UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL

“Evaluación de la eficacia in vivo de dos carbamatos de nueva

síntesis sobre Rhipicephalus microplus”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRA EN CIENCIAS

PRESENTA

Sandra Lizeth Iturbe Requena

TUTOR
Dr. Fernando Alba Hurtado

COMITÉ TUTORAL
Dra. Yazmín Alcalá Canto
Dr. Enrique Ángeles Anguiano

Cuautitlán Izcalli, Estado de México. 2014

 ÍNDICE

ÍNDICE......................................................................................................................... 1
RESUMEN ................................................................................................................... 3
ABREVIATURAS ........................................................................................................ 4
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 5
SITUACIÓN EN MÉXICO DE LA GARRAPATA Rhipicephalus sp. ...................... 5
GENERALIDADES DE R. microplus ...................................................................... 6
Clasificación taxonómica .................................................................................. 6
Morfología ........................................................................................................... 7
Ciclo biológico.................................................................................................... 9
PATOGENIA .......................................................................................................... 10
CONTROL ............................................................................................................. 12
Control químico ................................................................................................ 12
APLICACIÓN DE IXODICIDAS ............................................................................. 16
RESISTENCIA A LOS IXODICIDAS ...................................................................... 16
Mecanismos de resistencia ............................................................................. 18
Mecanismos de resistencia en las familias de ixodicidas ............................. 18
Resistencia a ixodicidas el mundo.......................................................................
19
Situación de la resistencia a ixodicidas en México...........................................20
Manejo de la resistencia a ixodicidas ............................................................. 21
CARBAMATOS ..................................................................................................... 21
Mecanismo de acción ...................................................................................... 22
CARBAMATOS DE NUEVA SÍNTESIS ............................................................. 23
JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 26
OBJETIVOS .............................................................................................................. 27
Objetivo general ................................................................................................... 27
Objetivos particulares.......................................................................................... 27
HIPÓTESIS ................................................................................................................ 28
MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................... 29
Ubicación .............................................................................................................. 29
Material biológico ................................................................................................. 29
Compuestos evaluados ....................................................................................... 29
Técnica de cámaras ............................................................................................. 30
DISEÑO EXPERIMENTAL..................................................................................... 31

1
 ANÁLISIS ESTADÍSTICO...................................................................................... 36
RESULTADOS .......................................................................................................... 37
Conteo total de hembras repletas en cámaras .................................................. 37
Porcentaje de oviposición......................................................................................40
Porcentaje de inhibición de la oviposición ........................................................ 43
Porcentaje de eclosión ........................................................................................ 45
Reducción total de larvas producidas ................................................................ 47
DISCUSIÓN ............................................................................................................... 49
CONCLUSIONES ...................................................................................................... 54
REFERENCIAS ......................................................................................................... 55

2
 RESUMEN

La resistencia a los ixodicidas es el principal problema para el control de

Rhipicephalus microplus en zonas tropicales y subtropicales del mundo. Lo anterior,
ha conducido a diseñar, sintetizar y probar nuevas moléculas para el control de esta
parasitosis. El objetivo del estudio fue determinar in vivo mediante la técnica de
cámaras, la eficacia dos nuevos carbamatos (Etil 4-clorofenil carbamato y Etil 4-
bromofenil carbamato, diseñados y sintetizados en la Facultad de Estudios
Superiores Cuautitlán), la supervivencia, la oviposición y la viabilidad de una cepa de
garrapatas resistentes de R. microplus tratadas en diferentes estadios de desarrollo
(larvas, ninfas y adultas). Los parámetros medidos fueron el total de hembras
repletas por cámara, el porcentaje de oviposición de las hembras repletas, el
porcentaje de inhibición de la oviposición, el porcentaje de eclosión de larvas de los
huevos producidos por estas garrapatas y la reducción de larvas producidas.
Los compuestos fueron evaluados a la concentración inhibitoria de la eclosión
(CIE99) obtenida previamente in vitro. El total de hembras repletas en cámaras
disminuyó (p<0.05) con el tratamiento hasta en un 99%. El porcentaje de oviposición
no se vio afectado (p>0.05), sin embrago, el porcentaje de inhibición de la
oviposición disminuyó hasta en un 75% (p<0.05) en las garrapatas que sobrevivieron
al tratamiento en comparación con su control. Además, se observó que el porcentaje
de eclosión disminuyó hasta en un 100%, en presencia del tratamiento. La eficacia
total calculada de estos productos se encuentra por arriba del 98%. En conclusión,
estos nuevos carbamatos mostraron un buen potencial ixodicida in vivo, sin
embargo, se requiere la realización de estudios complementarios para considerarlos
una nueva opción farmacéutica en el control de garrapatas.

3
 ABREVIATURAS

%Ec Porcentaje de eclosión

%InhOp Porcentaje de inhibición de la oviposición
%Op Porcentaje de oviposición
AChE Acetilcolinesterasa
ANOVA Analysis of variance. Análisis de varianza
c.b.p. Cuanto baste para
CIE Concentración inhibitoria de la eclosión
DMSO Dimetilsulfóxido
EE Error estándar
FAO Food and Agriculture Organization of the United
Nations
g Gramos
IO Índice de Oviposición
kg Kilogramos
LQM Laboratorio de Química Medicinal
mg Miligramos
mL Mililitros
NOM Norma Oficial Mexicana
PI Pos-infestación
SAGARPA Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo
Rural, Pesca y Alimentación

4
 INTRODUCCIÓN

Las garrapatas son los ectoparásitos hematófagos más importantes

del ganado en zonas tropicales y subtropicales del mundo (Anderson y
Magnarelli, 2008). En México, las especies que afectan al ganado bovino
son principalmente Rhipicephalus microplus y Rhipicephalus annulatus
(Rodríguez-Vivas et al., 2006).

La infestación por estos ectoparásitos causa pérdidas económicas

severas a la producción bovina, debido a que provoca anemia, disminución
del consumo de alimento, disminución en la producción de carne,
disminución en la producción de leche y daños a la piel de los animales.
También restringe de manera importante la movilización del ganado debido
a la transmisión de organismos causantes de enfermedades como la
babesiosis y anaplasmosis. Adicionalmente, se incrementa el costo de
producción por el empleo obligado de productos químicos y mano de obra
para el control de garrapatas, además de los costos por tratamientos de las
hemoparasitosis que transmiten (SAGARPA, 2014).

SITUACIÓN EN MÉXICO DE LA GARRAPATA Rhipicephalus sp.

En nuestro país (figura 1) el territorio libre ocupa una porción importante del
norte así como áreas del centro y comprende 94.4 millones de hectáreas,
las cuales equivalen al 47.88% del territorio nacional. Las zonas en fase de
erradicación cuentan con 1.1 millones de hectáreas y representan un
0.57%; y las áreas en fase de control en este momento alcanzan una
superficie total de 101.6 millones de hectáreas y representan el 51.5% del
país (SAGARPA, 2014).

5
 Figura 1: Clasificación del territorio nacional con relación a la
presencia de R. microplus (SAGARPA, 2014).

GENERALIDADES DE R. microplus

R. microplus es una garrapata originaria del sureste de Asia pero se

ha distribuido a través de los trópicos como Australia, Este y Sur de África, y
Centro de América; fue introducida a México junto con R. annulatus por el
sur de los Estados Unidos (George, 2000; Barré et al., 2008).

Clasificación taxonómica

R. microplus (Canestrini, 1887) es del Phylum Arthropoda, Clase

Arachnida, Orden Acarina, Suborden Metastigmata y Familia Ixodidae
(Quiroz, 1984; Encinas et al., 1999; Soulsby, 1988).

6
 Morfología

El cuerpo de las garrapatas está cubierto por un exoesqueleto

formado por una capa cuticular quitinosa, está formado por una porción
anterior denominada gnatosoma y una porción posterior denominada
idiosoma (figura 2). Las garrapatas pertenecientes a la familia Ixodidae
(garrapatas duras) poseen escudo y el gnatosoma se encuentra en posición
anterior con respecto al idiosoma (Quiroz, 1984; Anderson y Magnarelli,
2008). R. microplus es una garrapata dura, de color café oscuro, las
hembras llegan a medir hasta 1.5 cm cuando están repletas y los machos
hasta 0.5 cm. El gnatosoma es corto y su escudo es de color café sin
ornamentaciones (Barker et al., 2002). Los machos poseen un escudo que
cubre casi todo el cuerpo, no así en las hembras en las que el escudo es
pequeño y cubre aproximadamente un octavo del cuerpo, por lo que tienen
la capacidad de expandir la cutícula para repletarse (Encinas et al., 1999).

El gnatosoma o capítulo está formado por los órganos bucales y

forma un canal de alimentación a través del cual el alimento pasa hacia el
esófago. Las estructuras que lo conforman son: base del capítulo, palpos,
quelíceros e hipostoma. Los quelíceros poseen una función quimiosensorial
y los palpos están adaptados para el desgarre del tejido. El hipostoma se
introduce para formar el canal de alimentación, y posee una serie de
prolongaciones para la fijación de la garrapata a su hospedero (Quiroz,
1984; Anderson y Magnarelli, 2008). En el caso de R. microplus, la base del
capítulo es de forma hexagonal y los palpos no rebasan en tamaño al
hipostoma (Kang et al., 1985).

El idiosoma está formado por una parte anterior o propodosoma y una

posterior o histerosoma. En el propodosoma se encuentran las patas y el
poro genital, mientras que en el histerosoma se encuentran los espiráculos
respiratorios y el ano.
7
 La fase larvaria es hexápoda, mientras que las ninfas y adultas son
octápodas. Las patas están divididas en seis segmentos: coxa, trocánter,
fémur, gena, tibia y tarso. En el tarso del primer par de patas se encuentra
el órgano de Haller el cual sirve para detectar temperatura, corrientes de
aire, olores y químicos (Quiroz, 1984; Anderson y Magnarelli, 2008).

Figura 2: Morfología externa de R. microplus. Vistas dorsal y ventral de macho

y hembra adultos (Adaptado de Quiroz, 1984).

Los espiráculos respiratorios tienen una forma muy característica en

cada género, en el caso de R. microplus son circulares con una mácula
central y están situados posterolateralmente a la cuarta coxa (Kang et al.,
1985).

8
 Ciclo biológico

R. microplus es una garrapata de un solo hospedero (figura 3). Su

hospedero definitivo es principalmente el bovino, aunque puede encontrarse
también en venados. Las garrapatas tienen cuatro estadios evolutivos en su
ciclo vital: huevo, larva, ninfa y adulto.

El ciclo biológico puede durar entre 4 y 10 meses; y comprende dos

fases: la fase de vida libre o fase no parásita, y la fase parásita. La fase de
vida libre inicia cuando la hembra repleta se desprende del hospedero y
busca un lugar para ovipositar. El periodo de preoviposición es de 2 a 39
días y el periodo de oviposición es de 4 a 44 días. Cada hembra de R.
microplus pone entre 3500 y 4400 huevos. Después, los huevos se incuban
de 14 a 146 días hasta la eclosión de las larvas (Soulsby, 1988).

En la fase de vida libre se presentan dos etapas: la etapa pasiva y la

etapa de búsqueda. Durante la etapa pasiva las larvas recién nacidas
adquieren la madurez para buscar al hospedero alimentándose de su vitelo.
Dentro de la etapa de búsqueda, las larvas suben a las puntas de los pastos
para encontrar a su hospedero, al que detectan por medio de la emisión de
dióxido de carbono, la vibración y el calor corporal (Anderson y Magnarelli,
2008).

La fase parásita comienza una vez que las larvas han hallado a su
hospedero, se adhieren a su pelaje, insertan en la piel sus piezas bucales y
comienzan a alimentarse. Mientras se alimenta, la larva realiza la muda a
ninfa y posteriormente a adulto. El macho adulto busca a la hembra para la
cópula. Posteriormente la hembra fecundada se ingurgita (repleción de
sangre) y finalmente se desprende del hospedero, para llevar a cabo la
oviposición en el suelo (Quiroz, 1984).

9
 Figura 3: Ciclo biológico de R. microplus. Los estadios de la garrapata que
ocurren sobre el hospedero son la fase parásita, y los que ocurren en el suelo
pertenecen a la fase no parásita (Adaptado de Quiroz, 1984; Soulsby, 1988).

PATOGENIA

Los daños que R. microplus genera a su hospedero se deben a las

acciones patógenas traumática, expoliatriz, inoculatriz, tóxica y antigénica.
La acción traumática es causada por la perforación de la piel del hospedero
con las piezas bucales de la garrapata al momento de alimentarse. La
acción expoliatriz consiste en la sustracción de sangre y líquidos tisulares,
cuyo principal efecto es la anemia. En este sentido, cada hembra en estado
adulto es capaz de consumir entre 0.5 mL y 1.2 mL de sangre, por lo que el
total de la pérdida de volumen sanguíneo está directamente relacionado al
grado de infestación de los animales. Además, la anemia puede agravarse

10
debido a hemoparasitos transmitidos que pueden tener acción lítica sobre
los eritrocitos (Quiroz, 1984; Jonsson et al., 2006).

La acción inoculatriz, corresponde a la introducción de agentes

patógenos causantes de otras enfermedades en el hospedero. Las
garrapatas son vectores de microorganismos tales como protozooarios,
ricketsias, espiroquetas y virus. R. microplus es el principal transmisor de
Babesia bigemina en Australia, Panamá y América, Babesia argentina en
Australia y Argentina, y Anaplasma marginale en Australia y América
(Soulsby, 1988; Uilenberg, 1995; De Castro, 1997).

Las acciones tóxica y antigénica son asociadas a las secreciones

salivales de la garrapata que son inyectadas por la herida y que contribuyen
a prevenir la coagulación de la sangre y la reacción inflamatoria, además de
que inhiben el dolor causado por la presencia de la garrapata (Quiroz,
1984).

También, se ha sugerido que las infestaciones masivas por

garrapatas tienen efecto supresor del apetito en ganado de leche, basado
en que los animales afectados por garrapatas consumen menor cantidad de
materia seca, por lo que se observa en ellos disminución de la producción
láctea y disminución de la condición corporal. Así mismo, se ha observado
que los animales que no ingieren los requerimientos mínimos diarios de
acuerdo a su fin zootécnico, sufren infestaciones de un grado mayor que los
animales bien nutridos (Jonsson et al., 2006). En un estudio realizado en
ganado Holstein-Fresian, se demostró que por cada hembra repleta, hubo
una pérdida productiva de hasta 2.86 mL de leche por día y hasta 1.0 g de
peso vivo en los animales infestados relacionado a un bajo consumo de
materia seca (Jonsson et al., 1998; Jonsson et al., 2000).

11
CONTROL

Existen dos tipos de control para la ixodidosis: el control químico y el

control no químico. El control químico ha sido el más utilizado y se ha
basado en el empleo de productos de diferentes familias químicas a lo largo
de la historia. El control no químico conocido también como control
biológico, se basa en el manejo de diversos métodos, como la cruza de
animales para aumentar la resistencia natural del bovino determinada por la
raza, el uso de inmunógenos a base de antígenos provenientes de células
intestinales de las garrapatas, el uso de determinados tipos de forrajes en
los potreros, el empleo de biopesticidas, el manejo de praderas de acuerdo
al ciclo biológico de las garrapatas y también el control por medio de
patógenos para estos ectoparásitos o el control mediante otros organismos
que fungen como depredadores de fases no parásitas (Samish y Rehacek,
1999). Sin embargo, el control no químico no ha resultado del todo exitoso,
debido a que los mecanismos de acción de estas medidas son muy lentas y
no permiten observar un efecto con impacto inmediato; razón por la cual, se
ha preferido el uso de ixodicidas químicos. En la actualidad se ha propuesto
realizar un manejo integral, en el que se emplee ambos tipos de control,
para evitar la aparición de resistencia a los productos químicos, así como
disminuir el daño ambiental que genera el uso de estos.

Control químico
Hasta ahora el uso de productos químicos con efectividad contra
garrapatas llamados ixodicidas, ha sido el tipo de control más empleado en
todo el mundo para combatirlas. Se han tratado de desarrollar ixodicidas
que cumplan con una alta efectividad, sin causar daño a los animales, al
humano y/o al ambiente. El avance de la investigación en la biología de las
garrapatas, ha dado conocimiento de su estructura, fisiología y
comportamiento, lo que puede ser aplicado para diseñar fármacos con

12
mecanismos de acción más específicos que puedan detener su
reproducción, viabilidad y/o diseminación.

Los primeros intentos de aplicación de ixodicidas se realizaron en el

año de 1893, utilizando como garrapaticidas aceite de semilla de algodón,
aceite de pescado, petróleo crudo, keroseno, creosote, extracto de tabaco,
jabón o sulfuro, que se administraban dos o tres veces por semana con
ayuda de esponjas y cepillos. Posteriormente en 1895 se comenzó a
sumergir al ganado en mezclas que contenían este tipo de sustancias
(George, 2000; Botana et al., 2002; George et al., 2004).

El arsénico se introdujo como novedad reemplazando los remedios

anteriores, y demostró ser altamente efectivo contra las garrapatas. El
primer informe del uso de arsénico como acaricida, está reportado en
garrapatas R. microplus en ganado Angus de Australia en 1896, a esta
preparación se le conoció como “Queesland Dip” o “Australian Dip”. Sin
embargo, otras referencias indican que el arsénico se utilizó por primera vez
en la República de Sudáfrica en 1893. La resistencia a este compuesto
apareció alrededor de cincuenta años después de su utilización como
ixodicida. Las razones más importantes para reemplazar al arsénico por
insecticidas orgánicos sintéticos, fueron la cercanía de la dosis terapéutica
con la concentración tóxica, la acumulación de este compuesto en los
tejidos de los animales y la aparición de resistencia (George et al., 2004).

Después de la Segunda Guerra Mundial, se dio a conocer otro grupo

de compuestos conocidos como organoclorados tales como el
diclorodifeniltricloroetano (DDT), el hexaclorociclo-hexano (HCH), el
hexaclorobenceno (BHC), el toxafeno y la dieldrina. Este grupo fue
ampliamente utilizado en regiones resistentes al arsénico, y fueron los
primeros en ser comercializados también. Su prohibición se debió a su

13
acumulación en el tejido adiposo de los animales y su persistencia en el
ambiente (George et al., 2004).

Posteriormente los compuestos organofosforados como el etión,

coumafós, clorfenvinfós y clorpirifós, reemplazaron a los organoclorados
(Botana et al., 2002). Los organofosforados se han utilizado ampliamente,
demostrando tener una muy buena acción. Sin embargo, se ha observado
que presentan una elevada toxicidad en vertebrados, además de guardar
una relación con gases neurotóxicos como los gases sarín, soman y tabun
(George et al., 2004).

Los carbamatos como el carbaryl y promacyl, son compuestos

derivados del ácido carbámico que se caracterizan por tener una muy baja
toxicidad. El mecanismo de acción tanto de los organofosforados como de
los carbamatos, es la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa (AChE),
motivo por el que generalmente se presenta resistencia cruzada con los
organofosforados (George, 2000).

Los piretroides naturales son un grupo de ixodicidas muy costosos e

inestables en presencia de la luz solar, sin embargo, sirvieron como
predecesores de los piretroides sintéticos que son altamente efectivos como
acaricidas, incluyendo compuestos como permetrina, deltametrina,
decametrina, flumetrina, cyhalotrina y cyflutrina. Su prolongado efecto
residual es una desventaja en su empleo, debido a esta característica se
aumenta la presión de selección de cepas resistentes a estos ixodicidas
(George et al., 2004).

En 1970 se sintetizaron las formamidinas y cicloamidinas como:

clordimeform, clomethiuron, clenpyrin y amitraz (George et al., 2004; Botana
et al., 2002). El clordimeform fue utilizado en Australia como aditivo en los
baños de inmersión para tratar a los animales con cepas resistentes a

14
organofosforados. Sin embargo, en 1976 fue retirado del mercado debido a
que se comprobó su efecto carcinogénico. El amitraz es el más empleado
en el mundo, debido a que es un compuesto altamente efectivo; a pesar de
ser un compuesto inestable en baños de inmersión, pero si se agrega
hidróxido de calcio para lograr un pH de 12 el principio activo permanece
estable (George et al., 2004).

Las lactonas macrocíclicas son otro grupo de acaricidas, de las cuales

existen dos tipos; las avermectinas (ivermectina, eprinomectina y
doramectina) y las milbemicinas (moxidectina) obtenidas de Streptomyces
avermitilis y S. higroscopicus aureolacrimosus respectivamente. Su principal
ventaja es que la dosis tóxica para las garrapatas es baja en comparación
con otros productos y su aplicación puede ser por vía subcutánea, oral o
epicutánea pero su alto costo limita su uso (George, 2000; George et al.,
2004).

El fipronil es una fenilpirazolona que puede ser aplicada por vía

epicutánea y tiene una eficacia del 99% en animales alojados en unidades
de producción intensivas, además provee de protección contra la
reinfestación por larvas hasta por ocho semanas pos-tratamiento. Sin
embargo, en condiciones de producción extensiva, su vida se ve reducida,
debido a las condiciones ambientales como la luz solar, que reduce su
acción dos o tres semanas después de su aplicación (George et al., 2004).

Hacia finales del siglo XX aparecieron otros compuestos derivados de

benzoil fenil urea que actúan inhibiendo la formación de quitina, tal es el
caso del lufenurón, flufenoxuron, diflubenzuron y fluazurón. Su principal
efecto en garrapatas es la reducción casi total de la fertilidad y fecundidad
de hembras repletas, además de producir mortalidad de fases inmaduras
debido a que les impide mudar al siguiente estadio. El fluazurón puede

15
persistir hasta por doce semanas, aunque su uso es restringido debido a
que se excreta en la leche, lo cual es indeseable para la cría y para el
consumo humano (George et al., 2004).

El metopreno es un análogo sintético de la hormona eccdisona

producida por fases juveniles de la garrapata, la cual es promotora del
cambio de estadio, el metopreno bloquea el desarrollo juvenil evitando que
se llegue al estadio adulto. Debido a que la eccdisona es una hormona que
no poseen los mamíferos, su margen de seguridad es muy amplio, lo cual
es ventajoso para su uso (Botana et al., 2002).

APLICACIÓN DE IXODICIDAS

El éxito de un ixodicida depende de la toxicidad del principio activo, la

calidad y estabilidad del producto, su correcta dosificación o de la superficie
alcanzada en el cuerpo del animal. Es por ello que el método de aplicación
de un ixodicida dependerá de las características del producto. En este
sentido, los métodos más sencillos son la aplicación epicutánea y la
parenteral. Los baños de inmersión han caído en desuso debido al alto
costo de las instalaciones que se requieren y han sido sustituidos por el
baño de aspersión que ofrece las mismas ventajas y con un equipamiento
más portátil.

RESISTENCIA A LOS IXODICIDAS

La resistencia a un fármaco con acción sobre garrapatas, se define

como la capacidad de una fracción poblacional de estos parásitos para
sobrevivir a ciertas concentraciones de productos ixodicidas, que resultan
letales o afectan la reproducción del resto de la población considerada como
normal (susceptible), la cual una vez establecida es hereditaria (NOM-019-
ZOO-1994).

16
 Existen tres fases en el desarrollo de la resistencia a los ixodicidas
(Alonso-Díaz et al., 2006; Cardozo, 2007):

1) Fase de establecimiento: Esta ocurre cuando aparece el alelo

resistente en una población, generalmente es un proceso dado por
mutaciones naturales, independiente a la presión de selección.

2) Fase de desarrollo o diseminación: Es el aumento del número de

individuos resistentes después del uso de ixodicidas químicos. En
este pueden ocurrir dos métodos de selección: la selección rápida
ocurre cuando el gen de resistencia es dominante o parcialmente
dominante y permite la selección de heterocigotos. La selección lenta
se da cuando los alelos son recesivos. En esta fase aún no son
detectables las fallas de los ixodicidas llevándose a cabo la dispersión
hacia otras regiones en forma desapercibida.

3) Fase emergente: El alelo resistente es lo suficientemente común en la

población. En ésta la eficacia de los ixodicidas ha disminuido
considerablemente debido a la alta presión de selección.

Los factores principales asociados a la evolución de la resistencia,

son los genéticos, que incluyen la frecuencia de los alelos resistentes, el
número de alelos, la dominancia y la expresividad de estos; los factores
biológicos, que son los propios de la especie, como número de
generaciones, número de descendientes por generación, sobrevivencia y
refugio; y operacionales del químico, lo cuales incluyen la persistencia de
residuos, tipo de aplicación, formulación y umbral de aplicación y selección.

17
 Mecanismos de resistencia

En las últimas décadas se realizaron numerosos estudios dirigidos a

conocer los diversos procesos bioquímicos y genéticos desarrollados por las
garrapatas para evitar o disminuir el efecto de los productos químicos. De
acuerdo al tipo de respuesta al producto químico, la resistencia ha sido
agrupada en 4 categorías (Alonso-Díaz et al., 2006):

a) Resistencia de comportamiento: El parásito modifica su conducta

para evitar el químico.

b) Resistencia de la penetración: Es la modificación de algunos

compuestos presentes en el exoesqueleto para impedir o retardar la
penetración del producto.

c) Resistencia metabólica: Es la detoxificación del producto químico por

procesos enzimáticos que radica en la modificación en las vías
metabólicas del parásito.

d) Insensibilidad del sitio de acción: En esta se ve la modificación del

sitio de acción del ixodicida para disminuir el efecto del producto
químico.

Mecanismos de resistencia en las familias de ixodicidas

Se han descrito distintos tipos de resistencia en presencia de los

compuestos de las diferentes familias de ixodicidas.

Organofosforados: En insectos, las mutaciones del gen codificante de AChE

se han reportado en presencia de organofosforados (Temeyer et al., 2006).
También se ha reportado otro mecanismo de resistencia a estos mismos
compuestos, ligado a un aumento en la actividad de la citocromo
monoxigenasa P450 (Baffi et al., 2007).

18
Piretroides: La mutación en el gen del canal de sodio inhibe el efecto tóxico
de los piretroides debido a la modificación estereoquímica de la estructura
del canal (Jamroz et al., 2000). En R. microplus se ha documentado la
substitución de una fenilalanina por una isoleucina en el gen del canal de
sodio de cepas mexicanas (He et al., 1999). También se ha visto que existe
una esterasa metabólica específica con actividad de hidrolizar la permetrina
(Jamroz et al., 2000).

Fenilpirazolonas: En la actualidad, no se conocen los mecanismos

verdaderos de resistencia a éstos compuestos; sin embargo, se cree que la
resistencia a fipronil se debe en parte a la actividad de una esterasa elevada
(CzEst9), que fue preseleccionada por el uso generalizado de permetrina en
la década de 1980 en México (Miller et al., 2013).

Amidinas: El amitraz ha sido un compuesto muy utilizado contra garrapatas,

sin embargo, existe evidencia de las mutaciones de un gen putativo del
receptor octopamina en R. microplus resistente a este compuesto (Chen et
al., 2007).

Resistencia a ixodicidas en el mundo

Se ha reportado el fenómeno de resistencia desde los años 40’s y

50’s en Australia, Sudamérica y África, años en que aparecieron
poblaciones de garrapatas resistentes a diversos compuestos
organoclorados. A finales de los 50’s y principios de los 60’s se presentó en
Australia y Sudáfrica resistencia a compuestos inhibidores de las
colinesterasas como carbamatos y organofosforados. Para finales de los
años 70’s ya se habían reportado en Australia cepas de garrapatas

19
resistentes a amidinas y para inicios de los 80’s se tenía conocimiento de la
resistencia a los piretroides en Australia (Soberanes-Céspedes et al., 2002).

Situación de la resistencia a ixodicidas en México

Se ha documentado la resistencia de R. microplus hacia ixodicidas

organoclorados y organofosforados en nuestro país desde 1981, cuando se
caracterizó la cepa “Tuxpan”. Durante la misma década, también fue aislada
la cepa “Tempoal” resistente a éstos mismos compuestos. Garrapatas de
ambos tipos de cepas se distribuyen actualmente en las Huastecas
Mexicanas y en el estado de Yucatán (Alonso-Díaz et al., 2006).

La resistencia a piretroides se observó por primera vez en 1993. Las

cepas “Coatzacoalcos” y “Aldama” son medianamente resistentes a
permetrinas; sin embargo, las cepas “La Mora” y “San Jorge” provenientes
del golfo de México, además de presentar resistencia a piretroides, también
la presentaron hacia compuestos organofosforados (Alonso-Díaz et al.,
2006).

Debido a la resistencia a los compuestos antes mencionados, se

comenzó a utilizar el amitraz. Sin embargo, la alta presión de selección
ejercida, provocó en 2001 la aparición de cepas triple resistentes como lo es
la cepa “San Alfonso”, resistente a organofosforados, piretroides y amidinas
(Alonso-Díaz et al., 2006).

Recientemente, se ha detectado la resistencia de R. microplus a la

ivermectina (Pérez-Cogollo et al. 2010), y también la resistencia al fipronil
en cinco cepas de Tamaulipas, México (Miller et al., 2013).

20
Manejo de la resistencia a ixodicidas

Se han sugerido dos formas para controlar la resistencia en una

población de garrapatas, estas son saturación y moderación. La saturación
consiste en la utilización del mismo producto hasta que el cambio es forzoso
por la dispersión de la resistencia. La concentración y frecuencia de los
tratamientos se incrementan progresivamente. La moderación es un método
basado en el reemplazo inmediato del compuesto al que existe la
resistencia. Para lograr el reemplazo de estos compuestos se han evaluado
nuevos productos con el fin de encontrar alternativas farmacéuticas para el
tratamiento de la ixodidosis (Alonso-Díaz et al., 2006).

CARBAMATOS

Los carbamatos son definidos como ésteres del ácido carbámico;

estructuralmente presentan una región principal constituida por el
metilcarbamato de un fenol, con un sustituyente de carácter básico (Botana
et al., 2002). Son compuestos moleculares sencillos derivados inicialmente
de la fisostigmina, sin embargo, en la actualidad estos compuestos son de
origen sintético (Gupta, 2006).
A partir de los años 70’s, los carbamatos se han empleado de diversas
maneras, como herbicidas en la agricultura, ectoparasiticidas en veterinaria,
plaguicidas en cuidados forestales e incluso en medicina humana para el
tratamiento de algunas enfermedades degenerativas como Alzheimer,
miastenia gravis y glaucoma, como antimicrobianos, anestésicos locales,
anticonvulsivos, antiulcerosos, anticarcinogénicos, etc. (Odilón, 1993;
Botana et al., 2002; Ordaz-Pichardo et al., 2005; Gupta, 2006).
Dentro de los carbamatos utilizados en la actualidad se encuentran el
aldicarb, aminocarb, carbaril, carbofuran, carbosulfan, metiocarb entre otros

21
(Gupta, 2006). En medicina veterinaria los carbamatos empleados para el
control de artrópodos son el propoxur y el carbaril (Botana et al., 2002).

Mecanismo de acción

Algunos carbamatos como los N-metil carbamatos tienen una alta

afinidad por las esterasas tales como la quimiotripsina, la AChE, la
pseudocolinesterasa, carboxilesterasa y otras esterasas no específicas
(Córdoba, 2006). La AChE actúa en las sinapsis colinérgicas terminando el
impulso nervioso producido por el neurotransmisor acetilcolina. Estos
compuestos reaccionan con la AChE de forma análoga a la acetilcolina
(Sogorb y Vilanova, 2002). La acción inhibitoria en la función de la AChE de
los artrópodos, prolonga la excitación nerviosa causada por el
neurotransmisor acetilcolina provocando parálisis neuromuscular y la
muerte por tetanización (Tan et al., 2011).

Por otra parte, los carbamatos benzimidazoles han mostrado tener

interacción con los centros de organización de los microtúbulos,
especialmente con uno de los dímeros que los forman, la β-tubulina, de
algunos protozoarios como Trichomona vaginalis y Giardia lamblia, además
sobre helmintos y hongos, provocando efectos en la morfología y sobre el
índice mitótico en dichos parásitos (Carvalho y Gadelha, 2007; Chávez et
al., 1992; Katiyar et al., 1994); Se ha demostrado que el mecanismo de
acción del flubendazol sobre Toxocara canis y Ascaris suum es el de
impedir la polimerización de los microtúbulos en el interior de las células de
dichos parásitos, provocando severos daños en su hipodermis e intestinos y
evita la formación de gametos (Hanser et al., 2002).

22
 Por lo anterior, es indispensable que cuando se sinteticen nuevos
carbamatos se evalúe eficacia sobre diferentes organismos, su mecanismo
de acción y su toxicidad.

CARBAMATOS DE NUEVA SÍNTESIS

En la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán se han producido una

serie de nuevos carbamatos. El diseño y síntesis de estos productos se
llevó a cabo por parte del grupo de investigadores del Laboratorio de
Química Medicinal de la FESC (Ángeles et al., 2000).

A algunos de estos carbamatos se les ha estudiado su actividad

antibiótica sobre Escherichia coli, Salmonella typhi, Vibrio cholerae,
Enterobacter aerogenes y Helicobacter pylori demostrando tener una
eficacia de más del 50% (Bernal, 2000; Reyes-González, 2007).
En cuanto a su actividad antiparasitaria, se ha demostrado que estos
carbamatos tienen una actividad de entre el 50-80% sobre Hymenolepis
nana en ratones (Bernabe-Pérez, 2007), y sobre cepas de Giardia
intestinalis susceptibles y resistentes al albendazol (Jiménez-Cardoso et al.,
2004); así como su actividad inhibitoria hasta en un 97% sobre el
crecimiento in vitro de Entamoeba histolytica (Ordaz Pichardo et al., 2005).
Por otro lado se evaluó la actividad antimicótica de estos carbamatos, en
Trichophyton mentagrophytes y Aspergillus fumigatus; inhibiendo su
crecimiento en más del 60% (Reyes-González, 2007).
Así mismo, se han realizado pruebas con estos compuestos que han
permitido demostrar su potencial ixodicida y su posible uso en animales.
Dichos ensayos se han realizado por el grupo de investigadores del
laboratorio de Inmunología y Biología Molecular de Parásitos de la FESC.

23
 Inicialmente se realizaron las pruebas in vitro de estos compuestos
con cepas susceptibles y resistentes de R. microplus, de estos ensayos se
obtuvo que los carbamatos identificados como LQM 919 y LQM 996, inhiben
la oviposición en más del 60% e inhiben la eclosión de los huevos
producidos por las garrapatas tratadas con los carbamatos hasta en un
100%; además los huevos ovipositados por las garrapatas tratadas se
observaron disgregados, oscuros, secos y no fueron viables (Prado-Ochoa
et al., 2013; Pérez-González et al., 2013). Por otro lado se evaluó el efecto
del etil-4-clorofenil-carbamato (LQM 996) y del etil-4-bromofenil-carbamato
(LQM 919) sobre la actividad de AChE, estructura de los huevos y órganos
reproductores de dos cepas de R. microplus; cuyos resultados mostraron
que los efectos de estos carbamatos son independientes a la actividad de la
AChE y que las alteraciones morfológicas de los órganos reproductores
fueron debidas a la acción de estos carbamatos sobre la vitelogénesis y
viabilidad de las células del ovario (Prado-Ochoa et al., 2014b).

Posteriormente se realizaron las pruebas toxicológicas. Se determinó la

toxicidad oral aguda y dérmica aguda del etil-4-clorofenil-carbamato (LQM
996) y del etil-4-bromofenil-carbamato (LQM 919) en ratas. La dosis letal 50
(DL50) oral fue de 300-2000 mg/kg y la dérmica de >5000mg/kg para ambos
carbamatos, aunque se presentaron algunos signos de toxicidad en la
exposición oral, en la exposición dérmica no se observaron signos de
toxicidad en ninguna de las dosis empleadas. Con lo anterior se demostró
que los carbamatos evaluados son de baja toxicidad oral y dérmica (Prado-
Ochoa et al., 2014a). También se evaluó la toxicidad subcrónica en ratas
con los carbamatos LQM 919 y LQM 996. En este estudio se observaron
alteraciones en algunos de los parámetros evaluados como el hematocrito,
porcentaje de reticulocitos, algunas enzimas hepáticas y creatinina en las
ratas expuestas a los carbamatos y se demostró la reversibilidad de estas

24
alteraciones al suspender la exposición a los productos. Con este estudio
fue posible determinar que la dosis sin efectos adversos observables
(NOAEL) fue de 12.5 mg/kg/día (Prado-Ochoa et al., 2014c).

Finalmente, se evaluó por medio de la prueba de micronúcleos en

sangre periférica de rata el daño genético in vivo producido por los
carbamatos evaluados, además se evaluó el efecto de los carbamatos in
vitro sobre la cinética de proliferación celular en cultivos de linfocitos
humanos. Los resultados de este estudio mostraron el bajo potencial
genotóxico de los carbamatos estudiados en algunas dosis empleadas, así
como su efecto sobre el ciclo celular (Prado-Ochoa, 2013).

25
 JUSTIFICACIÓN

Debido a los problemas generados por la resistencia de las

garrapatas a las familias comerciales de ixodicidas químicos, la falta de
control integral y la poca o nula aplicación de otros tipos de control como el
biológico, es permanente la necesidad de la creación de productos de
nueva síntesis para el control químico de las garrapatas. El trabajo conjunto
de Químicos, Médicos Veterinarios y otros profesionales en la FES-
Cuautitlán, ha permitido diseñar, sintetizar y evaluar nuevos compuestos
para tal fin. En el Laboratorio de Química Medicinal de la FESC, se
diseñaron y sintetizaron una serie de nuevos carbamatos, los cuales
posteriormente fueron evaluados en el Laboratorio de Inmunología y
Biología Molecular de Parásitos de la UIM-FESC. Los resultados mostraron
que los carbamatos identificados como LQM 919 y LQM 996 tuvieron una
buena eficacia en pruebas in vitro sobre cepas susceptibles y resistentes de
garrapatas R. microplus además de obtener las concentraciones que son
efectivas (LQM 919= 0.703 mg/mL y LQM 996= 0.589 mg/mL) (Prado-
Ochoa et al., 2013; Pérez-González et al., 2013). Posteriormente, se
realizaron estudios de toxicidad aguda oral, crónica oral y aguda dérmica,
además de evaluar la genotoxicidad y la citotoxicidad de estos compuestos;
con lo que se pudo clasificar a los carbamatos antes mencionados como de
baja toxicidad según parámetros de la OCDE (Prado-Ochoa, 2013; Prado-
Ochoa et al., 2014a; Prado-Ochoa et al., 2014b; Prado-Ochoa et al., 2014c).
Sin embargo, no existen trabajos que hayan evaluado el efecto de estos
carbamatos sobre garrapatas que se encuentren parasitando a bovinos. Por
lo anterior en este proyecto se pretende evaluar la eficacia de estos
carbamatos in vivo para determinar si pueden ser una nueva alternativa
farmacéutica para el control de la ixodidosis en el ganado bovino.

26
 OBJETIVOS

Objetivo general

Evaluar in vivo, el efecto de los carbamatos de nueva síntesis Etil-4

cloro-fenilcarbamato y Etil-4 bromo-fenilcarbamato (identificados como LQM
919 y LQM 996 respectivamente), sobre las fases parásitas de la garrapata
Rhipicephalus microplus presentes en bovinos.

Objetivos particulares

• Evaluar el efecto de los carbamatos identificados como LQM 919 y LQM

996 sobre las diferentes fases parásitas de R. microplus en bovinos.

• Determinar si la exposición de diferentes estadios de garrapatas a los

carbamatos de nueva síntesis repercute en la oviposición de las
hembras que se logren repletar.

• Determinar si la eclosión de las larvas de huevos ovipositados por

hembras tratadas se ve afectada por la exposición a los carbamatos
LQM 919 y LQM 996.

27
 HIPÓTESIS

La exposición in vivo de garrapatas R. microplus a los carbamatos LQM

919 y LQM 996, genera el desprendimiento de fases parásitas, además de
la disminución en la cantidad y viabilidad de los huevos producidos.

28
 MATERIAL Y MÉTODOS

Ubicación
Este trabajo se desarrolló en el laboratorio de Inmunología y Biología
Molecular de Parásitos de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria
(laboratorio 1) y en las instalaciones del módulo de producción pecuaria de
posgrado de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM.

Material biológico
Cepa de garrapatas R. microplus: Se utilizó la cepa “San Alfonso”, que
es una cepa resistente a organofosforados, piretroides y amidinas. Esta
cepa fue donada por el Centro Nacional de Parasitología (SAGARPA); las
fases parásitas se mantuvieron a través de infestaciones controladas en
bovinos y las fases no parásitas se mantuvieron in vitro en el laboratorio.

Animales: Se utilizaron toretes raza Holstein-Fresian, clínicamente

sanos y con un peso de entre 100-150 kg.
Los bovinos fueron alojados en infestaderos cuyo diseño limita
parcialmente el movimiento para evitar que por conducta natural el animal
se desprenda las garrapatas del cuerpo. La alimentación de los animales
consistió en alfalfa achicalada y agua ad libitum. Las porciones de
mantenimiento fueron calculadas de acuerdo al peso y edad de los
animales.
Compuestos evaluados
Se evaluaron dos carbamatos que fueron diseñados y sintetizados en la
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán por el equipo de trabajo del Dr.
Enrique Ángeles Anguiano. Estos se sintetizaron utilizando aril y

29
alquilaminas con hidruro de sodio y dietilcarbonato de benceno;
posteriormente se purificaron mediante cromatografía en columna y se
recristalizaron. Su estructura fue elucidada mediante técnicas de
espectroscopia.
La estructura química, el peso molecular y la nomenclatura de éstos
compuestos se presentan en el cuadro 1. Para facilidad del texto, estos
compuestos serán referidos por su clave de identificación.
PESO
NOMBRE
ESTRUCTURA MOLECULAR CLAVE
QUÍMICO
(g/mol)
NH O CH3
Etil (4-
clorofenil) O 199.63 LQM 996
carbamato Cl
NH O CH3
Etil (4-
O
bromofenil) Br 244 LQM 919
carbamato
Cuadro 1: Nombre, estructura y peso molecular de los carbamatos de nueva
síntesis utilizados en el proyecto

Técnica de cámaras

Esta técnica está descrita en la norma NOM-006-ZOO-1993 de

SAGARPA ("Requisitos de efectividad biológica para los ixodicidas de uso
en bovinos y método de prueba"). La prueba proporciona información útil
acerca de la efectividad que alcanzan productos ixodicidas cuando son
aplicados en áreas seleccionadas de la piel del bovino, y en las cuales se
encuentran presentes garrapatas en distintos estadios de desarrollo,
incluyendo aquellas en fase de muda. Por otro lado, la oportunidad de
realizar seguimientos "in vitro" de los especímenes colectados durante el
periodo posterior al tratamiento, complementa y enriquece los resultados de
estas evaluaciones.

30
 Los bovinos se alojan de forma
individual en infestaderos. En cada
bovino se seleccionan de 4 a 6 áreas del
dorso en las cuales se rasura el
perímetro de un círculo, y posteriormente
se pegan cámaras de tela de algodón
(figura 4). Después de 24 horas, se
Figura 4: Bovino con la técnica de
colocan dentro de éstas cámaras cámaras preparado para infestar.

larvas de la especie de garrapata a estudiar, y se cierran. Se realizan

infestaciones en diferentes momentos con el fin de tener garrapatas de
distintos estadios evolutivos. Los tratamientos se aplican por aspersión
manual a las concentraciones previamente determinadas. Una vez que las
garrapatas alcanzan la repleción, se colectan de las cámaras para dar el
seguimiento de la oviposición y la eclosión de larvas in vitro.

DISEÑO EXPERIMENTAL

En la figura 5 se muestra un esquema del diseño experimental. Los dos

carbamatos fueron evaluados mediante la técnica de cámaras modificada.
Se realizó un ensayo y una repetición de la técnica in vivo. Para cada
ensayo, se utilizaron 4 bovinos de la raza Holstein-Fresian, por lo que para
cada uno de los productos se utilizaron 8 bovinos diferentes.

El día 0 se colocaron dentro de las cámaras aproximadamente 1000

larvas de R. microplus de la cepa San Alfonso. El tratamiento que recibieron
los bovinos de cada ensayo se resumen en el cuadro 2. En cada cámara se
aplicaron 200 mL de la solución preparada. Las soluciones para los
animales tratados contenían el producto a evaluar según el caso (LQM 919=
0.703 mg/mL y LQM 996= 0.589 mg/mL), se utilizó como vehículo

31
Dimetilsulfóxido (4%) y agua destilada
(c.b.p. 200 mL). Las cámaras de los
bovinos testigo (bovino 4 de cada
ensayo) solo fueros asperjadas con 200
mL del vehículo (figura 6).
Entre los días 21 a 26 P.I. se
recolectaron de las cámaras, las
garrapatas que lograron alcanzar la Figura 6: Aplicación del
tratamiento en las cámaras
repleción. Posteriormente, éstas se
pesaron en balanza analítica en grupos de 10 y se colocaron en cajas Petri.
Se colocaron en total 3 cajas Petri con garrapatas de cada una de las
cámaras. Éstas se incubaron durante 15 días en estufa entomológica a
28±2°C con una humedad relativa del 80-90%. Posteriormente, se realizó el
conteo de la cantidad de hembras que ovipositaron en cada caja. A
continuación, se separó la masa de huevos y se pesó en balanza analítica.
La masa de huevos recolectada de cada caja fue colocada en frascos de
cristal y se incubó en estufa entomológica a 28±2°C, con una humedad
relativa del 80-90% hasta la eclosión de las larvas (SAGARPA, 2014).

32
 RECOLECCION DE
INFESTACIÓN HEMBRAS REPLETAS MEDICIÓN DE
(DÍA 0) (DÍAS 21 AL 26) PARÁMETROS

PESAJE DE HEMBRAS CONTEO DE HEMBRAS

REPLETAS EN CAMARAS
TRATAMIENTO A
LARVAS (DÍA 2)
INCUBACION DE
HEMBRAS REPLETAS

CONTEO DE HEMBRAS MEDICIÓN DE %Op

TRATAMIENTO A QUE OVIPOSITARON ANALISIS
NINFAS (DÍA 8) ESTADISTICO

PESAJE DE HUEVOS MEDICIÓN %InhOp

TRATAMIENTO A INCUBACIÓN DE
ADULTAS (DÍA 16) HUEVOS

CONTEO DE LARVAS MEDICIÓN DE %Ec

ECLOSIONADAS

Figura 5: Diseño experimental. %Op: Porcentaje de oviposición; %InhOp: Porcentaje de Inhibición de la

Oviposición; %Ec: Porcentaje de Eclosión 33
 NO. DE CAMARAS CARBAMATO DÍA DE
ENSAYO BOVINO
POR BOVINO USADO TRATAMIENTO

1 4 2 PI
2 4 LQM 919 8 PI
1
3 4 16 PI
4 3 UNICAMENTE VEHICULO 2, 8, 16 PI
1 4 2 PI
2 4 LQM 919 8 PI
2
3 4 16 PI
4 3 UNICAMENTE VEHICULO 2, 8, 16 PI
1 4 2 PI
2 4 LQM 996 8 PI
3
3 4 16 PI
4 3 UNICAMENTE VEHICULO 2, 8, 16 PI
1 4 2 PI
2 4 LQM 996 8 PI
4
3 4 16 PI
4 3 UNICAMENTE VEHIVULO 2, 8, 16 PI

Cuadro 2: Esquema de los tratamientos y momentos de aplicación de los mismos, que recibieron los bovinos en el
presente trabajo.

34
 Parámetros evaluados

 Conteo total de hembras repletas: Es el conteo total de las hembras que

alcanzaron la repleción dentro de las cámaras durante los días de caída
de las garrapatas (FAO, 2011).

 Porcentaje de oviposición (%Op): Se calculó tomando los datos del

número de hembras que ovipositaron de cada grupo tratado y su testigo
empleando la fórmula (FAO, 2011):

HEMBRAS QUE OVIPOSITARON * 100

=%Op
=
HEMBRAS TOTALES

 Porcentaje de inhibición de la oviposición (%InhOp): Para calcular

este parámetro primero se calculó el índice de oviposición (IO) tomando el
peso de los huevos y las hembras, utilizando la fórmula 1 y posteriormente
se calculó el porcentaje de inhibición de la oviposición tomando los datos de
IO del grupo tratado y el IO del grupo testigo, con la fórmula 2 (FAO, 2011).

FÓRMULA 1:
PESO DE LOS HUEVOS (g)
= IO
PESO DE LAS HEMBRAS (g)
O
FÓRMULA 2:
IO GRUPO TESTIGO - IO GRUPO TRATADO
*100 = %InhOp
IO GRUPO TESTIGO

35
 Porcentaje de eclosión (%Ec): Se calculó tomando los datos del
número de cascarones y huevos no eclosionados colocados en el campo de
100 mm2 empleando la fórmula (FAO, 2011):

NO. DE CASCARONES * 100

= % Ec
NO. DE CASCARONES + NO. HUEVOS

 Reducción total de larvas producidas: Es la reducción final del número de

larvas producidas por las garrapatas tratadas en los diferentes estadios.
SE calculó sumando el porcentaje de reducción de hembras que
alcanzaron la repleción, el porcentaje de reducción de hembras que
ovipositaron, el porcentaje de inhibición de la oviposición y la reducción
del porcentaje de eclosión. Finalmente, se promedió la reducción total de
larvas producidas por las garrapatas tratadas en los diferentes estadios
(larvas, ninfas y adultas).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos fueron analizados con el programa estadístico Graph Pad
Prism ®. La comparación del parámetro de conteo de hembras repletas, se
realizó por prueba t-student para muestras no pareadas, el porcentaje de
inhibición de la oviposición se realizó por prueba de análisis de varianza de
una vía (ANOVA), y en el caso de los parámetros de porcentaje de
oviposición y porcentaje de eclosión, se realizó el análisis Xi-cuadrada. Para
todos los análisis se utilizó un nivel de confianza del 95%.

36
 RESULTADOS

Conteo total de hembras repletas en cámaras

En la gráfica 1 y cuadro 3 se muestran los resultados del total de

hembras repletas de R. microplus recolectadas de las cámaras tratadas con
los productos LQM 996 y LQM 919. Los resultados de este conteo
mostraron que una menor cantidad de hembras (p<0.05) que se repletaron
en las cámaras tratadas indistintamente con los productos, en comparación
con las garrapatas del grupo testigo. En las cámaras tratadas en fase de
larvas indistintamente con los productos hubo una disminución (p< 0.01) de
la cantidad de hembras repletas con respecto a su control. También se
apreció una disminución de hembras repletas, en las cámaras tratadas en
fase de ninfas (p<0.01) y en las cámaras tratadas en fase de adultas (p<
0.05) con respecto a su control. En la figura 7 se pueden observar los
efectos antes mencionados.

LQM 919 LQM 996

ESTADIO
TESTIGO TRATAMIENTO TESTIGO TRATAMIENTO

LARVAS 287.50±13.50 2.62±1.32* 226.50±15.50 8.37±4.31*

NINFAS 332.0±127.0 39.88±11.15* 402.50±15.50 104.90±32.81*

ADULTAS 352.50±2.50 222.80±25.23* 353.50±120.50 148.90±18.92*

Cuadro 3: Media ± EE del total de garrapatas que alcanzaron la repleción en cámaras,

agrupadas de acuerdo al estadio en el que recibieron el tratamiento con los carbamatos y
su respectivo testigo. * Indica diferencia (p<0.05) con respecto a su grupo testigo.

37
 Figura 7: Hembras repletas en cámaras, tratadas con la solución control o con el
carbamato LQM 996 o LQM 919. a Cámara testigo, b Cámara tratada en estadio de
larvas, c Cámara tratada en estadio de ninfas, d Cámara tratada en estadio de
adultas.

38
 TOTAL DE GARRAPATAS QUE ALCANZARON LA REPLECIÓN
500

400
CONTROL LARVAS
HEMBRAS REPLETAS

LARVAS TRATADAS
300
* CONTROL NINFAS

200
NINFAS TRATADAS

* * CONTROL ADULTAS

100 ADULTAS TRATADAS

* *
0
*
LQM 996 LQM 919
CARBAMATOS

GRÁFICA 1: Total de hembras repletas recolectadas en cámaras, agrupadas de acuerdo al estadio en el que
recibieron el tratamiento in vivo con los carbamatos y su respectivo testigo. Cada barra representa la media ± EE
de un ensayo y su repetición.

*Diferencia significativa contra su respectivo grupo testigo (p<0.05).

39
 Porcentaje de oviposición

En la gráfica 2 y cuadro 4 se compara el porcentaje de oviposición

(hembras que ovipositaron) de las garrapatas que fueron tratadas in vivo
con los productos LQM 996 y LQM 919 y que alcanzaron la repleción
(estadios de ninfas y adultas). El bajo número de hembras repletas
obtenidas de las garrapatas tratadas en estadio de larvas, no permitió la
evaluación de este parámetro.
Únicamente se observó una diferencia significativa (p<0.01) con respecto
al control en el estadio de ninfas con el tratamiento con LQM 919; sin
embargo, los huevos de las garrapatas tratadas con los carbamatos in vivo
tanto de las fases ninfas, como de las fases adultas mostraron una
apariencia opaca, reseca y más oscura, además de ser poco adherentes, en
comparación de los huevos ovipositados por garrapatas de grupos testigos
(Figura 8).

LQM 919 LQM 996

ESTADIO
TESTIGO TRATAMIENTO TESTIGO TRATAMIENTO

NINFAS 100±1.76 75±4.87* 100±2.11 100±1.24

ADULTAS 100±2.52 100±1.58 100±0.00 100±1.30

Cuadro 4: Media ± EE del parámetro de porcentaje de oviposición. Los datos se

encuentran agrupados de acuerdo al estadio en el que las garrapatas recibieron el
tratamiento in vivo con los carbamatos y su respectivo testigo. * Indica diferencia
(p<0.05) con respecto a su grupo testigo.

40
Figura 8: Huevos ovipositados por las hembras que recibieron el tratamiento in
vivo. a Huevos ovipositados por hembras control, b Huevos ovipositados por
hembras tratadas con los carbamatos LQM 919 y LQM 996

41
 PORCENTAJE DE OVIPOSICIÓN
100

80
*
% HEMBRAS QUE OVIPOSITARON

CONTROL NINFAS
60
NINFAS TRATADAS

CONTROL ADULTAS
40
ADULTAS TRATADAS

20

0
LQM 996 LQM 919
CARBAMATOS

GRÁFICA 2: Porcentajes de oviposición producidos por las hembras que lograron la repleción,
agrupadas de acuerdo al estadio en el que recibieron el tratamiento in vivo con los carbamatos y su
respectivo testigo. Cada barra representa la media ± EE de un ensayo y su repetición.

*Diferencia significativa contra su respectivo grupo testigo (p<0.05). 42

Porcentaje de inhibición de la oviposición

En la gráfica 3 y cuadro 5 se muestran los resultados del porcentaje de

inhibición de la oviposición; este parámetro refleja la relación existente entre
el peso de las hembras repletas y el peso de la masa de huevos
ovipositados por las mismas. Los resultados de este parámetro mostraron
que hubo un aumento (p<0.01), del porcentaje de inhibición de la
oviposición posterior al tratamiento con los productos LQM 996 y LQM 919
en los estadios de ninfas y adultas con respecto a su control. El bajo
número de hembras repletas obtenidas de las garrapatas tratadas en
estadio de larvas, no permitió la evaluación de este parámetro.

LQM 919 LQM 996

ESTADIO TESTIGO TRATAMIENTO TESTIGO TRATAMIENTO

NINFAS -0.0013±3.93 60.48±3.64* -1.73e-008±6.31 19.48±4.04*

ADULTAS 3.13±3.98 61.41±2.23* 7.74e-005±2.29 43.94±3.46*

Cuadro 5: Media ± EE del parámetro de inhibición de la oviposición. Los datos se

encuentran agrupados de acuerdo al estadio en el que las garrapatas recibieron el
tratamiento in vivo con los carbamatos y su respectivo testigo. * Indica diferencia
(p<0.05) con respecto a su grupo testigo.

43
 PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DE LA OVIPOSICIÓN
100

80

* *
% DE INHIBICIÓN

CONTROL NINFAS
60
NINFAS TRATADAS
* CONTROL ADULTAS
40
ADULTAS TRATADAS

*
20

0
LQM 996 LQM 919
CARBAMATOS

GRÁFICA 3: Porcentaje de inhibición de la oviposición de las garrapatas agrupadas de

acuerdo al estadio en el que recibieron el tratamiento in vivo con los carbamatos y su
respectivo testigo. Cada barra representa la media ± EE de un ensayo y su repetición.

*Diferencia significativa contra su respectivo grupo testigo (p<0.05).

44
Porcentaje de eclosión

Los porcentajes de eclosión de los huevos ovipositados por hembras que

alcanzaron la repleción y fueron tratadas in vivo en los estadios de ninfas y
adultas con LQM 996 y LQM 919 se presentan en la gráfica 4 y cuadro 6.
Se observó que el porcentaje de eclosión disminuyó (p<0.01), en presencia
del tratamiento en el caso de ambos productos y en ambos estadios en
comparación con su control. El bajo número de hembras repletas obtenidas
de las garrapatas tratadas en estadio de larvas, no permitió la evaluación de
este parámetro.

LQM 919 LQM 996

ESTADIO
TESTIGO TRATAMIENTO TESTIGO TRATAMIENTO

NINFAS 66.43±4.83 0.00±0.00* 78.87±3.83 28.39±5.67*

ADULTAS 67.68±4.70 0.27±0.17* 78.94±3.23 7.16±2.86*

Cuadro 6: Media ± EE de la eclosión de larvas de los huevos producidos por las

garrapatas tratadas. Los datos se encuentran agrupados de acuerdo al estadio en el
que las garrapatas recibieron el tratamiento in vivo con los carbamatos y su
respectivo testigo. * Indica diferencia (p<0.05) con respecto a su grupo testigo.

45
 PORCENTAJE DE ECLOSIÓN DE LARVAS

100

80
% ECLOSIÓN

60 CONTROL NINFAS

NINFAS TRATADAS
40
* CONTROL ADULTAS

ADULTAS TRATADAS
20
*
* *
0
LQM 996 LQM 919
CARBAMATOS

GRÁFICA 4: Porcentajes de eclosión de los huevos ovipositados por las garrapatas tratadas,
agrupadas de acuerdo al estadio en el que recibieron el tratamiento in vivo, y su respectivo testigo.
Cada barra representa la media ± EE de un ensayo y su repetición.

*Diferencia significativa contra su respectivo grupo testigo (p<0.05).

46
 Reducción total de larvas producidas

La eficacia de cada uno de los productos se presenta en el cuadro 7. En

las garrapatas tratadas en el estadio de larvas se puede apreciar que con el
carbamato LQM 919 se redujo la cantidad de larvas producidas un 99.97% y
con el carbamato LQM 996 un 98.30%.

47
 LQM 919 LQM 996

PARÁMETROS MEDIDOS LARVAS NINFAS ADULTAS LARVAS NINFAS ADULTAS

Reducción de hembras
99.09 87.99 36.80 96.31 73.94 57.88
repletas
Disminución de
100.00 75.00 0.00 100.00 0.00 0.00
oviposición

Inhibición de la oviposición 100.00 60.48 75.62 100.00 19.48 43.94

Reducción en la eclosión
100.00 100.00 99.73 100.00 71.61 92.84
de larvas
Reducción total de larvas
disponibles para la 100.00 100.00 99.93 100.00 5.96 98.30
siguiente generación

TOTAL CARBAMATO 99.97% 98.30%

Cuadro 7: Eficacia obtenida en cada parámetro y reducción total de larvas producidas por cada uno de los carbamatos
evaluados.

48
 DISCUSIÓN

La ixodidosis es un problema mundial que afecta severamente al ganado

bovino en zonas tropicales y subtropicales. El manejo que se le ha dado al
control de esta parasitosis ha sido poco adecuado y ha ocasionado la
aparición de garrapatas resistentes a la mayoría de las familias de químicos
empleados para combatirlas. Los carbamatos de nueva síntesis evaluados
en este trabajo demostraron ser eficaces sobre una cepa de garrapatas
triple resistentes a ixodicidas usados en México (amidinas, piretroides y
organofosforados.)
El uso indiscriminado de ixodicidas en México ha estimulado la aparición
de cepas de R. microplus resistentes a algunos Ixodicidas usados. En 2001
se aislo en la región de los Ríos en Tabasco, la cepa “San Alfonso”, que
presentó multirresistencia a organofosforados, piretroides y amidinas
(Fragoso y Soberanes, 2001). Previo a este trabajo se realizaron en nuestro
laboratorio pruebas para corroborar la resistencia de la cepa “San Alfonso”
usada en esta proyecto y se encontró que no solo es resistente a
organofosforados, piretroides y amidinas, sino también al propoxur (datos
no publicados). En el presente estudio, la eficacia calculada (reducción de
larvas disponibles para la siguiente generación) fue para el carbamato LQM
919 del 99.97% y para LQM 996 del 98.30%. Lo anterior muestra que los
carbamatos evaluados son altamente eficaces sobre las garrapatas R.
microplus resistentes a ixodicidas comerciales.
Una característica de un buen ixodicida es que sea efectivo a bajas
concentraciones. En este contexto, se ha demostrado in vitro por la técnica
de inmersión de hembras adultas que organofosforados (Coumafos 0.2
mg/mL, clorpirifos 0.3 mg/mL, clorfenvinfos 0.3 mg/mL, etion 0.56 mg/mL),
piretroides (flumetrina 0.04 mg/mL y deltametrina 0.02 mg/mL) y amidinas

49
(amitraz 0.15-0.5 mg/mL) a bajas dosis son efectivas sobre cepas de R.
microplus susceptibles a ixodicidas (Foil et al., 2004). Por otro lado, los
laboratorios farmacéuticos recomiendan usar estos productos sobre bovinos
a concentraciones similares (Asuntol®, coumafos 0.2 mg/mL; Bayticol® Dip
3%, Flumetrina 0.03 mg/mL; Bovitraz 12.5%®, amitraz 0.25 mg/mL). En el
presente estudio, las concentraciones empleadas de los carbamatos
LQM919 (0.703 mg/mL) y LQM996 (0.589 mg/mL) son ligeramente mayores
a las recomendadas para el uso in vivo de otros ixodicidas. Si bien, con
estos datos no se puede afirmar que los carbamatos evaluados son mejores
o peores que otros ixodicidas, si se puede concluir que la concentración
efectiva de ambos carbamatos se encuentra dentro del rango recomendado
para los ixodicidas comerciales, con la gran ventaja de ser efectivos sobre
cepas multiresistentes.
Se ha demostrado que algunos carbamatos como el propoxur o el
carbaryl actúan inhibiendo la AChE en el sistema nervioso de los
artrópodos, lo que les provoca parálisis y muerte (Sogorb y Vilanova, 2002;
Tan et al., 2011). En un estudio previo realizado por Prado-Ochoa et al.,
(2014b) demostraron que los carbamatos LQM919 y LQM996 son
inhibidores débiles de la AChE y que su principal mecanismo de acción es
inhibiendo la vitelogenesis y la viabilidad de las células ováricas, lo que
produce una disminución en la producción de huevos, cambios en su
morfología e inhibe la eclosión. En el presente estudio las hembras que
lograron repletarse produjeron huevos con alteraciones morfológicas
similares y de los cuales no eclosionaron larvas. Por lo anterior, podemos
concluir que cuando se tratan las fases de ninfas y adultos con los
carbamatos LQM919 y LQM996 sobre los bovinos, se inhibe la
vitelogenesis.
Prado-Ochoa et al., 2013 y Pérez-González et al., 2013 demostraron
por la técnica de paquete de larvas que los carbamatos LQM919 y LQM996

50
no tienen efecto sobre la mortalidad de larvas de cepas R. microplus
susceptibles o resistentes a ixodicidas comerciales usados en México.
Ademas, Prado-Ochoa et al., (2014b) demostró in vitro que estos
carbamatos son inhibidores débiles de la AChE. Sin embargo, en este
trabajo se observó que cuando estos carbamatos se aplicaron por aspersión
in vivo sobre las larvas de R. microplus se inhibió su desarrollo y murieron.
Un efecto similar ocurrió con aproximadamente el 80% de las ninfas que se
asperjaron con los carbamatos evaluados y el 50% de las adultas
asperjadas. Por lo anterior, los carbamatos evaluados deben tener un
mecanismo de acción adicional al ya reportado, puesto que cuando las
garrapatas se encuentran alimentándose sobre los bovinos, estos
carbamatos inducen la muerte.
Se ha demostrado que los carbamatos LQM919 y LQM996 alteran en
mamíferos el ciclo celular de células en rápida reproducción (Prado-Ochoa,
2013) y el desarrollo de ovocitos en hembras de garrapatas repletas (Prado-
Ochoa et al., 2014b). En ambos casos, afectan a células con alta actividad
metabólica. En los estadios de garrapatas que se encuentran
alimentándose, las células con mayor actividad son las del tracto digestivo
(glándulas salivales e intestino), por lo que probablemente estas sean las
células blanco de los carbamatos en garrapatas que están en alimentación.
Sin embargo, se requieren estudios posteriores para determinar cuál es
mecanismo de acción de estos carbamatos en los estadios que están
parasitando.
La técnica de cámaras desarrollada en este proyecto está basada en
la metodología propuesta en la norma oficial mexicana NOM-006-ZOO-1995
(SAGARPA 2014). La prueba proporciona información útil acerca de la
efectividad que alcanzan productos ixodicidas cuando son aplicados en
bovinos o sobre las áreas en las cuales se encuentran presentes las
garrapatas. La técnica menciona que se deben realizar 10 infestaciones

51
cada tercer día para cumplir un periodo de 27 días entre la primera y la
última infestación con aproximadamente entre 500-650 larvas por cámara,
con la finalidad de tener garrapatas de diferentes estadios en la misma
cámara para cuando se realice el tratamiento. Después de realizar varias
veces el intento, nosotros encontramos que no es posible poner tantas
garrapatas en el área indicada (20 cm de diámetro= 314.16 cm2), además al
tener diferentes estadios en la misma cámara, no es posible diferenciar el
efecto sobre cada una de las diferentes fases. Por lo anterior, nosotros
modificamos y estandarizamos la técnica. Dichas modificaciones
consistieron en: cada cámara se infestó con 1000 larvas de R. microplus
para evitar la saturación de garrapatas en el área delimitada para la
infestación y que esto evitara su desarrollo por competencia, por otro lado,
las cuatro cámaras de cada bovino se trataron al mismo tiempo para que
claramente se observaran los efectos de los carbamatos evaluados sobre
las fases tratadas. Nuestras observaciones muestran claramente que no es
posible realizar las pruebas como se encuentran en la norma oficial
mexicana NOM-006-ZOO-1995, por lo que sugerimos se realicen las
adecuaciones pertinentes.
Considerando las observaciones realizadas con anterioridad por
nuestro grupo de trabajo (Prado Ochoa, 2013; Pérez-González et al., 2013,
Prado-Ochoa et al., 2013; Prado-Ochoa, 2014; Prado-Ochoa et al., 2014a;
Prado-Ochoa et al., 2014b; Prado-Ochoa et al., 2014c), los resultados
obtenidos en este estudio superaron nuestras expectativas, puesto que no
esperábamos que los productos ocasionaran la muerte en alguna fase del
ciclo de las garrapatas. Nuestros resultados muestran que los efectos de
producidos por los carbamatos aplicados in vivo, suman la muerte producida
a un alto número de garrapatas, con la inhibición de la oviposición y la
disminución de la eclosión de larvas en las garrapatas restantes. Pese a lo
anterior, antes de ser utilizados estos carbamatos para el control de

52
garrapatas, es necesario realizar pruebas de establo con todas las fases
parásitas presentes de forma simultánea, y de campo; además de continuar
con los estudios para esclarecer el mecanismo de acción, estabilidad
química, formulación e impacto ambiental. Sin embargo, existe una gran
posibilidad de que estos compuestos sean en un mediano plazo una nueva
opción en el control de garrapatas.

53
 CONCLUSIONES

 Los productos LQM 919 y LQM 996 inhiben el desarrollo de las

garrapatas tratadas, casi en su totalidad en fase de larvas, mientras
que la cantidad de garrapatas tratadas en fase de ninfas y adultas
que alcanzan la repleción se ve disminuida.

 Los huevos ovipositados por las garrapatas tratadas mostraron serias

alteraciones morfológicas, por lo que hubo una elevada inhibición de
la oviposición, así como una disminución de la eclosión de larvas.

 La eficacia del producto LQM 919 fue de 99.9%, mientras que el

producto LQM 996 mostró una eficacia del 98.3%.

 Los efectos observados in vivo concordaron y superaron los efectos

observados in vitro.

54
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