Revista Científica

ISSN: 0798-2259
revistafcv@gmail.com
Universidad del Zulia
Venezuela

Jerez, Alejandro; Chihuailaf, Ricardo; Nella Gai, Maria; Noro, Mirela; Wittwer, Desarrollo Fernando y validación de un método de HPLC para

determinar lasalocido en muestras de leche cruda procedentes de los productos lácteos

vacas

Revista Científica, vol. XXIII, núm. 6, noviembre-diciembre, 2013, pp. 537-542

Universidad del Zulia
Maracaibo, Venezuela

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 _______________________________________________________Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXIII, Nº 6 537 - 542, 2013

Desarrollo y validación de un método de HPLC

PARA DETERMINAR EN LASALOCID muestras de leche cruda
Las vacas lecheras

Desarrollo y Validación de la ONU Método por HPLC para determinar S. Lasalocida

en Muestras de leche cruda de vacas lecheras

Alejandro Jerez 1 *, Ricardo Chihuailaf 2, Maria Nella Gai 3, Mirela Noro 4 y Fernando Wittwer 4
1 Instituto de Farmacia, Universidad Austral de Chile. 2 Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Católica de Temuco.
3 Departamento de Ciencias y Tecnología Farmacéutica de la Universidad de Chile. 4 Instituto de Ciencias Clínicas Veterinarias,

Universidad Austral de Chile. * alejandrojerez@uach.cl

ABSTRACTO Va de calibración FUE lineal de 0,5 a 3,0 g / ml. La precisión Que intra (7,2%) e inter
(7,0%) de diámetro (d) y la exactitud (84%) estuvieron Dentro de los Límites propuestos

El lasalocid ionóforo ha sido aprobado para su uso como aditivo en la alimentación de por la Food and Drug Administration en la Guía de Validación de Métodos Bioanalíticos.

rumiantes en muchos países. Este artículo describe un método simple y rápido para la La Estabilidad de la lasalocida FUE establecida en tres Ciclos de

determinación de lasalocid en la leche de vaca usando cromatografía líquida de alto congelamiento-descongelamiento y la Estabilidad un largo Plazo, La Temperatura FUE

rendimiento con detección ultravioleta. El método es específico para el análisis de de -30 ° C, se Desarrollo Durante 79 d. La Sensibilidad y sencillez del Método Hacen lo

lasalocid en la leche cruda después de una extracción líquido-líquido y fue validado por ADECUADO para el análisis de residuos de lasalocida en Muestras de leche cruda

el medicamento en la leche cruda bovina. La curva estándar fue lineal de 0,5 a 3,0 g / ml bovina.

Intra (7,2%) y entre (7,0%) días (d) la precisión y exactitud (84%) del método se
encontraban dentro de los límites propuestos por la Administración de Drogas y
Alimentos en el Bioanalytical método Guía de validación. La estabilidad de lasalocid se
Palabras clave: Ionóforos, Cromatografía, leche cruda, bioa-
estableció durante tres ciclos de congelación-descongelación y estabilidad a largo plazo
nalítico.
a -30 ° C durante 79 d.

INTRODUCCIÓN

Los ionóforos son compuestos de poliéter utilizados en aplicaciones veterinarias como

coccidiostáticos en aves de corral y el ganado y como promotores del crecimiento en rumiantes

para aumentar la eficiencia de conversión de alimentos [15].

palabras clave: Ionóforos, cromatografía, leche cruda, de bioanálisis.

Lasalocid pertenece a un grupo de compuestos llamados ionóforos carboxílicos

con una estructura molecular que se caracteriza por una composición de poliéter (Fig. 1).
RESUMEN
Los ionóforos son moléculas complejas de elevado peso molecular, producidas por
varias especies de Streptomyces ( Streptomyces lasaliensis en el caso lasalocid) [17]. La
El ionóforo lasalocida ha Sido Aprobado para su USO en rumiantes en Varios Países.
molécula de lasalocid tiene un un grupos aromáticos carboxílico libre y. ionóforos
This article describir la ONU Método Simple y Rápido para la determinacion de lasalocida
carboxílicos mueven iones a través de los lípidos por capas de unión a los iones de un
en leche de vaca utilizando Cromatografía líquida de alta efficiency con detection
lado de la membrana celular, moviendo el complejo resultante a través de la capa, y la
ultravioleta. El Método es Específico para el análisis de lasalocida en leche cruda bovina,
liberación de los iones en el otro lado de la membrana celular [14]. En consecuencia, los
con Una Extracción Líquido-Líquido Y FUE Validado párrafo Este Fármaco en la leche.
gradientes de Ca 2+, mg 2+, K + y Na + se disminuyen, causando la muerte celular [1, 27].
La Cur-
Lasalocid es un compuesto divalente ionóforo [1, 25]. Transporta iones bivalentes tales
como

Recibido: 21/01/2013. Aceptado: 20/09/2013.

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Desarrollo y validación de un método HPLC para determinar Lasalocid en muestras de leche cruda de Dairy Cows / Jerez, A. et al. _________

MATERIALES Y MÉTODOS

Sustancias químicas y reactivos

Todos los productos químicos usados ​se adquirieron de Merck (Darmstadt,

Alemania), y se incluyen metanol y diclorometano (grado HPLC), cloruro de sodio (grado
FIGURA 1. estructura molecular de LASALOCID. analítico) y ácido trifluoroacético (grado reactivo). El agua se genera mediante un
sistema de purificación ELGA (grado HPLC) y el gas de nitrógeno fue suministrado por
California 2+ y Mg 2 + [ 1, 18], y monovalentes iones como K + [1, 2]. Los compuestos AGA Chile (Santiago, Chile). sal de sodio Lasalocid (95,1%) fue suministrado por
ionóforos son activos contra organismos y micoplasmas Gram-positivas [1]. La pared Alpharma Chile. Todas las soluciones se filtraron antes de la inyección HPLC utilizando
celular de las bacterias Gram-negativas mayoría no permite el paso de moléculas filtros de PTFE, 0,45 m de Merck (Darmstadt, Alemania).
hidrófobas con pesos moleculares por encima de 600 g mol -1 de no ser susceptible a la
acción de los ionóforos [1, 27].

Ionóforos se utilizan en la medicina veterinaria hasta 16 años después de su condiciones cromatográficas

descubrimiento, debido a su alta toxicidad. Los estudios de toxicidad han demostrado cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se realizó utilizando un
que los órganos diana primarios de ionóforo son músculos cardíaco y esquelético, así sistema Shimadzu Prominencia HPLC (Shimadzu, Tokio, Japón) que consiste en una
como los nervios periféricos. Muchos casos de intoxicación severa en aves de corral, bomba LC-10AT, y controlador del sistema SCL-10A, un desgasificador DGU-20A5, un
caballos ( Equus) y otros animales han sido reportados, sin embargo, un menor número inyector automático SIL20A, y una detector SPD-M20A. datos cromatográficos fueron
de informes que afectan al ganado ( Bos taurus) adquiridos y analizados mediante el sistema LC-Solución de Cromatografía de datos
(Shimadzu, Tokio, Japón).
se han descrito [11, 14]. La creciente administración de estos agentes en la medicina
veterinaria puedan representar un peligro potencial para los seres humanos, como los
longitud de onda de trabajo en el detector se fijó en 315 nm. La separación se
residuos de estos fármacos pueden estar presentes en los tejidos o fluidos utilizados para el
lleva a cabo en una columna C18, (250 x 4,6 mm, 5 m), Kromasil, (Suecia), usando
consumo humano.
metanol: agua: ácido trifluoroacético 0,45% 90: 10: 3 v / v como una fase móvil
Lasalocid se ha utilizado ampliamente en la industria de la carne y, en algunos isocrática, a una tasa de 1,2 ml / min de flujo, a 25 ° C. La fase móvil se filtró a través de
países, en vacas lecheras lactantes [15]. De acuerdo con la Unión Europea (UE) [8] y la un filtro de membrana de nylon (0,45 micras de tamaño de poro) y ultrasónicamente
Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) [14] reglamentos, lasalocid no está desgasifica antes de su uso. El tiempo total para analizar era 14 min. El cien! L de
autorizado para su uso en vacas lecheras lactantes. soluciones y muestras analíticas estándar se inyectaron en el sistema de LC con el fin de
aumentar la sensibilidad. Se midió el área del pico de la respuesta.

Varios métodos han sido descritos con el fin de determinar la presencia de

ionóforos usados ​en medicina veterinaria. Las técnicas analíticas tales como la
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con luz ultravioleta (UV) de detección
madre del estándar y soluciones de trabajo
de [3, 5,
6, 20, 21, 26], la fluorescencia de detección [9, 16] y la detección de espectrometría de Todas las soluciones madre y de trabajo de lasalocid sódico se diluyeron en

masas 7 [, 12, 13, 22-24] se han utilizado para este propósito. Para estos métodos, la metanol y se prepara en condiciones de baja intensidad de luz. Una solución primaria de

preparación de muestras incluye precolumna o postcolumna derivatización y extracción stock (0,5 mg / ml) y las soluciones madre de trabajo secundarias de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 y

en fase sólida. Los límites de cuantificación (LOQ) en los métodos basados ​en HPLC son 3,0 mg / ml se prepararon.

principalmente superior a 1 mg / kg, con algunas excepciones para narasina lasalocid y

(LOQ de 0,5 mg / kg) [19]. de masas-cromatografía líquida espectrometría de (LC-MS) Preparación de estándares de calibración y las muestras de control de calidad (QC)
ha sido también utilizada para determinar ionóforos de poliéter en diferentes matrices. El
uso de un detector de espectrómetro de masas minimiza preparación de la muestra y
Los estándares de calibración se prepararon para cada ejecución mediante la adición de
aumenta la sensibilidad del método de [19]. Sin embargo, el equipo necesario es costoso
la persona que trabaja soluciones madre a 1 ml de la leche agrupado en blanco bovina cruda, y
en comparación con otros detectores usados ​para la cromatografía. Sería interesante
vórtice-mezcló durante 30 segundos. muestras de control de calidad se prepararon en el primer
desarrollar un método sencillo y eficaz para determinar lasalocido en la leche cruda para
día de validación utilizando soluciones madre a las 0,5, 1,5 y 3,0 g / ml. Todos los valores y de
mantener la calidad de la leche producida de control para el consumo humano. El
trabajo soluciones se almacenaron a 4 ° C y se utilizan para obtener la curva estándar en el día
objetivo de este trabajo fue desarrollar y validar un HPLC de detección con el método de
(d) de análisis. El control de calidad (QC) muestras se dividieron en alícuotas y se almacenan
detección de UV de lasalocid en la especie bovina muestras de leche cruda de acuerdo
hasta su análisis a baja intensidad de luz.
con Bioanalytical Método Guía de validación establecido por la FDA [10].

preparación de la muestra de leche

la leche cruda fresca a granel se recogió directamente desde el tanque de leche

en el tambo experimental de la Universidad Austral de

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Chile. manada lechera se basó en 62 lactantes Holstein vacas Frisian alimentados con una ane a tres concentraciones del fármaco: 0,5, 1,5 y 3,0 g / ml. Recuperación se evaluó
ración controlada basado en pasto, ensilaje de hierba y libre de aditivos concentrarse comparando muestras post extraída de leche cruda con muestras no extraídas (en el
(Iansagro ®, Chile). muestra de leche se mantuvieron en recipientes de vidrio a 4 ° C y se disolvente reconstitución) a las mismas concentraciones. muestras extraídas-Post se
utilizó dentro de 48 horas. Un ml de un representante se añadió bien mezclada muestra de prepararon mediante la adición de un volumen adecuado de las soluciones de trabajo en
leche completo a un tubo de centrífuga de 15 ml junto con 6 ml de metanol y se sometió a 1 ml de la leche cruda y se procesaron como se describe en el apartado “preparación de
ultrasonidos en un Ney 104 baño de ultrasonidos H (Ney Ultrasonics, Bloomfield, EUA), la muestra de leche”. Recuperación de lasalocid se determinó mediante la comparación
durante 30 segundos. Además, las muestras se mezcla durante 30 segundos y dejar a de cada área de pico de los estándares de control de calidad extraídos con el área del
temperatura ambiente (± 20 ° C) durante 10-15 min. Finalmente, las muestras se pico de soluciones estándar que contienen unextracted la concentración correspondiente
centrifugaron a 600 g durante 10 min hasta que se produjo un gránulo. de lasalocid disuelto en una mezcla de metanol: agua (90:10) medio. Las recuperaciones
se realizaron por triplicado.

Lasalocid se extrajo mediante un procedimiento de líquido-líquido. Los

sobrenadantes se decantaron en un matraz separador 250. Entonces, (v 10% w /) se Estabilidad del lasalocid en la leche fue probada usando estándares de control de calidad para el

añadieron seis ml de solución de NaCl. El lasalocid contenida en el sobrenadante de ciclo de tres ciclos de congelación-descongelación y la estabilidad a largo plazo. En cada ciclo de

metanol acuosa se extrajo con 12 ml de diclorometano (DCM). Se recogió la fase inferior congelación-descongelación, las muestras de control de calidad se congelaron a -30 ° C durante 24 h y se

(DCM) y se secó bajo una corriente de nitrógeno. descongelaron a temperatura ambiente (± 20 ° C). Estabilidad a largo plazo se evaluó mediante el

almacenamiento de las muestras de control de calidad a -30 ° C durante 79 d. Los resultados se

compararon con muestras de control de calidad recién preparados.

método de validación

El método fue validado para cumplir con los criterios de aceptación de

orientación industrial para la validación de métodos bioanalíticos en la leche cruda matriz RESULTADOS Y DISCUSIÓN
para este caso [10]. Se evaluaron los siguientes parámetros de validación: selectividad,
linealidad, sensibilidad, precisión, exactitud, recuperación, y la estabilidad. El presente estudio describe un método específico, isocrático, y fiable, así como
de bajo costo de HPLC-UV para la determinación de lasalocid en muestras de leche. El
ácido libre o la forma de sal de lasalocid adoptan una estructura cíclica [26] en el que el
La selectividad del método se evaluó por la ausencia de cualquier interferencia
grupo carbonilo está dirigida hacia el interior y participa en la quelación de iones
en los tiempos de elución de lasalocid. muestras de leche agrupados se analizaron
metálicos. En contraste con otros ionóforos, lasalocid no puede derivarse debido al
después de ser pre-tratado como se describe anteriormente.
impedimento estérico. Afortunadamente, la detección lasalocid es posible en una forma
no derivatizada por absorción UV del grupo bencénico a 315 nm [6]. Un estándar interno
La linealidad se cuantificó usando el área de pico del analito. áreas de los picos (IS) no se utilizó porque otros ionóforos de poliéter deben ser derivatizados para el
se representaron asociados con la concentración de analito de seis patrones de análisis de HPLC con detección UV. Los estándares de calibración se realizaron
calibración que van de 0,5 a 3,0 g / ml incluyendo el LLOQ (límite inferior de diariamente para mantener un control del procedimiento.
cuantificación). La curva estándar se encontraban en la forma y = a + bx. Las
concentraciones de lasalocid eran 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 mg / ml, respectivamente. La
curva de calibración usada para determinar la concentración de lasalocid en muestras
La detección de un fármaco en medios biológicos es un procedimiento complejo,
experimentales se fijó en un coeficiente de correlación (r) de 0,995 o mejor.
principalmente asociada a la matriz característica, debido a esto, se emplearon
diferentes extracciones utilizando disolventes para eficazmente componentes del
fármaco separados de interferencias endógenas. La sensibilidad final y la selectividad
El límite de detección (LOD) se define como la concentración más baja del método pueden estar limitados a los procedimientos de limpieza. Para evitar las
detectable con una relación señal: ruido de tres El límite inferior de cuantificación (LLOQ) pérdidas asociadas con el procedimiento de limpieza y para aumentar la recuperación
se definió por lo menos cinco veces la respuesta de analito en comparación con la del analito el número de pasos hasta limpias en una preparación de la muestra debe
respuesta en blanco. En este punto, la precisión se fijó en 20% y la precisión en el rango mantenerse a un mínimo [26]. De esta manera, la preparación de la muestra se basó en
de 80-120%. la solubilidad de lasalocid en solventes como metanol y diclorometano [9]. Este último no
mostró resultados satisfactorios debido a la adsorción de lasalocid al contenedor de
polipropileno. Los mejores resultados de la extracción se obtuvieron con metanol / NaCl
Exactitud y precisión se determinaron por análisis de estándares de control de
(10% w / v) / DCM (6: 6: 12).
calidad de lasalocid (0,5, 1,5 y 3,0 g / ml) con seis repeticiones en el mismo día y uno en
cada uno de tres días diferentes, respectivamente. La exactitud debe estar dentro de
75,115% y precisión, expresada como coeficiente de variación (CV) en caso de menos
de 15%.

La recuperación de lasalocid de la leche se determinó después de la extracción Los parámetros cromatográficos (tiempo de retención, la forma de pico y de
líquido-líquido con metanol y dichlorometh- resolución de pico) se ensayaron con arreglo a varios experi-

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Desarrollo y validación de un método HPLC para determinar Lasalocid en muestras de leche cruda de Dairy Cows / Jerez, A. et al. _________

condiciones mentales. Se evaluó una serie de fases móviles con diferentes proporciones Los datos para los parámetros utilizados para validar el método fueron de
de disolventes orgánicos y valores de pH. Una muestra pura de soluciones de lasalocid y acuerdo a los descritos por guía de la FDA para los métodos bioanalíticos y bien dentro
estándar preparadas en metanol eran adecuados para las condiciones cromatográficas. de los límites establecidos.
Lasalocid se separó de los componentes de la leche en una columna cromatográfica
La linealidad de la curva de calibración asistida por matriz se ensayó usando un
C18. El pico de lasalocid fue bien resuelto en las condiciones descritas y mostró buena
método de mínimos cuadrados, en consecuencia la determinación de lasalocid en la
forma con factor de asimetría adecuada. Por otra parte, la fase móvil permitió que el
matriz fue lineal en el intervalo de 0,5 -
compromiso entre la resolución y el tiempo de análisis. Una ventaja de este método fue
3,0 g / ml, con un coeficiente de correlación de 0,996.
la aplicación de una fase móvil isocrática con un sencillo en comparación con los
complejos composiciones de fase móvil y / o elución de gradiente utilizadas en otros Precisión fue mayor que 77,6% (media de 84,5%) y la precisión para las tres
métodos de HPLC [4]. El tiempo de retención de lasalocid era 11,33 ± concentraciones de analito estaban en el rango desde 4,8 hasta 13,3% (Tabla I).

valores LOD y LLOQ eran 0,03 y 0,5 g / ml, respectivamente. La tasa de

recuperación fue mayor a 80% en seis repeticiones. Por otra parte, las muestras con
0,2 min (Fig. 2) en las condiciones cromatográficas empleadas aquí. Cromatogramas
lasalocid en la leche de vaca demostraron ser estables durante 79 d se almacena a -30 °
mostró una separación clara y excelente entre las interferencias de lasalocid y
C y a través de tres ciclos de congelación y descongelación.
endógenos de la leche, la ausencia de picos de interferencia en el tiempo de retención
del lasalocid.

UN

segundo

Figura 2. Los cromatogramas de una leche BLANK (A) y sodio LASALOCID (3,0 mg / ml) en una muestra de leche (B).

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TABLA I
Precisión y exactitud PARA LASALOCID determinado por un método de HPLC-UV EN VACA LECHE CRUDA

El control de calidad (QC) análisis días concentración observada Precisión (a) Precisión (b)

Media ± SD (g / ml) % %

1 0,4799 ± 0,0033 8.0 96.3

0,5 g / ml 2 0,4038 ± 0,0339 5.6 80.8

3 0,4043 ± 0,0177 4.8 80.9

1 1,4200 ± 0,0861 6.4 94.7

1,5 g / ml 2 1,2416 ± 0,0513 8.1 82.8

3 1,1668 ± 0,0969 4.3 77.8

1 2,5744 ± 0,1698 7.2 85.8

3,0 g / ml 2 2,3269 ± 0,1275 5.5 77.6

3 2,3759 ± 0,3149 13.3 79.2

(A) Expresado como coeficiente de porcentaje de variación. (B) Calculado como (determinada concentración / concentración nominal media) x 100%. (N = 6).

De acuerdo con los datos obtenidos en el proceso de validación, esta técnica y el [3] CAMPBELL, H .; Nayeri, G. COSTA, J. Determinación de monensina, narasina,

protocolo muestran selectividad adecuada y linealidad, exactitud y precisión aceptables y la salinomicina en premezclas minerales, suplementos y animal se alimenta por

recuperación eficiente y la estabilidad de la muestra. La utilidad de este método analítico cromatografía de líquidos y derivatización post-columna. J. AOAC. En t.

para la determinación de lasalocid en la leche de vaca tiene una aplicación potencial en el

sistema de control de calidad en la industria láctea con un límite de detección de 0.03μg / ml 89: 1229-1242. 2006.

y el límite de cuantificación de 0.5μg / mL.

[4] CARR, P .; Stoll, D .; WANG, Perspectives X. sobre los recientes avances en la
velocidad de la cromatografía líquida de alto rendimiento. Anal. Chem. 83:
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CONCLUSIONES [5] DE JONG, J .; Stoisser, B .; WAGNER, K. Determinación de maduramicina en

los piensos y premezclas por cromatografía líquida: desarrollo, validación y
Los resultados indican que la HPLC-UV desarrollado estudio entre laboratorios. J. AOAC. En t. 87: 1033-1041. 2004.
método es adecuado para detectar y cuantificar lasalocid en la especie bovina muestras de
leche cruda en concentraciones mayores que 0,03 g / ml y
[6] DUSI, G .; GAMBA, cromatografía V. líquido con detección ultravioleta de
0,5 g / ml respectivamente.
lasalocid, monensina, salinomicina y la narasina en las aves de corral mediante
derivatización pre-columna.
EXPRESIONES DE GRATITUD
J. Chromatogr. A. 835: 243-246. 1999.

[7] EBEL, J .; WACHS, T .; Henion, J. rápido forense selecciona reacción monitoreo

Los autores expresan sus agradecimientos al Consorcio Lechero, Chile,
determinación cromatografía líquida / espectrometría de masas de antibióticos
Proyecto FIA-CS-C2004-1-P-002-M2P8 y la Universidad Austral de Chile
ionóforos que se encuentran en niveles tóxicos en alimentos para animales. J AOAC
(UACh-DID-I-2008-07) por el apoyo a este proyecto.
Int. 87: 25-30. 2004.

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