula y tras un proceso de
maduración dan lugar al ARNm, que sale al citoplasma.
ARN pequeño nuclear (ARNsn). Es un conjunto de pequeñas moléculas de ARN que se
localizan en el núcleo y se unen a proteínas, dando lugar a ribonucleoproteínas con actividad
enzimática. Concretamente intervienen en la maduración del ARNm.
AN pequeño nucleolar (ARNsno). Se localiza en el nucléolo y es el precursor de varios ARNr.
Tiene un coeficiente de sedimentación de 45S y cuando se fragmenta da lugar a los ARNr 5.8S,
18S y 28S.

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2.4. EL FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

El ADN almacena la información genética de un individuo, la transmite a los descendientes y
dirige la síntesis de las proteínas. Para que el ADN pueda llevar a cabo estas funciones son necesarios
tres procesos metabólicos principales: la replicación, la transcripción y la traducción.
El ADN contiene la información genética de un organismo, la cual se tiene que transmitir
íntegramente a la descendencia. Ello implica duplicar, en el caso de las células, o multiplicar, en el
de los virus, el material genético mediante la síntesis de nuevas moléculas de ADN con una
secuencia idéntica a la de las moléculas parentales. Este proceso se denomina replicación.
Por otro lado, el ADN almacena la información para la síntesis de proteínas. Pero el ADN
está en el núcleo y la síntesis de proteínas tiene lugar en el citoplasma. En consecuencia, es necesario
un flujo de información genética desde el ADN hasta las proteínas.
Esto se consigue mediante los procesos de transcripción que consisten en la síntesis de
moléculas de ARNm, con la misma secuencia que los genes de ADN, encargadas de transportar la
información al citoplasma y de traducción, por el que la secuencia de bases del ARNm se transforma
en la secuencia de aminoácidos de una proteína.
Si tenemos en cuenta que algunos tipos de virus cuyo material genético es ARN son capaces
de replicar su ARN e incluso otros son capaces de sintetizar ADN a partir de su ARN
(transcripción inversa), podemos esquematizar el flujo de la información genética desde el ADN
hasta su última etapa, que es la síntesis de proteínas, de la siguiente manera:

Flujo de información genética que interrelaciona ADN, ARN y proteínas.

Los procesos en rojo solo se producen en algunos tipos de virus ARN

2.4.1. REPLICACIÓN DEL ADN

La replicación de ADN es el proceso por el cual una molécula de ADN se duplica para dar
lugar a dos moléculas de ADN hijas idénticas, que conservan la misma secuencia de bases que la
molécula inicial.
Por lo tanto, mediante la replicación el ADN se copia para transmitirse a la descendencia.

- Características generales de la replicación

La replicación presenta varias características
comunes a procariotas y eucariotas:
Es semiconservativa. En cada molécula
hija, una de las cadenas procede de la
molécula original que se replica y la otra
cadena es de nueva síntesis.

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Comienza en un origen de replicación. La replicación comienza en unos puntos de

iniciación concretos denominados orígenes de replicación. El cromosoma
bacteriano de procariotas tiene un único origen de replicación, mientras que en los
cromosomas eucariotas hay muchos, por lo que la replicación se inicia de manera
simultánea en varios puntos de cada cromosoma.
Es bidireccional y secuencial. A partir del origen de replicación, las dos cadenas de
ADN molde se separan y la síntesis de las nuevas cadenas se produce en ambas
direcciones, lo que da lugar a dos horquillas de replicación.
Es semidiscontinua. La síntesis de las cadenas nuevas se produce siempre en dirección 5'-
3', por lo que la cadena molde tiene que leerse en dirección 3'-5'. Al ser bidireccional
desde el origen de replicación, se plantea un problema: en uno de los sentidos, la
cadena nueva puede crecer de manera continua a medida que avanza la horquilla de
replicación, puesto que la hebra molde se lee en la dirección correcta 3'-5', pero en el
sentido contrario la cadena nueva no se puede sintetizar de manera continua porque se
tendría que leer la hebra molde en la dirección incorrecta 5'-3'. Por ello, a uno de los
lados del origen de replicación, la nueva cadena se sintetiza de manera discontinua, en
forma de fragmentos denominados fragmentos de Okazaki. La hebra que se sintetiza de
manera continua se llama hebra adelantada o conductora y la hebra que se sintetiza a
fragmentos se denomina hebra retardada.

Replicación semidiscontinua y bidireccional del ADN. En cada horquilla de

replicación una de las nuevas cadenas se sintetiza de manera continua
(hebra conductora) y la otra se sintetiza de manera discontinua mediante
fragmentos de Okazaki (hebra retardada).

- Las enzimas del proceso de replicación

La replicación del ADN es un proceso complejo se puede dividir en fases y en el que
participan múltiples enzimas. La explicación de las fases en que se produce será más fácil si se conocen
antes las enzimas que toman parte en él:
Helicasa. Desenrolla y separa las dos cadenas de la doble hélice. Empieza en el
origen de replicación y continúa en ambos sentidos a medida que avanzan las
horquillas de replicación.
Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP). Se unen a las cadenas desenrolladas
evitando que se vuelva a formar la doble hélice.
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Girasa y topoisomerasa. La separación de las dos cadenas de ADN en la burbuja de

replicación genera un superenrollamiento en el resto de la doble hélice. Estas dos
enzimas relajan la tensión de la doble hélice mediante cortes y empalmes.
ADN polimerasa. Es la responsable de la síntesis de la nueva cadena, añadiendo
desoxinucleótidos al extremo 3' de una cadena en crecimiento. La ADN polimerasa
no puede iniciar una cadena, solo puede elongar una preexistente de ADN o ARN,
añadiendo desoxinucleótidos a la posición 3' libre. La secuencia de desoxinucleótidos
que incorpora es complementaria de la secuencia de la cadena mo lde que se está
leyendo.
En procariotas existen tres tipos de ADN polimerasas, que se nombran con números
romanos: 1, 11 y III. En eucariotas existen cinco tipos, que se nombran con letras griegas: ɑ,
β, y, δ. ƹ.
Además de la función polimerasa, estas enzimas tienen también actividad exonucleasa,
es decir, son capaces de eliminar nucleótidos uno a uno desde un extremo de la cadena.
Esta actividad es muy útil para corregir y reparar errores.
Primasa. Es una enzima con función ARN polimerasa que sintetiza cortos fragmentos de
ARN (aproximadamente 10 nucleótidos) denominados cebadores o primers,
complementarios de zonas concretas de la cadena de ADN que se está replicando. De
esta manera, sobre la cadena molde se forman cortas regiones de híbridos ARN-ADN
que son reconocidas por la ADN polimerasa para iniciar su función de elongación. Para
la síntesis de la hebra conductora se requiere un único cebador en el origen de la
replicación. En la hebra retardada, por el contrario, se requiere un cebador para cada
fragmento de Okazaki.

Ligasa. Es la enzima responsable de unir los fragmentos de Okazaki entre sí y con la

hebra conductora para conseguir la continuidad de la cadena de nueva síntesis.

- Fases de la replicación
Aunque existen diferencias entre el proceso de replicación en procariotas y eucariotas, el
desarrollo del proceso en procariotas nos servirá como explicación de las fases de la replicación; sobre
esta veremos las variaciones que se producen en eucariotas.
La replicación en procariotas se puede dividir en dos fases: iniciación y elongación.

-Fase de iniciación
La replicación se inicia cuando proteínas específicas reconocen el origen de replicación y se
unen a él. Esta unión activa las helicasas, que rompen los puentes de hidrógeno entre bases
complementarias y separan las dos cadenas de ADN, con lo que se forma una burbuja de replicación.
Las SSBP se unen a las cadenas separadas e impiden que se vuelva a formar la doble hélice. Si-
multáneamente se activan las girasas y topoisomerasas que relajan la tensión de la zona de doble
hélice próxima a la burbuja de replicación. La acción de la helicasa permite que la burbuja de
replicación se extienda en los dos sentidos a lo largo del cromosoma, generándose dos regiones en
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forma de Y en los extremos de la burbuja denominados horquillas de replicación, donde se van a

sintetizar las nuevas cadenas de ADN.
- Fase de elongación
En la siguiente figura se esquematizan los distin-tos procesos que tienen lugar durante la fase
de elongación.

1. La primasa sintetiza los cebadores en dirección 5'—›3'. En la hebra conductora solo se

requiere un cebador inicial en el origen de replicación, puesto que la elongación de la
cadena se produce en el mismo sentido en que avanza la horquilla de replicación. En la
hebra retardada, por el contrario, la primasa sintetiza un primer ceba-dor en una zona
próxima a la horquilla inicial de replicación y alejada del origen de replicación, pero, a
medida que la horquilla de replicación avanza, se requiere la síntesis sucesiva de
nuevos cebadores que darán lugar a los fragmentos de Okazaki.
2. La primasa se separa de la cadena molde y entra la ADN polimerasa III que inicia la
elongación del cebador mediante la incorporación de desoxinucleótidos en la posición 3'
libre. A medida que crece la cadena, la ADN polimerasa III se va desplazando sobre la
cadena molde, «leyendo» su secuencia e incorporando secuencialmente los
desoxinucleótidos complementarios. En la cadena conductora, la elongación de la
cadena continúa hasta que se fusionan ambas horquillas de replicación (hay que
recordar que el cromosoma bacteriano es circular). En la cadena retardada la ADN
polimerasa se separa de la cadena molde cuando la elongación de la cadena alcanza el
cebador del fragmento de Okazaki anterior.
3. La ADN polimerasa I se une a la cadena a nivel de los cebadores, los elimina mediante su
actividad exonucleasa 5'—›3' y los sustituye por ADN mediante su actividad polimerasa.
4. La ligasa une los fragmentos de Okazaki consecutivos, dando continuidad a la hebra
retardada.
Los posibles errores en la incorporación de bases se reparan gracias a la actividad exonucleasa
de la ADN polime-rasa III.
La replicación en eucariotas a grandes rasgos es similar a la de procariotas con algunas
peculiaridades:
Los orígenes de replicación son múltiples, por lo que se inicia simultáneamente en
varios puntos de cada cromosoma.
Hay cinco tipos de ADN polimerasas, que se reparten las tareas de elongación,
eliminación de cebadores y corrección de errores.
El ADN eucariótico se encuentra unido a histonas, por lo que durante la replicación se
van estructurando también los nucleosomas.

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2.4.2.TRANSCRIPCIÓN DEL ADN A ARN

La transcripción es el proceso por el cual se sintetiza una molécula de ARN utilizando
como molde una cadena de ADN.

- Las enzimas del proceso de transcripción

Este proceso requiere una enzima denominada ARN polirnerasa-ADN dependiente o
transcriptasa:
En procariontes solo existe un tipo de ARN polimerasa.
En eucariontes existen tres tipos:
o ARN polimerasa 1, responsable de la síntesis de la mayor parte del ARNr.
o ARN polimerasa 11, responsable de la síntesis del ARNm.
o ARN polimerasa 111, responsable de la síntesis del ARNt y de la subunidad 5S del
ARNr.

- Fases de la transcripción
El proceso se realiza en tres fases: iniciación, elongación y terminación.

1- Fase de iniciación
La transcripción se inicia cuando la ARN polimerasa reconoce una zona de la
molécula de ADN, llamada promotor que se localiza inmediatamente antes de la región del
ADN que se va a transcribir y que tiene una secuencia de bases específica y se une a ella.
La unión de la ARN polimerasa al promotor determina que las dos cadenas de la doble hélice
se separen y se pueda iniciar la síntesis de una cadena de ARN mediante la incorporación de
nucleótidos.
2- Fase de elongación
Consiste en la adición secuencial de ribonucleótidos catalizada por la ARN polimerasa.
De las dos cadenas de la molécula de ADN solo se transcribe una de ellas, llamada cadena molde
o cadena codificadora. La cadena que no se transcribe se denomina cadena no molde, cadena
informativa o cadena sin sentido.
Durante la fase de elongación, la ARN polimerasa se desplaza a lo largo de la cadena
molde en dirección 3' 5', «leyendo» la secuencia de bases, seleccionando el
ribonucleótido que tiene una base nitrogenada complementaria de la del ADN e
incorporándolo a la cadena de ARN en crecimiento mediante la formación de un enlace
fosfodiéster. En consecuencia el crecimiento de la cadena de ARN tiene lugar en dirección
5´ 3´.

Transcripción de ADN a ARN, fase de elongación. 18

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3- Fase de terminación
La síntesis de ARN termina cuando la ARN polimerasa alcanza una secuencia específica
en la molécula de ADN denominada señal o secuencia de terminación. En ese punto, la cadena
de ARN se separa del ADN y de la enzima, la ARN polimerasa se separa del ADN y la
molécula de ADN recupera su estructura en doble hélice.

- Maduración del ARN

La maduración es el proceso que requieren las cadenas de ARN transcritas para dar lugar a los
tipos principales de ARN que se han explicado (ARNt, ARNr, ARNm).
Este proceso es diferente en procariotas que en eucariotas.

* Maduración del ARN en procariontes

En los organismos procariotas los ARNt y ARNr se sintetizan en forma de largas moléculas de
ARN, denominadas transcritos primarios, que contienen numerosas copias de cada uno de ellos. Estos
transcritos son posteriormente cortados por enzimas específicas para dar lugar a los distintos tipos de
ARNt y ARNr.
Por el contrario, el ARNm transcrito no requiere ninguna modificación posterior. De hecho la
traducción a proteína se inicia incluso antes de que termine la transcripción, ya que los ribosomas se
pueden acoplar al extremo 5' libre de la cadena de ARNm en crecimiento.

* Maduración del ARN en eucariontes

En los organismos eucariotas, la maduración de los ARNt y ARNr es similar a como sucede en
procariontes, pero por el contrario el ARNm requiere un proceso complejo de maduración antes de
poderse traducir a proteína. Esto es debido a que en la mayoría de los genes eucariotas se alternan dos
tipos de secuencias, denominadas intrones y exones.
Los exones son secuencias que se transcriben y se traducen, ya que portan información para la
síntesis de una región de una proteína.
Los intrones son secuencias que se transcriben pero no se traducen, puesto que no codifican
para una cadena de aminoácidos y, por lo tanto, hay que eliminarlos antes de la traducción.
Por ello, el ARN sintetizado directamente mediante el proceso de transcripción se denomina ARN
heterogéneo nuclear (ARNhn) o pre-ARNm. Este ARNhn, además de contener intrones no
codificantes, no puede salir del núcleo para ir hacia el citoplasma, que es donde se encuentra la
maquinaria de síntesis de proteínas.
La maduración del ARNm se puede esquematizar
en tres pasos:
1. Adición de una caperuza en 5'. La maduración
se inicia ya durante la fase de elongación de la
transcripción, mediante la adición de una
«caperuza» o «casquete» (cap en inglés) en el
extremo 5' libre de la cadena en crecimiento.
Esta caperuza consiste en la incorporación de
una 7-metilguanosina-trifosfato, que protege al
ARN de la degradación.
2. Adición de una cola de Poli-A en 3'. Una vez
que la molécula de ARN se ha separado del
ADN y de la ARN polimerasa, una enzima
denominada Poli-A polimerasa añade una cola de
poli-A al extremo 3' de la nueva cadena de ARN.
El número de residuos de la cola varía según las
especies desde unas decenas hasta varios cientos.
La cola de poli-A permite al ARNm maduro salir
del núcleo al citoplasma.

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3. Eliminación de los intrones. Tiene lugar

mediante un proceso de corte y empalme
denominado empalme, splicing en inglés. En
este proceso intervienen unas proteínas
denominadas ribonucleoproteínas pequeñas
nucleares (RNPsn), que se sitúan en los
extremos de los intrones y se agrupan
formando un complejo de «corte y empalme»
que recibe el nombre de espliceosoma, de
manera que la secuencia intrónica forma un
bucle. Finalmente, la cadena de ARN se corta
en la base del bucle y se empalman los exones
para dar lugar al ARNm maduro.

2.4.3. TRADUCCIÓN DEL ARNm

La traducción es el proceso por el cual a partir de una molécula de ARNm se sintetiza una
proteína.
Durante la traducción, los aminoácidos se van incorporando secuencialmente de manera precisa
a la acadena polipeptídica en crecimiento de acuerdo con la información contenida en la secuencia
nucleótidos del ARNm. Ahora bien, ¿cómo se pasa de un «lenguaje» de cuatro letras (las cuatro :bases
nitrogenadas del ARN) a un «lenguaje» de letras (los 20 aminoácidos que forman las proteínas)?
Esto es posible gracias al código genético.

- El código genetico
El código genético es el diccionario que permite traducir una secuencia de bases nitrogenadas
a una secuencia de aminoácidos. Se basa en que una secuencia de tres bases nitrogenadas codifica un
aminoácido.
Cada triplete de bases nitrogenadas que codifican un aminoácido se denomina codón. De los 64
codones que se pueden formar por las variaciones con repetición de cuatro bases tomadas de tres en
tres, 61 codifican aminoácidos y 3 son codones de terminación.
El número posible de codones es igual al número de variaciones con repetición de cuatro bases
tomadas de tres en tres: 43= 64 codones

Características del código genético

El código genético presenta las siguientes características:
Es universal. El código genético es el mismo para todos los organismos. Es decir, un
codón específico codifica el mismo aminoácido en un eucarionte, en un procarionte y
en un virus.
Una excepción es el código genético mitocondrial, en el que algunos codones concretos
codifican un aminoácido distinto.
No es ambiguo. Cada codón codifica un único aminoácido.
Es degenerado. Dado que hay 20 aminoácidos y 61 codones codificantes, es evidente
que el código genético tiene redundancia. Esto es, la mayor parte de los aminoácidos

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están codificados por más de un codón. Los distintos codones que codifican un mismo
aminoácido se denominan codones sinónimos.
Es continuo y no solapado: en la cadena de ARNm, los codones se disponen de manera
secuencial uno a continuación de otro, sin espacios ni comas y sin compartir ninguna
base.

EL CÓDIGO GENÉTICO

Codones para la iniciación y para la terminación

Todas las secuencias de ARNm que se van a traducir empiezan con el codón de inicio AUG,
que codifica para metionina. Los codones UAA, UAG y UGA son codones de terminación.

- Fases del proceso de traducción

Para que se lleve a cabo la síntesis de polipéptidos se requiere:
Una molécula de ARNm, que contiene la información de la secuencia de aminoácidos.
Los 20 aminoácidos, que son los componentes de las proteínas.
Los ribosomas, que son los orgánulos en los que se realiza el proceso y están
constituidos por ARNr y proteínas.
Los ARNt, que transportan los aminoácidos hasta los ribosomas.
Las enzimas que catalizan la unión entre aminoácidos.

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Los ribosomas constan de dos subunidades de distinto tamaño: la subunidad menor y la

subuni-dad mayor
La subunidad menor tiene un sitio de unión al ARNm.
La subunidad mayor tiene dos sitios de unión a los ARNt:
o El sitio peptidil o sitio P, donde se sitúa el ARNt que porta la cadena
polipeptídica en crecimiento.
o El sitio aminoacil o sitio A, donde se sitúa el ARNt que porta el siguiente
aminoácido que se va a incorporar a la cadena.
Cada aminoácido se une a su respectivo ARNt por la acción de una enzima aminoacil-ARNt-
sinte-tasa, específica. Cada ARNt tiene en el lazo anti-codón un triplete de bases nitrogenadas
(antico-dón) complementarias del codón que codifica el aminoácido que porta.

Iniciación
El proceso se inicia con la unión de la subunidad menor del ribosoma a un ARNm, a la altura
del codón de inicio AUG.
A continuación un ARNt con un anticodón UAC (complementario del codón AUG) se
incorpora al conjunto mediante la formación de puentes de hidrógeno entre las bases del codón-
anticodón. Este ARNt transporta el aminoácido metionina. A este conjunto se le denomina
complejo de iniciación.
Posteriormente se incorpora la subunidad grande del ribosoma, de manera que el ARNt-Met
se sitúa en el sitio P.

Elongación
Comienza con la incorporación al sitio A de un segundo aminoacil-ARNt que tiene un
anticodón complementario al segundo codón del ARNm.
A continuación la enzima peptidil-transferasa cataliza la formación de un enlace peptídico
entre la metionina (en el sitio P) y el aminoácido que se encuentra en el sitio A. De esta manera, el
ARNt del sitio P queda sin aminoácido y el ARNt del sitio A está ahora unido a un dipéptido.
Una vez formado el enlace peptídico, el ribosoma se desplaza a lo largo de la molécula de
ARNm en dirección 5'—›3', en un movimiento denominado translocación.
De esta manera, el primer ARNt, ahora sin aminoácido, se separa del complejo; el ARNt que
porta el dipéptido se traslada al sitio P y en el sitio A entra un nuevo aminoacil-ARNt con un
anticodón complementario al tercer codón del ARNm.
Cada vez que se repite este ciclo se incorpora un nuevo aminoácido a la cadena polipeptídica
en crecimiento.

Terminación
Se produce cuando el ribosoma alcanza en el ARNm un codón de terminación (UAA,
UGA o UAG). No existe ningún ARNt que tenga un anticodón complementario de algún codón de
terminación.
Por el contrario, existen los llamados factores de liberación que sí reconocen estas secuencias, se
sitúan en el sitio A y hacen que la peptidil-trans-ferasa hidrolice la unión entre la cadena polipeptídica y
el ARNt que la porta en el sitio P, con lo que dicha cadena se libera del complejo.
A continuación, se disocia todo el complejo: las dos subunidades del ribosoma se separan y
los factores de liberación, el ARNm y el ARNt se liberan.

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FASE DE ELONGACIÓN DE LA TRADUCCIÓN DEL ARNm A PROTEINA

2.5. ENZIMAS EMPLEADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

Las técnicas de biología molecular que iremos abordando en las siguientes unidades implican
manipulaciones de ácidos nucleicos, tales como amplificación, degradación, corte, unión, marcaje,
secuenciación, etc. Todas estas acciones son posibles gracias a la actividad catalizadora de enzimas
específicas que son aisladas de todo tipo de organismos (virus, bacterias y células eucariotas). Realizan in
vitro la misma actividad que llevarían a cabo in vivo en condiciones fisiológicas.
Estas enzimas son, por tanto, una parte muy importante de las herramientas que se van a
utilizar en biología molecular. Algunas de las más habituales son las nucleasas, y particularmente
las endonucleasas de restricción, las ADN polimerasas y otras enzimas como las
retrotranscriptasas, la desoxinucleotidil transferasa terminal, las ligasas o las topoisomerasas.

2.5.1.Nucleasas
Las nucleasas son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del
enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos.

Clasificación de las nucleadas:

Dependiendo de sus características se pueden clasificar de varias maneras:
Según el tipo de ácido nucleico que atacan:
o Nucleasas de ARN (ARNasa o ribonucleasa). Son enzimas capaces de romper
enlaces fosfodiéster entre ribonucleótidos.
o Nucleasas de ADN (ADNasa o desoxirribonucleasa). Son enzimas capaces de
romper enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos.
Según el tipo de cadena que atacan:
o Nucleasas que atacan moléculas bicatenarias, rompiendo enlaces en ambas cadenas.

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o Nucleasas que solo atacan moléculas monocatenarias. Por ejemplo, la nucleasa

S1 degrada ARNss, ADNss y zonas monocatenarias de ADNds, como lazos o
bucles.
Según la situación del punto de corte:
o Exonucleasas, que eliminan nucleótidos uno a uno desde un extremo (en
dirección 5´ 3´, 3' 5' o en ambas).
o Endonucleasas, que cortan en puntos intermedios de la molécula. Algunas
endonucleasas como la ADNasa I, son muy útiles cuando se usan a baja
concentración porque son capaces de producir en moléculas bicatenarias de ADN
la rotura de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos solamente en una de las
cadenas. Estas roturas se denominan mellas (nick en inglés) y son fundamentales
para un tipo de marcaje de sondas denominado desplazamiento de mella (nick
translation).
Según la especificidad del corte:
o Nucleasas que cortan aleatoriamente. Son enzimas que cortan la cadena de
nucleótidos de forma aleatoria.
o Nucleasas que cortan en sitios concretos de la molécula. Son enzimas que se
unen a una cadena de nucleótidos en una secuencia específica y la cortan, como es
el caso de las endonudeasas de restricción que abordaremos en el apartado siguiente
dada su especial relevancia.

2.5.2. Endonucleasas de restricción

Las endonucleasas de restricción son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias
cortas de ADN bicatenario (de entre 4 y 8 pares de bases) y producen un corte en la doble cadena en
esa secuencia o cerca de ella, fragmentando la molécula.
A las secuencias de ADN específicas que reconocen se las denomina dianas de restricción.
En las bacterias, las endonucleasas de restricción, de alguna manera, constituyen un sistema de
defensa inmune, puesto que su función biológica es degradar el ADN exógeno o ajeno,
principalmente procedente de virus. Para evitar fragmentar su propio ADN, las bacterias se protegen
modificando sus dianas de restricción mediante metilación de bases nitrogenadas. De hecho, en
muchas ocasiones la enzima de restricción tiene ambas funciones (corte y metilación).
Las nucleasas de restricción son también llamadas simplemente enzimas de restricción.

Tipos de enzimas de restricción

Hay tres tipos de enzimas de restricción:
Enzimas de restricción tipo 1: la enzima reconoce su diana de restricción y efectúa un
corte en una región anterior o posterior de la diana a una distancia aleatoria de hasta
1000 pb. Estas enzimas no generan patrones específicos de fragmentos, es decir, cada vez
que cortan una misma molécula de ADN generan fragmentos distintos, por lo que no
tienen gran utilidad en biología molecular.
Enzimas de restricción tipo 11: reconocen la diana de restricción y cortan en puntos
específicos, generalmente dentro de la misma diana. En consecuencia, estas enzimas
generan patrones específicos y reproducibles de fragmentos, ya que siempre que se
enfrentan a la misma molécula cortan por los mismos puntos. Son una herramienta
fundamental en biología molecular y se las llama tijeras moleculares.
Enzimas de restricción tipo 111: reconocen dos secuencias invertidas dentro de la
misma cadena y cortan fuera de la diana de restricción, pero a una distancia corta (25-
30 pb).

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Nomenclatura
Las enzimas de restricción se nombran normalmente con tres letras y un número romano.
Las tres letras se escriben en cursiva y corresponden al nombre científico de la bacteria de la que se han
obtenido. La primera letra es la inicial del género; las otras dos, las primeras letras de la especie. El
número romano indica el orden en que se ha aislado la enzima en la misma especie. Por ejemplo, Pvu ll
es el nombre de la segunda enzima de restricción aislada de Proteus vulgaris.
En ocasiones, cuando la enzima se ha aislado de una cepa concreta de una especie bacteriana,
se añade una cuarta letra mayúscula que la representa. Así, EcoR V es el nombre de la quinta enzima de
restricción aislada de Escherichia coli, cepa RY13.

Tipos de corte
El corte realizado por una enzima de restricción puede ser de dos maneras distintas que se
caracterizan por los extremos generados:
1. Extremos romos. El corte se produce
en el mismo punto en las dos cadenas,
generalmente en el centro de la diana de
restricción.
2. Extremos cohesivos. El corte se produce
en puntos distintos de ambas cadenas,
normalmente en los extremos de la diana
de restricción. Esto genera en cada
extremo sendas regiones monocatenarias
cortas y complementarias entre sí, lo que
hace que sean muy reactivos al poderse
adherir a fragmentos de ADN que tengan
secuencias de bases complementarias.

Aplicaciones en biología molecular

Las enzimas de restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular, destacan dos
aplicaciones de especial importancia: en la tecnología del ADN recombinante y en la obtención de
patrones de restricción.

*Permite crear moléculas de ADN recombinante

La propiedad de las endonucleasas de restricción de cortar dejando extremos cohesivos o
reactivos, es decir, con regiones monocatenarias cortas de bases desapareadas, es muy útil en
biología molecular para crear moléculas de ADN recombinante.
El procedimiento es el siguiente:
1. Se cortan dos moléculas distintas de ADN con la misma enzima de restricción.
2. Cuando los fragmentos con extremos cohesivos de ambas moléculas se mezclan, se
unirán por la complementariedad de bases de sus respectivas regiones monocatenarias
generadas por la enzima de restricción.
3. Finalmente, las mellas que quedan en cada cadena se unen con una ligasa y se obtiene
una molécula híbrida recombinante.

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Obtención de un plásmido recombinante cortando el

plásmido y otra molécula de ADN con la mis ma
enzima de restricción que produce extremos cohesi -
vos, reasociando ambos tipos de fragmentos gracias a la
complementariedad de bases de los extremos
cohesivos y uniéndolos con una ligasa.

*Patrones de restricción
De esta manera se puede insertar un determinado gen de un organismo que sea responsable de la
producción de una determinada proteína en otro diferente, con la finalidad de producirla en grandes
cantidades. Así por ejemplo actualmente la insulina humana de uso terapéutico es producida en gran
escala por bacterias gracias a la tecnología del ADN recombinante.
Para una enzima de restricción concreta una molécula de ADN presenta un número
relativamente pequeño de dianas de restricción. En consecuencia, la digestión con esa enzima genera
un número discreto de fragmentos de distintos tamaños.
Estos fragmentos se pueden separar según su tamaño mediante la técnica de electroforesis en gel
de manera que se obtiene un conjunto de bandas que es único para un ADN en particular y que se
denomina patrón de restricción.
Conocer el patrón de restricción de una muestra de ADN dada tiene muchas utilidades
como pueden ser la identificación de muestras pertenecientes a un mismo individuo, la realización
de estudios filogenéticos (relación evolutiva entre organismos) y la detección de posibles anomalías en
el diagnóstico prenatal o en la detección de mutaciones (si se produce una mutación que afecta a
una diana de restricción, el patrón de restricción que se obtendrá será diferente).
Actualmente se conocen cientos de enzimas de restricción, cada una con una diana de
restricción diferente, lo que supone un inmenso material para la realización de estudios
filogenéticos y de mutaciones.

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Patrones de restricción obtenidos con endonu -

cleasas de restricción: A) Plásmidos de S.
aureus digeridos con Hae III. B) Material
genómico de S. aureus digerido con Sma I.

Dianas de restricción de algunas de las endonucleasas de restricción más usadas.

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2.5.3. ADN polimerasas

La mayor parte de las técnicas de análisis de los ácidos nucleicos requiere una fase previa de
amplificación, es decir, obtener un número de moléculas idénticas suficientemente grande para poder
realizar los estudios. Por esta razón, las ADN polimerasas son un tipo de enzimas clave en bio logía
molecular.
Las ADN polimerasas permiten realizar copias de moléculas de ADN mediante
replicación.
De hecho, la técnica básica en biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) que permite obtener millones de copias de una secuencia de interés.
Las ADN polimerasas más usadas son de los tipos III. Para realizar su función requieren que en
el medio de reacción estén presentes:
Los cuatro desoxinucleótidos trifosfato.
Un ADN molde.
Cebadores.
Mg2+ como cofactor.
Actualmente se dispone de numerosas polimerasas, que se diferencian en:
La velocidad de polimerización (número de nucleótidos incorporados por segundo).
La fidelidad en la replicación (proporción de errores).
La termoestabilidad (la temperatura a la que se inactivan).
La procesividad (número de nucleótidos que pueden incorporar antes de separarse
de la cadena molde).
La presencia o ausencia de actividad exonucleasa además de la actividad polimerasa.
Dependiendo de la técnica en la que se vayan a usar, interesarán unos tipos u otros. Por
ejemplo:
En la PCR, las muestras se someten a ciclos de desnaturalización, hibridación y
polimerización. Como en la fase de desnaturalización se alcanzan temperaturas
por encima de los 90 °C, interesará trabajar con polimerasas de gran
termoestabilidad. Además, convendrá que su procesividad, su velocidad de
polimerización y su fidelidad sean altas.
En el marcaje de sondas mediante la técnica de desplazamiento de mella, los
requerimientos son diferentes .
En esta técnica primero se producen mellas en la molécula de ADN que se quiere
marcar con una ADNasa 1 a baja concentración y a continuación se añaden
nucleótidos trifosfato marcados y una ADN polimerasa I para que repare las mellas.
La enzima se une a la mella y empieza a eliminar nucleótidos en dirección 3'--›5' a
la vez que incorpora nuevos nucleótidos marcados en dirección 5' 3'. De esta
manera, la enzima va desplazando la mella y la nueva cadena queda marcada. En este
caso:
o No se requiere que la enzima tenga gran termoestabilidad (la reacción no se
realiza a altas temperaturas) ni alta procesividad (las sondas suelen tener un
tamaño limitado) ni elevada velocidad de polimerización (la técnica se
realiza a tiempo final, sin ciclos cortos).
o Sí se requiere actividad exonucleasa 3' 5', alta fidelidad en la
polimerización para que no cometa errores y la sonda no pierda su
especificidad y sea capaz de utilizar nucleótidos marcados.

2.5.4. Otras enzimas

- Retrotranscriptasas
Las retrotranscriptasas o transcriptasas inversas son ADN polimerasas-ARN dependientes. Es
decir, sintetizan moléculas de ADN utilizando ARN corno molde.

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CICLO SUPERIOR DE ANATOMÍA PATOLÓGICA Y CITODIAGNOSTICO MÓDULO BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

El ADN sintet izado se denomina ADN copia (ADNc). Se han aislado de los retrovirus, virus
cuyo material genético es ARN, el cual se retrotranscribe a ADN en la célula infectada y se integra en el
genoma de la célula huésped.
El empleo de estas enzimas ha permitido:
Realizar estudios masivos de ARN. En concreto, en combinación con técnicas de ADN
recombinante, ha posibilitado la creación de genotecas de ADNc, fiel reflejo de la
expresión génica de una célula en un momento dado.
La amplificación de ARN. La PCR convencional no amplifica ARN, puesto que las
ADN polimerasas que se emplean son ADN dependientes. Sin embargo, un paso
previo de retrotranscripción con un cebador específico permite obtener un ADNc de la
secuencia de ARN que queremos amplificar, sobre el cual podemos aplicar después una
PC R convencional.
Este tipo de PCR que amplifica ARN se denomina RT-PCR.

- Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt)

La desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) es una ADN polimerasa que cataliza la
incorporación de desoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula de ADN.
A diferencia de otras ADN polimerasas, no requiere de un cebador ni de una cadena
molde para ejercer su actividad. En presencia de una molécula bicatenaria de ADN y
desoxinucleótidos, sintetiza colas de ADN monocatenarias en ambos extremos 3'.
Se han aislado de células linfoides inmaduras y de células de ciertos linfo mas y
leucemias. Una de sus principales utilidades es el marcaje terminal de sondas con nucleótidos
marcados.

-Ligasas
Las ligasas unen dos moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster
entre los extremos 3' de una molécula y 5' de la otra.
Pueden también reparar mellas en una de las cadenas de un ADNds mediante la formación del
correspondiente enlace fosfodiéster.
Son muy útiles en tecnología de ADN recombinante para unir fragmentos de ADN de
distinta procedencia previamente cortados por la misma enzima de restricción.
Existen también ligasas de ARN que permiten circularizar moléculas monocatenarias.

-Topoisomerasas
Las topoísomerasas relajan la tensión de la doble hélice de ADN próximas a las burbujas de
replicación o transcripción.
Se utilizan para relajar estructuras superenrolladas de ADN, como paso previo a la aplicación de
otras técnicas de biología molecular.

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