Diastasa Miel

BIOTECNOLOGIA/HLC 2 LAyCC
Practica 3: DETERMINACION DE DIASTASA EN LA MIEL

.
Objetivos
1. Determinar la calidad de una miel en función de su índice de diastasa de la escala Gothe.
2. Comprobar la actividad enzimática de la diastasa mediante la hidrólisis del almidón,

empleando como agente revelador yodo.
2. Fundamentos teóricos
2.1. Introducción
La determinación de la actividad de las enzimas de la miel está adquiriendo cada vez mayor
importancia como una forma de valorar su calidad.
La diastasa es una de las enzimas cuya determinación analítica aproximada se puede determinar
por un método sencillo, a fin de poder valorar la calidad de la miel.
La diastasa es una enzima de origen vegetal, contenida en ciertas semillas germinadas y otras
partes de las plantas. Cataliza la hidrólisis del almidón.
En este procedimiento, el sustrato de almidón se incuba con la muestra de miel y se produce la

hidrólisis enzimática, la cual se determina por el agregado del reactivo yodo que produce
colaboración con el remanente de almidón no hidrolizado.
La disminución del color que ocurre en los tubos del desconocido después de incubarlo, respecto
del tubo control, es una medida de la actividad diastasa de la muestra, que se expresa en
unidades de diastasa.
La diastasa fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Peyen en 1833,
quien la bautizó con ese nombre, aunque actualmente se conoce como amilasa.
2.2. Criterios a tener en cuenta para comprobar la calidad de una miel
La utilización de métodos adecuados durante la extracción y el fraccionamiento de la miel

contribuye a la obtención de un producto de buena calidad, pero un manejo deficiente puede
disminuirla. La actividad diastásica, la acidez y el hidroximetilfurfural (HMF) se consideran como
los principales parámetros para valorar el frescor de la miel y, por lo tanto, están en directa
relación con la calidad de la misma.
La actividad de la enzima diastasa es un factor de calidad en miel que puede alterarse durante
el procesado y el almacenamiento por lo que se utiliza como indicador de sobrecalentamiento y
por lo tanto de frescura.
La acidez es un importante criterio de calidad ya que la misma evoluciona durante el

almacenamiento siendo un indicador de envejecimiento.
Además junto a la temperatura son factores que tienen influencia en la velocidad de formación
de HMF. El HMF es un producto generado por la degradación de los azúcares, principalmente a
partir de la deshidratación de la fructosa y la glucosa que en un medio ácido y con el paso del
tiempo aumenta su concentración. Se considera que el HMF es el criterio más importante y
confiable para detectar el calentamiento de la miel. Asimismo las condiciones de calentamiento
a que se somete la miel también influirán de forma decisiva en su calidad en relación al tiempo
de almacenamiento.
1
2.3. Desnaturalización de proteínas por altas temperaturas
La baja estabilidad conformacional de la proteína nativa, la hacen fácilmente susceptible a la

desnaturalización por alteración del equilibrio de las débiles fuerzas no enlazantes que
mantienen dicha estructura.
Uno de los agentes que puede provocar la desnaturalización de las proteínas es el calor. El
calentamiento origina en las propiedades sensibles de una proteína como la rotación óptica, la
viscosidad y la absorción UV, cambios abruptos por encima de un estrecho rango de temperatura
(buscar grafica para informe de . Temperatura en el eje de abscisas frente a fracción desplegada
de la proteína en el eje de ordenadas para esta practica ). Esa transición indica que el polipéptido
entero se despliega o “derrite” cooperativamente, es decir, de forma simultánea. La mayoría de
las proteínas tienen temperaturas de desnaturalización por debajo de 100ºC. Dentro de las
excepciones están las proteínas de las bacterias termófilas.
3. Material y reactivos necesarios
MATERIAL NECESARIO REACTIVOS
Estufa 37 ºC Espátula Buffer acetato 1,59 M pH 5,3
Balanza Vaso de precipitados Solución de cloruro sódico 1%
Asa Drigalsky Gradilla Solución de almidón

Rotulador permanente Miel Solución madre de yodo 0,1 N
Agitador vórtex Pipeta Pasteur Solución de trabajo de yodo 0,01 N
Baño maría 45-50 ºC Puntas de micropipetas Solución de floruro de sodio
Micropipetas
Tubos de ensayo
3.1. Preparación de reactivos
Buffer acetato 1,59 M pH 5,3
Se encontraba preparado, en cualquier caso para preparar 50 ml: disolver 8,7 g de acetato de
sodio • 3 H2O en 40 ml de agua, añadir 1 ml de ácido acético glacial y completar hasta 50 ml.
Ajustar el pH a 5,3 con acetato de sodio o ácido acético, según el caso, utilizando un pH-metro.
Solución de cloruro de sodio 1%
Disolver 1 g de cloruro de sodio en agua destilada hervida y completar hasta 100 ml. El tiempo
de conservación está limitado por la formación de mohos.
Solución de almidón
2
Pesar, en una balanza analítica, en un vaso de precipitados de 50 ml, 0,050 g de almidón y

disolverlo en 10 ml de agua destilada fría. Posteriormente pasar a un vaso de precipitados de
100 ml con ayuda de agua destilada y llevarlo a un volumen de 70 ml con agua destilada caliente.
Someter a calentamiento y mantenerlo en ebullición por tres minutos; dejar enfriar
espontáneamente y, una vez frío, pasarlo a un matraz aforado de 100 ml y completar con agua
destilada hasta 100 ml.
Solución de floruro de sodio
Disolver 0,2 g de floruro de sodio en 10 ml de agua destilada en un tubo, colocar la tapa y agitar.
Solución madre de yodo 0,1 N
Disolver 0,2 g de yoduro de potasio en 10 ml de agua destilada en un tubo, colocar la tapa y

agitar. Posteriormente adicionar 0,127 g de yodo, colocar la tapa y agitar.
Solución de trabajo de yodo 0,01 N
Mezclar 1 ml de solución de yodo con 9 ml de solución de floruro de sodio en un tubo, colocar la

tapa y agitar.
4. Toma de muestras
1. Pesar 2 gramos de muestra de miel en un tubo de rosca en una balanza (con ayuda de
un vaso de precipitados para estabilizar el tubo y una pipeta Pasteur para depositar o
retirar la muestra hasta alcanzar la pesada adecuada).
2. Añadir un mililitro de buffer pH 5,3 con micropipeta y agitar en vórtex.
Si la miel es muy espesa debe calentarse suavemente al baño maría para que se vuelva menos
viscosa.
5. Procedimiento
1. Colocar en una gradilla 10 tubos de ensayo y agregar a cada uno un mililitro de solución
de cloruro de sodio 1% mediante una micropipeta.
2. Agregar al primer tubo un mililitro de la muestra con una pipeta Pasteur y mezclar por
aspiración y expulsión con la pipeta.
3. Pasar un mililitro del primer tubo al segundo tubo mediante una pipeta Pasteur, mezclar
y así sucesivamente hasta el noveno tubo, desechando el último mililitro.
4. El tubo 10 supone el testigo.
5. Colocar a cada tubo un mililitro de solución de almidón 0,050% mediante micropipeta,

agitar por aspiración y expulsión e incubar 30 minutos en estufa a 37 ºC.
6. Retirar, enfriar rápidamente, colocar una gota de solución de trabajo de yodo a cada
tubo, agitar y observar la coloración: en los tubos que presenten coloración azul no se
ha hidrolizado el almidón, reaccionando el mismo con yodo y originando este color.
3
6. Resultados
7. Cálculos
Unidades diastáticas = dilución mayor que permanece incolora x 2
8. Interpretación y conclusiones
9. Observaciones generales
10. Limpieza, gestión de residuos y seguridad
Referencias Bibliográficas

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1. Determinar la calidad de una miel en función de su índice de diastasa de la escala Gothe.

2. Comprobar la actividad enzimática de la diastasa mediante la hidrólisis del almidón,

En este procedimiento, el sustrato de almidón se incuba con la muestra de miel y se produce la

2.2. Criterios a tener en cuenta para comprobar la calidad de una miel

La utilización de métodos adecuados durante la extracción y el fraccionamiento de la miel

La acidez es un importante criterio de calidad ya que la misma evoluciona durante el

2.3. Desnaturalización de proteínas por altas temperaturas

La baja estabilidad conformacional de la proteína nativa, la hacen fácilmente susceptible a la

3. Material y reactivos necesarios

MATERIAL NECESARIO REACTIVOS

Estufa 37 ºC Espátula Buffer acetato 1,59 M pH 5,3

Balanza Vaso de precipitados Solución de cloruro sódico 1%

Asa Drigalsky Gradilla Solución de almidón

3.1. Preparación de reactivos

Buffer acetato 1,59 M pH 5,3

Solución de cloruro de sodio 1%

Pesar, en una balanza analítica, en un vaso de precipitados de 50 ml, 0,050 g de almidón y

Solución de floruro de sodio

Solución madre de yodo 0,1 N

Disolver 0,2 g de yoduro de potasio en 10 ml de agua destilada en un tubo, colocar la tapa y

Solución de trabajo de yodo 0,01 N

Mezclar 1 ml de solución de yodo con 9 ml de solución de floruro de sodio en un tubo, colocar la

2. Añadir un mililitro de buffer pH 5,3 con micropipeta y agitar en vórtex.

4. El tubo 10 supone el testigo.

5. Colocar a cada tubo un mililitro de solución de almidón 0,050% mediante micropipeta,

Unidades diastáticas = dilución mayor que permanece incolora x 2

10. Limpieza, gestión de residuos y seguridad

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