Actividad Enzimatica Medida Por Metodos Continuos y Discontinuos

Medida de la actividad enzimtica
ACTIVIDAD ENZIMTICA: MEDIDA POR MTODOS CONTINUOS Y DISCONTINUOS.

Salvo para unas pocas protenas que pueden ser detectadas por medidas
espectroscpicas directas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la
reaccin que cataliza, pudindose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la
reaccin. Adems, la caracterizacin de una enzima implica la determinacin de su actividad
en diferentes condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimtica es de importancia
para la investigacin y anlisis de protenas.
La figura 1 muestra una curva tpica de
Figura 1
formacin de un producto (P) en funcin del tiempo
para una reaccin catalizada enzimticamente. Se
observa que la velocidad disminuye con el tiempo,
hecho que puede deberse a las siguientes causas:
9 Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima
9 El transcurso de la reaccin produce una
disminucin significativa de la concentracin de
sustrato (S)
Tiempo
9 La reaccin inversa puede comenzar a cursar y
hacerse relativamente importante al aumentar la
concentracin de P
8
10
La medida adecuada de la actividad de una enzima requiere que se determine la velocidad

inicial, esto es, obtener la tangente al origen del grfico mostrado en la figura 1. De esta
manera, las diferentes causas que producen la disminucin de la actividad con el tiempo son
eliminadas.
La figura 2 ejemplifica medidas experimentales
de la formacin de P en funcin del tiempo (como en
la fig.1), determinadas a tres concentraciones
diferentes de S. Puede observarse que la velocidad
(v) que se obtendra en cada caso dependera del
intervalo de tiempo que se tomara para medirla.
Figura 2
1
s3
s2
s1
En este ejemplo, si medimos v para cuando

obtendramos
el
mismo
valor,
S=S1,
independientemente de haber elegido el intervalo 01 o el 1-2. En cambio para S=S2, la v obtenida sera
Tiempo
distinta segn el intervalo elegido. Para estos dos
casos, la v podra calcularse adecuadamente
eligiendo el intervalo 0-1, donde la formacin de P
es funcin lineal con el tiempo. Para el ejemplo de la figura 2, la medida de v, cuando S=S3,
usando el intervalo 0-1, no es enteramente confiable ya que se necesitan ms puntos
experimentales que verifiquen la condicin de linealidad en la estimacin de v realizada.
0
Adems de considerar la variacin de la velocidad con el tiempo, hay que tener en

cuenta que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la
fuerza inica, el pH, la concentracin de S, la cantidad de enzima en el medio de medida.
Todos estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de
actividad enzimtica.
La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la
aparicin de un P de la reaccin en funcin del tiempo. La determinacin cuantitativa de S o
de P puede hacerse por diferentes mtodos analticos segn el caso: espectrofotomtricos
(los ms comunes), volumtricos, potenciomtricos, radioqumicos, espectrofluoromtricos.
Independientemente del mtodo utilizado, puede suceder que para, por ejemplo, una
reaccin enzimtica: Sa + Sb P + Q, pueda medirse Q en presencia de los otros
componentes de la mezcla de reaccin. En este caso, la reaccin enzimtica podra seguirse
continuamente en funcin del tiempo. En consecuencia, podran obtenerse numerosos
puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automtico) de la
produccin de Q en funcin del tiempo, a partir de un nico medio de reaccin. Esto es lo
que se denomina mtodo continuo de medida de la actividad enzimtica.
Los ejemplos tpicos de mtodos continuos
empleados para medir actividad los constituyen las
deshidrogenasas que usan NAD(P)/NAD(P)H como
coenzima. Estos mtodos se basan en que la forma
reducida de la coenzima (NAD(P)H), pero no la forma
oxidada (NAD(P)), absorbe a 340nm (la Fig. 3A muestra
los espectros de absorcin del NAD+ y del NADH).
Figura 3 A
Coef.de
extincin
NAD(P)+
NAD(P)H
250
350
400
(nm)
As, la actividad de la Lactato deshidrogenasa:
+
+
piruvato + NADH + H lactato + NAD
podra seguirse por un mtodo continuo midiendo la disminucin de absorbancia a 340nm,
con lo que se obtendra la curva mostrada en la figura 3B.
En ciertos casos, aunque no haya una
propiedad analtica diferencial de un S o de un P
que permita su dosaje continuo, an puede
Figura 3
B
medirse la actividad de una enzima por un mtodo
continuo si se acopla otra reaccin enzimtica a la
de la enzima en cuestin. Por ejemplo, la actividad
de la piruvato quinasa (PK) podra medirse en
forma continua por un mtodo que utilice a la LDH
como enzima acoplada de forma que se dose el
piruvato producido por accin de la PK:
0.9
0.8
Abs 340nm
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Tiempo (min)
Fosfoenolpiruvato + ADP piruvato + ATP (PK)

Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+ (LDH)
Si las cantidades de LDH y de NADH
2
agregadas al medio de reaccin son los suficientemente elevadas, la disminucin de la

absorbancia a 340nm va a medir la velocidad de produccin de piruvato por parte de PK.
En otros casos, la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse
determinando continuamente un dado S o P en presencia de los dems componentes del
medio de medida y es necesario separar el compuesto a cuantificar, para lo cual se requiere
detener la reaccin enzimtica. En estos casos se utilizan mtodos discontinuos, en los
que la medida de S o de P requiere partir de un medio de reaccin diferente. Por ejemplo, la
actividad de la ADPglucosa pirofosforilasa:
ADPGlc + PPi Glc1P + ATP,
puede medirse usando PPi marcado con [32P] y midiendo la formacin de ATP radioactivo. Si
no se separa el ATP formado del PPi que no reaccion no se observa cambio de la
radioactividad en el medio de reaccin. Para determinar cunta radioactividad est en forma
de ATP es necesario detener la reaccin enzimtica y separar el ATP del PPi. De esta forma,
para tener una curva de ATP formado en funcin del tiempo, es necesario preparar tantos
medios de reaccin como puntos experimentales se deseen.
Un mtodo discontinuo puede comprender tambin aquel en el que el dosaje de un S
o P no implique su separacin del medio de reaccin, sino su reaccin qumica en
condiciones que afectan la actividad de la enzima. Por ejemplo, la actividad de la
fosfoglucosaisomerasa:
Glc6P Fructosa6P
podra medirse dosando Fru6P por el mtodo de Roe. Pero las condiciones del mtodo de
dosaje hacen que necesariamente se detenga la reaccin enzimtica con cada medida de
Fru6P. Se requiere nuevamente de un medio de medida de actividad por punto experimental
de cantidad de Fru6P producida.
Ntese que, en general, el uso de un mtodo continuo brinda con mayor facilidad un
nmero elevado de medidas de variacin de S o P en funcin del tempo (inclusive puede
tenerse un trazo continuo) que un mtodo discontinuo. Por esto, y teniendo en cuenta lo
antes mencionado sobre la variacin de v en funcin del tiempo, al usar un mtodo
discontinuo para medir actividad enzimtica hay que ser particularmente cuidadoso para
estar seguro de medir velocidades iniciales.

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