PROTEINAS I: EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS

Andrés Fernando Silvestre Suarez

Julieth Tatiana Valencia Castaño

INTRODUCCIÓN

La cuantificación de proteínas es de vital importancia para la obtención de información concreta

acerca de estas, habiendo realizado anteriormente una debida extracción del material vegetal,
animal o de un cultivo de bacterias. El lugar que ocupan las proteínas en los seres vivos, es de
gran importancia ya que la mayoría de los procesos biológicos dependen de la presencia de estas.

Existen muchos tipos de cuantificación de proteínas, pero el que se trata en esta práctica es el
método de Bradford, donde la determinación de la concentración de proteína total en una muestra
requiere de la preparación de una curva de calibración empleando una proteína patrón, la BSA.

RESULTADOS

 Proteína a partir de material vegetal: Se Pesa 1 g de espinaca la cual es picada en pequeños

trozos y posteriormente macerada en un mortero con 5 mL de buffer RIPA y 0,5 g de arena.
Se centrifuga por 10 min y se recupera el sobrenadante en un tubo para su cuantificación.
 Proteína a partir de tejido animal (hígado): Se colocan 0,4 g de tejido animal en el mortero
sobre el hielo, posteriormente se adiciona 1 mL de buffer RIPA y se homogeniza con el
vástago del mortero hasta disgregar el tejido, finalmente se centrifugar por 15 minutos y se
colecta el sobrenadante en un tubo para su cuantificación.
 Proteína a partir de cultivo de bacterias: Se colecta 1,5 mL de bacterias de un cultivo
líquido con centrifugación por 3 minutos y se descarta el sobrenadante, seguido de esto se
repite el paso anterior en el mismo tubo para duplicar la cantidad de material y se suspende
en 500 ul de buffer RIPA, finalmente se sonica la muestra y se centrifuga 15 minutos para
finalmente colectar el sobrenadante en un tubo para su cuantificación.
 Cuantificación por el método de bradford: Se prepara el reactivo 1 mL del concentrado en 4
mL de agua desionizada, seguido se preparan 5 diluciones de BSA entre 0,03; 0,06; 0,10;
0,13; 0,16 y 0,2 mg/mL y para cada muestra y estándar se pipetea 1 mL del reactivo
previamente diluido y se adicionan 20 µl de muestra. Se mide la absorbancia a 595 nm.
  En la tabla 1, se muestran los datos obtenidos de las absorbancias de los distintos extractos
recuperados tanto del material vegetal, animal y cultivo microbiológico analizados en la práctica.

Sustancia Blanco Absorbancia muestra diluida

Vegetal 0.001 0.225
Animal 0.251 0.237
Cultivo de bacterias 0.116 0.257
Tabla 1. Absorbancias obtenidas para cada muestra y sus respectivos blancos.

 En la tabla 2, se muestran los valores correspondientes a cada una de las variables medidas en el
ensayo de Bradford.
Ensayo de Bradford
Soluciones patrón Concentración de Absorbancias
proteínas(g/mL)
1 0,03 0,208
2 0.06 0,214
3 0.10 0,223
4 0,13 0,258
5 0,16 0,262
6 0,20 0,271
Tabla 2: Concentraciones y absorbancias para los patrones del reactivo de Bradford

 En la gráfica 1 se muestra la curva de calibración para la cuantificación de proteínas por el

método Bradford que corresponde a la tabla 2, en esta se observa que fue eliminado el dato de
absorbancia perteneciente a la solución número 4 , debido a que no era un valor consistente
respecto a las demás señales.

CURVA DE CALIBRACIÓN
0.3

0.25 f(x) = 0.4 x + 0.19

R² = 0.96
0.2
Absorbancia

0.15

0.1

0.05

0
0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22
Concentración

Gráfica 1: Curva de calibración para los patrones del reactivo de Bradford

 Con la curva de calibración de los patrones del reactivo de Bradford y con las absorbancias
diluidas de cada muestra podemos hallar las concentraciones de proteínas de estas como se puede
ver en la tabla 3:
 muestra concentración
vegetal 0,102
animal 0,112
cultivo de bacterias 0,129
Tabla 3: concentraciones de proteínas en la muestra

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los límites de detección y de cuantificación se vieron afectados por el blanco, pues este no es el
verdadero blanco del instrumento, si no una medida arbitraria a la cual se calibra el Fotómetro
generando lo que posiblemente se determinarían como falsos límites donde el equipo es capaz de
detectar la muestra mas no de producir una señal de absorbancia confiable.

Para el dato de absorbancia de la muestra vegetal y de la muestra de hígado, se obtuvo un valor

mayor a 0.271 (0.779 y 0.714 respectivamente), por lo cual se realizó una dilución para obtener
mejores resultados, esta absorbancia indica una clara desviación de la ley de Beer que pudo darse
por una alta concentración de proteína en la muestra. Las muestras con absorbancias mayores al
máximo de absorción tienen concentraciones demasiado elevadas y por ende se producirá un efecto
de apantallamiento en el que unas moléculas absorberán mayor cantidad de radiación
electromagnética que otras. Finalmente se observa que los resultados obtenidos para el cultivo de
bacterias fue el esperado ya que el blanco no absorbió mayor cantidad de radiación que la muestra.

El creador de este método es el bioquímico Marion M. Bradford describe el proceso que se lleva
a cabo en su escrito llamado “A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding”. La siguiente discusión de
resultados estará sustentada bajo los conceptos que presenta los autora Marilee Benoree en su
artículo “Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology”, en este
documento se explica claramente cómo actúa el colorante Coomassie Brillant Blue G250 sobre
las proteínas.
En el texto de la autora Marilee Benoree se asegura que los grupos de este compuesto que sean
capaces de donar pares electrónicos libres ejecutan esta acción formando un complejo no
covalente con los grupos aminos cargados positivamente, generando una desestabilización de la
estructura de la proteína, y una posterior desnaturalización de esta. Este proceso modificará la
polaridad del conjunto de aminoácidos, exponiendo su parte hidrofóbica. [1]
Este proceso se comprobó satisfactoriamente al ver un cambio de color del reactivo al agregarle
la solución patrón de BSA. Produciendo un cambio de coloración que pasa de marrón a un azul
traslúcido, ya que el autor MARION M. BRADFORD asegura que el cambia su color al
acomplejarse con estas biomoléculas.[2]
En el artículo mencionado anteriormente se encuentran gráficos que presentan un aumento en las
magnitudes de las absorbancias a medida que los valores de las concentraciones proteicas
presentes en solución también aumentan. Este hecho lo pudimos verificar en nuestros resultados,
ya que el comportamiento de nuestra curva de calibración es muy similar a la expuesta por el
autor.
Se puede apreciar que el R 2 se aproxima satisfactoriamente a 1.00, dando como resultado una alta
confiabilidad en el momento de hallar las concentraciones en las muestras proteicas analizadas,
puesto que se puede ejecutar una interpolación o si se prefiere verificar el resultado con la
ecuación de la recta también sería un procedimiento correcto.

MEJORAS U OPTIMIAZCIÓN DEL PROCESO

Realizar un barrido espectral de cada muestra para identificar si la longitud de onda especificada
en la guía de laboratorio es la correcta, ya que las muestras analizadas en el laboratorio dieron
absorbancias superiores al máximo requerido, catalogándolas como no indicadas.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los principales métodos que se utilizan para purificar proteínas a nivel
industrial?

En primer lugar, se debe recoger la proteína, después de esto se empieza el proceso de

purificación, lo que implica separar la proteína de la mezcla de moléculas biológicas. Como
procesos de purificación industrial se encuentran los siguientes métodos.

Cromatografía: Este proceso permite clasificar la proteína por tamaño o si tienden a adherirse a
otras sustancias o disolverse en ellas. Unos tubos son llenados con resina y una solución salina
tamponada, se añade el extracto de proteínas y fluyen a través de la columna; de acuerdo con la
resina utilizada, las proteínas se adhieren a las esferas de resina o atraviesan la columna.

 Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC): Utiliza esferas de gel como sistema de
filtración. Las moléculas de gran tamaño pasan rápidamente alrededor de las esferas de gel,
mientras que las moléculas pequeñas pasan más despacio ya que pueden atravesar
minúsculos agujeros de las esferas de gel. Existen geles de diferentes tamaños de poro, se
utilizará un gel dependiendo de los pesos moleculares de los contaminantes que tocan
separar del extracto.
 Figura 1. http://3.bp.blogspot.com/-InSMRc0TWFM/VSNvoS4T_5I/AAAAAAACG-
w/Jzq2Wml5BLw/s1600/Cromatografia%2Bpor%2Bexclusion.jpg

 Cromatografía por intercambio iónico (Ion X): método para purificación y concentración de
proteínas, se basa en la carga de adhesión estática para unir las proteínas a las esferas de
gel; mientras las proteínas se adhieren a la resina, los contaminantes atraviesan la columna
y salen de ella. Posteriormente se extraen las proteínas del gel cambiando la carga
electrostática enjuagando la columna con soluciones salinas lo que provoca que se libere la
proteína y se pueda recoger.

Figura 2. http://1.bp.blogspot.com/-Ru97JzAI1gU/VSNuGUJJJ6I/AAAAAAACG-
U/ZiJhZDNv3Ls/s1600/Cromatografia%2Bde%2Bintercambio%2Bionico.jpg
 Cromatografía de afinidad: Es la capacidad de la mayoría de las proteínas de unirse
específica y reversiblemente a compuestos llamados ligandos; una vez las proteínas se
hayan unido a las esferas de resina se usa una solución tampón para eliminar las moléculas
no unidas, posteriormente se usan soluciones tampón especiales para romper la unión de los
ligandos de las proteínas retenidas. Esta cromatografía suele emplearse en las fases finales
del proceso de purificación.

Figura 3. http://4.bp.blogspot.com/-YoiVbVvLR3I/VSNuaHbbRlI/AAAAAAACG-
c/Jyt_82_1eL8/s1600/Cromatografia%2Bde%2Bafinidad.jpg

 Cromatografía por interacción hidrófoba (HIC): Las proteínas se separan según se repulsión
al agua, las esferas de la columna están cubiertas de moléculas hidrofóbicas y los
aminoácidos hidrófobos de una proteína son atraídos a las sustancias similares de las
esferas.

 Enfoque isoeléctrico: este proceso se realiza para identificar dos proteínas que son difíciles
de separar por otros métodos. Cada proteína posee un número específico de aminoácidos
cargados en un lugar en específico; gracias a esto cada proteína tiene una firma conocida
como punto isoeléctrico (IEP), donde las cargas de la proteína se igualan al pH de la
solución.
 Figura 4. http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/IEF.png

 Electroforesis bidimensional: Separación de proteínas basado en su carga eléctrica y

tamaño. Se introduce una solución de proteínas celulares en una tira de polímero preparado,
cuando la tira de polímero se expone a una corriente eléctrica, cada proteína de la mezcla se
deposita en una capa según su carga, posteriormente la tira se alinea con un gel y se expone
nuevamente a la corriente eléctrica; al momento en que las proteínas migran a través del
gel, se separan de acuerdo con su peso molecular.

Métodos analíticos

 Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC): comparados con los métodos anteriores
que dependen de la gravedad o de bombas a muy baja presión para mover el extracto a
través de las columnas, pueden requerir de varias horas para procesar una sola muestra. En
cambio, este método utiliza mayores presiones para obligar al extracto a atravesar la
columna en menor tiempo; aún así tiene limitaciones donde las proteínas se van a separar
menos, por lo que es más efectivo para usos analíticos que en producción en masas.

 Espectrometría de masas: Es un método sensible para identificar oligoelementos; por lo

general se usa después de HPLC. Por lo general hacen tres procedimientos: suspender las
moléculas de la muestra en una fase de gas, separar las moléculas según su masa o carga, y
detectar los iones separados. Una importante aplicación de este proceso es la secuencia de
proteínas; una proteína grande puede ser descompuesta en péptidos y ser analizada.

2. Describa el procedimiento que aplicaría para purificar las proteínas de la espinaca

teniendo en cuenta los elementos que dispone en la escuela de química.

Para purificar las proteínas de la espinaca en la escuela de química se aplicaría el proceso de

electroforesis, ya que es un método efectivo para separar proteínas por medio de un campo
eléctrico, se sabe que cada proteína tiene una carga en específico por lo que facilita la separación
de los aminoácidos y tener así la purificación.

CONCLUSIONES

Se hizo una curva de calibración partiendo de los datos obtenidos de las soluciones patrón de
BSA, y con estos se pudieron hallar las concentraciones de proteínas presentes en cada muestra
biológica.

Se pudo obtener información cuantitativa en cada una de las muestras proteicas, la cual se logró
analizar con una curva de calibración, verificando la calidad de los diferentes métodos de
extracción y cuantificación.
Fue verificada la practicidad que caracteriza al ensayo de Bradford, debido a que las
absorbancias medidas mostraron un nivel bastante alto de precisión, manifestando que el
procedimiento es sencillo, eficaz y eficiente.

El método de Bradford presenta una complicación, la cual radica con la interferencia al momento
de realizar la cuantificación de proteínas que pueden ser los agentes desnaturalizantes que
precipitan a estas mismas, interfiriendo al momento de tomar la absorbancia.

Las absorbancias mayores a la máxima requerida pueden ser el resultado de la interacción de

otras sustancias químicas que interfieren en la muestra, debido a que el fotómetro identifica su
presencia en la misma longitud de onda que la proteína.

REFERENCIAS

[1]Bradford, Marion (1976). "A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding" (PDF). Analytical
Biochemistry. 72 (1–2): 248–254. doi:10.1006/abio.1976.9999. PMID 942051 – via Google
Scholar.

[2] Ninfa, Alexander J; Ballou, David P; Benore, Marilee (2008). Fundamental Laboratory

Approaches for Biochemistry and Biotechnology. Wiley. p. 113.

Abril 7 de 2015. Purificación y extracción de metabolitos de interés industrial y económico.

http://apuntesbiotecnologiageneral.blogspot.com/2015/04/purificacion-y-extraccion-de.html

Guía de laboratorio bioquímica. Práctica No. 4: Proteínas I: Extracción Y Cuantificación De

Proteínas.