Elektroporacija
Elektroporacija ili eletropermeabilizacija je molekulskobiološka tehnika u kojoj se električno polje primjenjuje na ćelije kako bi se povećala propusnost ćelijske membrane, omogućavajući emikalijama, lijekovima ili DNK da se uvedu u ćeliju. U molekulskoj biologiji, proces elektroporacije se često koristi za transformaciju bakterija, kvasaca ili biljnih protoplasta, uvođenjem novokodirajuće DNK. Ako se bakterija i plazmidi pomiješaju, nakon elektroporacije, preko plazmida, DNK se može prenijeti u bakterije. U ovom procesu se primjenjuje napon od nekoliko stotina volti sa udaljenosti od nekoliko milimetara. Nakon toga, ćelije moraju biti pažljivo održavane, sve dok imaju uvjete dijeljenje, tj. proizvodnju novih ćelija koje sadrže reproducirane plazmide. Ovaj proces je otprilike deset puta efikasniji nego hemijska transformacija.[1][2][3]
Prikazane su plastične sa aluminijskim elektrodama i zatvorene plavim poklopcima.
Maksimalna zapremina im je 400 μl.
Elektroporacija je također vrlo efikasna za uvođenje stranih gena u ćelijsku kulturu tkiva, posebno sisarskih ćelija. Na primjer, to se koristi u procesu proizvodnje knockout miševa, terapiji, kao i u tretmanu tumora, genskoj terapiji, kulturi ćelija. Proces uvođenja stranih DNK molekula u eukariotske ćelije je poznat kao transfekcija. Elektroporacija je široko upotrebljiva za transfekciju ćelija u suspenziji, pomoću elektroporacijskih kivete. Elektroporacija se pokazalo kao efikasna i za upotrebu na tkiva in vivo i in utero za aplikacije kao in ovo (u jajnoj ćeliji) transfekcijama. Pomoću elektroporacije također biti unesene i lprijanjajuće ćelije, pružajući istraživačima alternativu za tripsinizaciju ćelija prije transfekcije.
Elektroporacija se izvodi elektroporatorima, svrhiskodno izgrađenim uređajima koji stvaraju elektrostatičko polje u ćeliji. Ćelijska suspenzija se kapaljkkom unosi u čašu ili plastičnu kivetu koja sa strana ima dvije aluminijske elektrode. Za bakterijsku elektroporaciju, obično se uzima spenziju od oko 50 mikrolitar. Prije elektroporacije, suspenzije bakterija se miješa sa plazmidima da se transformira. Mješavina se zatim pipetira u kivetu, dok su već napon i kapacitet podešeni, a kiveta se ubacuje u electroporator. Odmah nakon elektroporacije, jedan mililitar tečnog medija se dodaje bakteriji (u kivetu ili u Eppendorf tubu), koje se se inkubiraju na optimalnoj temperaturi bakterije. Utrajanju od jedan sat ili više, kako bi se ćelijama omogućio oporavak i ekspresija plazmida. Zatim se bakterijske kulture stavljavji na agarne ploče. Uspjeh elecroporacije u velikoj mjeri ovisi o čistoći plazmidnog rastvora, pogotovo o njegovom sadržaju soli. U rastvorima s visokom koncentracijom soli može doći do električnog pražnjenja (poznat kao elektrčni luk), koji često smanjuje održivost bakterije. U daljnjem detaljnom praćenju procesa, više pažnje treba posvetiti izlaznoj impedanciji poratorskog uređaja i ulaznoj impedanciji suspenzije ćelija (npr. sadržaja soli). Kako je proces potreban direktan električni kontakt između elektrode i suspenzije, te je neoperativan sa izoliranim elektrodama, očigledno je da proces uključuje određene efekte elektrolize, zbog slabe struje, a ne samo luka električnog polja. Za daljnje detaljnu istragu procesa, više pažnje treba posvetiti izlazne impedancije od porator uređaja i ulazna impedancija suspenzije ćelija (npr soli sadržaja). Kako se proces treba direktan električni kontakt između elektrode i suspenzije, te je neoperativan sa izoliranim elektrode, očigledno je da proces uključuje određene efekte elektolize, zbog slabe struje, a ne samog polja.
Elektroporacija se sve obimnije primjenjuje i u genskoj terapiji.
Također pogledajte
[uredi | uredi izvor]Reference
[uredi | uredi izvor]- ^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
- ^ Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005): Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-3-4.
- ^ Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.
Vanjski linkovi
[uredi | uredi izvor]