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TRANSFORMACION DE CELULAS COMPETENTES DE ESCHERICHIA COLI.

Carrascal Antony1, Navarro Laureano1, Velásquez Maria1 & Viloria Gina1.

1. Universidad de Sucre, Facultad de Educación y Ciencias, Programa de Biología, Línea de

profundización en Biotecnología, Informe de Ingeniería Genética, Sincelejo-Colombia.

RESUMEN
La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente en el medio. Es un fenómeno
que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas
especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado
de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta
alteraciones en su pared y membranas celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. Es así,
que al trabajar con la cepa MM294 de Escherichia Coli, implicando procedimientos tales como crecimiento de
la E.coli, preparación de células competentes y la transformación de estas, se observaron resultados, donde hubo
crecimiento con un número significante de colonias.

PALABRAS CLAVE: Plásmido, Escherichia coli, transformación, DNA genómico.

INTRODUCCION
La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente en el medio. Es un fenómeno
que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas
especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado
de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta
alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula.1

En el laboratorio se ha conseguido poner a punto técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias
que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas técnicas se basan en diversos
tratamientos químicos o físicos que producen microporos en la célula, lo que permite la introducción del DNA
exógeno (transformación) de modo bastante eficiente. Uno de los métodos físicos es la electroporación,
consistente en inducir la competencia mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy breve e intenso. Dicha
competencia se puede inducir con tratamientos químicos utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Hay
que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las células del cultivo se hacen
competentes.2

La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir
prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El
método que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno de los más utilizados para transformar E.
coli. Para detectar la transformación, el DNA introducido llevará un marcador seleccionable en el medio
adecuado.3
 2

Uno de los métodos físicos es la electroporación, el cual es un método físico para transformaciones bacterianas,
este presenta una eficiencia de entre 109 y 1010 de colonias transformantes por cada microgramo de ADN
plasmídico empleado. En este procedimiento, una mezcla de ADN y las células receptoras es sometida a una
diferencia de potencial muy alta (2500 v) por un periodo de tiempo muy corto (milisegundos). Dicha
competencia se puede inducir utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Cabe resaltar que tras estos
tratamientos no todas las células del cultivo se hacen competentes. 4 El objetivo de la práctica fue transformar
células competentes de E. coli utilizando plásmido pAMP e identificar los clones de E. coli transformados a
partir de los marcadores de selección (resistencia a la ampicilina).

Metodología
Se trabajo gran parte del procedimiento en la cámara de flujo laminar.

Figura1. Cámara de flujo laminar.

 3

Fig2. Plásmidos resistentes ampicilina

Crecimiento de Escherichia coli

 4

Fig. 3. Muestra de colonias de bacterias. Fig. 4. Cultivo LB inoculado con E.Coli.

1. La tarde anterior se los técnicos de laboratorio tomaron una muestra de una colonia de bacterias (fig.3)
de una placa de Petri reciente, se transfirió 2 ml del medio LB. Se incubo en baño de maría a 37ºC, con
una fuerte agitación durante toda la noche.
2. Inoculamos 1000 µl del medio LB, luego tomamos 500 µl del cultivo inoculado con E. coli (fig.4) lo
depositamos en un tubo de eppendorf.

Fig. 5. Ajustando la temperatura Fig. 6. Muestras sumergidas en baño de maría a 39 ºC.

en el baño de maría.

3. La muestra se sumergió en un baño de María a 39ºC (fig.6), realizamos una constante agitación,
revisamos cada 5 min la temperatura a la cual estuvo expuesta la muestra, durante 30 min.

Preparación de células competentes

 5

Fig. 7. Muestras sacadas del baño de maría. Fig. 8. Muestra incubada

4. La muestra se enfrió por 8 min en el hielo (fig.8).

Fig. 9. Muestras sometidas a centrifugación Fig. 10. Resultados de la centrifugación.

3000rp por 10 min a 4ºC.

5. Realizamos una centrifugación a 3000 rp durante 10 min a 4 ºC (fig.9), luego descartamos el

sobrenadante (fig.11).
El tubo de eppendorf se invirtió sobre un papel absorbente durante 1 min.
 6

Fig. 11. Descarte del sobrenadante en Fig. 12. Muestra con CaCl2.
hipoclorito al 13 %.

6. En el tubo de eppendorf se adiciono 1.5 ml de 0.1 M CaCl 2 frio 0ºC. (fig.12) Con una pipeta se mezcló
suavemente hasta la disolución del precipitado.
7. La muestra se dejó por 20 min en el hielo, realizamos una centrifugación de 4000 rp durante 10 min a 4ºC
luego se descartó el sobrenadante.
8. Se adiciono 0.5 ml de 0.1M CaCl2 frio y se mantuvo en el hielo

Transformación de células competentes

Fig. 13. Muestras sometidas a baño Fig. 14. Adición de 250 µl de LB a cada tubo de eppendorf.
de maría a 40ºC durante 3 min.

9. Marcamos 2 tubos de eppendorf de 1.5 m: 1. plásmido + y el 2. Plásmido -, cada se le adiciono 250 µl del
medio de cultivo de células competentes.
10. Se adiciono 10 ml de ADN plasmídico al tubo 1. agitamos para mezclar luego se incubo durante 15 min en
el hielo.
11. Se rotularon las cajas de Petri: 1.LB p-;2. LBp+;3.LB/Amp p-; 4.LB/Amp p+.
 7

Fig. 15. Adición de 70 µl de la suspensión Fig. 16. Perlas de vidrio, selección de 4 para cada caja de Petri
celular con plásmido (+) y (-).

13. Se retiraron los tubos e inmediatamente se sumergieron en baño de maría a 40ºC durante 3 min (fig.13),
realizando una agitación suave, luego se incubaron por 2 min.
14. Se adiciono a cada tubo 250 µl de LB (fig.14).se dejaron 10 min a temperatura ambiente.
15. Se agregó 70 µl de la suspensión celular con plásmido+ esta se adiciono a las placas que contenían
plásmido+ (fig.15).
16. Se agregó 70 µl de la suspensión celular con plásmido - esta se adiciono a las placas que contenían
plásmido-(fig.15).

Fig. 17. Adición de las perlas, se esparcieron Fig. 18. Cajas de Petri selladas con plástico adherente.
por toda la superficie de la caja de Petri.

17. Por toda la superficie de agar se adicionaron 4 perlas de vidrio en cada una de las cajas de Petri (fig.16) se
esparcieron suavemente. Se dejaron secar las placas durante 15 min. Sellamos las cajas de Petri con un plástico
auto adherente (fig.18) por último se incubaron por 24 horas a temperatura ambiente.
 8

RESULTADOS
De acuerdo con los procedimientos de la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

Medios Predicción Resultados

Lb Plásmido (-) + +
Lb Plásmido (+) + +
Lb Ampicilina P (-) - +
Lb Ampicilina P (+) + +

Tabla 1. Resultados de la predicción del crecimiento bacteriano en distintos medios de cultivos para células
transformadas de E.coli.

Figura 1. Resultados de la transformación de E. coli MM294. A. Colonias de células competentes a simple vista de
E.coli con plásmido (-) en medio LB. B. Medio LB + ampicilina con plásmido (-). C. Colonias de células competentes de
E.coli con plásmido (+) en medio LB + ampicilina. D. Colonias de células competentes de E.coli con plásmido (+) en
medio LB + ampicilina.

Figura 2. Conteo de colonias de E. coli MM294 transformadas en medio de cultivo Lb + ampicilina con plásmido (+).
Valor promedio: 282 colonias.
 9

Figura 3. Vista en el estereoscopio con objetivo 8X de colonias de E.coli. Bacterias competentes en medio LB plásmido
(+).

ASPECTOS A EVALUAR VALORES

Masa total 0.05 μg

Volumen total de células en suspensión 760 μl
Fracción esparcida 0.0657 μl
Masa plasmídica esparcida 0.0032 μg
Eficiencia de la transformación 88125 colonias /μgADN

Tabla 4. Resultados de cálculos en cuanto la masa total (Con base al volumen y la concentración), el volumen total de
células en suspensión, fracción esparcida (volumen de la suspensión esparcida/volumen total de la suspensión), de igual
forma la masa plásmidica y la eficiencia de la transformación (número de colonias).

DISCUSIÓN
La transformación genética es un proceso mediante el cual la célula capta moléculas de ADN libre y las mantiene en su
interior en forma de un replicón extracromosómico o las incorpora a su genoma por recombinación homóloga. Muchos
organismos pueden activamente incorporar ADN exógeno mediante una capacidad genéticamente programada
denominada competencia natural. El estado de competencia natural nunca ha sido demostrado directamente en
Escherichia coli y en la mayoría de los casos, se emplea el término de transformación genética en lugar de
permeabilización artificial del ADN.5

Este ADN extraño puede derivarse de especies no relacionadas e incluso de otros reinos, como bacterias, hongos, plantas
o animales, que de otro modo serían inaccesibles para un organismo. Un proceso de transformación genética consta de
cuatro etapas que son comunes para todas las bacterias y necesarias para la detección exitosa de los transformantes. Estas
etapas son: (I) el desarrollo de un estado de competencia en la célula, (II) la unión de la molécula de ADN a la superficie
celular, (III) su entrada y procesamiento y, (IV) la expresión fenotípica del nuevo genotipo resultante. Por otra parte, la
introducción de un vector plásmidico es esencial y constituye la primera etapa en los trabajos de Biología Molecular. 6

Ahora bien, la bacteria Escherichia coli, la cual fue transformada se caracteriza por su material genético, que consiste
principalmente en un círculo grande de ADN de 3-5 millones de pares de bases de longitud, con pequeños bucles de ADN
llamados plásmidos, por lo general de entre 5.000 y 10.000 pares de bases de longitud, presentes en el citoplasma. Son
estos plásmidos que las bacterias pueden transferir de un lado a otro, lo que les permite compartir genes entre sí y, por lo
tanto, adaptarse naturalmente a nuevos entornos. 7
 10

Por otra parte, la ampicilina es un antibiótico y actúa evitando que E. coli construya paredes celulares, matando así a las
bacterias. Cuando el gen de resistencia a ampicilina está presente, dirige la producción de una enzima que bloquea la
acción del químico y que las bacterias pueden sobrevivir. Las bacterias sin el plásmido y, por tanto, el gen de resistencia
es incapaces de crecer en una placa que contiene ampicilina en el medio y solo sobrevivirán los transformantes 8, así como
se evidencia en la Tabla 1.

En la transformación es importante resaltar el mecanismo por el cual el cloruro de calcio media el proceso de
transformación artificial. Debido a que este sugiere que el calcio facilita la adsorción del ADN sobre la superficie celular
y el shock térmico permite la entrada del ADN adsorbido al citoplasma de la célula. Se postulan dos modelos que explican
el mecanismo de transformación inducida de las células bacterianas. Según el primer modelo, el ADN libre se une a un
receptor en la membrana celular y es transportado a través de canales, ya sea en forma circular o linear. Este modelo se
basa en el papel importante que representan los canales formados por el complejo poli-β-hidroxibutirato
(PHB)/calcio/polifosfato en la captación y entrada de moléculas de ADN. El segundo modelo asume que el shock térmico
desestabiliza la membrana celular, de manera que favorece la entrada del ADN a la célula a través de poros temporales
formados en aquella.9

CONCLUSIONES
Se logró obtener un crecimiento de E. coli en los medios LB que contenían ampicilina debido a que se logró transformar
bacterias competentes de E. coli resistentes a ampicilina introduciéndoles plásmidos pAMP.
Los resultados arrojaron que las células transformadas pueden crecer en agar con ampicilina. Si ninguna de las células de
E. coli sensibles se han transformado, nada crece en el agar con ampicilina.

CUESTIONARIO
1. Diga que factores pueden afectar la influencia de la trasformación bacteriana.
Respuesta
Tamaño de la población: Debido a que la muerte es exponencial, una población muy grande de microorganismos requiere
de mayor tiempo para su exterminación.

Composición de la población: la eficiencia del antimicrobiano varía considerablemente con respecto a la naturaleza de los
organismos que son tratados porque su susceptibilidad es distinta. Por ejemplo: las endosporas bacterianas son más
resistentes que las células vegetativas, las células jóvenes mueren con mayor facilidad y algunas especies soportan
mejores condiciones adversas.

Concentración o intensidad del agente antimicrobiano: A menudo, pero no siempre, entre mayor sea la concentración del
agente químico o más intenso agente físico, más rápidamente se destruyen los microorganismos. Pero generalmente la
eficiencia no está relacionada con la concentración o intensidad (alcohol).

Tiempo de exposición: cuanto más tiempo se exponga una población a un determinado agente, más organismos se
destruirán.
Temperatura: A menudo, un aumento en la temperatura aumenta la actividad de un agente químico.

Entorno: la población que se quiere destruir no se encuentra aislada, está rodeada de diversos factores ambientales que
pueden protegerla o facilitar su destrucción. Por ejemplo: el calor es más efectivo en un medio ácido, la materia orgánica
les da protección contra el calor y los desinfectantes químicos.

2. ¿Cómo se vería afectada la trasformación si en la muestra hubiera un mayor número de plásmidos con
respecto a la cantidad de bacterias?
Respuesta No tienen apenas efectos negativos sobre los demás caracteres de la bacteria ya que Muchos de ellos
responden a mayores concentraciones del plásmido aumentando su número de copias.

3. ¿Qué tipo de marcador de selección se emplean para identificar células transformantes?

Respuesta El gen lac Z, que codifica para β-galactosidasa.
 11

4. ¿Qué otro método de transformación utilizaría para incrementar su eficiencia?

Respuesta Uno de los métodos físicos más eficientes es la electroporación, consistente en inducir la competencia
mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy breve e intenso.
La electroporación es un medio rápido y eficaz de la transformación bacteriana, lo que requiere bacterias
electrocompetentes, ADN purificado, un módulo de control de impulsos que proporciona el impulso eléctrico, y una
cámara que se adapta a las pequeñas cubetas desechables que funcionan como un electrodo. Brevemente, las bacterias
competentes frías, se mezclan con el ADN plásmido, se somete a un pulso de alto voltaje en una cubeta, se resuspendieron
en medio de crecimiento, se incubaron a 30-37 ° C durante 30-45 minutos, y luego sembraron en placas de medio
semisólido (agar nutritivo placas) con el aproxopriate antibiótico selectivo. 10

5. Factores esenciales para el crecimiento bacteriano

Respuesta Los factores que influyen el crecimiento bacteriano son los siguientes:

Temperatura: la mayoría de lo que son capaces de producir enfermedades en el hombre que se mejora temperatura
aproximada 37 grados qué es la temperatura normal del cuerpo humano. Las bajas temperaturas retrasan incluso paralizan
su crecimiento.
pH: la mayoría de las bacterias crecen mejor en medios que tengan un pH próximo a la neutralidad.
Nutrientes: los distintos tipos de microorganismos requieren de distintos tipos de nutrientes. Las bacterias, por ejemplo,
necesitan proteínas y aunque necesitan azúcares las concentraciones muy altas de estás impiden su crecimiento.
Tiempo: junto con las anteriores es la más importante causa de la proliferación a más tiempo, más posibilidad de
reproducción.
Oxígeno: algunos microorganismos requieren la presencia de oxígeno para poder vivir y desarrollarse mientras que otros
no, respectivamente se les denomina aeróbico o anaeróbico. 11

6. Factores que inhiben el crecimiento

Respuesta Entre Los factores que afectan el crecimiento bacteriano se encuentran: actividad del agua, acidez, oxido-
reducción.

Los microorganismos necesitan de "agua disponible" para crecer. Ésta es el agua que no está ligada a otras moléculas del
alimento. El término "actividad de agua" (aw) se refiere a esta agua disponible para el crecimiento microbiano y varía de 0
a 1,0. La menor aw en la cual una bacteria patógena crece es 0,85. Los mejores valores de actividad de agua para el
crecimiento bacteriano están entre 0,97 y 0,99.

La actividad de agua, la temperatura y la disponibilidad de nutrientes, son factores interdependientes. A cualquier

temperatura, la capacidad de crecimiento del microorganismo disminuye proporcionalmente a la actividad de agua.
Cuando la temperatura está próxima a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo, el intervalo de valores
de actividad de agua que permite el crecimiento bacteriano será mayor. La presencia de nutrientes aumenta el intervalo de
valores de actividad del agua para la multiplicación de los microorganismos.

Oxido-reducción: Los procesos de oxidación-reducción están relacionados con el intercambio de electrones entre las
sustancias químicas.
Los microorganismos aerobios necesitan valores de Eh positivo para su crecimiento. En la misma manera, los
microorganismos anaerobios necesitan valores de óxido-reducción más pequeños. Algunas bacterias aerobias crecen
mejor en condiciones un poco reducidas y se denominan microaerofilas.
Finalmente, algunas bacterias crecen bien en ambas condiciones, en presencia o ausencia de aire, llamándose aerobias
facultativas.12

7. ¿Con que químicos mejoraría usted la eficiencia de transformación de E. coli al utilizar el buffer con
CaCl2?
Respuesta
 12

En respuesta al químico se mejoraría la eficiencia con el Método PEG. Este es un procedimiento rápido y simple que
ofrece la opción de almacenamiento a largo plazo de celdas competentes sin usar sin modificaciones adicionales. Las
principales ventajas de esto método son la velocidad y la facilidad de preparación de las células competentes. La principal
desventaja es la eficiencia de transformación reducida (106 transformantes por microgramo de ADN de plásmido), lo que
hace que este método no sea adecuado para la construcción de bibliotecas. Tenga en cuenta que la fase de crecimiento en
la que se cosechan las bacterias es anterior a los otros dos métodos El clásico y el modificado utilizado en la práctica. 13

8. ¿Qué pasaría con la eficiencia de la transformación si aumentamos el tamaño del ADN?

Respuesta Se conoce que el número de colonias dividido por la cantidad de DNA utilizado nos indicará la eficiencia de la
transformación, que dependerá del grado de competencia de las células utilizadas, del método de transformación elegido y
del tamaño del plásmido utilizado, siendo dicha eficiencia inversamente proporcional al tamaño del mismo. Por lo que si
se aumenta el tamaño la eficiencia disminuiría. 14

9. ¿Cómo protejo el ADN o los genes a transferir del sistema de restricción bacteriano?
Respuesta Existen sistema de modificación y restricción, donde actúan enzimas denominada metilasas, las cuales tienen
como función introducir grupos metilo en la misma secuencia reconocida por la enzima de restricción. La metilasa hace
que la diana sea resistente a la restricción. Por tanto, la metilación protege al ADN frente a la degradación. 15

ANEXOS

1. Masa total

Masatotal=volumen∗Concentración
Masatotal= (10 μl )∗(0,005 μg/ μl)
Masatotal=0,05 μg

2. Volumen total de células esparcidas

Volumen total=μl de medio cultivo + μl ADN plasmdico+ μl caldo de cultivo LB

Volumen total=250 μl+10 μl +500 μl
Volumen total=760 μl

3. Fracción esparcida
volumen de la suspención esparcida
Fracción esparcida=
volumen total de la suspención
50 μl
Fracción esparcida=
760 μl
Fracción esparcida=0,0657 μl
4. Masa plásmidica esparcida

Masa plásmidica esparcida=masa total∗Fraccion esparcida

Masa plásmidica esparcida=0,05 μg∗0,0657
Masa plásmidica esparcida=0,0032 μg
5. Eficiencia de la transformación

¿ Coloniasobservadas
Eficiencia de la transformación=
masa plasmidica
282
Eficiencia de la transformación=
0,0032
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Eficiencia de la transformación=88125 colonias /μgADN

REFERENCIAS
1. Lucia obeso Almeida. Ingeniería genética.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/IngenieriaGenetica_13407.pdf. (Último acceso 23 de febrero 2018).
2. Recombinación. Transformación. https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/17transforma.htm#_Toc64553403.
(Último acceso 15 febrero 2006).
3. Enrique Iáñez (1998). Hipertextos del área de la biología. Facultad de agroindustrias. Chaco República Argentina
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/25_micro.htm. (Último acceso 6 agosto 1998).
4. Bioquímica III. Transformación de plásmidos. https://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/TP3-09.pdf.
5. Sinha S, Redfield R J. Natural DNA Uptake by Escherichia coli. P LoS ONE. 2012; 7:1- 6
6. Baur B, Hanselmann K, Schlimme W, Jenni B. Genetic transformation in freshwater: Escherichia coli able to develop
natural competence. Appl Environ Microbiol. 1996; 62: 3673-3678.
7. Transformation of the bacterium E. coli. https://www.apsnet.org/edcenter/K-
12/TeachersGuide/PlantBiotechnology/Documents/TransformationEcoliBacterium.pdf
8. Bitesize Bio. 2017 Science Squared. Tomado de: https://bitesizebio.com/10188/whats-the-problem-with-ampicillin-
selection/
9. Chan J, Davis C, Jokic I. Influences of growth temperature and preparation of competent cells on efficiency of
chemically-induced transformation in Escherichia coli DH5α. Journal of Experimental Microbiology and
Immunology. 2006; 9:92-96.
10. Gonzales, M. F, Brooks, T, Pukatzki, S. U, Provenzano, D. Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent
Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. (80), e50684, doi: 10.3791/50684 (2013).
11. Factores esenciales Tomado de:
https://ikastaroak.ulhi.net/edu/es/COC/SHMA/SHMA03/es_COC_SHMA03_Contenidos/website_23_factores_que_in
fluyen_en_el_crecimiento_bacteriano.html
12. Factores que inhiben el crecimiento bacteriano. Tomado de: https://www.google.com.co/search?
q=factores+que+inhiben+el+crecimiento+bacteriano&oq=factores+que+inhiben+el+&aqs=chrome.3.69i57j0l3.5572j
0j7&client=ms-android-motorola&sourceid=chrome-mobile&ie=UTF-8
13. Swords WE. Chemical transformation of E. Coli. Methods Mol Biol 2003; 235. 49 - 53.
14. Hanahan, D. (1983) Studies on the transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557–580.
15. Lewin Benjamín. Genes. 1996. Reverte. Volumen 1. Edición ilustrada.
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