El resumen describe la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo en el laboratorio siguiendo las instrucciones provistas. Se calcularon 1.86 gramos de agar para preparar 20 ml de medio, el cual fue diluido en agua destilada y esterilizado en autoclave a 121°C por 15 minutos. Luego se distribuyó en dos placas de Petri e incubó a 37°C por 24 horas, mostrando resultados negativos para el crecimiento de colonias y demostrando la efectividad del método de esterilización.
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El resumen describe la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo en el laboratorio siguiendo las instrucciones provistas. Se calcularon 1.86 gramos de agar para preparar 20 ml de medio, el cual fue diluido en agua destilada y esterilizado en autoclave a 121°C por 15 minutos. Luego se distribuyó en dos placas de Petri e incubó a 37°C por 24 horas, mostrando resultados negativos para el crecimiento de colonias y demostrando la efectividad del método de esterilización.
El resumen describe la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo en el laboratorio siguiendo las instrucciones provistas. Se calcularon 1.86 gramos de agar para preparar 20 ml de medio, el cual fue diluido en agua destilada y esterilizado en autoclave a 121°C por 15 minutos. Luego se distribuyó en dos placas de Petri e incubó a 37°C por 24 horas, mostrando resultados negativos para el crecimiento de colonias y demostrando la efectividad del método de esterilización.
El resumen describe la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo en el laboratorio siguiendo las instrucciones provistas. Se calcularon 1.86 gramos de agar para preparar 20 ml de medio, el cual fue diluido en agua destilada y esterilizado en autoclave a 121°C por 15 minutos. Luego se distribuyó en dos placas de Petri e incubó a 37°C por 24 horas, mostrando resultados negativos para el crecimiento de colonias y demostrando la efectividad del método de esterilización.
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Preparacin, Esterilizacin y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton
Mndez, Helena Palacios, Hasleidy
Universidad de Boyac Facultad Ciencias de la Salud Bacteriologa y Laboratorio Clnico
RESUMEN
En condiciones de laboratorio se realiz la preparacin de Agar Mueller Hinton como
medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparacin dadas por la casa comercial. Basados en esta informacin se realizaron los clculos adecuados para la preparacin de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian distribuidos en dos cajas de petri pequeas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparacin del medio de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de precipitado que contena 20 ml de agua destilada, y se calent a 250C hasta que hirviera; una vez obtenida la preparacin, se llevo a esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. Luego se procedi a distribuir en las dos cajas de petri el medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cmara de flujo laminar, para evitar la contaminacin de este. Finalmente se realizo la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una temperatura de 37C. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido para la incubacin del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el crecimiento de colonias, indicando que el mtodo de esterilizacin empleado es efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de diferentes microorganismos.
PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilizacin, medios de cultivo, prueba
de esterilidad.
INTRODUCCIN
Fue en 1876 cuando Koch fue capaz carne e infusiones, a fin de
de propagar una bacteria patgena equipararlos con el tejido infectado (Bacillus anthracis) en cultivo puro, portador (1). fuera del cuerpo que la portaba; en Para el aislamiento, estudio y 1881, utilizando un medio liquido, lo clasificacin de los microorganismos, solidifico con gelatina y desarrollo los es necesario utilizar un medio de mtodos de rayado y siembra en placa cultivo en el que se dispongan de las para aislamiento de bacterias. El sustancias orgnicas e inorgnicas siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, necesarias e indispensables para el al utilizar como agente solidificante un normal desarrollo de su metabolismo. producto denominado agar, extrado En estos medios, los microorganismos de las algas rojas. El agar era muy adems de poder multiplicarse, superior a la gelatina, ya que era pueden manifestar caractersticas de resistente a la digestin microbiana y a crecimiento y propiedades la licuefaccin. Se enriqueci la bioqumicas, aspectos de gran composicin de los cultivos importancia para su clasificacin. (2). solidificados utilizando extractos de Estos preparado, poseen caractersticas especificas por menor que en los medios de cultivo ejemplo: contener sustancias nutritivas slidos. como protenas, azucares, minerales y - lquidos: no contiene ningn agente vitaminas; tener un pH adecuado; solidificante estar protegidos de posibles contaminaciones; y estar esterilizados. Segn se Composicin: (2). - empricos: en su composicin aparecen sustancias orgnicas. Ventajas al Utilizar los Medios de - sintticos: en su composicin Cultivo. aparecen sustancias qumicas permite el aislamiento de un definidas. microorganismo a partir de un sustrato - semisintticos: en su composicin natural (suelo, agua, plantas, aire, aparecen molculas naturales excrementos, pus, etc.). hidrolizadas. permite la identificacin del microorganismo, segn las Segn el uso a que se destinen: caractersticas de crecimiento, - medios enriquecidos: suelen ser morfologa celular, propiedades medios con un nutriente simple que tintoriales y reacciones bioqumicas. presentan enriquecedores, tales como Conservacin durante meses y la sangre de carnero. Son medios aos de las cepas identificadas. destinados a desarrollar Obtencin de clulas de microorganismos muy exigentes. microorganismos patgenos o de sus - Medios diferenciales: contienen toxinas para la elaboracin de colorantes, azucares e indicadores, productos biolgicos (vacunas, concebidos para provocar una antitoxinas, etc.) (2). respuesta bioqumica conocida, generalmente el color. El tipo de medio que utiliza un - Medios selectivos: adems de microbilogo depende del contar en su composicin con los microorganismo que esta cultivando y mismos productos que los medios el porque de dicho cultivo. Los diferenciales, presentan una serie de microorganismos presentan una agentes que sirven para inhibir la flora enorme variedad de requerimientos acompaante de la muestra a nutricionales. Se utiliza un medio estudiar, y aislar, de esta forma, el mnimo para determinar los microorganismo que se busca. requerimientos nutricionales de un - Medios de uso general: son medios organismo y un medio rico si se desea que soportan el crecimiento de una obtener masa celular de una forma amplia variedad de microorganismos rpida (3). fastidiosos, sin exigencias nutritivas especiales (1). Clasificacin de los Medios de Cultivo Preparacin del Agar Mueller Hinton
Segn se Estado Fsico:
- Slidos: presentan en su 1. se disuelven 38g en un litro de agua composicin una agente solidificante, destilada, calentndolo y agitndolo el agar, en una proporcin de 12 a 15 al mismo tiempo, hasta su completa gramos por litro. disolucin. El matraz se cierra con - semislidos: presentan agar en su doble capa de papel aluminio. composicin pero en una proporcin 2. se esteriliza en autoclave, a 121C RESULTADOS durante 15 minutos. 3. se dosifica en placa de petri a un Clculos Necesarios para Preparar la volumen de 20ml (1). Cantidad de Medio de Cultivo Deseado Se deben preparar dos cajas de petri pequeas con agar Mueller Hinton. MATERIALES Y MTODOS 20ml para cajas grandes Para la preparacin del medio de cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton 15ml para cajas medianas y se tomaron en cuenta las 10ml para cajas pequeas especificaciones de preparacin dadas por la casa comercial. Inicialmente se realizo el clculo de la cantidad de agar necesario para la preparacin del medio de cultivo, o sea se tomo 1.86gr de agar (incluido el peso del papel: 1.1gr), el cual se adicion en una vaso de precipitado que contena 20ml de agua destilada que se uso como diluyente del agar. Seguidamente se calent a 250C hasta que iniciara a hervir.
Despus de obtenida la solucin de
agar, se realizo proceso de esterilizacin con autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121C. Finalizado este proceso se procedi a dispensar el medio, realizando inicialmente limpieza con alcohol alrededor del vaso de precipitado para evitar contaminacin del medio de cultivo, luego se adiciono en dos cajas de petri pequeas aproximadamente 10ml de la preparacin, esto en condiciones estriles en cmara de flujo laminar, a la cual se le realizo limpieza previa con alcohol al 70% y se puso a funcionar el aire estril de la cmara durante 30 minutos.
Una vez dispensado el medio de Despus de realizado el proceso de
cultivo en las cajas de petri, estas se esterilizacin en el autoclave se sellaron con cinta de enmascarar y se observo en el vaso de precipitado la colocaron a incubar a 37C durante 24 formacin del agar con textura horas para verificacin de prueba de semilquida y de color amarillo muy esterilidad. claro, como se observa en la figura #1. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
Como se menciono anteriormente, se
utilizo agar Mueller Hinton de la casa comercial OXOID, (cdigo CM 337) para la preparacin del medio de cultivo. El agar Mueller Hinton se utiliza en la comprobacin de la susceptibilidad de microorganismos a antibiticos. Es un medio simple, transparente y sin materiales termolabiles (1) como se observa en la figura #1. Dentro de su composicin en un litro encontramos: - Infusin de carne . ...2g - cidos de casamino.......17.5g Figura #1 agar Mueller Hinton despus - Almidn......... 1.5g de proceso de esterilizacin. - Agar ... 17g
Estando con pH de 7.3 y una T
Los resultados obtenidos en las cajas entre 0.1 a 25C. de petri luego de la prueba de esterilidad, permitieron observar que el El almidn contribuye al fomento en el medio de cultivo con agar Mueller crecimiento, as como la infusin de Hinton continuaba de color amarillo carne y los cidos de casamino, que claro, sin observarse crecimiento sirven de nutrientes al medio sobre la superficie de ninguna (seleccionados estos para dar la poblacin bacteriana, indicando ser un mayor transparencia posible al medio de cultivo viable para su uso. medio). La tcnica de trabajo con este Figura #2. medio consiste en depositar, en la superficie, discos de papel impregnados de antibitico a probar, una vez sembrada la placa, para poder ver el halo que se forma alrededor del disco, y constatar as la inhibicin de los distintos discos en sus distintas concentraciones de antibitico (1) El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al Figura #2 agar Mueller Hinton despus enfriarse a 40 grados, lo cual se de prueba de esterilidad. observo durante la preparacin del medio de cultivo (2). La cantidad de agar encontrada en la composicin qumica (17g), indica que corresponde a un medio de cultivo cultivo estril para lograr excluir de el solid, y debido a componentes como todos los microorganismos (5). la infusin de carne y los cidos de casamino, se observa de color amarillo CONCLUSIONES claro. Figura #2. Se aprendi y manejo la tcnica Referente a la esterilizacin del medio empleada para la preparacin de de cultivo, debe ponerse mucha medios de cultivo. atencin en el tiempo de esterilizacin, Se aplico la tcnica de esterilizacin porque si el proceso no dura el tiempo de vapor a presin (autoclave), para preciso, el medio puede presentar medios de cultivo en agar y caldo problemas de esterilidad, y si nutritivo. excediera el tiempo preciso, el medio Se conoci el mtodo de prueba de se sobrecalentara y afectara a las esterilidad para verificar viabilidad de cualidades del medio y su pH (1). los medios de cultivo.
Las tcnicas de esterilizacin han de BIBLIOGRAFA
destruir todos los tipos de vida microbiana (4). El vapor a presin 1. Delgado, A. Polanco, A. Amich, S. (autoclave) es el mtodo ms eficaz y Prieto, S. Salve, M. Manual de practico para esterilizar con calor. La laboratorio clnico bsico exposicin al vapor en un autoclave, a "Microbiologa". Espaa. Mc Graw 15 libras de presin (121C) y durante Hill Interamericana. 2001. p 76, 77, 20 minutos, matara todas las formas 80, 91, 92. de vida. El vapor a presin penetra 2. Montealegre, J. Preparacin de mucho y es particularmente eficaz ya Medios de Cultivo para Hongos y que se condensa sobre un objeto fri Bacterias. Laboratorio #3. [En para liberar 596 cal por g (calor de linea]. Departamento de Sanidad condensacin). La condensacin Vegetal. Chile. Universidad de permite que mas vapor entre en Chile. [citado 2002]. Disponible en contacto con los objetos que se estn INTERNET: esterilizando (4). <URL:http:agronomia.uchile.cl/web cursos/microbiologiagral/pagina% Antes de proceder a realizar un cultivo 20microbiologia1/Word/guia_lab07 se microorganismos se debe _ (1).doc> considerar como evitar los 3. Ingraham, J. Ingraham, C. contaminantes. Los microorganismos Prentiss, H. Introduccin a la se encuentran en todas partes y, Microbiologa. Volumen I. Espaa. debido a su pequeo tamao, se Reverte SA. 1998. p 67,68. dispersan fcilmente por el aire y las 4. Quentin, M. Russell, W. superficies. Por consiguiente se debe Bacteriologa y Micologa Mdicas. esterilizar el medio de cultivo Segunda Edicin. Mxico. inmediatamente despus de su Interamericana Mc Graw Hill. preparacin para eliminar los 1991. p. 85, 87. microorganismos que lo contaminan, 5. Madigan, M. Martinko, J. Parker, J. esto se hace normalmente por calor. Brock Biologa de los Pero es tambin importante tomar las Microorganismos. Octava edicin debidas precauciones durante el revisada. Madrid. Prentice Hall manejo posterior de un medio de Iberia. 1999. p 15, 16.