PRESENTACIÓN DE INFORME DE PRÁCTICA N° 10

Est. Jhon Kevin Bonilla León

Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

Biología Molecular

09 de Octubre del 2020

I. OBJETIVOS

 Describir el proceso de Electroforesis.

 Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una Electroforesis.

 Preparar una Electroforesis

II. INTRODUCCIÓN

La electroforesis en gel es un método que para Somma & Querci se usa para

separar macromoléculas de acuerdo a su tamaño, carga eléctrica y otras

propiedades físicas. Básicamente el término describe lo que en realidad es:

«Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, que significa

«trasladar». Entonces, es una técnica que para Green & Sambrook consiste en

aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que “corran” en una placa de gel de

agarosa. La fuerza provendría de la aplicación de corriente a los electrodos en

ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula determinan la velocidad

con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de un medio gelatinoso.

Su creación data del año 1962, a cargo de Matsubara y Takagi, donde, según Drabik

y colaboradores se utilizaba al almidón como gel de corrimiento. Entonces, la

necesidad de analizar moléculas de ADN de longitudes variables sugirió a la

agarosa, un polisacárido obtenido del aislamiento de agar de algas rojas marina, en

1969 como un candidato adecuado. Por lo que, la electroforesis de ADN fue, y sigue

siendo, una herramienta importante en el desarrollo de las técnicas del ADN

recombinante o ingeniería genética.

En el siguiente informe se presentan los principios físicos, los componentes (y los

procedimientos para preparar la electroforesis en gel de agarosa.

Fierro en su trabajo describe a la electroforesis en gel de agarosa como una técnica

que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Para el autor

antes citado se trata de un método sencillo y rápido que permite diferenciar

fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros

procedimientos.

Los geles de agarosa tienen un poder de resolución mucho menor que los de

poliacrilamida, por ello, Drabik y colaboradores detallan que ello no permite separar

moléculas de ADN que difieren en tamaño menos de unas 50 pb. Sin embargo,

Somma & Querci dicen que el rango de tamaños que pueden separarse es mucho

mayor en un gel de agarosa (moléculas desde 50 pb hasta unas 40 kb) dependiendo

de la concentración del mismo; cuanto más baja es la concentración de agarosa

mayor es el tamaño de las moléculas que pueden separarse, y viceversa. Este rango

de tamaños, para Somma & Querci hace a los geles de agarosa ideales para

analizar el producto de digestiones con enzimas de restricción, lo que puede

combinarse con otras técnicas como el Southern blot.

La electroforesis en gel de agarosa tiene un límite superior de unas 40-50 kb en el

tamaño de las moléculas de ADN que puede separar. Por lo tanto, no es posible

separar cromosomas enteros, como los cromosomas de eucariotas. Si reducimos

hasta un 0.1 o 0.2% puede incrementar el límite de separación hasta los 750 pb, sin

embargo estos geles son extremadamente frágiles y muy difíciles de manipular.

Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son

polímeros la agarosa. Fierro detalla que este gel se coloca en la cubeta de

electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las

ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un

filtro molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y

forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta

en un gel de electroforesis. Por otro lado, es importante la utilización de marcadores

de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las

muestras de DNA problema.

El protocolo para la preparación de muestras para electroforesis en gel de agarosa

es sencillo y rápido. Green & Sambrook dicen que las muestras se mezclan con

tampón de carga, que consiste en glicerol, colorante azul de bromofenol y tampón

electroforético. Se debe evitar el alto contenido de sal, ya que podría afectar el

proceso de separación.

En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se

intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz

ultravioleta, según Green & Sambrook. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con

una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de

DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.

Montalvo y Lugo dicen que el método es posible aplicarlo en el estudio de células

sanguíneas provenientes de animales o humanos, células de hemolinfa de moluscos

e insectos, esperma, tejidos animales disgregados, levaduras, núcleos liberados de

tejidos vegetales, en otras palabras es aplicable a cualquier tipo de célula

eucariota que pueda obtenerse como una célula única.

Placas de vidrio

• Solución de Agarosa 0.8%

• TAE 1X

• Agua destilada

• Buffer de carga

• Bromuro de etidio

• Cámara electroforética

• Fuente de poder o energía

• Micropipetas

• Peine

• Tips o puntas

V. PROCEDIMIENTOS

- VIRUS

En este caso Villaquirán (2020) utilizó dos cebadores, el primero fue el cebador

VILLA cuya secuencia de reversa fue 5-TTTCTTCAGCGCGGTATTCT-3 y el forward

5-GTTACCTTTGCTGCCAGAGC-3 de 20 pb cada una. El segundo fue el cebador

QUIRAN cuya secuencia de reversa fue 5-GGTCCGTCTACTGCGTCTTC -3 y el

forward 5-CGAAGCTGAAGCGACTACG-3, para detectar la presencia del virus

IHHNV.
Se utilizó un termociclador, donde se aplicaron las siguientes condiciones las cuales

fueron de 40 ciclos, iniciando con una pre-desnaturalización a 94°C durante cinco

minutos; los segmentos fueron de 94°C (1 min), 55°C; (45 s) y 72°C por 45

segundos,extensión final de 72°C durante 7 minutos y conservación a 4°C para la N-

PCR.

Luego, se preparó un gel de agarosa al 2% y se procesó 8µL de amplicón en un

teñido con 1.8 µL de Bromuro de Etidio. Los amplicones fueron corridos a 100V

durante 30 minutos, posteriormente se reveló a través del fotodocumentador.

- VEGETAL

Agorio estableció dos cebadores, el primero fue MADC2 con una secuencia forward

5-TTGATGGTGGTGAAACGGC-3 y una de reversa 5-

CCCCAATCTCAATCTCAACCC-3 con un tamaño de 235pb y 244 pb

respectivamente. El segundo cebador fue SCAR con una secuencia forward 5-

GGTTGGGATGTTGTTGTTGTG-3 de 105 pb y una de reversa de 5-

AGAAATCCAAGGTCCTGATGG-3 de 111pb para determinar el sexo de las

especies de Canabis.

Esto se realizó utilizando, 2 μl de PCR Buffer mix sin Mg (10 x), 0.4 μl de dNTP’s (10

mM), 2 μl de cebadores (10 μM cada uno); 0.1 μl de Taq DNA polimerasa (5 U/μl),

para finalmente llevar a 20 μl con H2O ultrapura. Finalmente se agregaron 2 μl de

cada ADN.

Las condiciones utilizadas para la amplificación fueron una desnaturalización inicial a

95°C 5 minutos (una sola vez); dos ciclos de 95°C, 60°C, 72°C todos de 30

segundos, dos ciclos de 95°C, 58°C, 72°C todos de 30 segundos, dos ciclos de

95°C, 56°C, 72°C todos de 30 segundos, dos ciclos de 95°C, 54°C, 72°C todos de
30 segundos, dos ciclos de 95°C, 52°C, 72°C todos de 30 segundos, treinta ciclos de

95°C, 50°C, 72°C todos de 30 segundos; para finalmente terminar con un ciclo de

72°C 7 minutos que se realizó una sola vez.

Luego, se realizaron las corridas electroforéticas de ADN que fueron realizadas en

geles de agarosa 2.5% para la observación de 8 μl de los productos de PCR

utilizando buffer TAE 1X. El resto del volumen de la PCR fue observado en geles de

5% de agarosa, utilizando buffer TBE 0.5X, para la correcta separación de bandas.

Para estimar tamaños y concentraciones de banda se recurrió a la utilización del

marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder. Se visualizó los resultados en

un transiluminador UV.

- BACTERIA

Peidro y colaboradores seleccionaron los oligonucleótidos de secuencias: 5’-CCC

AAA GTC TAG GTG TAAAAT TCC-3’ y 5’- GCA ATC CTC AGG GTA TCC TTC-3’

para detectar los genes codificadores de la toxina del cólera(ctxAB).

Las concentraciones de los reactivos empleadas para el ensayo de PCR fueron:

1,5mM de MgCl2; 10 pmol /L de cebadores; 200mol/L de desoxinucleósidos

trifosfato; 1 X de tampón de PCR y 1 U de ADN polimerasa Taq. Las reacciones de

PCR se realizaron en el equipo de ciclos térmicos en un volumen final de 20L, con el

siguiente programa de desnaturalización a 94◦C por 2min, 40 ciclos de 94 ◦C por 30

s, 50 ◦C por 30 s y 72 ◦C por 30 s. Se utilizó un paso de extensión final de 2min a 72

◦C. Luego, lo que se amplificó se guardó a −20 ◦C hasta su análisis electroforético,

para lo cual se emplearon 15 ul del producto de la reacción de PCR.

Saldaña y Hung utilizaron dos cebadores CHD P8 cuya secuencia fue 5’-

CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3’ y P2 cuya secuencia fue 5’-

TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3’ para obtener extraer el ADN de aves de corral.

Luego se les colocó en 500μl de un buffer de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 8, 20 mM

EDTA, 2% SDS) y 10μl de proteinasa K. Los tubos fueron mezclados en el vortex

por 10 segundos y luego llevados a incubación a 56°C durante toda la noche. Al día

siguiente los tubos fueron homogenizados en el vortex por algunos segundos y

luego centrifugados a 12 000 RPM por 10 minutos y el sobrenadante fue colocado

en tubos limpios desechando los restos conteniendo el raquis de las plumas. A

continuación, se purificó el ADN con 500μl de fenol:cloroformo:isosamyl alcohol. Se

agitó la mezcla en el vortex y centrifugó a 10 000 RPM por 5 minutos. Después se

agregó 50μl de NaCl a una concentración de 2M y 100μ de etanol

Después de la amplificación por PCR se observó los resultados a través de una

electroforesis en gel de agarosa al 2%.

VI. RESULTADOS

VIRUS

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 2%

los productos de PCR. Después de la separación, los fragmentos de ADN

resultantes son visibles como bandas claramente definidas. El estándar de ADN o

escalera debe ser separado a un grado que permita la determinación útil de los

tamaños de las bandas de la muestra.

VEGETAL

Marcador

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 2% de los productos de PCR obtenidos

con el marcador MADC2

Se observa seis bandas de 0,5 Kb para todas las muestras estudiadas.

Marcador SCAR
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 2% de los productos de PCR obtenidos

con el marcador específico SCAR

Se identifica cuatro perfiles macho (CAN 2, CAN 3, CAN 5 y CAN 6) y dos perfiles

hembra (CAN 1 y CAN 4). Esto es debido a que el marcador no hace correr las

muestras de hembras.

BACTERIA

Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa

migración y su comparación con la del patrón de peso molecular. Esta talla es

cercana a la esperada (399 pb)

Estos resultados indicaron que los cebadores seleccionados eran específicos para

los genes ctxAB.

ANIMAL

Solo 3 muestras de ADN a partir de sangre fueron visibles, mientras que todas las

muestras de plumas mostraron resultados visibles.

En 10 de las 13 muestras de plumas se observó una banda alrededor de los 300

pares base estas muestras concordaron con los datos recogidos asegurando que

estos especímenes eran hembras. En cuanto a las muestras de machos no se

observó ninguna banda. También se corrió un agar con una muestra de hembra, una

muestra de macho y una muestra problema; encontrando que el espécimen

problema concordaba con las muestra de hembra.

VII. DISCUSIONES

VIRUS

La amplificación de la región del gen y cuyo cebador se corrió se utiliza para evaluar la

viabilidad del ADN extraído y en este trabajo se logró amplificar el fragmento diana, lo cual

coincide con Saksmerprome y colaboradores, quienes demostraron en su trabajo el uso del

gen evaluado como marcador para las amplificaciones, pero difieren con Tang y

colaboradores, ya que ellos en su trabajo utilizan marcadores de longitudes variables.

Para MADC2 y SCAR se puede observar total coincidencia en los perfiles para las plantas

estudiadas, además de coincidir con el resultado conocido según el sexo de la flor

observada para las plantas. Esto último valida los resultados obtenidos por Weelling y

colabores en su trabajo para los marcadores MADC2 y SCAR y por tanto serían los elegidos

para realizar un estudio de sexado en plantas de Cannabis. Ante estos resultados

confirmaría lo que Köhnemann y col utilizó como marcador MADC2, y sería utilizado como

marcador de sexo y como control positivo de amplificación ya que con el mismo Köhnemann

y col obtuvo amplicones en plantas macho y hembra.

BACTERIA

Este ensayo amplificó la banda de la talla esperada (399 pb) en las muestras de

ADN de la cepa toxigénica. Este valor está en el mismo orden que el reportado por

otros autores como Studer & Candrian y Benites y colaboradores, para garantizar la

seguridad de vacunas orales vivas contra el cólera como es el caso de la vacuna

Orochol7 por lo que, una vez validado, el ensayo del presente estudio podría

emplearse en la detección de cepas toxigénicas en los preparados vacunales.

ANIMAL

No se observó la diferencia entre hembras y machos, se esperaba una banda a 345

bp en hembras y una banda a 362 bp en los machos. Sin embargo se observó que

las muestras de machos no mostraban ninguna banda en la electroforesis, lo que

contrastaría con el trabajo de Liza y colaboradores en la que obtuvo bandas tanto

para machos como para hembras a partir de muestras de plumas.

Se describió el proceso de Electroforesis.

Se detalló los componentes necesarios para llevar a cabo una Electroforesis

Se preparó una Electroforesis y se evaluó la amplificación de fragmentos de ADN,

así como la secuenciación de los mismos.

IX. REFERENCIAS

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que permitan diferenciar variedades y determinar el sexo en plantas de

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Rendon, M. Rocha (eds). Herramientas moleculares aplicadas en ecología:

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6. Köhnemann S, Nedele J, Schwotzer D, Morzfeld J, Pfeiffer H. (2016). The

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7. Liza, R., Maturrano, H., & Rosadio, A. (2018). De - terminación del sexo por

ADN en cinco especies de guacamayos. Revista de Investigaciones Veterina -

rias del Perú, 19(1), 31-36.

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9. Peidro, H., Marrero, K., Ledón, T., & Fando, R. (2016). Desarrollo de un

ensayo de PCR para detectar los genes codificadores de la toxina del cólera

(ctxAB) en preparaciones del candidato vacunal vivo atenuado CV638.

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Characterisation of cannabinoid composition in a diverse Cannabis sativa L.

germplasm collection. Euphytica. 208: 463 – 475

1. ¿En función de qué parámetros separa las moléculas la electroforesis en

gel de agarosa?

Separa las moléculas en función de su tamaño, su carga y su forma.

2. Explique la migración en función de la carga.

Las moléculas de carga negativa migran hacia el electrodo positivo; las moléculas de

carga positiva migran hacia el electrodo negativo

3. ¿Por qué añadimos glicerol a las soluciones demuestra antes de

depositarlas en los pocillos? (EN CLASE DIJO QUE NO SE RESPONDE)

4. ¿Qué sucedería si colocásemos tampón en lugar de agua destilada en la

solución de la cuba o en la del gel?

El agua destilada no contiene ningún ion. La conductividad de los fluidos requiere

iones. Por lo tanto, la migración de moléculas a través del gel también requiere

iones.