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Ud7 Técnicas de Separación
Ud7 Técnicas de Separación
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UD 6 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
INTRODUCCIÓN
En este tema vamos a ver las técnicas básicas que se utilizan en el laboratorio para separar los
componentes de mezclas de componentes sólidos o líquidos. Cada una de ellas se basa en una
característica diferente de los integrantes del sistema:
I. FILTRACIÓN
1. CONCEPTO
La filtración es una de las técnicas más utilizadas en el laboratorio. Puede tener como
objetivo recoger el filtrado, recoger el residuo o ambos. Así, por ejemplo, se utiliza para
eliminar impurezas de las disoluciones, esterilizar disoluciones, concentrar muestras eliminando
parte del disolvente, etc.
2. FILTROS
FILTROS: dispositivos porosos de diversa naturaleza, que dejan pasar partícula de tamaño
inferior al de su poro. Pueden ser de materiales muy diferentes: papel, porcelana, de vidrio
molido, de membrana (nylon, acetato de celulosa). Se ha de elegir el tipo de filtro adecuado al
tipo de filtración y a la naturaleza de las sustancias a filtrar.
Tipos de filtros
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1.2. El filtro de pliegues (francés): ofrece una mayor superficie de filtración que el liso,
por lo que la velocidad de filtración es mayor.
Elaboración:
- Se dobla un círculo de papel por su diámetro (1)
- El semicírculo obtenido se dobla por la mitad, marcando las líneas de pliegue (2)
- Se desdobla, para dejar la forma de semicírculo (2)
- Cada sección obtenida se pliega por la mitad, llevando los vértices del semicírculo
a la línea de pliegue central > así habremos marcado 4 secciones. (3 y 4)
- Cada una de las secciones se divide en otras dos mitades, volviendo a llevar los
vértices del semicírculo a las nuevas líneas de pliegue obtenidas > marcado de 8
secciones. (5)
- El fuelle obtenido se coloca sobre el embudo de manera que adopte su forma de
cono.
2) Filtros de membrana
Son discos de acetato o nitrato de celulosa. Hay con diferente tamaño de poro. Se usan
para esterilizar disoluciones por filtración, ya que sus diámetros de poro se corresponden con
los tamaños de diferentes bacterias.
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Una vez montado todo el sistema de filtrado se procede a la filtración, para ello se
siguen las siguientes precauciones:
- Se vierte un poco de la disolución a filtrar en el interior del filtro de forma que se
humedezcan las paredes del filtro y se peguen bien al embudo.
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Requiere conectar el extremo final del brazo del matraz kitasato a una bomba de
vacío, de tal forma que se origine un vacío que acelere el paso del líquido a través del
filtro ya que se produce un efecto de succión. Por tanto, todos los materiales usados
deben soportar esta fuerza.
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Si el objetivo es recoger el residuo filtrado: para arrastrar todo el sólido que haya
quedado en el recipiente original en el que estaba la solución a filtrar, se añade un poco
de disolvente del que se esté utilizando (ej: agua destilada) y se vierte sobre el
embudo. Una vez que se ha filtrado toda la suspensión se lava el sólido filtrado
añadiendo más agua o el disolvente adecuado.
Consisten en la utilización de una jeringa (que se carga con la solución a filtrar) a la que
se le acopla un filtro > se empuja con el embolo haciendo pasar el líquido a través del
filtro.
Estos sistemas se aplican cuando la cantidad a filtrar es muy pequeña (por ejemplo,
para esterilizar pequeñas cantidades de disoluciones). En estos casos, el sistema de
filtrado contiene un filtro de un tamaño de poro tal que impide el paso de
microorganismos. Tanto el filtro como el recipiente en el que se vierte la solución
filtrada deben ser estériles y la filtración debe efectuarse en el interior de una cabina
estéril.
II. DECANTACIÓN
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III. EXTRACCIÓN
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IV. CENTRIFUGACIÓN
1. CONCEPTO DE CENTRIFUGACIÓN
Hay varios tipos de centrifugación, dependiendo del factor que permite que las fases se
separen:
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A nivel práctico, cada partícula tiene una VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (vS) en función de
su tamaño, densidad, forma y de las características del medio en el que se encuentra, por lo
que:
hay que aplicar una velocidad adecuada en función de la mezcla que queramos
separar.
La velocidad de centrifugación a la que se separa una mezcla permite identificar la
naturaleza de esos componentes.
F.
Centrifuga
Radio de
giro
Pe Peso
Eje de so Efectivo
giro
La velocidad de sedimentación o de giro se mide en revoluciones por minuto (rpm) (y debe
ajustarse en la centrífuga antes de centrifugar cada muestra).
Otra unidad de medida es la aceleración centrífuga o Fuerza Centrífuga Relativa (FCR), que
coloquialmente se llama “número de ges”, porque la unidad de medida es la aceleración de la
gravedad (“g”).
Para conseguir la misma aceleración entre dos centrífugas diferentes se debe dar/utilizar el
mismo FCR (y no a misma velocidad de giro –rpm-).
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2. LA CENTRÍFUGA
CENTRÍFUGA: instrumento consistente en un rotor que hace girar un eje, al cual se encuentra
acoplado un soporte en el que se colocan los recipientes con el material que se va a
centrifugar. Al activar la corriente eléctrica, el rotor girará con la velocidad que hayamos
seleccionado previamente, transmitiendo esa fuerza centrífuga al soporte (o CABEZAL) que
contiene las muestras a centrifugar.
Los cabezales más frecuentes son los horizontales o basculantes y los de ángulo fijo:
Basculantes u horizontales: Los tubos se hallan dentro de unos cestillos que
cuelgan. Estos cestillos están unidos al rotor con un eje y cuando la centrífuga
gira se quedan suspendidos en dirección perpendicular a la del rotor. Es decir,
que pasan de estar en vertical (en parada) a horizontal (en marcha).
En general este tipo de rotores no permite trabajar con aceleraciones muy altas,
aunque para las técnicas de separación con gradiente se prefiere este tipo de
cabezales.
Ángulo fijo: los tubos se adaptan a una cavidad que presenta un ángulo entre
25° y 45° respecto al eje vertical de rotación. Durante el movimiento las
partículas chocan contra la pared del tubo, de manera que el sedimento en
bisel. Por su forma aerodinámica estos rotores permiten aceleraciones
superiores.
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C. Ultracentrífugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de
refrigeración y de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la obtención de
datos precisos de propiedades de sedimentación
(coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y
preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente
de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas).
a) Volumen: Desde algunos tubos tipo Eppendorf (que permiten volúmenes de 1,5 ml, e
incluso inferiores) hasta botellas de 1000 ml.
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c) Control de equilibrio: Al colocar los tubos en el rotor hay que procurar que las
cargas situadas a ambos lados del eje de rotación estén equilibradas, es decir, que
sean iguales en masa y tengan el mismo centro de gravedad. Alteraciones en este
equilibrio pueden afectar el eje de rotación y provocar la rotura de los tubos e
incluso el eje. Actualmente la mayoría de centrifugas disponen de controles que
detienen el movimiento en caso de desequilibrio.
d) Freno: Muchas centrifugas vienen equipadas con freno, lo que permite disminuir
el tiempo de desaceleración. Es mejor evitar en lo posible frenados bruscos, ya
que ello puede favorecer la redisolución del sedimento y el remezclado de los
componentes ya separados.
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3. PROCEDIMIENTO DE USO
a) Colocar el tubo de muestra (suspensión o disolución) en uno de los receptáculos del rotor.
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2. CROMATOGRAFÍA
1. CONCEPTO DE CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es una técnica física que se emplea en los laboratorios clínicos para separar
una gran variedad de sustancias para, después y mediante otras técnicas, poder cuantificarlas.
La separación es posible gracias a dos elementos o FASES que ejercen dos fenómenos
opuestos combinados:
a) FASE MÓVIL: arrastra (Desplazamiento) la mezcla a través del sistema, para hacerla
pasar a través de la fase estacionaria. Puede ser un líquido o un gas.
b) FASE ESTACIONARIA: capta (Retención) uno de los componentes de la mezcla. Puede
ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
Como sólo uno de los dos componentes quedará retenido, el otro “saldrá” junto con la
fase móvil, quedando separados.
Podremos recuperar y cuantificar cualquiera de los dos, después de separarlos de la
fase correspondiente.
ELUCIÓN: PROCESO por el que una fase móvil atraviesa una fase estacionaria y se produce la
separación de los componentes de una muestra.
ELUYENTE: fase móvil, que permite la elución.
ELUÍDO: sustancia que se obtiene del proceso de elución, tras atravesar la fase estacionaria y
salir del sistema.
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Este fenómeno hace que sea fácil regenerar la resina que suele usarse como
fase estacionaria, ya que, al pasar otra solución de pH diferente, las partículas
retenidas cambiarán de carga y podrán ser eluídas. A su vez, la resina quedará
libre y podrá volver a ser utilizada.
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Cromatografía de afinidad
Se basa en interacciones muy específicas que tienen lugar entre unas moléculas de la
fase estacionaria (denominadas LIGANDOS) y los componentes de la muestra
(hormona-receptor, antígeno-anticuerpo…)
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Pico
cromatográfico
Cromatograma
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HbA
04-7-11 NO.063
HbA1c 8.0 % HbA1 10.3 %
HbF 1.2 %
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6. CROMATOGRAFíA DE GASES
La cromatografía de gases es una técnica de reparto líquido-gas que se realiza en una columna
rellena de un sólido, finamente dividido, que actúa como soporte.
La fase estacionaria está formada por un líquido no volátil que impregna el soporte
la fase móvil es un gas inerte, (nitrógeno, helio, hidrógeno o argón) que fluye por la
columna a velocidad constante.
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Ejemplo:
3. ELECTROFORESIS
1. CONCEPTO DE ELECTROFORESIS
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Así, de forma muy básica, un sistema de electroforesis se compone de un recipiente al que hay
conectados dos electrodos (positivo y negativo). Dentro del recipiente hay una solución salina
(tampón) que favorece que las moléculas de la muestra que vamos a separar (por ejemplo,
proteínas) presenten una carga determinada. Introduciremos la muestra en un soporte y, al
someterlo al campo eléctrico, los componentes de la muestra cargados irán migrando hacia el
polo de signo opuesto, separándose entre sí. Cada uno migrará más o menos en función de
varios factores, como el tamaño de la molécula. Las moléculas más grandes avanzarán menos
(simplemente por la resistencia que ofrece el soporte a que pasen a su través).
Resultado: bandas separadas, cada una correspondiente a un tipo de molécula. EJ: diferentes
proteínas.
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Se trata de una técnica fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar con
fines preparativos (para aislar una proteína con la que luego queremos hacer otro tipo de
pruebas).
2. TIPOS DE ELECTROFORESIS
b. Zonal: en la que el campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante. Son las
más comunes, siendo útiles para lograr la separación de mezclas complejas de proteínas u
otras macromoléculas capaces de cargarse eléctricamente. (Por ello, todo lo que veamos a
continuación será referido a este tipo concretamente).
3. COMPONENTES DE UN SISTEMA DE ELECTROFORESIS ZONAL
Ánodo Cátodo
(Soporte)
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CAMPO ELÉCTRICO: región en la que actúa una fuerza eléctrica generada por dos polos
eléctricos (positivo y negativo) entre los que se crea una DIFERENCIA DE POTENCIAL
ELÉCTRICO (también llamado GRADIENTE DE POTENCIAL o VOLTAJE O FUERZA
ELECTROMOTRIZ. Su unidad es el voltio).
Por ello, se tiene que aplicar un voltaje que logre la relación óptima entre todas estas
circunstancias.
Cuando las moléculas cargadas están sometidas a un campo eléctrico hay dos fuerzas que
actúan sobre ellas:
Fuerza debida al campo eléctrico: impulsora
F=QE
Q: carga eléctrica del ión (positiva o negativa)
E: intensidad del campo eléctrico
En otras palabras: A mayor carga eléctrica y mayor intensidad de campo,
mayor migración.
La combinación de ambas fuerzas (que son opuestas) hace que el ión se desplace a través de
la disolución a una velocidad constante y alcance una determinada distancia. Esta velocidad
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dividida por la intensidad del campo eléctrico se conoce como MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
o MOVILIDAD MOLECULAR (): es un parámetro característico de cada molécula (para un
medio y un pH determinado > es decir, que podremos identificar una molécula observando
su desplazamiento electroforético.
3.2. Cubeta
Cámara con dos compartimentos separados entre sí, que se rellenan con el tampón. Cada
uno de estos compartimentos contiene un electrodo (que queda sumergido en el tampón)
conectado a través de un cable a la fuente de alimentación.
Los tabiques de los compartimentos permiten montar un SOPORTE donde se colocan o
“siembran” las muestras. El soporte está embebido también en tampón y en contacto a cada
lado con el tampón de los compartimentos, de modo que se crea un circuito eléctrico cerrado:
la corriente eléctrica va desde uno de los electrodos atravesando el soporte hasta el otro
electrodo.
Como al aplicar electricidad, aumenta la temperatura del tampón, la cubeta dispone de una
tapa para minimizar la evaporación. Incluso en algunos casos lleva un sistema de refrigeración.
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Cuanto más cercano esté el pH del sistema al pI, más moléculas estarán en estado
neutro, por lo que menos se desplazarán > GRADO DE IONIZACIÓN de la muestra =
relación entre el número de moléculas ionizadas y no ionizadas.
Las sustancias ANFÓTERAS o ANFIPRÓTICAS son aquellas que pueden actuar tanto como
ácidos como bases, dependiendo del pH. Ej: aminoácidos, el agua…
En la electroforesis nos interesa que todas nuestras proteínas tengan una carga concreta
para que su migración sea la adecuada y, por tanto, nos sirva como prueba diagnóstica.
Por otro lado, los tampones están relacionados con la FUERZA IÓNICA del MEDIO (medida de
la concentración de iones de un medio y de las fuerzas de atracción y repulsión que hay
entre ellos). La diferencia de potencial que se aplique “se reparte” entre todos los iones
presentes y es lo que les “impulsa” a desplazarse. Cuantos más iones haya, más repartida
estará y, por tanto, menos se desplazarán. El tampón también está formado por iones, por lo
que la diferencia de potencial también se repartirá entre ellos. Cuanto mayor sea la
concentración del tampón (FUERZA IÓNICA DEL TAMPÓN), menor porcentaje de corriente
“será acarreada” por los iones de la muestra, y menos migrarán (cuando nuestro objetivo es
justo el contrario).
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3.4. El soporte
Es una porción plana de un material sobre la que se deposita la/s muestra/s a analizar y que
permite la migración y visualización de sus componentes, para lo cual debe estar sumergido en
solución tampón.
Vamos a ver las características de cada uno por separado (en verde se destacan los más
usados):
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b. Acetato de celulosa: bajo precio, fácil manejo y lectura, presenta una baja adsorción y una
mayor resolución. Es posible transparentarla (ya que es opaca) o disolverla con disolventes
orgánicos para detectar y recuperar las proteínas. Ej: Cellogel®
c. Almidón: la resolución es mayor que la que ofrecen los medios anteriores. El principal
inconveniente es la baja repetitividad de los resultados debido a la dificultad de preparar
los geles. Actualmente se utiliza poco, sustituido por la poliacrilamida.
d. Gel de agarosa:
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a. Horizontal
En papel: para aminoácidos u otras moléculas pequeñas
En acetato de celulosa: para proteínas
En gel de almidón o de agarosa: para proteínas y ácidos nucleicos. Casi siempre el
tampón cubre el gel para evitar que se seque por el calentamiento al paso de la
corriente), denominándose ELECTROFORESIS SUBMARINA.
La muestra se aplica depositándola (con pipeta o aplicador especifico) como una gota
sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel
con un PEINE.
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b. Vertical
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El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido entre
dos placas rectangulares.
Potencial del campo eléctrico: cuanto mayor sea, mayor movilidad, pero mayor
temperatura (incluso desnaturalización de las proteínas).
Grado de ionización de las moléculas a separar: es el cociente entre la forma ionizada
y la no ionizada de una partícula en solución. A mayor grado de ionización, mayor es la
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carga neta.
pH del medio: determina la carga neta de la molécula
Fuerza iónica del medio: si la concentración de iones del medio es elevada, se
dificulta la separación electroforética.
Tamaño y forma de las partículas a separar: en el caso de los soportes restrictivos.
Soporte: tamaño de poro, resolución…
1) Preparación de la muestra:
Las muestras biológicas que pueden ser sometidas a electroforesis son cualquier
líquido biológico: suero, plasma, sangre total, orina, líquido cefalorraquídeo, etc.
La forma de preparar la muestra depende del tipo de muestra y el objetivo de la
electroforesis. En algunos basta con centrifugar la muestra (electroforesis de proteínas del
plasma o suero), en otros es necesario una concentración previa (electroforesis de muestras de
orina), o un proceso de extracción previa (electroforesis de ácidos nucleicos).
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ambos extremos del soporte estén en contacto con el tampón durante toda la prueba.
El tampón utilizado durante la electroforesis se puede reutilizar un par de veces (si se
mantiene en refrigeración), pero suele contaminarse con facilidad.
4) Aplicación de la muestra:
Para la aplicación de la muestra en el soporte se puede aplicar las siguientes técnicas:
- Aplicación sobre la superficie del soporte: (por ejemplo, el suero se deposita sobre
la superficie de la tira de acetato de celulosa).
- Introducir la muestra en los pocillos de los geles: para asegurar que la muestra
queda dentro del pocillo y para visualizar el avance de la electroforesis.
5) Proceso electroforético:
Una vez depositadas las muestras se cierra la tapa de la cubeta, se seleccionan los
PARÁMETROS ELECTROFORÉTICOS (voltaje, intensidad y tiempo) y se pone en marcha la
fuente de voltaje.
El resultado de la electroforesis es la formación de una serie de bandas correspondientes a
las fracciones separadas.
6) Revelado:
Este proceso permite visualizar las bandas obtenidas. Hay diferentes técnicas de
revelado:
Se pueden emplear
sustancias
coloreadas
(colorantes
inorgánicos que se
unen a las proteínas
de forma poco
selectiva) o
fluorescentes que se
unan a las proteínas
o los ácidos
nucleicos.
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La tinción con plata es una alternativa a la tinción rutinaria de geles de proteínas (así
como de ácidos nucleicos y lipopolisacáridos) por su gran sensibilidad.
¡¡¡ATENCIÓN!!!
El BROMURO DE ETIDIO (BrEt) es una sustancia fluorescente muy usada como revelador
hasta hace poco tiempo. Se intercala entre las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos.
Absorbe luz ultravioleta de λ ≈ 300 nm, y emite una luz anaranjada de 590 nm, mediante la
cual se puede detectar la posición y cantidad relativa del ADN en el gel tras la electroforesis.
Tiene el inconveniente de su elevada toxicidad y poder cancerígeno, por lo que está siendo
sustituido por otras sustancias también fluorescentes como el SYBR Green.
3.6. Autorradiografía
Tanto proteínas, como ácidos nucleicos pueden marcarse con isótopos radiactivos.
Procedimiento:
o Se marcan previamente a la electroforesis.
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o Se realiza la electroforesis.
o Se pone en contacto el soporte con una película radiográfica > la
radiactividad marcará las bandas.
o Se revela la película.
3.7. Inmunoensayo
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7) Lectura y evaluación:
En función de los resultados, la electroforesis puede ser:
- cualitativa (presencia o ausencia de bandas)
- cuantitativa (cantidad de sustancia que hay en cada una de las bandas obtenidas):
para conseguirlo se pueden usar varias técnicas:
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Patrón normal
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ACTIVIDADES
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