Cromatografía Monografia

CROMATOGRAFÍA:
Según define la IUPAC, la cromatografía es un método, usado primariamente para

la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se
distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras la otra se
mueve. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un
sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar extendida como una capa o
distribuida como una película, etc
Los componentes que tienen mayor afinidad por la fase estacionaria son más
retenidos en el sistema que aquellos que son distribuídos en la fase móvil.
(Quattrochi, Andrizzi, & Laba, 1992)
Por tanto la modalidad de cromatográfica empleada en el presente trabajo es

cromatografía líquida de alta performance (HPLC) correspondiente a la
cromatografía liquido-solido (LSC) de fase reversa donde :
a) LA FASE ESTACIONARIA: Es solida de naturaliza apolar ( COLUMNA C18

es de silicagel con una cubierta por d 18 átomos de carbono forma de
relleno) este por un mecanismos de retencion por adsorcion separa a los
analitos Gatifloxacina y Dexametasona fosfato en funcion a la polaridad
de los mismos.
b) LA FASE MOVIL: Es mezcla liquida de solventes polares constituída por

:
 SOLUCION BUFFER 40% (1,36g de fosfato monobásico de
potasio solubilizados en 400 mL de agua ultrapurificada)
actuando como currier y mejora la asimetria de los picos de los
analitos Gatifloxacina y Dexamentasona.
 MODIFICADOR ORGÂNICO: METANOL 60% ayuda a mejorar la
selectividad .
La proporcion selecionada se debe a que el modificador orgânico mejora

acortando el tiempo de retencion de los analitos Gatifloxacina y mas que
todo a la Dexametasona fosfato debido a que la fuerza de elucion del
metanol arrastra a la dexametasona que es de alta polaridade .
c) Los SOLUTOS son los analitos Gatifloxacina y Dexametasona que seran

separados y retenidos segun su polaridad :
 Gatifloxacina: sera el primero en eluir con la fase movil mediante
una reaccion de puentes de hidrogeno formada por el agua y
moléculas de oxigeno presente en la estrutura siendo corto el
tiempo de retencion del analito.
 Dexametasona: la alta apolaridad le da el anillo alifatico logrando ser
retenido en la fese estacionaria con un mayor tiempo por fuerzas de
vander waals teniendo um mayor tiempo de retencion con la fase
estacionaria .
INSTRUMENTACION: El notorio avance que la cromatografia liquida moderna ha

experimentado en los ultimos años , en especial en lo referente al desarrollo de
nuevas fases estacionarias, ha permitido al analista acceder a un nivel
instrumental de alta precision, compuesto por bombas que permiten entregar( en
un solo instrumento) caudales muy estables que varian entre el microlitro y varios
mililitros, detectores con celdas intercambiables en las cuales el volumen puede
escogerse, generalmente, entre 1 y 12µL, valvulas accionadas por
microprocesadores que permiten direccionar la fase movil para automatizar
procesos, integradores versatiles conectados a una computadora que puede
permitir no solo el contrl global de uno o mas equipos cromatograficos sino la libre
manipulacion y almacenamito de datos, generacion de reportes e incluso el
desarrollo automatico de metodos.
(Quattrochi, Andrizzi, & Laba, 1992)
DESCRIPCION:
En el presente trabajo se utilizo para la parte experimental el equipo HPLC

JASCO AUTOMATICO LC- 4000 el cual esta compuesto por una amplia gama de
modulos los cuales son:
Donde el funcionamiento y conexión a cada módulo es la siguiente, por acción de
una bomba, se hace pasar una mezcla de compuestos o analitos en un sistema
disolvente comúnmente conocido como fase móvil. La fase móvil pasa a través de
una columna cromatográfica, que contiene la fase estacionaria a un flujo
especificado. La separación de los compuestos ocurre en base a la interacción de
éstos con la fase móvil y la fase estacionaria
PARTES HPLC JASCO AUTOMATICO LC- 4000 :
a) RESERVORIO DE LA FASE MOVIL: Que suelen ser botellas de vidrio y

tubos de teflón provistos de aditamentos indispensables para eliminar los
gases disueltos y partículas que pudiera tener la fase móvil. El reservorio se
encuentra en la CABINA DEL DISOLVENTE.
b) BOMBA: HPLC JASCO AUTOMATICO LC- 4000 serie PU-4180 ofrecen
precisión de caudal con RSD de mejor que 0.05% (difícil lograr con
comercialmente disponible zapatillas). Las bombas PU-4180 operar a
presiones de hasta 70 MPa, diseñado principalmente para su uso con
RHPLC para columnas core-shell o micro similar materiales de embalaje,
así como de trabajo a presiones comúnmente usadas para HPLC
convencional. Las bombas analíticas PU-4180 puede configurarse tanto
para gradiente simple de bomba como para múltiple operación de gradiente
de la bomba. La única bomba cuaternaria El módulo de gradiente ofrece
una excelente formación de gradiente para hasta cuatro solventes. La
válvula de disolvente de 4 vías recientemente diseñada para el cambio de
los cuatro solventes se sincroniza con la operación del control del motor de
la bomba - adaptación de ciclo variable optimiza la entrega según la
resolución del gradiente y el flujo tarifa. Este modo de gradiente cuaternario
altamente eficiente puede se aplicará a un amplio rango de velocidad de
flujo de flujo bajo a alto tasas. Dos y tres módulos de gradiente binario o
ternario de bomba con desgasificador integrado opcional disponible para
ciclo rápido formación de gradiente de alta resolución; el tiempo de
respuesta es superior al sistema de gradiente cuaternario de una sola
bomba.
Mezcla de solventes: La mezcla de gradiente multi-bomba se realiza
usando una velocidad variable Mezclador dinámico con un rango de mezcla
de pequeño volumen cámaras que incorporan un micro-agitador para
proporcionar la el volumen muerto más pequeño posible, ofreciendo una
mayor mezcla Eficiencias para todos los solventes HPLC.
Desgasificación de solvente: El módulo de desgasificador de vacío en
línea utiliza un nuevo Teflon Membrana AF con un volumen de retención de
solo 400μL (por línea de disolvente); esto ofrece un reemplazo de solvente
muy rápido con desperdicio mínimo. A pesar de su pequeño tamaño, el
nuevo desgasificador ofrece una desgasificación más efectiva y estable que
una mayor modelos de generaciones anteriores. Un desgasificador para
preparativos- HPLC también está disponible.en la entrega de solvente a
través de todo el flujo analítico.
c) INYECTOR: Son válvulas dosificadores que permiten regular la aplicación
de la muestra el HPLC JASCO AUTOMATICO LC – 4000 el modelo es El
AS-4050 es un muestreador automático de 60 muestras para usar con
HPLC convencional con opciones para volúmenes de inyección analíticos y
semipreparativos
d) HORNO DE COLUMNA: HPLC JASCO AUTOMATICO LC – 4000 tiene un
modelo CO-4061. Para requisitos simples el CO-4061 apilable se puede
usar con longitudes de columna de hasta 200 mm (o hasta 300 mm con una
extensión opcional). El modelo CO-4061 tipo de hornos se puede equipar
con un opcional unidad de recalentamiento de microvolúmenes para
precalentamiento la fase móvil antes de la columna para mejorar la
resolución y el pico forma.
e) COLUMNA: Contiene a las partículas de la fase estacionaria el que
empleamos en el presente trabajo es C18 de marca Fenomenex 4.6
x30cm , L1 ,5µ, 100Å, empleada para la separación de solutos apolares.
El cual ayuda a :
 Gran estabilidad de pH para una larga vida útil de la columna y
flexibilidad de métodos
 Escalabilidad fácil del método de LC rápido a purificación preparativa
y a granel
f) DETECTOR: Responderán a una propiedad de la fase móvil. HPLC JASCO
AUTOMATICO LC – 4000 la serie MD-4010 está diseñado para alta
sensibilidad y alto espectro y tiempo resolución. El detector MD-4010 PDA
ofrece la máxima sensibilidad de detección, equivalente a un solo detector
de longitud de onda. Fabricación uso de un elemento fotométrico de 1024
elementos diodo ar ray, la medida de 190nm a 900nm con una resolución
de 1nm y tasa de adquisición de espectro rápido de hasta a 100 espectros /
seg. Separaciones RHPLC. El MD-4010 es equipado con una lámpara de
mercurio interna para calibración automática de longitud de onda.
g) ESTACION DE DATOS COMPUTARIZADOS- CROMATOGRAMAS: Es
indispensable para registrar los cambios en alguna propiedad en función del
tiempo. La representación grafica de estos registros se llama
cromatograma. En estos registros aparece una serie de picos simétricos
sobre el eje de los tiempos para la identificación cuantitativa.
(JASCO INTERNATIONAL CO.)

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Por tanto la modalidad de cromatográfica empleada en el presente trabajo es

a) LA FASE ESTACIONARIA: Es solida de naturaliza apolar ( COLUMNA C18

b) LA FASE MOVIL: Es mezcla liquida de solventes polares constituída por

La proporcion selecionada se debe a que el modificador orgânico mejora

c) Los SOLUTOS son los analitos Gatifloxacina y Dexametasona que seran

INSTRUMENTACION: El notorio avance que la cromatografia liquida moderna ha

(Quattrochi, Andrizzi, & Laba, 1992)

En el presente trabajo se utilizo para la parte experimental el equipo HPLC

a) RESERVORIO DE LA FASE MOVIL: Que suelen ser botellas de vidrio y

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