2010

OBTENCIÓN DE BIODIESEL POR VÍA

ENZIMÁTICA A PARTIR DE UN ACEITE
MODELO DE MICROALGAS EN MEDIOS
NO CONVENCIONALES
 Investigadores Principales

Dra. Lourdes Calvo Garrido

Profesora Titular
Dr. Miguel Ladero Galán
Profesor Titular
Departamento de Ingeniería Química
Universidad Complutense de Madrid

Esta investigación ha sido financiada por Fundacion mapfre en la Convocatoria Ayuda a la Investigación 2010.
Índice

Página
1. Resumen 4
2. Introducción 4
3. Objeto y alcance 7
4. Materiales y Metodología 8
4.1. Reactivos 8
4.2. Catalizador 8
4.3. Métodos de síntesis de biodiesel 8
4.3.1. Síntesis de FAMEs en ausencia de codisolventes 8
4.3.2. Síntesis de FAMEs con CO2 supercrítico como codisolvente 9
4.4. Métodos de análisis químico 10
4.4.1. Resonancia magnético nuclear de protón ( H-RMN)
1
10
4.4.2. Análisis por cromatografía líquida de alta resolución (RP-HPLC) 10
5. Resultados y Discusión 10
5.1. Optimización para síntesis sin codisolventes 10
5.2. Síntesis con CO2 supercrítico como codisolvente 12
6. Conclusiones 14
7. Referencias Bibliográficas 14
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1. Resumen procuren de forma cíclica y renovable la energía necesaria

para la Humanidad, reduciendo al mismo tiempo las pér-
En este trabajo se muestra la producción de biodiesel a didas de energía. El potencial es considerable: la Tierra
partir de aceite de microalga, obtenido por catálisis enzi- recibe del sol 10000 veces más energía que la utilizada
mática. Para preservar la actividad de las enzimas (Novo- anualmente en todo el planeta. La energía potencial pro-
zym 435 y Lipozyme TLIM), se reduce el metanol a una cedente de biomasa cada año asciende al triple del con-
relación molar 1:1 respecto a aceite y se trabaja con pro- sumo energético mundial, mientras que la energía anual
porciones elevadas de acetato de metilo. Es éste, pues, el procedente de vientos y olas es veinte veces mayor. Las
principal agente metilante y el que desplaza los equilibrios fuentes geotérmicas podrían proveer de sesenta veces
químicos hacia la producción de biodiesel. Los procesos más energía que la necesaria cada año a nivel mundial
de síntesis se han llevado a cabo en ausencia y en pre- (Figura 1). Por otra parte, el margen de optimización del
sencia de CO2 supercrítico, analizando las muestras con aprovechamiento energético es considerable y se puede
RMN de protón y por HPLC de fase reversa. Se ha deter- abordar a través de nuevos ciclos termodinámicos (pilas
minado que es especialmente relevante la necesidad de de combustible) y de nuevos sistemas de transporte y de
utilizar las dos enzimas conjuntamente para lograr la mejor almacenamiento de energía, en especial eléctrica.
actividad. También se obtiene mejor rendimiento (80% en
24 horas) cuanto mayor es el exceso de agentes metilan-
tes y en el intervalo 40-50ºC. En condiciones supercríticas
se ha comprobado como la dilución apenas afecta a la
actividad de las lipasas y, por tanto, a la productividad de
los metilésteres, probablemente debido a la ausencia de
restricciones difusionales en este sistema.

Palabras clave
Microalga, catálisis enzimática, biodiesel, acetato de me-
tilo, CO2 supercrítico.

2. Introducción
Según el informe sobre tendencias futuras “Energy Out-
look 2030” de la compañía petrolera británica BP, para
2015, el producto interior bruto OCDE será igual al de la
suma de los países no pertenecientes a la OCDE, con
especial influencia de China y la India. Para entonces,
estos países serán los principales consumidores de ener-
gía y, en consecuencia, los principales emisores de CO2.
Figura 1. El sol como fuente de energía. Fósil, ayer, y renovable, hoy.
Por otra parte, en ellos vivirán seis veces más personas
que en los países de la OCDE [1].
Las reservas de petróleo actuales están mermándose, La aportación de las fuentes de energía renovable
con la previsión de que las reservas seguras (ya en explo- (FER) a la producción y consumo de energía primaria es,
tación o explotables con un 90% de certeza) no puedan año a año, cada vez más considerable. En la generación
atender la demanda mundial por un periodo superior al del de energía eléctrica en el 2009, en España, se emplearon
siglo que ya ha entrado. Sin embargo, la percepción de estas fuentes en un 24%, con una especial incidencia de
esta realidad está más ligada al llamado pico de produc- la energía eólica (un 12,4 %) y de la hidráulica (un 9% del
ción o pico de Hubbert, que pasa a ser un índice de ca- total). La Unión Europea, a través de la directiva 2009/28/
restía de petróleo al sumarse a la tendencia actual de CE, quiere profundizar en la diversificación en la genera-
mayor demanda de crudo. Este pico, según la fuente que ción energética, de tal forma que las FER supongan el
se consulte, se habría alcanzado o se alcanzará en una 20% de la energía primaria producida para 2020 y el 10%
fecha próxima (2037, según las previsiones más optimis- de la energía gastada en el sector de transporte. En Es-
tas) [2]. Palabras como eficiencia energética, fuentes de paña, el Instituto para la Diversificación y Ahorro Energé-
energía renovables, sostenibilidad, intensificación de pro- tico (IDAE) ha presentado el Plan de Acción Nacional de
cesos, diversificación energética… no proceden de una Energías Renovables (PANER) 2011-2020, desarrollando
moda pasajera: son síntoma de un cambio de ciclo, una la Directiva europea antes mencionada. Para alcanzar los
percepción de que el uso intensivo y lineal de la energía, objetivos finales de dicha directiva, el PANER sugiere una
sin reposición, no es aceptable ni es realista a medio evolución de producción y consumo de energía bruta que
plazo. Es hora de dar paso a nuevas tecnologías que suponga una participación de fuentes renovables del 40%
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de la electricidad producida en 2020, así como un 13,6% res sólidos, son la base de nuevas posibilidades tecnoló-
de incidencia de dichas fuentes en la energía consumida gicas para la obtención de biodiesel y bioetanol basada
en transporte, y un 18,6% de incidencia de dichas fuentes en la utilización térmica y catalítica del material lignocelu-
en el sector de calefacción y refrigeración (Objetivo global: lósico y microbiano, sin competir por suelo necesario para
22,7% de la energía primaria producida debe ser de fuen- la producción de alimentos (Figura 2). Así se están
tes renovables). En el sector de transportes el consumo de creando paulatinamente nuevos biocarburantes de se-
energía FER pasaría de 1802 a 3885 ktep (de las que 252 gunda, tercera e, incluso, cuarta generación. Estos últimos
ktep deberían producirse a partir de biocarburantes, con se basan en la utilización de árboles y microalgas modifi-
un aumento de su incidencia del 500% respecto a la situa- cadas genéticamente y también estarían orientados a la
ción actual) [3]. En la Unión Europea y dentro del séptimo captura de dióxido de carbono con una efectividad entre
Programa Marco de Investigación, Desarrollo y Evaluación un 30 y un 40% mayor que las especies actuales. La se-
(FP7), se dedican más de 10.000 millones de euros a lección de la materia prima, del tratamiento térmico y ca-
áreas como energía, transporte, medio ambiente y biotec- talítico, y de los procesos de purificación es vital, junto con
nología, incidiendo los proyectos aprobados en este último la subida de los precios del barril de crudo, para que en
campo en la obtención de biomasa mejorada para la pro- algún momento los biocarburantes tengan viabilidad eco-
ducción de energía, preferentemente [4]. nómica “per se”, en ausencia de ayudas fiscales. En estas
En los últimos años, a pesar de los miles de millones primeras décadas de desarrollo tecnológico, sin embargo,
de euros invertidos en plantas basadas en biocarburantes solo un fuerte impulso económico y una fiscalidad ade-
de primera generación, la materia prima más interesante cuada pueden ayudar a la implantación de este tipo de
para obtener bioetanol y biodiesel, los principales biocar- combustibles [9].
burantes, ya no es el maíz, la colza, la soja y otras plantas Las principales ventajas ambientales de la utilización
de uso alimentario, sino cultivos agroenergéticos de arbus- de biocombustibles se basan en que su producción ayuda
tos (jatropa, ricino y otros), árboles modificados para un a cerrar el ciclo de carbono al utilizar CO2 y luz para pro-
rápido crecimiento (álamos, eucaliptos, etc.) y crecimiento ducir la materia prima de partida. En el caso de las mi-
de biomasa microbiana (en especial, por su alto contenido croalgas, esto es especialmente cierto, ya que podrían
en lípidos, las microalgas) [5-8]. Estos cultivos, junto con utilizarse para captar el dióxido de carbono de plantas de
tecnologías térmicas y catalíticas basadas en catalizado- producción de energía o de consumo intensivo de la

Figura 2. Resumen de procesos de movilización y uso energético de biomasa.

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misma. Además, al crecer hasta densidades celulares truido en Sete (160.000 tm biodiesel/año) y está constru-
muy altas (>200 g/L) con contenidos lipídicos medios a yendo plantas para la empresa Diester en Francia basa-
altos (un 40-50% de la biomasa seca) en un volumen y no das en catálisis heterogénea, en concreto en el proceso
en superficie, su uso del espacio es muy notable y la pro- comercializado por Axens (Axens Esterfip H). Este pro-
ductividad posible extraordinaria comparada con las me- ceso fue desarrollado en primer lugar en el Instituto Fran-
jores plantas oleaginosas (>20 veces más que la palma). cés del Petróleo y está basado en el uso de un óxido
Tanto es así que varias previsiones de la evolución del mixto de dos metales no nobles. Un resultado, por citar
mercado energético pronostican un crecimiento exponen- una característica notable, es que la glicerina que se
cial tanto del bioalcohol como del biodiesel de microalgas, obtiene a salida del reactor tiene un 98% de pureza, en
siendo estos los principales biocombustibles que se prevé lugar del 80% que es habitual en los procesos basados
dominen el mercado para 2040. Los principales proble- en catálisis homogénea. Este tipo de plantas son más
mas que limitan hoy en día su viabilidad económica están simples (menos unidades de purificación) y más renta-
asociados a la eliminación de agua y a la extracción es- bles que las plantas basadas en catalizadores homogé-
pecífica de los triglicéridos, por una parte, y a la necesi- neos, según varios estudios de simulación de procesos
dad de una alta productividad de triglicéridos con un per- y estimación económica y la experiencia acumulada en
fil de ácidos grasos adecuados, por otra parte [10, 11]. los últimos cuatro años [13-16].
Hoy en día la mayor parte de las plantas de produc- Una línea de trabajo propia de la biorrefinería biotec-
ción de biocarburantes (bioetanol y biodiesel, sobre todo) nológica es la basada en catálisis enzimática. En reali-
se basan en el empleo de procesos clásicos y bien cono- dad, no es muy novedosa en cuanto a que las lipasas se
cidos en industria alimentaria. En el caso del bioetanol, la conocen y se aplican como enzimas sintéticas (cataliza-
sacarificación se hace por vía enzimática, con amilasas y dores para síntesis orgánica) desde principios de los
enzimas similares que actúan sobre el almidón, y por vía años noventa [17]. No obstante, desde 2004-2005, se
ácida. La glucosa obtenida es empleada en fermentacio- han desarrollado nuevas estrategias que permiten supe-
nes con levaduras del género Saccharomyces para obte- rar el principal escollo en la aplicación de lipasas como
ner soluciones acuosas de etanol que son tratadas por Novozym 435, Lypozyme RMIM o Lypozyme TLIM: su
destilación para obtener el bioetanol. La utilización de bio- estabilidad en proceso, que se ha extendido de horas a
masa lignocelulósica para bioetanol de segunda genera- meses, mediante la utilización de cosolventes y agentes
ción supondrá el empleo de nuevos procesos térmicos, acilantes estabilizantes [18, 19]. Algunos trabajos actua-
ácidos y enzimáticos (empleándose xilanasas, lacasas y les se centran en la utilización de nuevas enzimas de
celulasas en este último caso) [7]. Para obtener biodiesel Novozymes (el proyecto es una colaboración entre el
de primera generación se suelen usar catalizadores áci- grupo del profesor J.M. Woodley y Novozymes A/S) en
dos para tratar los ácidos grasos libres, y catalizadores un sistema de dos reactores en tándem, uno de ellos
básicos (como sosa y potasa) para transesterificar los para transesterificación del aceite, otro para esterifica-
aceites con metanol y etanol, preferentemente, obtenién- ción de ácidos grasos que pueda haber en la materia
dose metil- o etilésteres de los ácidos grasos, respectiva- prima. Este grupo de trabajo ha demostrado que la utili-
mente, y glicerina como subproducto. El uso de cataliza- zación del soporte adecuado para la lipasa de Ther-
dores homogéneos, que se disuelven en la mezcla líquida momyces lanuginosus da lugar a la mejora del tiempo de
en reacción, supone la presencia de reacciones laterales reacción de 24 a 6 horas, al evitar la acumulación de
y la producción de jabones. Tras la recuperación del alco- glicerina en las proximidades de la enzima. Así, se puede
hol empleado, por destilación, se necesita un tren de la- ir mejorando la actividad de las lipasas hasta alcanzar la
vado exhaustivo con gran gasto de agua que permita la de catalizadores heterogéneos como los óxidos mixtos
obtención de un biodiesel que cumpla normativa (DIN antes mencionados, especialmente si se optimizan las
E51106 en Europa y ASTM D-6751-3 en Estados Unidos) condiciones de trabajo [19-21].
y de una glicerina grado farmacéutico o USP apta para los También se están probando tecnologías basadas en
usos que tiene ahora este poliol en el mercado (cosmética, el uso de fluidos supercríticos. Si se alcanzan condiciones
farmacéutica, química fina, etc.) [12]. de operación superiores al punto crítico del alcohol que
Frente al proceso habitual de catálisis homogénea actúa como agente acilante (241 ºC y 60,6 atm para el
con hidróxidos o alcóxidos, desde finales de los años etanol y 240ºC y 79,8 atm para el metanol), la transesteri-
noventa se han investigado y desarrollado nuevas posi- ficación transcurre en apenas unos minutos hasta conver-
bilidades: catálisis heterogénea basada en alcóxidos al- siones superiores al 99% a biodiesel [22]. Sin embargo, su
calinotérreos y en óxidos mixtos, catálisis enzimática con viabilidad económica está lastrada por la necesidad de
lipasas inmovilizadas (heterogénea, por tanto) y procesos grandes cantidades de agente metilante (relaciones mola-
térmicos en estado supercrítico. En lo relativo a la catáli- res mayores a 40:1 respecto al aceite) y por las altas
sis heterogénea clásica se pueden emplear resinas áci- presiones y temperaturas requeridas, que suponen un
das para la esterificación de los ácidos grasos presentes coste considerable de operación y de inversión inicial en
en aceites de fritura y aceites de baja calidad, seguidas equipos [23]. Este problema se puede reducir conside-
de catalizadores básicos soportados o másicos. En la rando la utilización de dióxido de carbono supercrítico
actualidad, la empresa de ingeniería Technip ha cons- (CO2SC) cuyas propiedades críticas son más moderadas
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(31 ºC y 74 atmósferas) y su efecto estabilizador es similar tida la microalga Chlorella protothecoides, porque heteró-
al del hexano o al del acetato de metilo. En la Tabla 1 se trofamente, este microorganismo es capaz de asimilar
muestran resultados obtenidos por varios autores con carbono orgánico (por ejemplo de residuos) sintetizando
aceites de primera y segunda generación en este medio rápidamente un gran contenido de lípidos (hasta un 55%
[24-29]. Se puede observar que la selección adecuada de en peso).
enzimas y otras condiciones de operación lleva a conver- Este estudio se centra en la síntesis de metilésteres de
siones elevadas en condiciones de reacción moderadas ácidos grasos (biodiesel) a partir del aceite sintetizado por
(45 ºC y 130 atmósferas) a tiempos de operación similares esta microalga utilizando lipasas inmovilizadas como cata-
a los requeridos para catalizadores heterogéneos básicos lizador y acetato de metilo como principal agente metilante
[27]. Desde el punto de vista técnico, existen otras venta- debido a su poder estabilizador de la enzima, combinado
jas de interés en el uso de este codisolvente supercrítico: con una pequeña proporción de metanol, que actúa como
no se afecta por la presencia de agua, reduce la viscosi- activador especialmente en el ataque a los diglicéridos.
dad de la mezcla de reacción, no deja residuo en los Esta posibilidad ya se probó en el estudio de Talukder y
productos obtenidos y el proceso se puede simplificar col., donde se obtuvieron buenos resultados con dicho
puesto que la separación posterior del biodiesel se puede sistema, alcanzando rendimientos del 95 % en biodiesel
realizar mediante manipulaciones en las condiciones de [19].
operación. El estudio se hace en dos sistemas de producción
alternativos. Primero en exceso de acetato de metilo que
actuaría además de cómo reactivo como disolvente y
3. Objeto y alcance luego en presencia de CO2SC como codisolvente. El es-
quema de la reacción se muestra en la Figura 3. La reac-
En el Departamento de Ingeniería Química de la Universi- ción que se produce entre el aceite y el acetato de metilo
dad Complutense de Madrid se ha comenzado a investi- es de interesterificación y además de biodiesel, se pro-
gar un proceso para la síntesis de biocombustibles alter- duce triacetín. Este compuesto es un excelente aditivo
nativo a los actuales, que resuelve las principales para el biodiesel pues mejora su comportamiento en frío.
limitaciones de los mismos. El proceso utiliza como gene- Por tanto, no es necesaria su eliminación completa en el
radora de biomasa para la producción del aceite de par- producto final.

Tabla 1. Resumen de resultados obtenidos utilizando CO2 supercrítico y enzimas como catalizadores.

Relación molar
Agente Relación peso P T Tiempo Conversión
Materia prima Enzima agente
acilante enzima/aceite [bar] [°C] [h] [%]
acilante/aceite
Aceite mostaza metanol 70
Aceite mostaza etanol 68
Novozym 435 10 mg enzima 3:1 100 50 24
Aceite sésamo metanol 55
Aceite sésamo etanol 49
metanol 68 inicial 23
Aceite de girasol Novozym 435 30% peso 5:1 45 6
etanol >73,8 reacción 27
Aceite de oliva 65,18
Aceite de soja 58,95
Aceite de colza metanol Lipasa B Candida antartica 20% peso 3:1 130 45 6 61
Aceite de girasol 50
Aceite de palma 60
Lipasa Candida rugosa
Aceite de soja metanol Lipasa Rhizopus oryzae 20% peso 4:1 130 45 3 99,13
Relación peso 1:1
metanol Novozym 435 20% peso 5:1 68 inicial 50 12 45
Aceite de ricino
etanol 45 38
metanol 51
Aceite de palma
etanol 69
Aceite de metanol 45
cacahuete etanol 58
Novozym 435 30% peso 5:1 68 inicial 45 8
metanol 38
Pongamia pinnata
etanol 42
metanol 38
Jatropha curcas
etanol 41
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Figura 3. Esquema de la reacción de síntesis de biodiesel cuando se emplea acetato de metilo como agente metilante.

Los objetivos concretos del estudio son: RM IM), se consiguen velocidades mayores cuando se
1) Optimizar las condiciones de trabajo para operar trabaja con Novozym 435. Como contrapartida, el rendi-
con máxima concentración de reactivos y cataliza- miento a FAMEs es menor. Por tanto, se propone utilizar
dor. una mezcla de enzimas, amablemente donadas por Novo-
2) Llevar a cabo experimentos de síntesis en condi- zymes A/S: Novozym 435 y Lipozyme TL IM, aprove-
ciones similares para un sistema que utiliza dióxido chando así las ventajas de cada una de ellas.
de carbono supercrítico, con vistas a su utilización
en continuo.
4.3. Métodos de síntesis de biodiesel
4.3.1. Síntesis de FAMEs en ausencia de codisolventes
4. Materiales y Métodología Las reacciones se llevan a cabo en matraces redondos de
250 ml de capacidad que sirven de reactores disconti-
4.1. Reactivos nuos. Estos matraces se colocan en un StarFish TM, que
tiene como base una placa agitadora y calefactora. El
El aceite de interés es el producido por la microalga Chlo-
equipo tiene capacidad para albergar hasta cinco matra-
rella protothecoides. Sin embargo, dada su enorme similitud
ces (Figura 4a). Los ensayos se realizan a 600 r.p.m. de
con el aceite de oliva variedad arbequina (Tabla 2), éste se
velocidad de agitación, por ser la máxima velocidad que
utiliza como aceite modelo en los experimentos [30, 31].
el sistema permite antes de desestabilizarse. En cuanto al
Como agentes metilantes se usan acetato de metilo (pureza
imán, se utiliza uno en cruz, ya que se ha visto que es el
del 99 %) de Acros Organics y metanol, procedente de la
adecuado para reducir problemas de abrasión. Con el fin
casa Sigma – Aldrich, (pureza del 99,9 %).
de evitar pérdidas por evaporación de los agentes meti-
Tabla 2. Composición de los aceites del microalga Chlorella proto- lantes, a cada matraz se le acopla un refrigerante Dimroth.
tecoides y de oliva variedad arbequina. La toma de muestra se debe realizar con aguja de preci-
Aceite de oliva
Aceite de Chlorella
sión por una boca lateral a través de un “septum”.
Ácido graso (variedad arbequina) Se preparan las cantidades necesarias de aceite y de
protothecoides [31]
[30]
agentes metilantes (acetato de metilo, metanol). Como se
Palmítico (C16:0) 14,10 ± 1,10 12,94 estudia la influencia de la cantidad de agente metilante y
Palmitoleico (C16:1) 1,77 ± 0,57 – el porcentaje de enzimas, las cantidades de los reactivos
Margárico (C17:0) 0,11 ± 0,03 – y enzimas cambian según el experimento que se lleve a
cabo. Sin embargo, todos los ensayos se realizan teniendo
Margaroleico (C17:1) 0,26 ± 0,04 –
en cuenta que el volumen final de reacción es el corres-
Esteárico (C18:0) 1,74 ± 0,18 2,76 pondiente a 50 ml de reactivos.
Oleico (C18:1) 68,90 ± 3,30 60,84 A continuación, se conecta el equipo, fijando la tem-
Linoleico (C18:2) 11,60 ± 1,80 17,28 peratura deseada. Cuando el sistema ha alcanzado la
temperatura de reacción, se incorporan los reactivos al
Linolénico (C18:3) 0,61 ± 0,07 0,00 matraz redondo que actúa como reactor discontinuo, y
Araquídico (C20:0) 0,37 ± 0,02 – éste se coloca en la placa. Se dejan transcurrir 10 minu-
Gadoleico (C20:1) 0,31 ± 0,02 – tos para asegurar que los reactivos hayan alcanzado
esta misma temperatura. En ese momento, se añaden
Behénico (C22:0) 0,12 ± 0,01 –
las enzimas y comienza a contabilizarse el tiempo de
Lignocérico (C24:0) 0,03 ± 0,00 0,00 reacción.
Durante la primera hora se toman tres muestras de 1
ml. Los tiempos a los que se cogen son: 15, 30 y 60 mi-
4.2. Catalizador
nutos. Transcurridas 20 horas, se vuelve a tomar muestra,
Según la literatura consultada, de los tres tipos de enzimas también de 1 ml. La última muestra corresponde a un
más utilizadas (Novozym 435, Lipozyme TL IM y Lipozyme tiempo total de 24 horas. La razón de tomar un mayor
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a)

PI
b)

Camisa calefactora
TI

Reactor PI Válvula
despresurización
TIC
Salida CO2
-10 ºC 300 bar

Disco de ruptura
Agitación magnética Vial recogida muestra

Baño refrigeración
CO2 Bomba

Figura 4. Esquemas de los equipos de síntesis empleados: a) en ausencia de disolventes y b) usando CO2 supercrítico como disolvente.

número de muestras al inicio de la reacción se debe a tor. Se utiliza una placa agitadora (Elmulab LTD) con agi-
que, precisamente, es en ese momento cuando más rá- tación controlada a 1500 rpm para mover el imán. En pri-
pido transcurre la reacción, por lo que de esta manera se mer lugar, se abre el paso de CO2 y se hace una primera
facilita el seguimiento de la misma. Todas estas muestras presurización hasta la presión de botella (aproximada-
son tomadas por la parte superior del reactor utilizando mente 50 bar). Se coloca la camisa calefactora y se inicia
una aguja de precisión. Una vez que se ha tomado la úl- el incremento de temperatura hasta las condiciones de
tima muestra, se apaga el equipo y se limpian los Erlen- operación de 40 °C. Una vez que la temperatura se esta-
meyer con acetona. biliza (±2 °C) se bombea CO2 con una bomba Jasco 2080
Plus hasta que el reactor alcanza la presión de 250 bar.
La reacción transcurre en estas condiciones durante un
4.3.2. Síntesis de FAMEs con CO2 supercrítico como tiempo preestablecido: algunos minutos para los experi-
codisolvente mentos a tiempo cero y 24 horas para los experimentos de
La reacción tiene lugar en un reactor tubular de acero síntesis.
inoxidable 316 de 20 mL de volumen que opera en discon- Una vez terminada cada reacción, se comienza lenta-
tinuo (Figura 4b). El aceite, el acetato de metilo y el meta- mente la despresurización. Los productos arrastrados du-
nol se introducen en el reactor con la ayuda de una jerin- rante la despresurización se recogen en un vial a la salida
guilla y sobre ellos se añaden las enzimas. Se introduce de la conducción de escape de gases para posterior aná-
también un agitador en forma de cruz y se cierra el reac- lisis.
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4.4. Métodos de análisis químico y agua milliQ. Se inicia el método de análisis empleando
un 90 % de acetonitrilo y un 10 % de agua milliQ. A tiempo
4.4.1. Resonancia magnético nuclear de protón
15 min, el eluyente está constituido en un 100 % por ace-
(1H-RMN)
tonitrilo, y esta composición se mantiene hasta los 20 min.
Previamente al análisis de las muestras se procede a
Posteriormente, de 20 min a 30 min, el disolvente alcanza
la eliminación del agente metilante residual, ya que inter-
progresivamente una composición del 50 % de acetonitrilo
fiere con los metilésteres de los ácidos grasos (FAMEs)
y el otro 50 % de la mezcla de isopropanol y hexano. Estas
que constituyen el biodiesel. Esta operación se lleva a
concentraciones se mantienen constantes hasta los 50
cabo por arrastre mediante un chorro de aire que incide
min. De 50 min a 60 min, se va alcanzando una composi-
sobre la superficie líquida de la muestra. El tiempo de
ción del 90 % de acetonitrilo y del 10 % de la mezcla. Por
operación es función del grado de conversión del aceite
último, de 60 min a 70 min, el eluyente está formado por
ya que, a medida que el aceite reacciona, disminuye la
un 90 % de acetonitrilo y un 10 % de agua milliQ. El cau-
cantidad de acetato de metilo y metanol que hay que eli-
dal del eluyente es de 0,75 mL/min.
minar. Para tener constancia de que se ha eliminado real-
Los componentes arrastrados por el disolvente se
mente todo el agente metilante es necesario asegurarse
analizan en un detector Diode Array (Jasco MD-2015
de que la pesada de la muestra es constante.
Plus), que mide a longitudes de onda de 205 nm, 215 nm
Una vez que se ha conseguido evaporar todo el
y 220 nm, eligiéndose la primera para cuantificar los com-
agente metilante de la muestra, se procede a su análisis
puestos implicados por la mayor sensibilidad demostrada.
mediante resonancia magnética de protón (1H-RMN). El
Para la cuanti-ficación se utilizan calibrados externos de
área de una señal de resonancia de este tipo es propor-
concentración frente a altura de trioleina para los picos de
cional al número de núcleos por molécula que producen
aceite, y de concentración frente a área para los picos de
la señal y a la concentración del compuesto en el que
metilésteres de oleico, linoleico y esteárico.
están incluidos, lo que permite su integración y la cuanti-
Este análisis se puso a punto y se aplicó con las
ficación del compuesto de interés [32].
muestras obtenidas en los experimentos con CO2 super-
El análisis se realiza a una frecuencia de trabajo de
crítico como disolvente.
300 MHz, con un espectrómetro BRUKER AC-300 con au-
toinyector del C.A.I de Resonancia Magnética Nuclear de
la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Com-
plutense de Madrid. Las muestras se preparan con 10 µl 5. Resultados y Discusión
de muestra en 700 µl de cloroformo deuterado. Se sigue
el aumento de la señal a desplazamiento 3,5, propia del 5.1. Optimización para síntesis sin codisolventes
grupo metilo de los FAMEs, además de la señal a despla-
Los factores que afectan a la catálisis enzimática de bio-
zamiento 3,6-4,0, propia de los triglicéridos que constitu-
diesel a partir de aceites con mayor influencia son en ge-
yen el aceite. Dichas señales se refieren siempre al patrón
neral: temperatura, proporción de las enzimas (en este
interno, en este caso la señal de los protones asociados a
caso Novozym 435 y Lipozyme TL IM) en la mezcla que
los dobles enlace C=C que hay en las cadenas de los
se usa como catalizador, cantidad de enzima total y la
ácidos grasos insaturados. Esta señal es constante inde-
relación agente metilante/aceite [18, 19, 21, 26, 27, 31].
pendientemente de en que molécula se encuentre dicha
La mayoría de los trabajos realizados en sistemas si-
cadena.
milares empleaban temperaturas comprendidas entre 25
Este tipo de análisis se ha empleado en la optimiza-
y 60 ºC, siendo el intervalo más habitual entre 30 y 50 ºC.
ción de la síntesis sin codisolventes, centrándose en el
Esto se debe a que, en principio, un aumento de esta
rendimiento a FAMEs a 24 horas.
variable favorece la reacción aunque, llegado cierto límite,
puede provocar la desactivación de la enzima. Por ello, se
4.4.2. Análisis por cromatografía líquida de alta eligió dicho rango de valores para estudiar este factor, fi-
resolución (RP-HPLC) jándose tres niveles: 30, 40 y 50 ºC.
El método de análisis empleado se desarrolló a partir del Por otro lado, la mayor parte de los estudios se han
método de Holcapek y col. [33]. Primero se centrifugan los realizado empleando una sola enzima. Sin embargo, se
productos recogidos en el vial para separar las fases pre- optó por usar una mezcla de enzimas donde los benefi-
sentes en la misma. A continuación, se recogen 10 µL de cios podrían ser doble [21, 27]: por un lado, se sabe que
la fase superior y se diluyen con 990 µL de tetrahidrofu- Novozym 435 es más específica a las posiciones 1 y 3,
rano. La muestra así preparada se somete a un análisis con lo que se pretende que Lipozyme TL IM, al ser ines-
HPLC, que utiliza una columna Mediterránea C18, de 150 pecífica, ataque a la posición 2 del triglicérido; por otra
x 4,6 mm (ancho externo) y con un diámetro de partícula parte, el coste de Novozym 435 es muy superior al de
de 3 µm. Además esta columna cuenta con un filtro y una Lipozyme TL IM, por lo que, de obtener resultados positi-
precolumna. La temperatura del horno en el que se en- vos, podría reducirse notablemente el coste del cataliza-
cuentra la columna es de 25 °C. dor. Así, se seleccionaron los siguientes niveles de por-
Como eluyentes se emplean una mezcla de isopropa- centaje de Novozym 435 respecto al total de la enzima:
nol y hexano con una relación en volumen 5:4, acetonitrilo 25, 50 y 75.
 OBTENCIÓN DE BIODIESEL POR VÍA ENZIMÁTICA A PARTIR DE UN ACEITE MODELO DE MICROALGAS EN MEDIOS NO CONVENCIONALES | 11

Además, la cantidad de enzima total necesaria suele Aplicándolo al caso de interés, la zona de estudio se loca-
encontrarse en el rango 2 – 20 % de aceite en peso, to- lizó en los niveles 5:1, 6:1 y 7:1.
mando por lo general valores entre 4 y 10 % [10, 14, 17]. Elegidas las variables y niveles, se planteó un diseño
En consecuencia, los niveles escogidos se localizaron en factorial fraccionado que permitió reducir el número de
este último intervalo correspondiéndose con los valores de experimentos de un diseño clásico. La notación que se
5, 7 y 10 %. sigue para este tipo de diseños es nk-p, donde n es el nú-
Respecto al agente metilante (mezcla de metanol y mero de niveles, k el número de factores con los que se
acetato de metilo), se toma como base el trabajo de Ta- va a experimentar, y p el grado de fraccionamiento. Como
lukder y col., en el que se decide emplear siempre una se ha comentado, se escogieron tres niveles para los cua-
relación molar aceite:metanol de 1:1 [19]. Según los auto- tro factores de estudio, y un grado de fraccionamiento 1.
res, esta proporción es la óptima para evitar, en la medida De esta manera, el diseño sería del tipo 34-1, es decir, un
de lo posible, la desactivación de la enzima y, a la vez, diseño que permite estudiar 4 factores en 27 experimen-
beneficiarse del aumento de la velocidad de reacción que tos.
lleva asociado el uso de metanol. En este mismo estudio, Los resultados de conversión a 24 horas (ver Tabla 3)
se analizan también distintas relaciones acetato de metilo/ muestran que la mejor producción con un 80% de conver-
aceite, concretamente: 3:1, 4:1, 6:1, 8:1 y 12:1, consi- sión a FAMEs, se obtiene para el experimento realizado a
guiendo los mejores resultados con la proporción 8:1 [16]. 50 ºC, con una mezcla 1:1 en peso de Novozym 435 y

Tabla 3. Resultados de los experimentos de optimización de condiciones de operación para la síntesis de FAMEs en ausencia de codisolventes.

Factores
Experim. T (ºC) % N435 % enzimas AcMe:aceite Rendimiento (%)
1 50 75 10 5 64,7
2 30 75 10 5 65,9
3 40 75 10 5 59,8
4 50 25 10 6 69,9
5 30 25 10 6 79,2
6 40 25 10 6 73,5
7 50 50 10 7 58,0
8 30 50 10 7 75,0
9 40 50 10 7 71,2
10 50 75 5 5 76,1
11 30 75 5 5 57,3
12 40 75 5 5 71,3
13 50 25 5 6 54,0
14 30 25 5 6 66,7
15 40 25 5 6 76,1
16 50 50 5 7 76,9
17 30 50 5 7 71,0
18 40 50 5 7 59,7
19 50 75 7 5 68,7
20 30 75 7 5 77,3
21 40 75 7 5 64,8
22 50 25 7 6 69,9
23 30 25 7 6 67,4
24 40 25 7 6 64,6
25 50 50 7 7 80,2
26 30 50 7 7 65,3
27 40 50 7 7 63,5
12 | OBTENCIÓN DE BIODIESEL POR VÍA ENZIMÁTICA A PARTIR DE UN ACEITE MODELO DE MICROALGAS EN MEDIOS NO CONVENCIONALES

Lipozyme TLIM, con un 7% en peso de enzima respecto Los resultados conseguidos pueden compararse con
a aceite y una relación acetato de metilo:aceite de 7:1. los obtenidos en otros trabajos a través de la Tabla 4 que
Este resultado es lógico teniendo en cuenta lo obtenido recoge, a grandes rasgos, las similitudes de otras investi-
por otros autores y el hecho de que un exceso de agente gaciones con la propia. El trabajo aquí reflejado es una
metilante supone una dilución del aceite que ya reduce la alternativa de interés, puesto que se podrían alcanzar re-
velocidad de reacción y la productividad. sultados del mismo orden que otros autores, pero em-
El trabajo también muestra que temperaturas dema- pleando menor cantidad de Novozym 435 con respecto al
siado altas suponen deactivación enzimática y que las dos total de catalizador, lo que conlleva una reducción del
enzimas son complementarias y necesarias para un coste, factor determinante a la hora de evaluar la viabili-
máximo rendimiento a biodiesel (lo cual también se de- dad de un proceso. Además, se consigue reemplazar el
muestra para el par de lipasas Candida rugosa: Rhizopus metanol en un alto grado, pudiéndose reutilizar la enzima
oryzae empleado en condiciones supercríticas en el tra- al evitar el efecto desactivador del alcohol.
bajo de Lee y col. [27]).
Además, los resultados obtenidos se pueden repre-
5.2. Síntesis con CO2 supercrítico como codisolvente
sentar en gráficas con superficies de respuesta, tras rela-
cionar la variable “rendimiento a FAMEs a 24 h” con las Una vez conocidas las condiciones mejores sin añadir
variables independientes antes mencionadas. De esta co- codisolventes a la mezcla de reacción, se llevaron a cabo
rrelación surge la ecuación que relaciona el rendimiento varios experimentos utilizando dióxido de carbono super-
(la función objetivo seleccionada) con las variables de crítico.
operación: Para llevar a cabo los experimentos se emplearon las
mejores condiciones halladas en la etapa anterior, es
decir como agente metilante se empleó una mezcla de
acetato de metilo en relación molar 7:1 respecto del
, donde el subíndice 1 designa la temperatura, el 2 la aceite y como catalizador una mezcla de las enzimas en
proporción de Novozyme a enzima total, 3 el porcentaje una relación en peso 1:1 entre ellas y del 7% respecto
de enzima y 4 la relación acetato de metilo/aceite. del aceite de oliva.
Esta ecuación sirve para poder dibujar las superficies La cantidad de agentes metilantes fue de un 10 % en
de respuesta (de las que una muestra se da en la Figura peso respecto a la cantidad de CO2. Esta relación se fijó
5) y corroborar las condiciones óptimas de operación dis- para asegurar la total solubilización del aceite en la mezcla
cutidas. CO2-agentes metilantes. Y se fijó atendiendo a la solubili-

95

90

85

80
Xb (%)

75

7,4 70

7,0 65

60
6,0

Acetato de 55
metilo/aceite 5,0 54
50
40
4,6 30
26
T (ºC)

Figura 5. Efecto de la temperatura y de la relación entre reactivos en la conversión (Xb) a biodiesel.

 OBTENCIÓN DE BIODIESEL POR VÍA ENZIMÁTICA A PARTIR DE UN ACEITE MODELO DE MICROALGAS EN MEDIOS NO CONVENCIONALES | 13

Tabla 4. Resumen de los resultados de rendimiento de biodiesel (Xb) consegui-dos en este trabajo y por otros autores en ausencia de codi-
solventes.

Condición experimental relacionada Xb (%) Referencia

Intervalo de temperatura: 30 - 50 ºC 86 – 97 [7, 17-19, 21, 27, 31]
Sistema enzimático: Novozym 435 + Lipozyme TL IM 96 – 97 [21]
Agente metilante: Metanol + Acetato de metilo 95 – 96 [19]
Tiempo de reacción: 24 h 84 – 96 [7, 17-19, 21, 27, 31]
Este trabajo 80 –

dad del aceite de girasol en CO2 supercrítico, tomando Como se observa, el rendimiento a FAMEs a las 24 h
como codisolvente etanol, que, para las condiciones de era del 60%, es decir, similar a los obtenidos en ausencia
operación de 250 bar y una temperatura de 40 °C, es de de CO2SC y por otros autores con otras enzimas y aceites
30 g de aceite/kg de CO2 [34]. (Tabla 1), y del 80% a las 48 horas. Este hecho es intere-
Los experimentos se llevaron a cabo a esta tempera- sante ya que muestra que la dilución considerable debida
tura porque se consideró que el empleo de condiciones al uso del codisolvente (entendiendo que la mezcla de
supercríticas estaba orientado a la producción en conti- agentes metilantes ya actúa como disolvente, además de
nuo, tipo de operación que requiere de las condiciones como mezcla de reactivos) no frena las reacciones que
más estables posibles. En estas condiciones, hay que re- dan lugar a los ésteres metílicos de ácidos grasos. Es
cordar que los rendimientos a FAMEs en ausencia de co- más, se puede intuir un efecto activador considerable, al
disolvente estaban en el intervalo 58-65%. estar la mezcla de reacción en proporción 1:10 en peso
El análisis de las muestras a tiempo cero, a 1 hora, a respecto al dióxido de carbono supercrítico a 250 atm y
24 y a 48 horas (experimentos por duplicado) se llevó a 40ºC. Si se acepta una densidad del CO2SC de 0,3 g/cm3
cabo por el método de HPLC en fase reversa (RP-HPLC) a estas condiciones, ello supone una dilución 30 veces
anteriormente descrito. En la Figura 6 se muestra la evolu- mayor a las condiciones sin codisolvente. La razón de este
ción de los cromatogramas correspondientes en los que buen resultado puede estribar en la gran velocidad de
se indican los picos del aceite de partida y los FAMEs difusión en los poros de los catalizadores enzimáticos que
producto. se obtiene en condiciones supercríticas (del orden de

Mezcla aceite-AcMe-metanol Diglicéridos Triglicéridos (aceite)

Muestra reacción scCO2 a 1h
Muestra reacción scCO2 a 44h

Monoglicéridos FAMEs (biodiesel)

Figura 6. Cromatogramas de RP-HPLC que muestran la evolución temporal de la síntesis de FAMEs (biodiesel) en CO2 supercrítico.
14 | OBTENCIÓN DE BIODIESEL POR VÍA ENZIMÁTICA A PARTIR DE UN ACEITE MODELO DE MICROALGAS EN MEDIOS NO CONVENCIONALES

1000 a 10000 veces superiores a la de los sistemas en ves on biotechnology. Journal of Biotechnology, 2011. 156(4):
ausencia de codisolvente supercrítico). La alta viscosidad p. 382-391.

de los sistemas líquidos lleva a unas velocidades de trans- 5. Brennan, L. y P. Owende. Biofuels from microalgae–A review of
technologies for production, processing, and extractions of bio-
ferencia de materia en los poros muy bajas. Los sistemas
fuels and co-products. Renewable and Sustainable Energy
supercríticos tienen viscosidades varios órdenes de mag- Reviews, 2010. 14(2): p. 557-577.
nitud inferiores (en especial, si se considera la alta visco-
6. Wen, Z., J. Liu y F. Chen, 3.12 - Biofuel from Microalgae, in
sidad del aceite), que explican la alta difusividad en estos Comprehensive Biotechnology (Second Edition), M.-Y. Editor-in-
sistemas. Esta difusividad elevada contrarrestaría la dilu- Chief: Murray, Editor. 2011, Academic Press: Burlington. p.
ción de los reactivos y llevaría a un rendimiento a biodiesel 127-133.
elevado aún a baja concentración de los mismos. 7. Naik, S.N., V.V. Goud, P.K. Rout y A.K. Dalai. Production of first
En estas circunstancias cabría proponer el desarrollo and second generation biofuels: A comprehensive review.
Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2010. 14(2): p.
de experimentos en continuo en dióxido de carbono su- 578-597.
percrítico en reactores tipo lecho fijo que contengan una
8. Cheng, J.J. y G.R. Timilsina. Status and barriers of advanced
mezcla de las dos enzimas empleadas al 50% en peso biofuel technologies: A review. Renewable Energy, 2011. 36(12):
(concentración de enzima total a medio de reacción en p. 3541-3549.
torno al 150%), maximizando hasta donde deje la solubili- 9. Norsker, N.-H., M.J. Barbosa, M.H. Vermuë y R.H. Wijffels.
dad y la difusividad efectiva de los reactivos, la concen- Microalgal production – A close look at the economics.
tración de estos en el medio de reacción. Así mismo, sería Biotechnology Advances. 29(1): p. 24-27.
de utilidad estudiar la estabilidad de tal sistema una vez 10. F. Xavier, M. Microalgae and biofuels: A promising partnership?
optimizada su actividad, teniendo en cuenta la gran capa- Trends in Biotechnology, 2011. 29(11): p. 542-549.
cidad de estabilización que tiene tanto el acetato de metilo 11. Lee, D.H. Algal biodiesel economy and competition among bio-
como el propio CO2SC. fuels. Bioresource Technology, 2011. 102(1): p. 43-49.
12. Vicente, G., M. Martínez y J. Aracil. Integrated biodiesel produc-
tion: a comparison of different homogeneous catalysts systems.

6. Conclusiones Bioresource Technology, 2004. 92(3): p. 297-305.

13. Chouhan, A.P.S. y A.K. Sarma. Modern heterogeneous catalysts
for biodiesel production: A comprehensive review. Renewable
A la vista de los resultados obtenidos en los dos sistemas and Sustainable Energy Reviews, 2011. 15(9): p. 4378-4399.
analizados, cabe concluir que:
14. West, A.H., D. Posarac y N. Ellis. Assessment of four biodiesel
a) Las condiciones óptimas en exceso de acetato de production processes using HYSYS. Plant. Bioresource
metilo indican que se precisa de temperaturas mo- Technology, 2008. 99(14): p. 6587-6601.
deradas, mezclas enzimáticas adecuadas, al 50% 15. Marchetti, J.M., V.U. Miguel y A.F. Errazu. Techno-economic
en peso, concentraciones globales de enzimas study of different alternatives for biodiesel production. Fuel
elevadas y relaciones molares de acetato de metilo Processing Technology, 2008. 89(8): p. 740-748.
a aceite que desplacen el equilibrio químico hacia 16. Kiss, F.E., M. Jovanović y G.C. Bošković. Economic and ecolo-
los FAMEs pero que no diluyan en exceso el aceite. gical aspects of biodiesel production over homogeneous and
heterogeneous catalysts. Fuel Processing Technology, 2010.
b) El uso de dióxido de carbono supercrítico no re-
91(10): p. 1316-1320.
duce el rendimiento a FAMEs a pesar de la gran
17. Gog, A., M. Roman, M. Toşa, C. Paizs y F.D. Irimie. Biodiesel
dilución respecto a las condiciones en ausencia de production using enzymatic transesterification – Current state
este codisolvente. Este hecho se puede deber a la and perspectives. Renewable Energy, 2012. 39(1): p. 10-16.
mejora de la difusividad de los reactivos en los 18. Rodrigues, A.R., A. Paiva, M.G. da Silva, P. Simões y S. Barreiros.
poros de los biocatalizadores y a la dilución que Continuous enzymatic production of biodiesel from virgin and
sufren tanto el aceite como los agentes metilantes. waste sunflower oil in supercritical carbon dioxide. The Journal
Por ello, este medio podría ser adecuado para me- of Supercritical Fluids, 2011. 56(3): p. 259-264.

jorar la estabilidad del catalizador enzimático en 19. Talukder, M.M.R., P. Das, T.S. Fang y J.C. Wu. Enhanced enzy-
matic transesterification of palm oil to biodiesel. Biochemical
producción en continuo y para facilitar la posterior
Engineering Journal, 2011. 55(2): p. 119-122.
separación de los productos.
20. Xu, Y., M. Nordblad, P.M. Nielsen, J. Brask y J.M. Woodley. In
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nolysis of rapeseed oil. Journal of Molecular Catalysis B:
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