INTEGRACIÓN DE LA SÍNTESIS COMBINATORIA Y LOS BIOENSAYOS

La industria farmacéutica esperaba que grandes colecciones de nuevos compuestos aceleraran la

identificación de candidatos a fármacos adecuados. Hoy en día, el enfoque industrial estándar para
la síntesis de pequeñas moléculas similares a los fármacos, ya sea en solución o en un soporte
sólido, es altamente paralelo. En el caso ideal, cada compuesto se purifica y se caracteriza en
cuanto a su identidad y pureza con técnicas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
y la espectrometría de masas (MS) antes de su ensayo. El cribado se realiza principalmente en
formatos de 96 y 384 pocillos. La síntesis altamente paralela requiere la automatización no sólo de la
síntesis, sino también del análisis y el cribado. Además, son necesarios enormes esfuerzos para
manejar la cantidad de datos generados.
A medida que se disponga de más y más dianas proteicas potenciales, habrá que crear bibliotecas
de compuestos cada vez más diversas y desarrollar formas de extraer información de forma eficiente
de dichas bibliotecas. Por tanto, ya no bastará con sintetizar bibliotecas grandes y diversas, sino que
será cada vez más importante encontrar formas de integrar exigencias como la biodisponibilidad en
una fase temprana de la búsqueda de fármacos. Estos retos sólo pueden superarse creando
interfaces eficientes entre las síntesis combinatorias y los bioensayos.
Cribado de mezclas altamente complejas en solución
La síntesis y el cribado de ligandos de receptores inmunológicos pueden vincularse directamente
utilizando mezclas equimolares de compuestos en solución. Estas mezclas pueden obtenerse, por
ejemplo, en forma de subcolecciones de péptidos sintetizadas por síntesis en fase sólida con
mezclas de aminoácidos activados en acoplamiento aleatorio. En cada subcolección, una posición
de aminoácido se deja inalterada y las otras se aleatorizan. Por ejemplo, de 220, 11 polimeros de las
subcolecciones de aminoácidos, cada una de las cuales contiene 2 x 10 13 péptidos, pueden
probarse por separado en un ensayo en solución para extraer la información biológica pertinente de
esas mezclas complejas (Fig. 1).

Figura . Cribado de mezclas muy complejas. Se ensayaron simultáneamente 2 x 1013 péptidos en solución.
Sintetizando subcolecciones de péptidos de 11 polímeros con una posición inalterada (0) y todas las demás
posiciones aleatorias {X), se pudieron identificar péptidos super agonistas para la activación de un clon de
células T relacionado con la esclerosis múltiple.

Cribado en el interior de perlas de resina Podría decirse que el vínculo más estrecho entre la
síntesis y el cribado se consigue realizando ambos en el mismo soporte, es decir, en perlas de
resina. Una aplicación más amplia de este concepto tan temprano estuvo prohibida durante mucho
tiempo por la falta de materiales de resina compatibles con el uso de enzimas en el interior de las
perlas. La resina superpermeable para química combinatoria orgánica (SPOCC) se introdujo
recientemente para ampliar el uso de resinas biocompatibles como el copolímero de polietilenglicol
dimetilacrilamida (PEGA) . La resina superpermeable para química combinatoria orgánica (SPOCC)
sólo contiene enlaces primarios de éter y es totalmente compatible con la química orgánica y los
ensayos enzimáticos. Estas resinas polares se han utilizado para sintetizar bibliotecas de péptidos
mediante la técnica de división y combinación. Los sustratos peptídicos que llevan un colorante
fluorescente y una desactivación fluorescente pueden utilizarse para ensayos de sustrato de
proteasas; al escindir un sustrato, la perla de resina se vuelve fuertemente fluorescente. Este ensayo
de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se ha utilizado con grandes
bibliotecas de péptidos para seleccionar buenos sustratos recogiendo las perlas más fluorescentes.
Además, Meldal y otros han demostrado la selección de inhibidores a partir de una biblioteca de una
perla y dos compuestos preparada por síntesis en escalera (Fig. ).

Fig. . Cribado con ensayos en perlas. Mediante el método de dividir y combinar, se sintetizó una biblioteca de
inhibidores de metaloproteinasas de la matriz de fosfato (MMP) en nuevas resinas biocompatibles a base de
polietilenglicol. Cada microesfera llevaba un compuesto inhibidor potencial y un sustrato fluorescente (una
microesfera-dos compuestos). Tras la digestión enzimática de la biblioteca, las microesferas que llevan los
inhibidores más activos permanecen oscuras y pueden ser seleccionadas y analizadas, preferentemente
mediante técnicas de espectrometría de masa (EM)
El concepto ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) ahorra
pasos de aislamiento y limpieza porque sólo hay que analizar las perlas que llevan los compuestos
más activos y sólo hay que resintetizar y purificar las moléculas identificadas. Las estructuras de los
compuestos activos pueden dilucidarse mediante la escisión de un enlazador fotolábil seguida de la
ionización por desorción láser asistida por matriz (MALD1). Este enfoque combinado del ensayo de
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se ha demostrado ahora para la
elucidación de la especificidad de sustrato de varias proteasas y para la selección de inhibidores de
una metaloproteasa relacionada con la osteoporosis.
Cribado de microarrays Una alternativa viable al cribado en microesferas es el cribado en
superficies funcionalizadas. En las superficies se pueden utilizar compuestos sintetizados en fase
sólida o en solución. Además, las superficies son accesibles para proteínas y complejos proteicos de
mayor tamaño, así como para células enteras. El ejemplo clásico de un microensayo en matriz es la
técnica de manchas desarrollada por Frank. En este método, la síntesis y el cribado se realizan
sobre celulosa añadiendo gotas de reactivos o soluciones de cribado con un robot. Tales matrices se
han utilizado en ensayos para el mapeo de epítopos, el análisis de sustratos y la inhibición de
proteasas. En la actualidad, la mayoría de los bioensayos utilizan placas de 96 o 384 pocillos, que
inmovilizan una de las partes de unión mientras la otra se aplica en solución.
Un inconveniente crucial de este formato de ensayo clásico es la cantidad relativamente alta de
proteína y de solución de ensayo que se necesita (volumen de muestra en el rango de microlitros a
mililitros). Se está abordando la miniaturización de este concepto de ensayo a volúmenes de
nanolitros para crear un sistema de alto rendimiento cuando sólo se dispone de pequeñas
cantidades de proteína objetivo. Los microarrays de ADN se utilizan de forma rutinaria en el análisis
de la expresión y la genómica, y su uso para la elaboración de perfiles de expresión de pequeñas
moléculas similares a los fármacos se está investigando intensamente. Estas técnicas de
microarrays permiten manipular volúmenes muy pequeños de solución utilizando un sistema
microfluídico con un robot de pipeteo como piedra angular. Hasta ahora, las técnicas sólo se han
utilizado en ensayos de interacciones de unión conocidas, y su éxito en la detección de ligandos de
proteínas de una biblioteca de compuestos está por demostrar. Una característica potencialmente
interesante de estos microarrays es la preparación del cribado que podría reutilizarse en varios
ensayos con diferentes proteínas objetivo y convertirse en una valiosa herramienta para la
evaluación de objetivos.
La reacción se detiene con lavados de PBS al aparecer la coloración azul en determinadas manchas.
La aparición de la coloración sobre la superficie de las manchas indica el reconocimiento de una
secuencia determinada por el anticuerpo. El procedimiento para sueros, proteínas, péptidos
sintéticos u otras moléculas puede ser el descrito con modificaciones específicas para cada ensayo.
La concentración adecuada de la molécula blanco utilizada en el pesquisaje de los péptidos con
actividad biológica positiva se determina con ensayos progresivos de disminución de la dilución.
https://www.proquest.com/docview/213576813
Jarg Rademann and Ciinther Jung, Integrating Combinatorial Synthesis and Bioassays; TECHVIEW:
DRUG DISCOVERY; SCIENCE VOL 287 17 MARCH 2000.

Una vez identificado el blanco, el paso siguiente es la generación de series de compuestos que
puedan ser sintetizados y ensayados. Para esto es de importancia vital el uso de la mayor cantidad
de información disponible que permita reducir al máximo el espacio virtual. Entre la información
importante a tener en cuenta se encuentran los datos de compuestos que interaccionan con el
blanco o receptor, las características estructurales de esta interacción y las propiedades químicas o
farmacológicas de los compuestos. Como se puede suponer, el mejor de los casos que se puede
encontrar es aquel en el que se disponga de la estructura tridimensional de la proteína blanco en
complejo con su ligando natural u otro compuesto. Esta estructura provee de información detallada
acerca de la topología del sitio de unión y de las características fundamentales que deberán tener los
compuestos a diseñar. Después de la selección inicial, alrededor de 1 000 compuestos deben pasar
a la etapa de síntesis y ensayos biológicos.
https://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/Muestras/chapter21.pdf
Mientras la química tradicional arriba a un compuesto único bien caracterizado, la combinatoria produce
de manera deliberada y simultánea una gran cantidad de ellos y luego procura identificar los que podrían
tener propiedades terapéuticas.
De esta manera, la química combinatoria permite obtener una gran cantidad de sustancias diferentes
(llamadas colectivamente bibliotecas ) en forma rápida, simultánea y eficiente. La simultaneidad puede
lograrse de dos maneras: mediante síntesis de mezclas o síntesis en paralelo.

La química combinatoria se hizo notar cuando se obtuvieron las primeras bibliotecas, formadas por
mezclas de miles o cientos de miles de componentes en cada recipiente de reacción. La potencialidad
del método produjo una transformación conceptual de la disciplina química, que trascendió sin demoras
el campo de los medicamentos y se extendió a otras áreas, como la ciencia de materiales.

La química combinatoria aplicada a la preparación de compuestos con potenciales efectos biológicos, o

compuestos bioactivos, derribó algunos preconceptos arraigados entre los químicos dedicados a la síntesis
orgánica, especialmente la premisa de que se debe obtener primero un compuesto puro y caracterizarlo
bien, para luego determinar su utilidad. Dado que el objetivo es descubrir fármacos, el nuevo precepto es
dar prioridad a encontrar un compuesto que tenga los efectos biológicos deseados.
Para aplicar lo anterior, fue necesario hallar formas o métodos prácticos que permitieran acelerar la
producción de nuevos compuestos orgánicos.

La química combinatoria es una tecnología que hace posible la construcción rápida y eficiente de colecciones de
moléculas con rasgos estructurales comunes, llamadas quimiotecas o bibliotecas.

Una biblioteca química es una serie de sustancias similares que han sido preparadas para un fin específico. Se pueden
preparar bibliotecas de catalizadores, aleaciones para la desulfuración del petróleo, sensores ópticos y biológicos,
vacunas, antibióticos, vitaminas y otros productos farmacéuticos, etcétera.

No solo las sustancias que son de interés para la química farmacéutica, sino también los materiales, catalizadores y
biomoléculas como el ADN u oligosacáridos están fácilmente disponibles con una gran diversidad estructural.
Perspectivas a futuro:
El constante desarrollo de la química combinatoria como metodología de búsqueda de nuevos
materiales ha tenido un gran impacto en la actualidad. La química combinatoria está indeleblemente
incorporada al proceso de descubrimiento de medicamentos. Una de sus áreas de mayor desarrollo
futuro será posiblemente la química de nanomateriales, cuyas propiedades son intermedias entre las
de entes químicos o moleculares y las de materiales comunes. Por ello, los métodos de síntesis
serán una combinación de los usados en ambas áreas y llevarían a efectuar síntesis en fase sólida
de nanopartículas funcionalizadas, es decir, modificadas químicamente en su superficie para que el
material tenga determinada función. Por otra parte, es posible imaginar el uso de nanopartículas o
sólidos nanoporosos actuando como resinas sólidas para efectuar una síntesis combinatoria en fase
sólida. Recientemente, la química combinatoria dinámica comenzó a buscar aplicaciones que utilicen
el comportamiento global de las bibliotecas completas, más que el comportamiento de sus
constituyentes individuales. Así, recurrió a bibliotecas dinámicas completas como sensores de
metales, nucleótidos y péptidos, con un enfoque que constituye una puerta de entrada a la incipiente
química de sistemas.
Los conceptos básicos de la química combinatoria se diseminaron más allá de la química y han
servido de inspiración a la biología y a las ciencias de materiales.