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CAPTULO 2
Lavador de ELISA
Cdigo (s) ECRI

Cdigo (s) ECRI

17-489

Lavador de microplacas

LAVADOR DE ELISA
Est diseado para efectuar las operaciones de lavado que se requieren cuando se
utiliza la tcnica de ELISA. El equipo efecta el lavado de los pozos que contienen
las placas de ELISA, durante las diferentes
etapas de la tcnica.

podra llegar a intervenir por lo general entre

una y cuatro veces, suministrando buffer de
lavado, agitando y extrayendo, una vez cumplidos los tiempos programados, los compuestos que no participaron en las reacciones2. El lavador dispone de dos depsitos; en
uno de ellos, se coloca el buffer de lavado,
mientras que en el otro, se recolectan las sustancias que se desechan en la tcnica de ELISA.

FOTOGRAFA DE LAVADOR DE ELISA1

PRINCIPIOS DE OPERACIN
El lavador de ELISA ha sido diseado para
realizar las operaciones de lavado que se encuentran involucradas en la tcnica de ELISA.
El equipo dispone de al menos los siguientes
subsistemas que varan en diseo dependiendo del fabricante:

PROPSITO DEL LAVADOR DE ELISA

El lavador ha sido diseado para proporcionar, de forma controlada, los buffers de limpieza que se requieren al desarrollar un anlisis utilizando la tcnica de ELISA. Asimismo,
el equipo cumple la funcin de retirar de cada uno de los pozos las sustancias que no participaron en la reaccin. Dependiendo de las
variantes que presente la tcnica, el lavador

1
2
3

Subsistema de control. Por lo general, es

controlado por microprocesadores y permite
programar y controlar las actividades que debe realizar el lavador como el nmero de ciclos de lavado requeridos3 (1-5), los tiempos
de espera, las presiones de suministro y de extraccin, el tipo de placa utilizada (96 - 384
pozos); ajusta la funcin de succin segn la
forma del pozo4 fondo plano, fondo en V,
fondo redondo o tiras utilizadas; regula los
volmenes dispensados y/o aspirados, los
tiempos de remojo y agitacin, entre otros.
Subsistema de suministro. Por lo general, est compuesto por un depsito para la
solucin de lavado, una o varias bombas,
usualmente de desplazamiento positivo tipo jeringa y una cabeza dispensadora que

http://www.mtxlsi.com/images/FinstrumentsWasherFloat.jpg
Ver explicacin breve de la tcnica de ELISA en el captulo 1, Analizador de ELISA.
El nmero de operaciones de lavado requeridas depende exactamente de la tcnica que se utilice, aspecto que se encuentra explicado en las instrucciones de cada prueba que suministra el fabricante.
Si el fondo es plano, la aguja de succin es colocada muy cerca a una de las caras del pozo; si es redondeado o en V, se coloca la aguja de succin en el centro del pozo.

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suministra, a travs de agujas, la solucin

de lavado a los diferentes pozos. La cabeza
suele contar con ocho pares de agujas para
lavar y aspirar los pozos de una misma fila
de la placa de forma simultnea en la cabeza confluyen los subsistemas de suministro y
de extraccin. Tambin hay modelos que
disponen de doce pares de agujas y existen
versiones que efectan el proceso de lavado
de manera simultnea en todos los pozos de
la placa. Algunos lavadores brindan la posibilidad de trabajar con diversas soluciones
de limpieza, efectuando los cambios de solucin segn programe el operador.

nica aguja. Si se utilizan dos agujas, una se

usa para el suministro de la solucin de lavado
y la otra para la extraccin. Si se utilizan tres,
la primera es para el suministro de la solucin
de lavado, la segunda para la extraccin y la
tercera para controlar extraer cualquier exceso de volumen dentro del pozo.
En general la longitud de la aguja de extraccin es mayor que la longitud de la aguja de
suministro, con el fin de que pueda avanzar
verticalmente hasta una altura que oscila
entre 0,3 y 0,5 mm del fondo del pozo.

Subsistema de extraccin. Requiere de

un mecanismo de vaco y de un sistema de
almacenamiento para recolectar los fluidos
y desechos retirados de los pozos de las placas. El vaco puede ser proporcionado por
bombas externas o internas. La extraccin
se realiza mediante un conjunto de agujas
montadas en la cabeza lavadora/aspiradora. El nmero de agujas vara entre uno y
tres, segn el fabricante y el modelo.

Subsistema de avance. Est compuesto

por un mecanismo que desplaza horizontalmente la cabeza de suministro y extraccin, para poder llegar en la placa de ELISA a cada uno de los pozos; cuando se ha
efectuado el desplazamiento horizontal a
la siguiente fila, se realiza un movimiento
vertical hacia los pozos, con el fin de dispensar y/o extraer la solucin de lavado.
Hay lavadores que efectan estas operaciones de forma simultnea.

Si se usa una sola aguja, las operaciones de lavado y extraccin se hacen a travs de esta

Se presenta a continuacin una ilustracin en la

que se muestran los subsistemas mencionados.

Ilustracin 2: Lavador de ELISA

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Lavador de ELISA

La siguiente ilustracin muestra las formas de

pozo ms comunes encontradas en las placas

de ELISA. Cada forma de pozo es adecuada

para un tipo de prueba en particular.

Ilustracin 3: Perfiles de los pozos, tcnica de ELISA

Proceso de lavado
El lavado es una de las etapas que se debe realizar cuando se efectan anlisis, utilizando la
tcnica de ELISA. Se emplean para el efecto soluciones especiales. Entre las ms usadas se encuentra la solucin buffer fosfatada o PBS. La solucin buffer fosfatada tiene una estabilidad de
2 meses, si se la conserva a 4 C. Se estima que
para el lavado de una microplaca se requiere entre 1 y 3 litros de solucin. Se estima que en cada pozo se utilizan 300 l de solucin de lavado
por ciclo. El lavado es una operacin que se puede realizar manualmente, pero si se tienen demandas altas y si se trabaja con sustancias potencialmente contaminadas, es mejor utilizar un
equipo de lavado automatizado.

Aspiracin y dispensacin simultneas. En este tipo de lavado los sistemas

de lavado y aspiracin funcionan simultneamente, generando una turbulencia
controlada dentro del pozo que remueve
las sustancias no unidas durante los tiempos estimados de reaccin.
Aspiracin desde el fondo de los pozos. En este sistema, la aspiracin del
fluido contenido en los pozos se efecta
posicionando inicialmente las agujas de
aspiracin en una posicin muy cercana
al fondo, iniciando en seguida un ciclo de
succin que generalmente es controlado
por tiempo. Este sistema puede llegar a
aspirar aire si hay diferencias en los niveles de llenado de los tanques.

Entre los procesos de lavado se destacan los

siguientes:
Calibracin del lavador
Aspiracin de arriba hacia abajo. Cuando se inicia la fase de aspiracin, las agujas
se desplazan verticalmente y la aspiracin
se inicia de inmediato; estas entran en el lquido; el proceso contina hasta que las
agujas alcanzan la posicin mxima inferior, muy cerca del fondo de los pozos, momento en el que se detienen para evitar
succionar aire que fluira necesariamente
sobre las paredes laterales interiores de los
pozos. Este tipo de aspiracin previene
que corrientes de aire sequen la protena
unida sobre la superficie de los pozos.

El lavador de ELISA resulta crtico para garantizar que la tcnica de ELISA funciona de forma apropiada. Se presentan a continuacin
los lineamientos a tener en cuenta para que
el equipo funcione adecuadamente.
Posicin de las agujas (cabeza de suministro y aspiracin). Se debe verificar con
cuidado el ajuste de la posicin horizontal y
vertical respecto de los pozos. Si la placa tiene pozos de fondo plano, se debe verificar que
la aguja de aspiracin se encuentre ubicada

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muy cerca a la pared del pozo; si el fondo es

redondo o en V, se debe verificar que la
aguja de succin se encuentre en el centro
del pozo y, cuando se efecta el movimiento vertical, se mantenga una distancia aguja-fondo del pozo, comprendida entre 0,3 y
0,5 mm. Nunca se debe permitir que las
agujas toquen el fondo de los pozos, para
evitar interferencias de tipo mecnico entre
la punta de la aguja y el fondo del pozo durante la funcin de aspiracin.
Tiempo de aspiracin. Ajustar el tiempo
de aspiracin de forma que resulte adecuado, para que la pelcula de solucin adherida a la pared del pozo pueda fluir hasta el
fondo del mismo. Evitar tiempos demasiado
largos para impedir que se seque el recubrimiento de los pozos. Verificar que las agujas del sistema de succin se encuentren
limpias (libres de obstrucciones).
Volumen dispensado. Verificar que el volumen dispensado est lo ms cerca posible
del volumen mximo del pozo; confirmar
que todos los pozos se llenen de forma homognea al mismo nivel. Comprobar que
las agujas dispensadoras se encuentren limpias (libres de obstrucciones).
Vaco. El sistema de succin debe estar graduado de forma adecuada. Si el vaco es muy
alto, puede alterarse la prueba, pues podran
secarse los pozos y debilitar considerablemente la actividad de la enzima en los pozos,
alterando por completo el resultado de la
prueba. La mayora de los lavadores funcionan bien con un vaco que oscila entre el 60 y
70 % de la presin atmosfrica. En algunos
lavadores, el vaco se produce en una bomba
externa que opera como un accesorio del lavador y su operacin es controlada desde el
lavador, lo que implica que la bomba de vaco opera nicamente cuando se requiere.

de ELISA han desarrollado procedimientos que

deben ser efectuados de forma regular. Uno de
los controles5 se basa en la utilizacin del reactivo Peroxidasa, el cual se dispensa mediante
una pipeta en los pozos de la placa para ser ledo a 405, 450 y 492 nm. En seguida los pozos
se lavan y se les aade un sustrato incoloro
(TMB/H2O2 - Tetrametilbenzidina/Perxido
de hidrgeno). Cualquier residuo conjugado
hidrolizar la enzima y el cromgeno cambiar a color azul. Despus de detener la
reaccin con cido, el TMB se vuelve amarillo. La intensidad del color resultante est
directamente relacionada con la eficiencia
del proceso de lavado.

SERVICIOS REQUERIDOS
Para que el lavador de ELISA opere correctamente, se necesita disponer de los siguientes
servicios:
1. Un ambiente limpio, libre de polvo.
2. Una mesa de trabajo estable. Se aconseja
que la misma est alejada de equipos que
generen vibraciones centrfugas, agitadores, que tenga un tamao adecuado para
que permita ubicar, al lado del lavador de
ELISA, los equipos complementarios requeridos para efectuar la tcnica en mencin: analizador, incubadora, dispensador
y computador con perifricos.
3. Una toma elctrica con polo a tierra en
buen estado, conectada a una acometida
que cumpla con las normas y estndares
elctricos implementados en el pas o el laboratorio. En los pases americanos se utilizan generalmente voltajes de 110 V y frecuencias de 60 Hz.

RUTINAS DE MANTENIMIENTO
Verificacin del proceso de lavado
Para verificar si el proceso de lavado se realiza
de acuerdo con las especificaciones exigidas por
la tcnica de ELISA, los fabricantes de pruebas

Las rutinas que se describen a continuacin estn enfocadas exclusivamente al lavador de

ELISA. El mantenimiento del analizador de ELISA est tratado en el captulo correspondiente.

Procedimiento desarrollado por PANBIO, ELISA Check Plus, Cat. N E-ECP01T.

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Lavador de ELISA

Mantenimiento bsico
Frecuencia: Diaria

Mantenimiento preventivo
Frecuencia: Trimestral

1. Verificar el volumen dispensado.

1. Desensamblar y limpiar los conductos y conectores. Verificar la integridad de los mismos. Si de detectan fugas o vestigios de
corrosin, ajustar y/o reemplazar.

2. Comprobar la uniformidad del llenado.

3. Verificar la eficiencia del subsistema de
aspiracin.
4. Confirmar la limpieza de las agujas de suministro y extraccin.
5. Limpiar el lavador con agua destilada despus de haberlo utilizado, para remover
cualquier vestigio de sal en los conductos
de los subsistemas de suministro y extraccin. Las agujas pueden mantenerse sumergidas en agua destilada.
6. Verificar la limpieza del cuerpo del lavador. Si es del caso, limpiar las superficies
exteriores con una pieza de tela humedecida, con un detergente suave.

2. Verificar la integridad de los componentes

mecnicos. Lubricar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Comprobar el ajuste de cada uno de los
subsistemas. Calibrar de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
4. Confirmar la integridad del conector elctrico y el cable de interconexin.
5. Verificar la integridad del fusible, y que sus
puntos de contacto estn limpios.
Nota: Personal tcnico debidamente capacitado debe realizar el mantenimiento
de sistema de control. Si se requiere, debe
llamarse al fabricante o representante.

Tabla de solucin de problemas

PROBLEMA

CAUSA PROBABLE

REMEDIO

Al terminar el lavado quedan residuos El sistema de extraccin del lavador Verificar si el sistema de vaco funciona a la
presenta fallas.
presin adecuada.
de la solucin utilizada en los pozos.
Los conductos del sistema de vaco son Comprobar el dimetro de los conductos que
de dimetro diferente al recomendado. recomienda el fabricante.
La lnea de succin presenta obstruc- Verificar que las lneas de vaco se encuentren
ciones.
limpias.
El recipiente para almacenar el desper- Confirmar el nivel del recipiente de desperdicio.
dicio se encuentra lleno.
El filtro de la lnea se encuentra hme- Verificar el estado e integridad del filtro del sisdo o bloqueado.
tema de succin.
La punta de la pipeta no est colocada Examinar la colocacin de las puntas en la
y no llega hasta el fondo de los pozos. pipeta.
Se utiliz una microplaca diferente en Verificar el tipo de placa que requiere el ensayo.
el ensayo.
El lavador no ha sido purgado adecua- Revisar el proceso de purga.
damente.
El operador no ha seguido las instruc- Examinar el proceso recomendado por el faciones del fabricante correctamente.
bricante. Efectuar los ajustes requeridos.
Se coloc la placa en el lavador, sin la Revisar la colocacin de la placa en el lavador.
alineacin correcta.

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PROBLEMA

CAUSA PROBABLE

REMEDIO

El ciclo de lavado se desarrolla de for- Se agot la reserva de la solucin de Examinar el recipiente de almacenamiento de
lavado.
la solucin de limpieza. Reponer el volumen
ma inadecuada.
faltante.
El lavador no fue purgado adecuada- Limpiar adecuadamente para homogeneizar
mente al inicio del ciclo de trabajo.
la humedad en cada uno de sus componentes
y que se eliminen las burbujas de aire.
El volumen dispensado de solucin de la- Verificar los volmenes de solucin requeridos
vado ha sido programado errneamente. para cada tipo de prueba y cada tipo de placa.
La placa fue colocada de forma inco- Comprobar la correcta instalacin de la placa
rrecta en el lavador.
en el lavador.
La altura de trabajo fue mal seleccionada. Revisar la altura de trabajo recomendada para cada tipo de placa.
Las placas utilizadas son diferentes a Verificar que las placas utilizadas sean comlas recomendadas por el fabricante.
pletamente compatibles con el lavador.
No se mantienen los niveles de fluido
adecuado en los pozos.
El tubo de suministro de la solucin de Revisar las especificaciones del fabricante. Colavado no es del dimetro ni del espe- rregir si es del caso.
sor definido por el fabricante.
La presin es insuficiente para entregar Revisar el sistema de suministro y los conducla cantidad adecuada de solucin de tos de suministro. Puede haber una obstruclavado.
cin en la lnea de llenado.
El recipiente de lavado presenta creci- El sistema no se usa frecuentemente.
miento de hongos o bacterias.
No se utiliza un procedimiento de con- Revisar los procedimientos usados para impetrol adecuado (desinfeccin).
dir el crecimiento de hongos o bacterias.
Los tubos y conectores no se cambian Verificar la frecuencia de cambio sugerida por
con la frecuencia requerida.
el fabricante y/o por el departamento tcnico.
La solucin de lavado se ha contaminado. Confirmar los procedimientos utilizados en la
preparacin y manejo de la solucin de lavado, a fin de determinar la causa de la contaminacin y eliminarla.
No se ha efectuado el mantenimiento Revisar las fechas previstas para efectuar el
de acuerdo a la programacin.
mantenimiento. Informar a los responsables.

DEFINICIONES BSICAS
Bomba de desplazamiento positivo. Dispositivo conformado por un mbolo que se
desplaza a lo largo de un cilindro. El mecanismo es similar al que presenta una jeringa. Est dotado de un conjunto de vlvulas para
controlar los flujos hacia y desde la bomba.
Buffer. Solucin que mantiene un valor constante y conocido de pH a una temperatura
dada.
PBS. Una de las soluciones que se utiliza para efectuar las operaciones de lavado en las

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pruebas de ELISA. PBS es el acrnimo de

Phosphate Buffer Solution. Est compuesto
por las siguientes sustancias: NaCl, KCl, NaHPO42H2O y KH2SO4. Las casas productoras suministran los boletines tcnicos que indican
las proporciones e instrucciones de cmo prepararse. En general se mezcla una parte de
PBS, con 19 partes de agua desionizada.
Placa (de ELISA). Dispositivo de dimensiones
estandarizadas diseado para colocar las muestras que requieren ser analizadas mediante la
tcnica de ELISA. En general existen disposiciones de 96, 384 y 1 536 pozos. Se fabrican en
plsticos como poliestireno y polipropileno.

Lavador de ELISA

Existen tambin placas que han recibido tratamientos especiales para facilitar la realizacin de pruebas.

TMB/H2O2. (Tetrametilbenzidina/Perxido de
hidrgeno). Reactivo que se emplea para verificar la calidad del lavado de los pozos utilizados en la tcnica ELISA.

Bibliografa
ELISA Check Plus, Panbio, Cat. N E-ECP01T, Brisbane, 2004.
(http://www.panbio.com.au/prodinfo/E-ECP01T.pdf)
Good technique for ELISA Assay, GTI, Inc.
(http://www.gtidiagnostics.com/forms %26docs/good_elisa_techniques_062304.pdf)
Solid Phase Guide, NUNC, Brand Products, Introduction to Solid Phase Techniques.
(http://www.nuncbrand.com/PDF/Guides%20and%20Manuals/Guide%20to%20Solid%20Phase.pdf)
Universal Medical Device Nomenclature System (UMDNS), Product Categories Thesaurus,
ECRI, 5200 Butler Pike, Plymouth Meeting, PA, USA, 2000.
Zoon, Kathryn, Recommendations to users of medical devices that test for infectious disease markers by enzyme immunoassay (EIA) test systems, Division of Blood Applications, Bethesda, MD. (http://www.fda.gov/cber/bldmem /122094.txt)

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